DK2844751T3

DK2844751T3 - Forbedrede varianter af enzymet chymosin

Info

Publication number: DK2844751T3
Application number: DK13724535.3T
Authority: DK
Inventors: Petrus Jacobus Theodorus Dekker; De René Marcel Jong; Cornelis Marinus Muijlwijk
Original assignee: Dsm Ip Assets Bv
Priority date: 2012-05-03
Filing date: 2013-05-03
Publication date: 2019-02-04
Also published as: LT2844750T; US10167463B2; US20150118356A1; WO2013164481A1; WO2013164479A3; US20180030427A1; US10253305B2; US20150140169A1; HK1207881A1; BR112014027371A2; EP2844750B1; WO2013164479A2; NZ701125A; HK1207880A1; CA2872132A1; MX2014013333A; MX355170B; MX2014013329A; US9822352B2; EA035275B1

Claims

1. Variant polypeptid med chymosinaktivitet, hvor varianten har en aminosyresekvens, der, når den er rettet ind med chymosinet, der omfatter sekvensen ifølge SEQ ID NO: 2, omfatter mindst én substitution af en aminosyrerest svarende til aminosyre 51, hvor positionen er defineret ved henvisning til SEQ ID NO: 2, og hvor varianten har en eller flere ændrede egenskaber sammenlignet med et referencepolypeptid med chymosinaktivitet, og hvor referencepolypeptidet er chymosinet ifølge SEQ ID NO: 2, og hvor den mindst ene substitution omfatter en A51V-, A51T-, A51I-, A51L- eller A51N-substitution, og hvor det variante polypeptid har mindst 90 % sekvensidentitet med SEQ ID NO: 2.

2. Variant polypeptid ifølge krav 1, hvor varianten viser nedsat proteolyse i en ostematrix og/eller forøget produktivitet sammenlignet med et referencepolypeptid med chymosinaktivitet, og hvor referencepolypeptidet omfatter sekvensen ifølge SEQ ID NO: 2.

3. Variant polypeptid ifølge krav 2, hvor varianten viser forøget specificitet, reduceret ostemassemålretning eller reduceret termostabilitet sammenlignet med et referencepolypeptid med chymosinaktivitet, og hvor referencepolypeptidet omfatter sekvensen ifølge SEQ ID NO: 2.

4. Variant polypeptid ifølge krav 2 eller 3, som omfatter en aminosyresekvens, der, når den er rettet ind med sekvensen ifølge SEQ ID NO: 2, omfatter mindst én substitution af en aminosyrerest svarende til aminosyre 51, hvor positionen er defineret ved henvisning til SEQ ID NO: 2, og hvor varianten viser forøget specificitet sammenlignet med et referencepolypeptid med chymosinaktivitet, og hvor referencepolypeptidet omfatter sekvensen ifølge SEQ ID NO: 2.

5. Variant polypeptid ifølge et hvilket som helst af kravene 2 til 4, som omfatter en aminosyresekvens, der, når den er rettet ind med sekvensen ifølge SEQ ID NO: 2, omfatter mindst én substitution af en aminosyrerest svarende til aminosyre 51, hvor positionen er defineret ved henvisning til SEQ ID NO: 2, og hvor varianten viser reduceret temperaturstabilitet sammenlignet med et referencepolypeptid med chymosinaktivitet, og hvor referencepolypeptidet omfatter sekvensen ifølge SEQ ID NO: 2 .

6. Variant polypeptid ifølge et hvilket som helst af kravene 2 til 5, hvor varianten viser forøget specifik aktivitet eller et forøget ekspressionsniveau.

7. Variant polypeptid ifølge krav 1, som omfatter en aminosyresekvens, der, når den er rettet ind med sekvensen ifølge SEQ ID NO: 2, omfatter mindst én substitution af en aminosyrerest svarende til aminosyre 51, hvor positionen er defineret ved henvisning til SEQ ID NO: 2, og hvor varianten viser reduceret proteolytisk aktivitet ved lavt pH sammenlignet med et referencepolypeptid med chymosinaktivitet, og hvor referencepolypeptidet omfatter sekvensen ifølge SEQ ID NO: 2.

8. Variant polypeptid ifølge krav 1, som omfatter en aminosyresekvens, der, når den er rettet ind med sekvensen ifølge SEQ ID NO: 2, omfatter mindst én substitution af en aminosyrerest svarende til aminosyre 51, hvor positionen er defineret ved henvisning til SEQ ID NO: 2, og hvor varianten viser reduceret proteolytisk aktivitet ved lav temperatur sammenlignet med et referencepolypeptid med chymosinaktivitet, og hvor referencepolypeptidet omfatter sekvensen ifølge SEQ ID NO: 2.

9. Variant polypeptid ifølge et hvilket som helst af ovennævnte krav, som omfatter yderligere substitutioner ud over de, der er defineret i krav 1.

10. Nukleinsyresekvens, der koder for et variant polypeptid ifølge et hvilket som helst af ovennævnte krav.

11. Nukleinsyrekonstruktion, der omfatter nukleinsyresekvensen ifølge krav 10, der er operabelt koblet til en eller flere kontrolsekvens, der er i stand til at styre ekspressionen af et chymosin i en egnet ekspressionsvært.

12. Rekombinant ekspressionsvektor, der omfatter nukleinsyrekonstruktionen ifølge krav 11.

13. Rekombinant værtscelle, der omfatter ekspressionsvektoren ifølge krav 12.

14. Fremgangsmåde til fremstilling af et chymosin, som omfatter dyrkning af værtscellen ifølge krav 13 under betingelser, der fører til produktion af chymosinet, og indvinding af chymosinet.

15. Fremgangsmåde til fremstilling af en chymosinpolypeptidvariant, hvilken fremgangsmåde omfatter: a) selektion af et polypeptid med chymosinaktivitet; b) substitution af mindst én aminosyrerest svarende til aminosyre 51, hvor positionen er defineret ved henvisning til SEQ ID NO: 2; hvor den mindst ene substitution omfatter en A51V-, A51T-, A51I-, A51L- eller A51N-substitution; c) eventuelt substitution af en eller flere yderligere aminosyrer som defineret i b); d) frembringelse af varianten, der opnås fra trinene a)-c); e) bestemmelse af en egenskab for varianten; og f) selektion af en variant med en ændret egenskab sammenlignet med et referencepolypeptid med chymosinaktivitet, hvor referencepolypeptidet omfatter sekvensen ifølge SEQ ID NO: 2, til derved fremstilling af en chymosinpolypeptidvariant, og hvor det variante polypeptid har mindst 90 % sekvensidentitet med SEQ ID NO: 2.

16. Sammensætning, der omfatter det variante polypeptid ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 9, eller som kan opnås ved hjælp af en fremgangsmåde ifølge krav 15.

17. Anvendelse af et variant polypeptid ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 9 eller af en sammensætning ifølge krav 16 til fremstilling af en ost.

18. Fremgangsmåde til fremstilling af en ost, hvilken fremgangsmåde omfatter tilsætning af en mælkekoagulerende effektiv mængde af et variant polypeptid ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 9 eller af en sammensætning ifølge krav 16 til mælk og udførelse af yderligere passende ostefremstillingstrin.