SK43498A3 - Method of disrupting cultured cells using an impinging jet device - Google Patents
Method of disrupting cultured cells using an impinging jet device Download PDFInfo
- Publication number
- SK43498A3 SK43498A3 SK434-98A SK43498A SK43498A3 SK 43498 A3 SK43498 A3 SK 43498A3 SK 43498 A SK43498 A SK 43498A SK 43498 A3 SK43498 A3 SK 43498A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- cells
- virus
- cell
- animal
- pressure
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
- C12M47/06—Hydrolysis; Cell lysis; Extraction of intracellular or cell wall material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/06—Lysis of microorganisms
- C12N1/066—Lysis of microorganisms by physical methods
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
- C12N2710/16751—Methods of production or purification of viral material
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Mycology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Vynález sa týka spôsobu rozrušovania buniek vypestovaných v kultúre použitím proti sebe tryskajúcich prúdov pracujúcich pri nízkom tlaku za vytvorenia rozrušujúceho strihu v kvapaline, ktorý je dostatočne intenzívny na rozrušenie buniek, ale nie taký intenzívny, aby zničil ich obsah.The invention relates to a method of disrupting cells grown in culture using counter-jet streams operating at low pressure to produce a disruptive shear in a liquid that is intense enough to disrupt the cells but not intense enough to destroy their contents.
Doterajší stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION
Základom mnohých biotechnologických a fermentačných postupov je vypestovanie veľkého množstva buniek v bioreaktore a potom ich rozrušenie na uvoľnenie požadovaných produktov. Rozrušenie buniek môže byť dosiahnuté mechanickými, chemickými, biologickými alebo fýzikálnymi prostriedkami. V mnohých protokoloch sa dáva prednosť spôsobom mechanického rozrušenia, pretože je vysoko žiadúce odstrániť potrebu ďalších reagencií (detergenty, enzýmy alebo látky ovplyvňujúce osmotický tlak) a vylúčiť neľahké zväčšovanie meradla u fyzikálnych metód, ako je zmrazenie/topenie.The basis of many biotechnological and fermentation processes is to grow a large number of cells in a bioreactor and then disrupt them to release the desired products. Cell disruption can be achieved by mechanical, chemical, biological or physical means. In many protocols, mechanical disruption is preferred because it is highly desirable to eliminate the need for additional reagents (detergents, enzymes, or agents affecting osmotic pressure) and to avoid the scale-up of physical methods such as freezing / melting.
Na rozrušenie mikroorganizmov bolo vyvinuté veľké množstvo mechanických metód. Tieto metódy sa zvyčajne na dosiahnutie prasknutia bunkovej steny a membrány spoliehajú na strihové sily v kvapaline a/alebo stlačovanie. Avšak na všetky biotechnologické a fermentačné postupy využívajú mikroorganizmy. Vhodným voliteľným hostiteľom sú často živočíšne bunky. Pretože živočíšne bunky sú väčšie a majú krehkejšiu membránu, na uskutočnenie požadovaného rozrušenia buniek je potrebný oveľa menší prísun energie. Veľa komerčných systémov navrhnutých na použitie u baktérií nie je vhodných na použitie v prípade živočíšnych buniek.A large number of mechanical methods have been developed to disrupt microorganisms. These methods typically rely on shear forces in the liquid and / or compression to achieve cell wall and membrane rupture. However, they use microorganisms for all biotechnological and fermentation processes. Often, animal cells are a suitable optional host. Since animal cells are larger and have a more fragile membrane, much less energy is required to effect the desired cell disruption. Many commercial systems designed for use in bacteria are not suitable for use in animal cells.
Zariadenia typu rotor/stator, ktoré je možné použiť na rozrušovanie živočíšnych buniek, majú valcový rotor, ktorý sa otáča vysokou rýchlosťou koncentricky vo vnútri statora. Tieto zariadenia vytvárajú v prstencovej oblasti strmý gradient rýchlosti vytvárajúci dostatočné strihové namáhanie v kvapaline naRotor / stator devices that can be used to disrupt animal cells have a cylindrical rotor that rotates at a high speed concentrically within the stator. These devices create a steep velocity gradient in the annular region creating sufficient shear stress in the liquid to
-2rozrušenie buniek. Podobné zariadenie nazývané Chaikoff Press má valec a piest s trochu menším priemerom. Pohyb piestu vytvára v kvapaline vo vnútri prstencového priestoru vysoké strihové sily, ktoré spôsobujú rozrušenie buniek. Tento typ zariadenia sa tiež označuje ako „douncer“ a bolo používané na rozrušovanie diploidných pľúcnych buniek MRC-5 infikovaných vírusom varicely. Tieto metódy sú však použiteľné v laboratórnom meradle a nie ej možné ich zväčšovať na výrobu v priemyselnom meradle.-2cell disruption. A similar device called Chaikoff Press has a cylinder and piston with a slightly smaller diameter. The movement of the piston creates high shear forces in the liquid within the annular space, causing cell disruption. This type of device is also referred to as a "douncer" and has been used to disrupt varicella-infected diploid MRC-5 lung cells. However, these methods are applicable on a laboratory scale and cannot be scaled up for industrial scale production.
Ultrazvuk alebo sonikácia rozrušuje bunky vytváraním oblastí vysokého strihového napätia v kvapaline pri procese kavitácie. Oscilácia akustických vín (ξ 20 kHz) vytvára poklesy tlaku v kvapaline. Bubliny pary vytvorené v oblasti s nízkym tlakom po vstupe do oblasti s vysokým tlakom zanikajú za vytvorenia šokových vín s vysokou energiou. Pretože šokové vlny sa pohybujú radiálne z miesta počiatočnej kavitácie, vytvárajú sa pri pohlcovaní energie kvapalinou vysoké strihové sily, rovnako ako teplo.Ultrasound or sonication disrupts cells by creating high shear stress regions in the liquid during the cavitation process. Oscillation of acoustic wines (ξ 20 kHz) creates pressure drops in the liquid. The vapor bubbles formed in the low-pressure area upon entering the high-pressure area cease to form high-energy shock wines. Since the shock waves move radially from the point of initial cavitation, high shear forces as well as heat are generated when the energy is absorbed by the liquid.
Zariadenie využívajúce kontinuálnu prietokovú sonikáciu bolo použité na rozrušovanie diploidných pľúcnych buniek MRC-5 obsahujúcich vírus varicely. Oblasť v tesnej blízkosti vzniku šokovej vlny má dostatočnú energiu na zničenie infekčnosti varicely. Preto miera straty infekčnosti vírusu závisí na počte miest nukleácie vytvorených na jednotku objemu kvapaliny, ktoré súvisia so vstupom energie do kvapaliny. Postup kontinuálnej sonikácie má však tiež za následok vzrast teploty o 5 až 10 °C v spracovanej kvapaline, čo zvyšuje rýchlosť degradácie vírusu. Množstvo vloženej sonikačnej energie na zvýšenie titrov môže byť po sonikácii znížené; avšak menší počet rozrušených buniek vedie k väčším stratám na vyčerujúcich filtroch. Existuje optimálny pomer medzi stratou titra v dôsledku sonikácie a mierou rozrušenia buniek vyžadovanou pre vysoké titre po vyčerení.A device using continuous flow sonication was used to disrupt the varicella virus containing MRC-5 diploid lung cells. The area in close proximity to the shock wave has sufficient energy to destroy the infectivity of the varicella. Therefore, the level of virus infectious loss depends on the number of nucleation sites created per unit volume of liquid that are associated with energy input into the liquid. However, the continuous sonication process also results in a temperature increase of 5-10 ° C in the treated liquid, which increases the rate of virus degradation. The amount of sonicated energy input to increase titers may be reduced after sonication; however, a smaller number of disrupted cells leads to greater losses on clarifying filters. There is an optimal ratio between the loss of titer due to sonication and the degree of cell disruption required for high titers after clarification.
V ďalších postupoch podľa doterajšieho stavu techniky sa na maximalizáciu uvoľňovania rotavírusu z kultúry využíva postup zmrazovania/topenia. Táto metóda, aj keď je užitočná, môže byť len ťažko použiteľná vo výrobnom meradle.In other prior art processes, a freeze / thaw process is used to maximize the release of rotavirus from the culture. This method, although useful, can be difficult to apply on a production scale.
Metódy využívajúce vzájomné zrážanie dvoch prúdov sú známe tiež: môže byť použité narážanie prúdu kvapaliny na dosku alebo zrážanie dvoch proti sebe smerujúcich prúdov. Oblasť zrážania poskytuje zónu mikromiešania, kde je strihová sila riadená lineárnou rýchlosťou lúča. Tieto zariadenia boli používané naMethods utilizing two streams are also known: impacting a liquid stream on a plate or colliding two opposing streams may be used. The precipitation area provides a micro-mixing zone where the shear force is controlled by the linear beam speed. These devices were used to
-3rozrušovanie mikrobiálnych buniek. Komerčné zariadenia typu MICROFLUIDIZER využívajú interakčné komory, v ktorej sa navzájom zrážajú dva prúdy z trysiek pri lineárnych rýchlostiach až do 200 m/s. Udáva sa, že rozrušovanie v tomto systéme prebieha kavitáciou, strihovými silami v kvapaline a vzájomnými zrážkami. Toto zariadenie však nie je vhodné na použitie u živočíšnych buniek, pretože sa rozrušujú nielen bunky, ale poškodzuje sa aj ich obsah.-3destruction of microbial cells. Commercial MICROFLUIDIZER devices utilize interaction chambers in which two nozzle flows collide with each other at linear speeds up to 200 m / s. It is reported that the disruption in this system is due to cavitation, shear forces in the liquid, and collisions. However, this device is not suitable for use in animal cells as it not only breaks the cells, but also damages their contents.
Je preto treba vyvinúť také zariadenie, ktoré by účinne rozrušovalo živočíšne bunky a pritom zanechalo obsah buniek bez poškodenia.Therefore, there is a need to develop a device that effectively disrupts animal cells while leaving the cell contents intact.
Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION
Vynález sa týka nového spôsobu rozrušovania buniek, ktoré nemajú bunkovú stenu, z kultivačného procesu, ktorý zahrnuje prechod buniek suspendovaných v kvapaline zariadením s prúdmi zrážajúcimi sa za nízkeho tlaku.The present invention relates to a novel method of disrupting cells that do not have a cell wall from a culture process which involves passing cells suspended in a liquid through a device with low-precipitation currents.
Jednou z výhod tohto postupu je to, že produkty vyrábané kultivovanými bunkami je možné uvoľňovať bez ich deštrukcie, vystavením buniek riadenej strihovej sile v kvapaline s nízkym tlakom dodávané zariadením so zrážajúcimi sa prúdmi. Ďalším hľadiskom tohto vynálezu je preto spôsob zberu bunkového produktu obsiahnutého v bunkách, ktoré nemajú bunkovú stenu, zahrnujúci:One advantage of this process is that the products produced by cultured cells can be released without destruction by exposing the cells to a controlled shear force in a low pressure liquid supplied by the coagulating device. Therefore, a further aspect of the invention is a method of collecting a cell product contained in cells that do not have a cell wall, comprising:
a) kultiváciu buniek za takých podmienok a v takom kultivačnom médiu, pri ktorých sa vytvára bunkový produkt;(a) culturing the cells under conditions and in a culture medium which produces a cellular product;
b) suspendovanie buniek v suspendujúcej kvapaline;b) suspending the cells in the suspending liquid;
c) pretlačovanie suspendovaných buniek nízkotlakovým zariadením so zrážajúcimi sa prúdmi tak, že sa bunky rozrušujú pri tlaku od približne 34,5 až 690 kPa a bunkový produkt sa uvoľňuje; ac) extruding the suspended cells by a low-pressure coagulating device such that the cells are disrupted at a pressure of about 34.5 to 690 kPa and the cell product is released; and
d) oddelenie uvoľneného bunkového produktu.d) separating the released cell product.
Spôsob podľa predkladaného vynálezu je možné široko používať na akúkoľvek bunku, ktorá nemá bunkovú stenu, alebo z ktorej bola jej bunková stena odstránená. Aj keď výhodné sú bunky živočíšne, tento spôsob pracuje rovnako dobre s inými bunkami, ako sú protoplasty rastlín alebo húb a bakteriálne sféroplasty. Jedinou požiadavkou je, aby bolo možné bunky kultivovať a je výhodné, ak je možné kultivovať bunky vo veľkom meradle. Príkladmi vhodných živočíšnychThe method of the present invention can be broadly applied to any cell that does not have a cell wall or from which its cell wall has been removed. Although animal cells are preferred, this method works equally well with other cells such as plant or fungal protoplasts and bacterial spheroplasts. The only requirement is that the cells can be cultured and it is preferred that the cells can be cultured on a large scale. Examples of suitable animal
-4buniek sú bunky VERO, CHO a diploidné fibroblastové bunky, ako sú bunky MRC-5. Príkladmi vhodných protoplastov rastlín sú protoplasty Nicotiana, Petunia, Zea, Brassica a medzidruhové hybridy. Tieto bunkové línie môžu byť trvalé alebo nemusia a môžu byť kultivované buď v stacionárnej alebo v suspenznej kultúre. Pre spôsob podľa predkladaného vynálezu nie sú kritické žiadne zo špecifických parametrov kultivácie.-4-cells are VERO, CHO cells and diploid fibroblast cells, such as MRC-5 cells. Examples of suitable plant protoplasts are the protoplasts of Nicotiana, Petunia, Zea, Brassica and interspecific hybrids. These cell lines may be permanent or not and can be cultured in either a stationary or suspension culture. None of the specific culture parameters are critical to the method of the present invention.
Spôsob podľa predkladaného vynálezu môže byť používaný na získanie skutočne akéhokoľvek typu produktu, ktorý sa vyrába pomocou kultivovaných buniek, príkladmi takýchto produktov zahrnujú: v prírode sa vyskytujúce produkty ako proteíny; polysacharidy; rekombinované proteíny vrátane protilátok a enzýmov; a vírusy. Vo výhodnom uskutočnení tohto vynálezu sa používajú ako hostiteľské bunky na produkciu vírusov používaných pri výrobe vakcín živočíšne bunky. Vynález teda zahrnuje spôsob zberu vírusu vo zvieracej bunke, zahrnujúci:The method of the present invention can be used to obtain virtually any type of product that is produced by cultured cells, examples of such products include: naturally occurring products such as proteins; polysaccharides; recombinant proteins including antibodies and enzymes; and viruses. In a preferred embodiment of the invention, animal cells are used as host cells for the production of viruses used in the production of vaccines. Accordingly, the invention includes a method of harvesting a virus in an animal cell, comprising:
a) kultiváciu živočíšnych buniek infikovaných vírusom;(a) culturing virus-infected animal cells;
b) suspendovanie živočíšnych buniek, obsahujúcich vírus v suspendujúcej kvapaline;b) suspending the virus-containing animal cells in the suspending liquid;
c) pretlačovanie suspendovaných živočíšnych buniek zariadením so zrážajúcimi sa prúdmi za zníženého tlaku tak, že sa bunky rozrušia a vírus sa uvoľní; ac) extruding the suspended animal cells through a coagulating device under reduced pressure such that the cells are disrupted and the virus is released; and
d) zber uvoľneného vírusu.(d) harvesting the virus released.
V jednom zvlášť výhodnom uskutočnení sa rozrušujú ľudské diploidné pľúcne bunky MRC-5 infikované vírusom Varicella zoster, najmä vírusom Varicella zoster kmeňa OKA na získanie vírusu použiteľného na výrobu živej vírusovej vakcíny VARIVAX(R).In one particularly preferred embodiment, human diploid MRC-5 lung cells infected with Varicella zoster virus, in particular Varicella zoster virus strain OKA, are disrupted to obtain a virus useful for the production of a live VARIVAX (R) viral vaccine.
Bunky sa kultivujú tak, ako je to pre konkrétne bunky zvyčajné. Po vhodnej dobe kultivácie sa bunky uvoľňujú zo svojho substrátu (pokiaľ sú prichytené) a suspendujú sa v kvapaline. Kvapalina môže byť rovnaká alebo podobná ako kvapalina používaná pri kultivácii buniek alebo môže mať stabilizujúci účinok. Na účely tohto vynálezu nie je zloženie suspendujúcej kvapaliny kritické. Potom sa suspendované bunky spracovávajú prechodom zariadením so zrážajúcimi sa prúdmi, znázorneným na obr. 1. Podľa zobrazenia znázorneného na obr. 1 sa strih v kvapaline s výhodou vytvára vzájomnou zrážkou dvoch proti sebe tryskajúcich prúdov 111 a 101 s riadenou lineárnou rýchlosťou v malej komôrke 120. ZariadenieThe cells are cultured as is customary for particular cells. After a suitable culture time, the cells are released from their substrate (if attached) and suspended in the liquid. The liquid may be the same or similar to the liquid used in cell culture, or it may have a stabilizing effect. For the purposes of the present invention, the composition of the suspending liquid is not critical. Thereafter, the suspended cells are processed by passing through the clotting apparatus shown in FIG. 1. As shown in FIG. 1, the shear in the liquid is preferably formed by colliding two opposing jet streams 111 and 101 with controlled linear velocity in the small chamber 120.
-5sa s výhodou prevádzkuje kontinuálnym spôsobom za rozdelenia vstupného prúdu do dvoch prúdov z trysiek WO, 1W a jedného výstupného prúdu 130 odchádzajúceho z komory. Je žiadúce, aby trysky 111 a 101 boli na získanie maximálneho strihu v kvapaline umiestnené v tesnej vzájomnej blízkosti, t.j. vo vzdialenosti menšej ako 25,4 mm a výhodnejšie vo vzájomnej vzdialenosti približne 3,175 až 9,525 mm. Kritickým faktorom tohto spôsobu je skutočnosť, že zariadenie je prevádzkované pri nízkom tlaku v nekavitačnom móde, s výhodou menšom ako približne 1,03 MPa a výhodnejšie menšom ako približne 689 kPa. Menší pracovný tlak poskytuje mierne rozrušenie pri veľmi nízkom tlaku, od približne 34,5 do približne 689 kPa. To je jeden z rysov, ktoré rozlišujú opisovaný spôsob od spôsobov podľa stavu techniky. Napríklad komerčne dostupné zariadenie so zrážajúcimi sa prúdmi na rozrušovanie buniek predávané pod obchodným názvom MICROFLUIDIZER(R) firmou Microfluidics International Corp., Newton, MA, udáva rozrušovanie živočíšnych buniek pri tlaku 13,8 MPa. pri takomto vysokom tlaku pravdepodobne dochádza ku kavitácii a jej škodlivým účinkom.Preferably, it operates in a continuous manner by dividing the inlet stream into two streams from the nozzles WO, 1W and one outlet stream 130 exiting the chamber. Desirably, the nozzles 111 and 101 are positioned in close proximity to each other to provide maximum shear in the liquid, i.e., at a distance of less than 25.4 mm, and more preferably at a distance of about 3.175 to 9.525 mm. A critical factor of this method is the fact that the device is operated at low pressure in a non-citation mode, preferably less than about 1.03 MPa and more preferably less than about 689 kPa. The lower working pressure provides a slight disturbance at very low pressure, from about 34.5 to about 689 kPa. This is one feature that distinguishes the method described from the prior art methods. For example, a commercially available precipitating cell disruption device sold under the trade name MICROFLUIDIZER (R) by Microfluidics International Corp., Newton, MA, reports disintegration of animal cells at a pressure of 13.8 MPa. at such high pressure, cavitation and its deleterious effects are likely to occur.
Lineárna rýchlosť prúdu v mieste zrážky je tiež kritickým aspektom vynálezu, pretože určuje rozrušujúci silu. pri tomto spôsobe je výhodné, ak je lineárna rýchlosť prúdu približne 5 až 50 m/s a s výhodou 10 až 30 m/s.The linear velocity of the current at the collision point is also a critical aspect of the invention since it determines the disruptive force. in this method it is preferred that the linear flow velocity is about 5 to 50 m / s and preferably 10 to 30 m / s.
Spôsob podľa tohto vynálezu bol konkrétne navrhnutý na rozrušovanie buniek bez bunkových stien, kedy je riadeným spôsobom privádzaná nižšia energia. Pre vysokotlakové zariadenia ako je homogenizátor alebo MICROFLUIDIZER(R), ktoré sú navrhnuté na poskytovanie tlaku 103 MPa, prípadne 276 MPa je ťažké poskytovať presné riadenie nízkych tlakov, ktoré sú značne nižšie ako tlaky, pre ktoré je toto zariadenie navrhnuté, zatiaľ čo spôsob podľa tohto vynálezu s výhodou používa zariadenie, ktoré pracuje optimálne pri nízkom tlaku.In particular, the method of the invention has been designed to disrupt cells without cell walls, wherein less energy is delivered in a controlled manner. For high pressure equipment such as a homogenizer or MICROFLUIDIZER (R) , which are designed to provide a pressure of 103 MPa or 276 MPa, it is difficult to provide accurate low pressure control that is considerably lower than the pressures for which this device is designed, The present invention preferably uses a device that operates optimally at low pressure.
Spôsob so zrážajúcimi sa prúdmi podľa tohto vynálezu poskytuje podľa pozorovania zodpovedajúce rozrušenie buniek na dosiahnutie vysokých výťažkov filtrácie s malou stratou infekčného titra. V predbežných pokusoch poskytlo zariadenie so zrážajúcimi sa prúdmi oproti metóde zmrazovanie/topenie lepšie výsledky.The precipitating current method of the present invention provides, as observed, adequate cell disruption to achieve high filtration yields with low loss of infectious titer. In preliminary experiments, the colliding current device gave better results over the freezing / melting method.
Spôsob podľa predkladaného vynálezu má proti súčasným metódam rozrušovanie buniek rad výhod. Za prvé je zariadenie jednoduché a nevyžadujeThe method of the present invention has a number of advantages over current cell disruption methods. First, the device is simple and does not require
-6piestové pumpy ani chladiace zariadenie, čo predchádza problémom spojeným s týmito typmi zariadení. Systém pracujúci pri nízkom tlaku má ďalšiu výhodu v tom, že je možné na pretlačovanie kvapaliny použiť čerpadlo pracujúce pri nízkom tlaku (krídlového alebo membránového) alebo nádobu pre relatívne nízky tlak.-6-piston pumps or cooling equipment, which avoids problems associated with these types of equipment. A low pressure system has the additional advantage that a low pressure pump (vane or diaphragm) or a relatively low pressure vessel can be used to transfer fluid.
V dôsledku nízkeho pracovného tlaku zariadenia dochádza pri rozrušovaní buniek k tvorbe len malého množstva tepla (vzrast teploty < 0,1 °C). Zariadenie má pomerne malú veľkosť, takže je možné ho zaradiť do štandardného potrubia spájajúceho pri výrobe dve nádoby. Zariadenie so zrážajúcimi sa prúdmi rozrušuje bunky strihom v kvapaline vytváraným mikromiešaním v dobre definovanej zóne zrážania. Za použitých podmienok rozrušovania nedochádza ku kavitácii. Nevznikajú heterogénne zóny poškodenia vysokým strihovým napätím zvyčajné pre rozrušovanie mechanizmami založené na kavitáciiDue to the low operating pressure of the device, only a small amount of heat is generated when the cells are disrupted (temperature rise <0.1 ° C). The device is relatively small in size, so it can be integrated into a standard pipeline connecting two vessels during production. The coagulating device disrupts the cells by shearing in the liquid produced by micromixing in a well defined coagulation zone. There is no cavitation under the disintegration conditions used. Heterogeneous zones of high shear stress damage do not arise, usually due to cavitation-based disruption
Zariadenie so zrážajúcimi sa prúdmi je možné prispôsobiť väčšiemu meradlu. Objemová rýchlosť spracovania pri danej lineárnej rýchlosti môže byť zvýšená zvýšením priemeru trysky.A colliding current device can be adapted to a larger scale. The bulk processing rate at a given linear rate can be increased by increasing the nozzle diameter.
Zariadenie poskytuje riadené rozrušovanie založené na strihu v kvapaline vhodné na získanie vysokého podielu labilných biomolekúl alebo vírusov.The apparatus provides shear-based shear-based disruption suitable for obtaining a high proportion of labile biomolecules or viruses.
Zariadenie je navrhnuté tak, aby malo ľahkú údržbu a používa komerčne dostupné technológie trysiek pre reprodukovateľnú výrobu a môže byť priamo zaradené do štandardného spracovania zariadenia. Naviac je možné zariadenie sterilizovať v mieste použitia.The equipment is designed to be easy to maintain and uses commercially available nozzle technologies for reproducible production and can be directly incorporated into standard equipment processing. In addition, the device can be sterilized at the point of use.
Nepoužíva sa práca s vysokými tlakmi väčšími ako 1,38 MPa a tým nedochádza k javom spojeným s vysokými tlakmi.Work with high pressures greater than 1.38 MPa is not used and thus no high pressure phenomena occur.
Vo výhodnom uskutočnení môže byť spôsob rozrušovania buniek zrážajúcimi sa prúdmi podľa predkladaného vynálezu použitý na získavanie vírusu Varicella zoster s vysokým výťažkom, alebo iných vírusov alebo intracelulárnych proteínov zo živočíšnych buniek. Po rozrušení sa úlomky buniek oddelia od častíc vírusu vyčerujúcim filtrom a získaný vírusový preparát sa zmrazí až do ďalšieho spracovania na vakcínu.In a preferred embodiment, the cell clotting method of the present invention can be used to obtain high yield Varicella zoster virus, or other viruses or intracellular proteins from animal cells. After disruption, the cell debris is separated from the virus particles by a clarifying filter and the virus preparation obtained is frozen until further processing into a vaccine.
-7Prehľad obrázkov na výkresoch-7Overview of figures in drawings
Obr. 1 znázorňuje zariadenie so zrážajúcimi sa prúdmi, použiteľné pri spôsobe podľa predkladaného vynálezu.Fig. 1 illustrates a colliding current device useful in the method of the present invention.
Príklady uskutočnenia vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Príklad 1Example 1
Otáčavé fľaše, obsahujúce prichytené bunky MRC-5 infikované vírusom varicely sa opláchnu, pridá sa do nich vždy 40 ml buď 1,0 x alebo 1,5 x stabilizátora PGSE a bunky sa zoberú z otáčavých fliaš mechanickým zoškrabaním vrstvy buniek za použitia ramena robota. Bunková kaša sa z otáčavej fľaše odtiahne, zhromaždí sa v nádobe a zmrazí pri -60 °C. Pred spracovaním sa zariadenie so zrážajúcimi sa prúdmi kalibruje na stanovenie tlaku nutného na poskytnutie požadovanej lineárnej rýchlosti a potom sa sterilizuje. Nádoby obsahujúce zmrazený zobratý materiál sa ponechajú roztopiť, spoja sa a umiestnia do tlakovej nádoby pripojenej k zariadeniu so zrážajúcimi sa prúdmi. Obsah tlakovej nádoby sa natlakuje na získanie lineárnej rýchlosti v prúdoch 22,5 m/s (1,0 x PGSE) alebo 25,0 m/s (1,5 x PGSE). Materiál, ktorý prešiel zariadením sa preloží do tlakovej nádoby na uskutočnenie druhého prechodu.The spinning flasks containing the attached varicella virus-infected MRC-5 cells are rinsed, 40 ml of either 1.0x or 1.5x PGSE stabilizer is added thereto, and the cells are harvested from the spinning flasks by mechanically scraping the cell layer using a robot arm. The cell slurry was withdrawn from the spinner bottle, collected in a flask, and frozen at -60 ° C. Prior to processing, the precipitating current apparatus is calibrated to determine the pressure necessary to provide the desired linear velocity and then sterilized. The containers containing the frozen recovered material are allowed to melt, join, and placed in a pressure vessel connected to the precipitating device. The contents of the pressure vessel are pressurized to obtain a linear velocity in streams of 22.5 m / s (1.0 x PGSE) or 25.0 m / s (1.5 x PGSE). The material that has passed through the device is transferred to a pressure vessel to effect a second pass.
Príklad 2Example 2
Alternatívne je možné použiť dve zariadenia podľa vynálezu v sérii. Rozrušené bunky sa potom vyčeria filtráciou polypropylénovými hĺbkovými filtrami. Infekčná schopnosť sa testuje testom pomocou plakov. Uskutoční sa taktiež analýza veľkosti častíc pomocou analyzátora častíc Elzone.Alternatively, two devices according to the invention may be used in series. The disrupted cells are then clarified by filtration with polypropylene depth filters. The infectious ability is tested by plaque assay. A particle size analysis using an Elzone particle analyzer is also performed.
Claims (9)
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US506295P | 1995-10-06 | 1995-10-06 | |
| GBGB9603759.3A GB9603759D0 (en) | 1996-02-22 | 1996-02-22 | Method of disrupting cultured cells using an impinging jet device |
| PCT/US1996/015801 WO1997012959A1 (en) | 1995-10-06 | 1996-10-02 | Method of disrupting cultured cells using an impinging jet device |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK43498A3 true SK43498A3 (en) | 1998-12-02 |
Family
ID=26308786
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK434-98A SK43498A3 (en) | 1995-10-06 | 1996-10-02 | Method of disrupting cultured cells using an impinging jet device |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0854913A1 (en) |
| CN (1) | CN1100868C (en) |
| AR (1) | AR003776A1 (en) |
| AU (1) | AU7204496A (en) |
| BR (1) | BR9610773A (en) |
| CZ (1) | CZ104198A3 (en) |
| EA (1) | EA000703B1 (en) |
| SK (1) | SK43498A3 (en) |
| TW (1) | TW426733B (en) |
| WO (1) | WO1997012959A1 (en) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19749735C1 (en) * | 1997-11-11 | 2000-02-10 | Invent Gmbh Entwicklung Neuer Technologien | Method and device for producing enzymes |
| CA2467099C (en) | 2001-12-20 | 2013-01-29 | Bavarian Nordic A/S | Method for the recovery and purification of poxviruses from infected cells |
| DE102005034629B4 (en) * | 2005-07-19 | 2007-09-13 | Dr. Hielscher Gmbh | Device and method for the mechanical disruption of cells |
| WO2008019964A1 (en) * | 2006-08-15 | 2008-02-21 | Basf Se | Method for isolating proteins from production cells |
| CN103282509A (en) * | 2010-12-28 | 2013-09-04 | 中外制药株式会社 | Animal cell culturing method |
| CN104861038B (en) * | 2015-05-08 | 2019-10-01 | 永联生物科技(上海)有限公司 | A kind of homogeneous valve group |
| BR102018004973B1 (en) * | 2018-03-13 | 2021-10-13 | Petróleo Brasileiro S.A. - Petrobras | DEVICE AND METHOD FOR RUPTING MICROORGANISMS CELLS BY EXTRUSION |
| EP4296352A1 (en) | 2022-06-20 | 2023-12-27 | LenioBio GmbH | Tunable disruption of eukaryotic protoplast to release intact cellular organelles |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR346862A (en) * | 1904-10-07 | 1905-02-13 | Henri Charles Empis | Extraction and preparation of substances contained in organic cells |
| GB877898A (en) * | 1956-12-06 | 1961-09-20 | Apv Co Ltd | A new or improved method of liberating enzymes |
| US3309032A (en) * | 1964-03-23 | 1967-03-14 | Sorvall Inc Ivan | Cell fractionator apparatus |
| DE3810462A1 (en) * | 1988-03-26 | 1989-10-05 | Dechema | METHOD FOR UNLOCKING CELLS IN A CELL SUSPENSION AND DEVICE FOR IMPLEMENTING THE METHOD |
-
1996
- 1996-10-01 TW TW085111939A patent/TW426733B/en not_active IP Right Cessation
- 1996-10-02 CN CN96198826A patent/CN1100868C/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-10-02 EA EA199800266A patent/EA000703B1/en not_active IP Right Cessation
- 1996-10-02 AR ARP960104582A patent/AR003776A1/en unknown
- 1996-10-02 BR BR9610773A patent/BR9610773A/en not_active Application Discontinuation
- 1996-10-02 EP EP96933226A patent/EP0854913A1/en not_active Withdrawn
- 1996-10-02 WO PCT/US1996/015801 patent/WO1997012959A1/en not_active Application Discontinuation
- 1996-10-02 AU AU72044/96A patent/AU7204496A/en not_active Abandoned
- 1996-10-02 SK SK434-98A patent/SK43498A3/en unknown
- 1996-10-02 CZ CZ981041A patent/CZ104198A3/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| TW426733B (en) | 2001-03-21 |
| AU7204496A (en) | 1997-04-28 |
| WO1997012959A1 (en) | 1997-04-10 |
| EP0854913A1 (en) | 1998-07-29 |
| BR9610773A (en) | 1999-07-13 |
| CZ104198A3 (en) | 1998-08-12 |
| CN1203626A (en) | 1998-12-30 |
| AR003776A1 (en) | 1998-09-09 |
| EA199800266A1 (en) | 1998-10-29 |
| CN1100868C (en) | 2003-02-05 |
| EA000703B1 (en) | 2000-02-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102015933B1 (en) | Systems and methods of virus propagation in cell culture for vaccine manufacture | |
| Wu | Mechanisms of animal cell damage associated with gas bubbles and cell protection by medium additives | |
| Grösch et al. | Ultrasonic separation of suspended particles-Part III: Application in biotechnology | |
| Hultström et al. | Proliferation and viability of adherent cells manipulated by standing-wave ultrasound in a microfluidic chip | |
| US5721120A (en) | Method of disrupting cultured cells using an impinging jet device | |
| Shirgaonkar et al. | Acoustic cell filter: a proven cell retention technology for perfusion of animal cell cultures | |
| SK43498A3 (en) | Method of disrupting cultured cells using an impinging jet device | |
| US6168944B1 (en) | Methods for cultivating cells and propagating viruses | |
| US6146891A (en) | Methods for cultivating cells and propagating viruses | |
| KR101157174B1 (en) | Method and apparatus for rapidly lysing cells or virus | |
| CA2278808C (en) | Methods for cultivating cells and propagating viruses | |
| US6878545B2 (en) | Method for separating viable cells from cell suspensions | |
| JP2012525830A (en) | Method for producing virus from cell culture including homogenization | |
| Göbel et al. | Upstream processing for viral vaccines-Process intensification | |
| Lothert et al. | Upstream and downstream processes for viral Nanoplexes as vaccines | |
| EP2997125B1 (en) | Method and device for cell lysis or poration | |
| EP2966093A1 (en) | Process for the preparation of magnetic sulfated cellulose particles, magnetic sulfated cellulose particles and their use | |
| US20240368525A1 (en) | Cell dissociation device and method | |
| Göbel et al. | 6 Upstream processing for | |
| WO2012114063A1 (en) | Cell lysis process | |
| US20230044572A1 (en) | Plug flow tubular bioreactor, system containing the same and method for production of virus | |
| US20040191899A1 (en) | Method for disrupting cells that lack a cell wall | |
| CA2595915A1 (en) | Methods for cultivating cells and propagating viruses | |
| MXPA99007121A (en) | Methods for cultivating cells and propagating viruses |