EA000703B1 - Method of disrupting cultured cells using an impinging jet device - Google Patents
Method of disrupting cultured cells using an impinging jet device Download PDFInfo
- Publication number
- EA000703B1 EA000703B1 EA199800266A EA199800266A EA000703B1 EA 000703 B1 EA000703 B1 EA 000703B1 EA 199800266 A EA199800266 A EA 199800266A EA 199800266 A EA199800266 A EA 199800266A EA 000703 B1 EA000703 B1 EA 000703B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- cells
- virus
- animal
- cell
- pressure
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
- C12M47/06—Hydrolysis; Cell lysis; Extraction of intracellular or cell wall material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/06—Lysis of microorganisms
- C12N1/066—Lysis of microorganisms by physical methods
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
- C12N2710/16751—Methods of production or purification of viral material
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Mycology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Настоящее изобретение относится к способу дезинтеграции культивированных клеток путем использования противоположно направленных струйных потоков при низком давлении, создающих деструктивный сдвиг в жидкости, который является достаточно мощным для разрушения клеток, но недостаточно мощным для повреждения содержимого клеток.The present invention relates to a method for disintegrating cultured cells by using oppositely directed low-pressure jet streams to create a destructive shift in a fluid that is powerful enough to destroy cells, but not powerful enough to damage cell contents.
Предпосылки создания изобретенияBACKGROUND OF THE INVENTION
Многие способы биотехнологии и ферментации требуют большого количества клеток для культивирования в биологических реакторах с последующим их разрушением в целях высвобождения нужных продуктов. Дезинтеграция клеток может быть осуществлена механическими, химическими, биологическими или физическими способами. Многие специалисты предпочитают механические способы дезинтеграции, поскольку они не требуют использования дополнительных реагентов (детергентов, ферментов или агентов осмомолярности) и позволяют избежать необходимой адаптации физических способов, таких как замораживание/оттаивание, для крупномасштабного производства.Many methods of biotechnology and fermentation require a large number of cells for cultivation in biological reactors with their subsequent destruction in order to release the desired products. Cell disintegration can be accomplished by mechanical, chemical, biological or physical methods. Many experts prefer mechanical disintegration methods, since they do not require the use of additional reagents (detergents, enzymes or osmolarity agents) and avoid the necessary adaptation of physical methods, such as freezing / thawing, for large-scale production.
Для дезинтеграции микроорганизмов был разработан ряд механических методов. Эти методы основаны, главным образом, на сдвиговом усилии, создаваемом в жидкости, и/или компрессии в целях разрушения клеточной стенки и мембраны. Однако не во всех способах биотехнологии и ферментации используются микроорганизмы. Все более распространенным объектом для выбора клеток-хозяев становятся клетки животных. Поскольку клетки животных являются более крупными и имеют хрупкую мембрану, то для разрушения этих клеток требуются меньшие затраты энергии. Многие системы, производимые промышленностью и предназначенные для микробиологических систем, не пригодны для применения к клеткам животных.A number of mechanical methods have been developed for the disintegration of microorganisms. These methods are based mainly on shear in the fluid and / or compression to destroy the cell wall and membrane. However, not all biotechnology and fermentation methods use microorganisms. Animal cells are becoming an increasingly common target for selecting host cells. Since animal cells are larger and have a fragile membrane, less energy is required to destroy these cells. Many systems manufactured by industry and designed for microbiological systems are not suitable for use on animal cells.
Для дезинтеграции клеток животных могут быть использованы роторные/статорные устройства, имеющие цилиндрический ротор, концентрически вращающийся с высокой скоростью внутри статора. В этом устройстве создается крутой градиент скорости в кольцевой зоне, в результате чего генерируется сдвиговое напряжение, достаточное для разрушения клеток. Аналогичное устройство, называемое прессом Чайкова (Chaikoff), имеет цилиндр и поршень немного меньшего диаметра. Движение поршня создает высокое сдвиговое усилие в жидкости внутри кольцевого пространства, что приводит к разрушению клетки. Устройство такого типа также называют даунсером (от названия гомогенизатора Даунса), и используют для дезинтеграции диплоидных клеток легких MRC-5, инфицированных вирусом ветряной оспы (Varicella). Однако эти методы применяются лишь для лабораторных исследований и не пригодны для крупномасштабного производства.Rotary / stator devices having a cylindrical rotor concentrically rotating at high speed inside the stator can be used to disintegrate animal cells. In this device, a steep gradient of velocity is created in the annular zone, as a result of which a shear stress sufficient to destroy the cells is generated. A similar device, called the Chaikoff press, has a cylinder and a piston of slightly smaller diameter. The movement of the piston creates a high shear force in the fluid inside the annular space, which leads to the destruction of the cell. A device of this type is also called a downer (from the name of the Downs homogenizer), and is used to disintegrate diploid lung cells of MRC-5 infected with chickenpox virus (Varicella). However, these methods are used only for laboratory research and are not suitable for large-scale production.
Ультразвуковая обработка клеток приводит к их разрушению путем создания в жидкости областей высокого сдвигового напряжения благодаря процессу кавитации. Колебательные акустические волны (~20 кГц) создают перепад давления в жидкости. Пузырьки пара, образованные в области низкого давления, лопаются после их попадания в область высокого давления, создавая тем самым ударные волны высокой энергии. Поскольку ударные волны распространяются радиально от первоначальной зоны кавитации, то в результате этого генерируется высокое сдвиговое напряжение, а также продуцируется тепло вследствие диссипации энергии в жидкости.Ultrasonic treatment of cells leads to their destruction by creating regions of high shear stress in the fluid due to the cavitation process. Oscillating acoustic waves (~ 20 kHz) create a pressure drop in the liquid. Steam bubbles formed in the low-pressure region burst after they enter the high-pressure region, thereby creating high-energy shock waves. Since shock waves propagate radially from the initial cavitation zone, a high shear stress is generated as a result of this, and heat is also produced due to energy dissipation in the liquid.
Для дезинтеграции диплоидных клеток MRC-5, инфицированных вирусом ветряной оспы, было использовано устройство для ультразвуковой обработки непрерывного действия. Область, находящаяся в непосредственной близости от источника ударной волны, является достаточно энергетичной для разрушения инфекционности вируса ветряной оспы. Поэтому, уровень снижения инфекционности вируса зависит от числа сайтов нуклеации, генерированных на единицу объема жидкости, которое соответствует количеству энергии, поступающей в жидкость. Однако процесс непрерывной ультразвуковой обработки также приводит к повышению температуры в жидкости на 5-10°С, что увеличивает степень деградации вируса. Энергетические затраты на ультразвуковую обработку могут быть снижены с повышением титров после обработки; однако меньшая степень дезинтеграции приводит к большим потерям при пропускании через осветляющие фильтры. Потери инфекционных титров, обусловленные ультразвуковой обработкой, и степень дезинтеграции клеток, необходимая для получения высоких титров после осветления, могут быть оптимизированы.For the disintegration of diploid cells of MRC-5 infected with chickenpox virus, a device for continuous ultrasonic treatment was used. The area in the immediate vicinity of the source of the shock wave is sufficiently energetic to destroy the infectiousness of chickenpox virus. Therefore, the level of reduction in the infectivity of the virus depends on the number of nucleation sites generated per unit volume of fluid, which corresponds to the amount of energy entering the fluid. However, the process of continuous ultrasonic treatment also leads to an increase in temperature in the liquid by 5-10 ° C, which increases the degree of degradation of the virus. The energy cost of ultrasonic treatment can be reduced with increasing titers after processing; however, a lower degree of disintegration leads to greater losses when passing through clarifying filters. Loss of infectious titers due to ultrasound treatment and the degree of cell disintegration required to obtain high titers after clarification can be optimized.
В другом известном способе, для максимизации высвобождения ротавируса из культуры была использована методика замораживания/оттаивания. Этот метод имеет определенные достоинства, однако, он мало применим в промышленном производстве.In another known method, a freeze / thaw technique was used to maximize the release of rotavirus from the culture. This method has certain advantages, however, it is of little use in industrial production.
Известны две методики, основанные на использовании сталкивающихся струй, а именно, столкновение струи жидкости с плоскостью, и столкновение с противоположно направленной струёй. Область столкновения продуцирует образование зоны микросмешивания, где сдвиговое усилие регулируется линейной скоростью струи. Эти устройства были использованы для дезинтеграции микробных клеток. В выпускаемом промышленностью устройстве, микрофлюидизаторе (MICROFLUIDIZER), используется камера взаимодействия, где два струйных потока сталкиваются друг с другом при линей3 ных скоростях, достигающих 200+ м/с. Отмечается, что механизм такой дезинтеграции основан на кавитации, сдвиговом напряжении в жидкости и соударении. Однако это устройство не пригодно для дезинтеграции клеток животных, поскольку оно разрушает не только клетки, но также и их содержимое.Two techniques are known based on the use of colliding jets, namely, a collision of a liquid jet with a plane, and a collision with an oppositely directed jet. The collision region produces a micro-mixing zone, where the shear force is controlled by the linear velocity of the jet. These devices were used to disintegrate microbial cells. A commercially available device, the microfluidizer (MICROFLUIDIZER), uses an interaction chamber where two jet streams collide with each other at linear speeds reaching 200+ m / s. It is noted that the mechanism of such disintegration is based on cavitation, shear stress in a liquid, and collision. However, this device is not suitable for the disintegration of animal cells, since it destroys not only the cells, but also their contents.
Поэтому было бы желательно разработать такое устройство, которое позволяло бы эффективно дезинтегрировать клетки животных, не повреждая при этом их содержимое.Therefore, it would be desirable to develop such a device that would effectively disintegrate animal cells without damaging their contents.
Подробное описание изобретенияDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Настоящее изобретение относится к новому способу дезинтеграции культивированных клеток, в которых отсутствует клеточная стенка, предусматривающему пропускание клеток, суспендированных в соответствующей жидкости для суспендирования, через устройство со сталкивающимися струями при низком давлении.The present invention relates to a new method for the disintegration of cultured cells in which there is no cell wall, providing for the passage of cells suspended in an appropriate liquid for suspension through a device with colliding jets at low pressure.
Одно из преимуществ этого способа заключается в том, что продукты, продуцируемые культивированными клетками, могут быть высвобождены из этих клеток без какой-либо их деструкции путем воздействия на эти клетки сдвиговым усилием, регулируемым жидкостью, подаваемой под низким давлением с помощью вышеуказанного устройства. Поэтому, в другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу сбора клеточного продукта, содержащегося внутри клеток, не имеющих клеточной стенки, где указанный способ предусматривает:One of the advantages of this method is that the products produced by cultured cells can be released from these cells without any degradation by subjecting these cells to a shear force controlled by a liquid supplied under low pressure using the above device. Therefore, in another aspect, the present invention relates to a method for collecting a cell product contained within cells that do not have a cell wall, wherein said method comprises:
a) культивирование клеток в условиях роста в культуральной среде до тех пор, пока не будет продуцирован клеточный продукт;a) culturing cells under growth conditions in a culture medium until a cell product is produced;
b) суспендирование клеток в жидкости для суспендирования;b) suspending cells in a suspension fluid;
c) пропускание суспендированных клеток через устройство со сталкивающимися струями низкого давления так, чтобы дезинтеграция клеток происходила под давлением от около 5 до 100 фунт/кв. дюйм (34, 470-689,4 кПа) с последующим высвобождением клеточного продукта; иc) passing suspended cells through a device with colliding low-pressure jets so that cell disintegration occurs at a pressure of about 5 to 100 psi. inch (34, 470-689.4 kPa) followed by release of the cell product; and
d) выделение высвобожденного клеточного продукта.d) isolation of the released cellular product.
Способ настоящего изобретения может быть широко применен к любым клеткам, у которых отсутствует клеточная стенка, или у которых была удалена клеточная стенка. Хотя клетки животных являются предпочтительными, однако, этот способ может быть также с успехом применен и в отношении других клеток, таких, как протопласты растений или грибов и сферопласты бактерий. При этом требуется лишь одно условие, а именно, чтобы эти клетки были способны к культивированию, и чтобы эти клетки были предпочтительно пригодными для крупномасштабного культивирования. Примерами подходящих клеток животных являются клетки VERO, клетки СНО, и диплоидные фибробласты, такие как клетки MRC-5. Примерами подходящих растительных протопластов являются Nicotiana, Petunia, Zea, Brassica, и межвидовые гибриды. Клеточные линии могут быть иммортализованы или не иммортализованы, и кроме того, они могут быть культивированы либо в стационарной культуре, либо в суспензионной культуре. Ни один из этих параметров культивирования не имеет решающего значения для способа настоящего изобретения.The method of the present invention can be widely applied to any cells that lack a cell wall or that have had a cell wall removed. Although animal cells are preferred, however, this method can also be successfully applied to other cells, such as plant or fungus protoplasts and bacterial spheroplasts. This requires only one condition, namely, that these cells are capable of cultivation, and that these cells are preferably suitable for large-scale cultivation. Examples of suitable animal cells are VERO cells, CHO cells, and diploid fibroblasts, such as MRC-5 cells. Examples of suitable plant protoplasts are Nicotiana, Petunia, Zea, Brassica, and interspecific hybrids. Cell lines can be immortalized or not immortalized, and in addition, they can be cultured either in a stationary culture or in suspension culture. None of these culture parameters are critical to the method of the present invention.
Способ настоящего изобретения может быть использован для выделения фактически любого типа продукта, продуцируемого с использованием культивированных клеток. Примерами таких продуктов являются натуральные продукты, такие как белки; полисахариды; рекомбинантные белки, включая антитела и ферменты; и вирусы. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, в качестве клеток-хозяев для продуцирования вирусов, применяемых в промышленности для изготовления вакцин, используются клетки животных. Таким образом, настоящее изобретение относится к способу сбора вируса, культивированного в клетках животных, где указанный способ предусматривает;The method of the present invention can be used to isolate virtually any type of product produced using cultured cells. Examples of such products are natural products such as proteins; polysaccharides; recombinant proteins, including antibodies and enzymes; and viruses. In a preferred embodiment of the present invention, animal cells are used as host cells for the production of viruses used in the vaccine manufacturing industry. Thus, the present invention relates to a method for collecting a virus cultured in animal cells, wherein said method comprises;
a) культивирование клеток животных, инфицированных вирусом;a) culturing the cells of animals infected with the virus;
b) суспендирование вируссодержащих клеток животных в жидкости для суспендирования;b) suspending virus-containing animal cells in a suspension liquid;
c) пропускание суспендированных клеток животных через устройство со сталкивающимися струями для дезинтеграции клеток и высвобождения вируса; иc) passing suspended animal cells through a colliding jets to disintegrate cells and release the virus; and
d) сбор высвобожденного вируса.d) collection of released virus.
В одном особенно предпочтительном варианте настоящего изобретения, диплоидные клетки легких человека MRC-5, инфицированные вирусом ветряной оспы - опоясывающего лишая (Varicella Zoster), а особенно штаммом ОКА вируса ветряной оспы - опоясывающего лишая, дезинтегрируют для сбора вируса в целях получения живой вирусной вакцины, VARIVAX®.In one particularly preferred embodiment of the present invention, diploid human lung cells MRC-5 infected with varicella zoster virus (Varicella zoster), and especially the strain OKA virus varicella zoster virus, are disintegrated to collect the virus in order to obtain a live virus vaccine, VARIVAX®.
Краткое описание чертежаBrief Description of the Drawing
Фиг. 1. - cхематическое изображение устройства с применением сталкивающихся струй, которое может быть использовано в способе настоящего изобретения.FIG. 1. is a schematic illustration of a device using colliding jets, which can be used in the method of the present invention.
Клетки культивируют как это обычно принято для конкретного типа клеток. После соответствующего периода культивирования клетки отделяют от субстрата (в случае, если они заякорены на субстрате) и суспендируют в жидкости. Такой жидкостью может быть та же самая жидкость, которая была использована для культивирования клеток, или аналогичная ей жидкость, либо такой жидкостью может быть стабилизатор. В соответствии с настоящим изобретением, состав жидкости для суспендирования не имеет решающего значения. Затем, суспендированные клетки пропускают через устройство с применением сталкивающихся струй, такое, как показано на фиг.1. В соответствии с этим чертежом, сдвиг в жидкости предпочтительно генерируется посредством столкновения в небольшой камере 120 двух противоположно направленных струйных потоков 111 и 101 с регулируемой линейной скоростью. Это устройство предпочтительно работает в непрерывном режиме, где входящий поток разделяется на две струи 100 и 110, а выходящий поток 130 сливается в камеру. При этом для максимизации сдвигового напряжения в жидкости, предпочтительно, чтобы сопла 111 и 1 01 находились в непосредственной близости друг от друга, то есть, на расстоянии менее, чем один дюйм (25,4 мм), а более предпочтительно, на расстоянии приблизительно 1/8 - 3/8 дюйма (3,175 - 9,25 мм).Cells are cultured as is customary for a particular type of cell. After an appropriate cultivation period, the cells are separated from the substrate (if they are anchored on the substrate) and suspended in a liquid. Such a liquid may be the same liquid that was used to cultivate the cells, or a similar liquid, or such a liquid may be a stabilizer. In accordance with the present invention, the composition of the suspension liquid is not critical. Then, the suspended cells are passed through a device using colliding jets, such as shown in FIG. According to this drawing, shear in a liquid is preferably generated by a collision in a small chamber 120 of two oppositely directed jet streams 111 and 101 with an adjustable linear velocity. This device preferably operates in a continuous mode where the inlet stream is divided into two jets 100 and 110, and the outlet stream 130 is discharged into the chamber. Moreover, to maximize shear stress in the liquid, it is preferable that the nozzles 111 and 1 01 are in close proximity to each other, that is, at a distance of less than one inch (25.4 mm), and more preferably at a distance of approximately 1 / 8 - 3/8 inch (3.175 - 9.25 mm).
Решающим фактором в данном аспекте осуществления способа настоящего изобретения, является то, что это устройство работает при низком давлении, в режиме отсутствия кавитации, предпочтительно при давлении менее чем около 150 фунт/кв.дюйм (1034,1 кПа), а более предпочтительно менее чем 1 00 фунт/кв. дюйм (689,4 кПа). Работа данного устройства при низком давлении приводит к мягкой дезинтеграции клеток, при этом, предпочтительно, чтобы дезинтеграция клеток происходила при очень низком давлении, составляющим от около 5 до 100 фунт/кв. дюйм (34,470-689,4 кПа). Такое низкое давление является одним из основных особенностей способа настоящего изобретения, отличающих его от предшествующих известных способов. Так, например, коммерчески доступный дезинтегратор, продающийся под торговым знаком MICROFLUIDIZER® фирмой Microfluidics International Corp., Newton, MA, и используемый для дезинтеграции клеток животных, работает при давлении 2000 фунт/кв.дюйм (13788 кПа). При таком высоком давлении, очевидно, происходит кавитация, которая приводит к нежелательному повреждающему воздействию на клетки.The decisive factor in this aspect of the method of the present invention is that this device operates at low pressure, in the absence of cavitation mode, preferably at a pressure of less than about 150 psi (1034.1 kPa), and more preferably less than 1 00 psi inch (689.4 kPa). The operation of this device at low pressure leads to mild cell disintegration, while it is preferable that the cell disintegration occurs at a very low pressure of from about 5 to 100 psi. inch (34.470-689.4 kPa). Such a low pressure is one of the main features of the method of the present invention, distinguishing it from previous known methods. For example, a commercially available disintegrator sold under the trademark MICROFLUIDIZER® by Microfluidics International Corp., Newton, MA, and used to disintegrate animal cells, operates at a pressure of 2000 psi (13788 kPa). At such a high pressure, cavitation obviously occurs, which leads to an undesirable damaging effect on the cells.
Линейная скорость струи в точке столкновения также является критическим фактором в способе настоящего изобретения, поскольку этот параметр определяет деструктивную силу. Для данного метода, предпочтительная линейная скорость струи составляет приблизительно 5-50 м/с, а предпочтительно 10-30 м/с.The linear velocity of the jet at the collision point is also a critical factor in the method of the present invention, since this parameter determines the destructive force. For this method, a preferred linear jet velocity is about 5-50 m / s, and preferably 10-30 m / s.
Способ настоящего изобретения предназначен специально для дезинтеграции клеток, у которых отсутствует клеточная стенка, причем, в этом способе, более низкие затраты энергии обеспечиваются путем регуляции. Действительно, при таком высоком давлении, на котором работает гомогенизатор или микрофлюидизатор MICROFLUIDIZER®, а именно при давлении 15000 и 40000 фунт/кв.дюйм (103410 и 275760 кПа), соответственно, было бы трудно обеспечить точный контроль при низких давлениях, которые были бы значительно ниже соответствующих расчетных технических данных, тогда, как в способе настоящего изобретения предпочтительно используется устройство, которое оптимизировано для работы при низких давлениях.The method of the present invention is intended specifically for the disintegration of cells that lack a cell wall, and, in this method, lower energy costs are provided by regulation. Indeed, at such a high pressure that the MICROFLUIDIZER® homogenizer or microfluidizer is operating, namely at 15,000 and 40,000 psi (103410 and 275760 kPa), respectively, it would be difficult to provide accurate control at low pressures that would be significantly lower than the corresponding calculated technical data, while the method of the present invention preferably uses a device that is optimized for operation at low pressures.
Было показано, что способ настоящего изобретения, основанный на применении сталкивающихся струй, обеспечивает адекватное разрушение клеток, и дает высокий выход после фильтрации с незначительными потерями инфекционного титра. В предварительных исследованиях было установлено, что метод с применением сталкивающихся струй дает значительно более высокий выход по сравнению с методом замораживания/оттаивания.It was shown that the method of the present invention, based on the use of colliding jets, provides adequate destruction of cells, and gives a high yield after filtration with little loss of infectious titer. In preliminary studies, it was found that the method using colliding jets gives a significantly higher yield compared to the method of freezing / thawing.
По сравнению со стандартными способами дезинтеграции клеток, способ настоящего изобретения имеет ряд преимуществ. Во-первых, устройство, используемое в способе настоящего изобретения, имеет простую конструкцию, и не требует ни использования поршневого насоса, ни системы охлаждения, что позволяет избежать проблем, связанных с устройствами такого типа. Еще одним преимуществом этого способа является применение системы, работающей при низком давлении, что позволяет использовать насос низкого давления (лопастый или диафрагменный насос) или баллон относительно низкого давления, используемый для подачи жидкости.Compared to standard cell disintegration methods, the method of the present invention has several advantages. Firstly, the device used in the method of the present invention has a simple design, and does not require the use of a piston pump or cooling system, which avoids the problems associated with devices of this type. Another advantage of this method is the use of a system operating at low pressure, which allows the use of a low pressure pump (vane or diaphragm pump) or a relatively low pressure cylinder used to supply fluid.
Благодаря низкому рабочему давлению, используемому в этом способе, в процессе дезинтеграции клеток продуцируется лишь очень незначительное количество тепла (< 0,1°С).Due to the low working pressure used in this method, only a very small amount of heat (<0.1 ° C) is produced in the process of cell disintegration.
Описанное устройство имеет очень небольшие размеры, такие, что оно может быть введено в стандартную систему трубопровода, соединяющего два резервуара.The described device is very small, such that it can be introduced into a standard piping system connecting the two tanks.
Устройство, основанное на применении сталкивающихся струй, позволяет разрушать клетки посредством сдвигового напряжения в жидкости, создаваемого путем микросмешивания в точно определенной зоне столкновения. В используемых условиях дезинтеграция клеток, кавитации не происходит. Поэтому, в данном способе удается избежать возникновения гетерогенных зон повреждающего клетки высокого сдвигового напряжения, которые обычно ассоциируются с механизмами дезинтеграции, основанными на кавитации.A device based on the use of colliding jets allows the destruction of cells by shear stress in a fluid created by micro-mixing in a precisely defined collision zone. Under the conditions used, cell disintegration, cavitation does not occur. Therefore, in this method, it is possible to avoid the occurrence of heterogeneous zones of the damaging cell of high shear stress, which are usually associated with disintegration mechanisms based on cavitation.
Данное устройство с применением сталкивающихся струй может быть адаптировано для крупномасштабного производства. Объемный расход в этом технологическом процессе при данной линейной скорости может быть увеличен путем увеличения отверстия для подачи струи.This device using colliding jets can be adapted for large-scale production. The volumetric flow rate in this process at a given linear speed can be increased by increasing the hole for feeding the jet.
Дезинтеграция клеток, основанная на приложении регулируемого сдвигового напряжения в жидкости, обеспечивает высокий выход лабильных биологических молекул или вирусов.Cell disintegration, based on the application of controlled shear stress in a fluid, provides a high yield of labile biological molecules or viruses.
По своей конструкции, данное устройство является достаточно гигиеничным; в нем ис7 пользуются коммерчески доступные технологии сопла для непрерывного производства; и оно может быть непосредственно включено в стандартные технологические линии. Кроме того, это устройство может быть стерилизовано на месте.By its design, this device is quite hygienic; it uses commercially available nozzle technology for continuous production; and it can be directly incorporated into standard production lines. In addition, this device can be sterilized on site.
В этом устройстве не используется высокое давление > 200 фунт/кв.дюйм (1378,8 кПа), что позволяет избежать связанных с ним проблем.This device does not use high pressure> 200 psi (1378.8 kPa), which avoids the associated problems.
В предпочтительном варианте настоящего изобретения, способ дезинтеграции клеток с применением сталкивающихся струй может быть использован для получения высокого выхода вируса ветрянки и опоясывающего лишая, а также других вирусов или внутриклеточных белков, продуцируемых клетками животных. После дезинтеграции клеточный дебрис отделяют от ассоциированных с ними вирусных частиц с помощью осветляющего фильтра, и полученные вирусные препараты замораживают вплоть до их использования в приготовлении вакцины.In a preferred embodiment of the present invention, a method for disintegrating cells using colliding jets can be used to obtain a high yield of chickenpox virus and herpes zoster, as well as other viruses or intracellular proteins produced by animal cells. After disintegration, the cell debris is separated from the associated viral particles using a clarifying filter, and the resulting viral preparations are frozen until they are used in the preparation of the vaccine.
Для более наглядной иллюстрации настоящего изобретения, ниже приводятся примеры, которые не должны рассматриваться как ограничение изобретения.To more clearly illustrate the present invention, the following are examples that should not be construed as limiting the invention.
Пример 1 .Example 1
Роллер-флаконы, содержащие связанные и инфицированные вирусом ветряной оспы клетки MRC-5, споласкивают, наливают в них 40 мл либо 1,0х, либо 1,5х стабилизатора PGSE, и с этих роллер-флаконов собирают пласт клеток путем его механического соскабливания со стенок флакона с использованием механической руки робота. Клеточную суспензию удаляют из роллер-флакона, собирают в сосуд, и замораживают до -60°С. До обработки аппарат со сталкивающимися струями калибруют в целях определения давления, необходимого для получения нужной линейной скорости, а затем стерилизуют. Замороженный собранный материал, содержащийся в сосудах, оттаивают, объединяют, и помещают в автоклав, подсоединенный к аппарату со сталкивающимися струями. В автоклав с находящимся в нем материалом подают давление так, чтобы линейная скорость сквозного потока струй составляла 22,5 м/с (1,0х PGSE) или 25,0 м/с (1,5х PGSE). Отработанный материал подают обратно в автоклав на второй цикл.Roller bottles containing linked and infected with chickenpox virus MRC-5 cells are rinsed, 40 ml of either 1.0x or 1.5x PGSE stabilizer are poured into them, and a cell layer is collected from these roller bottles by mechanical scraping from the walls bottle using a robotic arm of a robot. The cell suspension is removed from the roller bottle, collected in a vessel, and frozen to -60 ° C. Prior to treatment, the colliding jet apparatus is calibrated to determine the pressure required to obtain the desired linear velocity, and then sterilized. The frozen collected material contained in the vessels is thawed, combined, and placed in an autoclave connected to the apparatus with colliding jets. Pressure is applied to the autoclave with the material inside it so that the linear velocity of the through stream of jets is 22.5 m / s (1.0x PGSE) or 25.0 m / s (1.5x PGSE). The spent material is fed back to the autoclave for a second cycle.
Пример 2.Example 2
Альтернативно, могут быть использованы две струи, последовательно следующие друг за другом. После этого, дезинтегрированные клетки осветляют путем фильтрации через полипропиленовые объемные фильтры. Иммуногенность вирусов анализируют методом бляшек. Анализ размера вирусных частиц может быть также проведен с помощью анализатора частицAlternatively, two jets successively following each other can be used. After that, the disintegrated cells are clarified by filtration through polypropylene volumetric filters. The immunogenicity of viruses is analyzed by plaque. Viral particle size analysis can also be performed using a particle analyzer.
Claims (10)
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US506295P | 1995-10-06 | 1995-10-06 | |
| GBGB9603759.3A GB9603759D0 (en) | 1996-02-22 | 1996-02-22 | Method of disrupting cultured cells using an impinging jet device |
| PCT/US1996/015801 WO1997012959A1 (en) | 1995-10-06 | 1996-10-02 | Method of disrupting cultured cells using an impinging jet device |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA199800266A1 EA199800266A1 (en) | 1998-10-29 |
| EA000703B1 true EA000703B1 (en) | 2000-02-28 |
Family
ID=26308786
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA199800266A EA000703B1 (en) | 1995-10-06 | 1996-10-02 | Method of disrupting cultured cells using an impinging jet device |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0854913A1 (en) |
| CN (1) | CN1100868C (en) |
| AR (1) | AR003776A1 (en) |
| AU (1) | AU7204496A (en) |
| BR (1) | BR9610773A (en) |
| CZ (1) | CZ104198A3 (en) |
| EA (1) | EA000703B1 (en) |
| SK (1) | SK43498A3 (en) |
| TW (1) | TW426733B (en) |
| WO (1) | WO1997012959A1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2615448C2 (en) * | 2010-12-28 | 2017-04-04 | Чугаи Сейяку Кабусики Кайся | Description of animal cell cultivation method |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19749735C1 (en) * | 1997-11-11 | 2000-02-10 | Invent Gmbh Entwicklung Neuer Technologien | Method and device for producing enzymes |
| CA2467099C (en) | 2001-12-20 | 2013-01-29 | Bavarian Nordic A/S | Method for the recovery and purification of poxviruses from infected cells |
| DE102005034629B4 (en) * | 2005-07-19 | 2007-09-13 | Dr. Hielscher Gmbh | Device and method for the mechanical disruption of cells |
| WO2008019964A1 (en) * | 2006-08-15 | 2008-02-21 | Basf Se | Method for isolating proteins from production cells |
| CN104861038B (en) * | 2015-05-08 | 2019-10-01 | 永联生物科技(上海)有限公司 | A kind of homogeneous valve group |
| BR102018004973B1 (en) * | 2018-03-13 | 2021-10-13 | Petróleo Brasileiro S.A. - Petrobras | DEVICE AND METHOD FOR RUPTING MICROORGANISMS CELLS BY EXTRUSION |
| EP4296352A1 (en) | 2022-06-20 | 2023-12-27 | LenioBio GmbH | Tunable disruption of eukaryotic protoplast to release intact cellular organelles |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR346862A (en) * | 1904-10-07 | 1905-02-13 | Henri Charles Empis | Extraction and preparation of substances contained in organic cells |
| GB877898A (en) * | 1956-12-06 | 1961-09-20 | Apv Co Ltd | A new or improved method of liberating enzymes |
| US3309032A (en) * | 1964-03-23 | 1967-03-14 | Sorvall Inc Ivan | Cell fractionator apparatus |
| DE3810462A1 (en) * | 1988-03-26 | 1989-10-05 | Dechema | METHOD FOR UNLOCKING CELLS IN A CELL SUSPENSION AND DEVICE FOR IMPLEMENTING THE METHOD |
-
1996
- 1996-10-01 TW TW085111939A patent/TW426733B/en not_active IP Right Cessation
- 1996-10-02 CN CN96198826A patent/CN1100868C/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-10-02 SK SK434-98A patent/SK43498A3/en unknown
- 1996-10-02 BR BR9610773A patent/BR9610773A/en not_active Application Discontinuation
- 1996-10-02 EP EP96933226A patent/EP0854913A1/en not_active Withdrawn
- 1996-10-02 WO PCT/US1996/015801 patent/WO1997012959A1/en not_active Application Discontinuation
- 1996-10-02 EA EA199800266A patent/EA000703B1/en not_active IP Right Cessation
- 1996-10-02 CZ CZ981041A patent/CZ104198A3/en unknown
- 1996-10-02 AU AU72044/96A patent/AU7204496A/en not_active Abandoned
- 1996-10-02 AR ARP960104582A patent/AR003776A1/en unknown
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2615448C2 (en) * | 2010-12-28 | 2017-04-04 | Чугаи Сейяку Кабусики Кайся | Description of animal cell cultivation method |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU7204496A (en) | 1997-04-28 |
| BR9610773A (en) | 1999-07-13 |
| TW426733B (en) | 2001-03-21 |
| AR003776A1 (en) | 1998-09-09 |
| WO1997012959A1 (en) | 1997-04-10 |
| CN1100868C (en) | 2003-02-05 |
| CZ104198A3 (en) | 1998-08-12 |
| EA199800266A1 (en) | 1998-10-29 |
| CN1203626A (en) | 1998-12-30 |
| EP0854913A1 (en) | 1998-07-29 |
| SK43498A3 (en) | 1998-12-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102015933B1 (en) | Systems and methods of virus propagation in cell culture for vaccine manufacture | |
| Grösch et al. | Ultrasonic separation of suspended particles-Part III: Application in biotechnology | |
| US5721120A (en) | Method of disrupting cultured cells using an impinging jet device | |
| Wang et al. | The bioreactor: a powerful tool for large-scale culture of animal cells | |
| Shirgaonkar et al. | Acoustic cell filter: a proven cell retention technology for perfusion of animal cell cultures | |
| Zhang et al. | High‐density perfusion culture of insect cells with a BioSep ultrasonic filter | |
| EA000703B1 (en) | Method of disrupting cultured cells using an impinging jet device | |
| EP2076157B1 (en) | Dispersion devices for aggregates | |
| US5550051A (en) | Avian embryo cell aggregate biomass for producing virus/virus antigen and method for producing virus/virus antigen | |
| CN101235365A (en) | Highly effective method for producing adenovirus | |
| CN111249456A (en) | Purification method of rabies virus inactivated vaccine | |
| CN111569055A (en) | Production method and equipment of human influenza vaccine | |
| WO1998033886A1 (en) | Methods for cultivating cells and propagating viruses | |
| CA2407933C (en) | A method of separating viable cells from cell suspensions | |
| CN103223163A (en) | IPV-DPT Vaccine | |
| AU2019201507A1 (en) | A high cell density fill and draw fermentation process | |
| US20100144016A1 (en) | Apparatus for the disruption of animal cells | |
| RU2794425C1 (en) | Perfusion filtration method for continuous culturing of cell cultures | |
| RU2800874C1 (en) | Perfusion filtration method of continuous culturing of cell cultures | |
| US20040191899A1 (en) | Method for disrupting cells that lack a cell wall | |
| WO2024080892A2 (en) | Perfusion filtration system for continuous cultivation of cell cultures | |
| Gilden et al. | Biological separation of adenovirus T and V antigen synthesis in KB cells | |
| Trudel et al. | Characterisation of rubella virus hemagglutinin rosettes | |
| Göbel et al. | 6 Upstream processing for | |
| CN103923960A (en) | High-efficiency producing method for purified porcine leukocyte interferon by employing porcine spleen |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): RU |