CZ104198A3 - Způsob rozrušování buněk - Google Patents

Description

- 1 Způsob rozrušování buněk

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu rozrušování buněk vypěstovaných v kultuře použitím proti sobě tryskajících proudů pracujících při nízkém tlaku za vytvoření rozrušujícího střihu v kapalině, který je dostatečně intenzívní pro rozrušení buněk, ale ne natolik intenzívní, aby zničil jejich obsah.

Dosavadní stav techniky

Základem mnoha biotechnologických a fermentačních postupů je vypěstování velkých množství buněk v bioreaktoru a potom jejich rozrušení pro uvolnění požadovaných produktů. Rozrušení buněk může být dosaženo mechanickými, chemickými, biologickými nebo fyzikálními prostředky. V mnoha protokolech se dává přednost způsobům mechanického rozrušení, protože je vysoce žádoucí odstranit potřebu dalších reagencií (detergenty, enzymy nebo látky ovlivňující osmotický tlak) a vyloučit nesnadné zvětšování měřítka u fyzikálních metod, jako je zmražení/tání.

Pro rozrušování mikroorganismů bylo vyvinuto velké množství mechanických metod. Tyto metody se obvykle pro dosažení prasknutí buněčné stěny a membrány spoléhají na střižné síly v kapalině a/nebo stlačování. Avšak ne všechny biotechnologické a fermentační postupy využívají mikroorganismy. Vhodným volitelným hostitelem jsou často živočišné buňky. Protože živočišné buňky jsou větší a mají křehčí membránu, pro uskutečnění požadovaného rozrušení buněk je třeba mnohem menšího přísunu energie. Mnoho komerčních systémů navržených pro použití u bakterií není vhodné pro použití v případě živočišných buněk.

- 2 ·· ·*

Zařízení typu rotor/stator, kterých je možno použít pro rozrušování živočišných buněk, mají válcový rotor, který se otáčí vysokou rychlostí koncentricky uvnitř statoru. Tato zařízení vytvářejí v prstencové oblasti strmý gradient rychlosti vytvářející dostatečné 5 střižné namáhání v kapalině pro rozrušení buněk. Podobné zařízení nazývané Chaikoff Press má válec a píst s poněkud menším průměrem. Pohyb pístu vytváří v kapalině uvnitř prstencového prostoru vysoké střižné síly, které způsobují rozrušení buněk. Tento typ zařízení se také označuje jako „douncer“ a bylo používáno pro io rozrušování diploidních plicních buněk MRC-5 infikovaných virem varicely. Tyto metody jsou však použitelné v laboratorním měřítku a není možno je zvětšovat pro výrobu v průmyslovém měřítku.

Ultrazvuk nebo sonikace rozrušuje buňky vytvářením oblastí vysokého střižného napětí v kapalině při procesu kavitace. Oscilace 15 akustických vln (~ 20 kHz) vytváří poklesy tlaku v kapalině. Bubliny páry vytvořené v oblasti s nízkým tlakem po vstupu do oblasti s vysokým tlakem zanikají za vytvoření šokových vln s vysokou energií. Protože šokové vlny se pohybují radiálně z místa počáteční kavitace, vytvářejí se při pohlcování energie kapalinou vysoké střižné 2o síly, stejně jako teplo.

Zařízení využívající kontinuální průtokové sonikace bylo použito pro rozrušování diploidních plicních buněk MRC-5 obsahujících virus varicely. Oblast v těsné blízkosti vzniku šokové vlny má dostatečnou energii pro zničení infekčnosti varicely. Proto míra ztráty infekčnosti 25 viru závisí na počtu míst nukleace vytvořených na jednotku objemu kapaliny, které souvisí se vstupem energie do kapaliny. Postup kontinuální sonikace má však také za následek vzrůst teploty o 5 až 10 °C ve zpracovávané kapalině, což zvyšuje rychlost degradace viru. Množství vložené sonikační energie může být pro zvýšení titrů po 30 sonikaci sníženo; avšak menší počet rozrušených buněk vede k větším ztrátám na vyčeřujících filtrech. Existuje optimální poměr mezi ztrátou *· *· ·· ♦* ·· ·« ♦··· · · A • · * I · ♦** · · 99 • · ····*·*·♦»·*·

9 9 9 · · · ♦ « 9 ♦ ♦♦ ·♦·· ·· ·· ·· 99 titru v důsledku sonikace a mírou rozrušení buněk vyžadovanou pro vysoké titry po vyčeření.

V dalších postupech podle dosavadního stavu techniky se pro maximalizaci uvolňování rotaviru z kultury využívá postupu zmrazování/tání. Tato metoda, i když je užitečná, může být pouze nesnadno převedena do výrobního měřítka.

Metody využívající vzájemného srážení dvou proudů jsou známy také: může být použito narážení proudu kapaliny na desku nebo srážení dvou proti sobě směřujících proudů. Oblast srážení poskytuje zónu mikromísení, kde je střižná síla řízena lineární rychlostí paprsku. Tato zařízení byla používána pro rozrušování mikrobiálních buněk. Komerční zařízení typu MICROFLUIDIZER využívají interakční komory, ve které se vzájemně srážejí dva proudy z trysek při lineárních rychlostech až do 200 m/s. Udává se, že rozrušování v tomto systému probíhá kavitací, střižnými silami v kapalině a vzájemnými srážkami. Toto zařízení však není vhodné pro použití u živočišných buněk, protože se rozrušují nejen buňky, ale poškozuje se také jejich obsah.

Je proto třeba vyvinout takové zařízení, které by účinně rozrušovalo živočišné buňky a přitom zanechávalo obsah buněk bez poškození.

Podstata vynálezu

Vynález se týká nového způsobu rozrušování buněk, které nemají buněčnou stěnu, z kultivačního procesu, který zahrnuje průchod buněk suspendovaných v kapalině zařízením s proudy srážejícími se za nízkého tlaku.

Jednou z výhod tohoto postupu je to, že produkty vyráběné kultivovanými buňkami je možno uvolňovat bez jejich destrukce, vystavením buněk řízené střižné síle v kapalině s nízkým tlakem dodávané zařízením se srážejícími se proudy. Dalším hlediskem

99 • 9 9

9 99

9 9

99

9

99 tohoto vynálezu je proto způsob sklizně buněčného produktu obsaženého v buňkách, které nemají buněčnou stěnu, zahrnující:

a) kultivaci buněk za takových podmínek a v takovém kultivačním médiu, při kterých se vytváří buněčný produkt;

b) suspendování buněk v suspendující kapalině;

c) protlačování suspendovaných buněk nízkotlakým zařízením se srážejícími se proudy tak, že se buňky rozrušují při tlaku od přibližně 34,5 až 690 kPa a buněčný produkt se uvolňuje;

a

d) oddělení uvolněného buněčného produktu.

Způsob podle předkládaného vynálezu je možno široce používat na jakoukoliv buňku, která nemá buněčnou stěnu, nebo ze které byla její buněčná stěna odstraněna. I když výhodné jsou buňky živočišné, tento způsob pracuje stejně dobře s jinými buňkami, jako jsou protoplasty rostlin nebo hub a bakteriální sféroplasty. Jediným požadavkem je, aby bylo možno buňky kultivovat a je výhodné, jestliže je možno kultivovat buňky ve velkém měřítku. Příklady vhodných živočišných buněk jsou buňky VĚRO, CHO a diploidní fibroblastové buňky, jako jsou buňky MRC-5. Příklady vhodných protoplastů rostlin jsou protoplasty Nicotiana, Petunia, Zea, Brassica a mezidruhové hybridy. Tyto buněčné linie mohou být trvalé nebo nemusí a mohou být kultivovány buď ve stacionární nebo v suspenzní kultuře. Pro způsob podle předkládaného vynálezu nejsou kritické žádné ze specifických parametrů kultivace.

Způsob podle předkládaného vynálezu může být používán pro získání skutečně jakéhokoliv typu produktu, který se vyrábí pomocí kultivovaných buněk. Příklady takových produktů zahrnují: v přírodě se vyskytující produkty jako proteiny; polysacharidy; rekombinované proteiny včetně protilátek a enzymů; a viry. Ve výhodném provedení tohoto vynálezu se používají jako hostitelské buňky pro produkci viru · ♦ · » ·♦ • · 9 9 9 ··» « · ··

9 999 99 99 999 99

- 9 9 9 9 9 9 9 9 99

- 5 - 99 9999 99 99 9999 používaných při výrobě vakcín živočišné buňky. Vynález tedy zahrnuje způsob sklizně viru pomnoženého ve zvířecí buňce, zahrnující:

a) kultivaci živočišných buněk infikovaných virem;

b) suspendování živočišných buněk obsahujících virus v suspendující kapalině;

c) protlačování suspendovaných živočišných buněk zařízením se srážejícími se proudy za nízkého tlaku tak, že buňky se rozruší a virus se uvolní; a

d) sklizení uvolněného viru.

ίο V jednom zvláště výhodném provedení se rozrušují lidské diploidní plicní buňky MRC-5 infikované virem Varicella zoster, zvláště virem Varicella zoster kmene OKA pro získání viru použitého pro výrobu živé virové vakciny VARIVAX®.

Buňky se kultivují tak, jak je to pro konkrétní buňky obvyklé. Po vhodné době kultivace se buňky uvolňují ze svého substrátu (pokud jsou přichyceny) a suspendují v kapalině. Kapalina může být stejná nebo podobná jako kapalina používaná při kultivaci buněk nebo může mít stabilizující účinek. Pro účely tohoto vynálezu není složení suspendující kapaliny kritické. Potom se suspendované buňky

2o zpracovávají průchodem zařízením se srážejícími se proudy jako je zařízení ukázané na obr. 1. Podle zobrazení ukázaného na obr. 1 se střih v kapalině s výhodou vytváří vzájemnou srážkou dvou proti sobě tryskajících proudů 111 a 101 s řízenou lineární rychlostí v malé komůrce 120. Zařízení se s výhodou provozuje kontinuálním způsobem za rozdělení vstupního proudu do dvou proudů z trysek

100, 110 a jednoho výstupního proudu 130 odcházejícího z komory. Je žádoucí, aby trysky 111 a 101 byly pro získání maximálního střihu v kapalině umístěny v těsné vzájemné blízkosti, tj. ve vzdálenosti menší než 25,4 mm a výhodněji ve vzájemné vzdálenosti přibližně 3,175 až

9,525 mm. Kritickým faktorem tohoto způsobu je skutečnost, že φφ «φ φφ φφ ·« φφ

Φ Φ Φ Φ φφφ Φ φ Φ 4 \ Φ Φ Φ Φ · φΦΦ « · ΦΦ

ΦΦΦΦΦΦΦΦΦ φφφ φ φ • Φ Φ φ Φ 4 ♦ θ ΦΦ ΦΦΦ· ΦΦ ·Φ ΦΦ ΦΦ zařízení je provozováno při nízkém tlaku v nekavitačním modu, s výhodou menším než přibližně 1,03 MPa a výhodněji menším než přibližně 689 kPa. Menší pracovní tlak poskytuje mírné rozrušení, buňky se s výhodou rozrušují při velmi nízkém tlaku, od přibližně 34,5 5 do přibližně 689 kPa. To je jeden z rysů, které rozlišují popisovaný způsob od způsobů podle stavu techniky. Například komerčně dostupné zařízení se srážejícími se proudy pro rozrušování buněk prodávané pod obchodním názvem MICROFLUIDIZER® firmou Microfluidics Intemational Corp., Newton, MA, udává rozrušování io živočišných buněk při tlaku 13,8 MPa. Při takto vysokém tlaku pravděpodobně dochází ke kavitaci a jejím škodlivým účinkům.

Lineární rychlost proudu v místě srážky je také kritickým aspektem vynálezu, protože určuje rozrušující sílu. Při tomto způsobu je výhodné, jestliže je lineární rychlost proudu přibližně 5 až 50 m/s 15 a s výhodou 10 až 30 m/s.

Způsob podle tohoto vynálezu byl konkrétně navržen pro rozrušování buněk bez buněčných stěn, kdy je řízeným způsobem přiváděna nižší energie. Pro vysokotlaká zařízení jako je homogenizátor nebo MICROFLUIDIZER®, která jsou navržena pro 2o poskytování tlaku 103 MPa, popřípadě 276 MPa je nesnadné poskytovat přesné řízení nízkých tlaků, které jsou značně nižší než tlaky, pro které jsou tato zařízení navržena, zatímco způsob podle tohoto vynálezu s výhodou používá zařízení, které pracuje optimálně při nízkém tlaku.

Způsob se srážejícími se proudy podle tohoto vynálezu poskytuje podle pozorování odpovídající rozrušení buněk pro dosažení vysokých výtěžků filtrace s nepatrnou ztrátou infekčního titru. V předběžných pokusech poskytlo zařízení se srážejícími se proudy proti metodě zmrazování/tání lepší výsledky.

3o Způsob podle předkládaného vynálezu má proti současným metodám rozrušování buněk řadu výhod. Za prvé je zařízení • · • 9 99 • 9 9 ·

4 44

444 9 9 • 4 4

4«

- 7 4 4 4 · • · 4· • 99

9 99

99

99999·

4· ·♦ • 99

9999

9 9 99

9 99

9999 jednoduché a nevyžaduje pístové pumpy ani chladicí zařízení, což předchází problémům spojeným s těmito typy zařízení. Systém pracující při nízkém tlaku má další výhodu v tom, že je možno pro protlačování kapaliny použít čerpadla pracujícího při nízkém tlaku (křídlového nebo membránového) nebo nádoby pro relativně nízký tlak.

V důsledku nízkého pracovního tlaku zařízení dochází při rozrušování buněk k tvorbě pouze nepatrného množství tepla (vzrůst teploty <0,1 °C). Zařízení má poměrně malou velikost, takže je možno je zařadit do standardního potrubí spojujícího při výrobě dvě nádoby. Zařízení se srážejícími se proudy rozrušuje buňky střihem v kapalině vytvářeným mikromísením v dobře definované zóně srážení. Za použitých podmínek rozrušování nedochází ke kavitaci. Nevznikají heterogenní zóny poškození vysokým střižným napětím obvyklé pro rozrušovací mechanismy založené na kavitaci.

Zařízení se srážejícími se proudy je možno přizpůsobit většímu měřítku. Objemová rychlost zpracování při dané lineární rychlosti může být zvýšena zvýšením průměru trysky.

Zařízení poskytuje řízené rozrušování založené na střihu v kapalině vhodné pro získání vysokého podílu labilních biomolekul nebo virů.

Zařízení je navrženo tak, aby mělo snadnou údržbu a používá komerčně dostupné technologie trysek pro reprodukovatelnou výrobu a může být přímo zařazeno do standardního zpracovacího zařízení. Navíc je možno zařízení sterilizovat v místě použití.

Nepoužívá se práce s vysokými tlaky větší než 1,38 MPa a tím nedochází k jevům spojeným s vysokými tlaky.

Ve výhodném provedení může být způsob rozrušování buněk srážejícími se proudy podle předkládaného vynálezu použit získávání viru Varicella zoster s vysokým výtěžkem, nebo jiných virů nebo \

‘ . - 8 ··** «*· ··«· • · · · ···* « · ·« • ♦ · · · ·· ·· »··« » »♦· «««· * * * •* «··· * · »· » · r · intracelulárních proteinů z živočišných buněk. Po rozrušení se úlomky buněk oddělí od částic viru vyčeřujícím filtrem a získaný virový preparát se zmrazí až do dalšího zpracování na vakcínu.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 znázorňuje zařízení se srážejícími proudy, použitelné při způsobu podle předkládaného vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Otáčivé láhve obsahující přichycené buňky MRC-5 infikované virem varicely se opláchnou, přidá se do nich vždy 40 ml buď 1,0 x nebo 1,5 x stabilizátoru PGSE a buňky se sklidí z otáčivých láhví mechanickým seškrabáním vrstvy buněk s použitím robotického ramene. Buněčná kaše se z otáčivé láhve odtáhne, shromáždí v nádobě a zmrazí při - 60 °C. Před zpracováním se zařízení se srážejícími se proudy kalibruje pro stanovení tlaku nutného pro poskytnutí požadované lineární rychlosti a potom sterilizuje. Nádoby obsahující zmrazený sklizený materiál se ponechají roztát, spojí a umístí do tlakové nádoby připojené k zařízení se srážejícími se proudy. Obsah tlakové nádoby se natlakuje pro získání lineární rychlosti v proudech 22,5 m/s (1,0 x PGSE) nebo 25,0 m/s (1,5 x PGSE). Materiál prošlý zařízením se převede zpět do tlakové nádoby pro provedení druhého průchodu.

Příklad 2

Alternativně je možno použít dvou zařízení podle vynálezu v sérii. Rozrušené buňky se potom vyčeří filtrací polypropylenovými

-9·· ♦· ♦· Φ· φφ φφ φφφφ φφφ φφφφ φφ φ φ φ φφφ φφφφ φ φ φ φφ φφ φφ φφφφ φ φφφ φφφφ φφφ φφ φφφφ φφ Φ· φφ φ* hloubkovými filtry. Infekční schopnost se testuje testem pomocí plaků. Provede se rovněž analýza velikosti částic pomocí analyzátoru částic Elzone.

Claims (10)

1. Způsob rozrušování buněk, které nemají buněčnou stěnu, po kultivaci, vyznačující se tím, že zahrnuje procházení buněk suspendovaných v kultivační kapalině nízkotlakým zařízením s proudy srážejícími se za nízkého tlaku.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, ž e buňkami jsou živočišné buňky.

3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, ž e buňky jsou zvoleny ze skupiny: buňky VĚRO, buňky CHO a buňky diploidních fibroblastů.

4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, ž e zařízení rozrušuje buňky při tlaku přibližně 34,5 až 690 kPa.

5. Způsob sklízení buněčného produktu obsaženého uvnitř buněk, které nemají buněčnou stěnu, vyznačující se tím, že zahrnuje:

a) kultivaci buněk za takových podmínek a v takovém kultivačním médiu, při kterých se vytváří buněčný produkt;

b) suspendování buněk v suspendující kapalině;

c) protlačování suspendovaných buněk nízkotlakým zařízením se srážejícími se proudy tak, že se buňky rozrušují při tlaku od přibližně 34,5 až 690 kPa a buněčný produkt se uvolňuje; a

d) oddělení uvolněného buněčného produktu.

• • • « • · 9 • « 9 • · • • · ··· • · «· • · ♦ · • · • · < ·· · * • • • • · • · • • • ·· Λ ·

6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, ž e buňkou je buňka živočišná.

5

7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, ž e produkt je zvolen ze skupiny přirozeně se vyskytujícího proteinu, rekombinantního proteinu a viru.

8. Způsob sklízení viru pomnoženého v živočišné buňce, io vyznačující se tím, že zahrnuje:

a) kultivaci živočišných buněk infikovaných virem;

b) suspendování živočišných buněk obsahujících virus v suspendující kapalině;

c) protlačování suspendovaných živočišných buněk

15 zařízením se srážejícími se proudy za nízkého tlaku tak, že buňky se rozruší a virus se uvolní; a

d) sklizení uvolněného viru.

9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím,

2o že živočišnými buňkami jsou diploidní plicní buňky MRC-5.

10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, ž e virem je virus varicely.