DK175706B1 - Beskyttede biotinderivater - Google Patents

Description

DK 175706 B1 i ! Den forliggende opfindelse angår fremgangsmåder til fremsti 1- ! lingen af biotinylerede polynukleotider og analoger deraf og mel 1 emprodukter til anvendelse ved sådanne fremgangsmåder.

5 Anvendelsen af mærkede polynukleotidsonder er velkendt til en lang række anvendelser, som f.eks. beskrevet af Lewin, Science 221:1167 (1983) og Klausner et al., Bio/Technology, 1:471 (1983). Mærkede oligonukleotidsonder er af særlig interesse som diagnostiske værktøjer til kliniske og forskningsmæssige 10 anvendelser.

Konventionelle radiomærkede sonder er effektive og følsomme, men er forbundet med flere problemer, som formindsker rutine-mæssi g anvendelse til screening, f.eks. i kliniske 1aborato-15 rier. Således er radiomærkede sonder potentielt farlige og giver problemer med bortskaffelse. Endvidere er radiomærkede sonder ofte ustabile og har begrænset opbevaringsholdbarhed som et resultat af den relativt korte halveringstid for de radioaktive materialer, der anvendes som mærker, især 32p. End-20 videre kan autoradiografisk påvisning være tidsforbrugende og håndteringen af radiomærkede sonder kræver personale med den passende sikkerhedstræning.

Der er derfor et ønske at anvende ikke-radioakti ve fremgangs-25 måder til mærkning af sonder og visse sådanne metoder er blevet beskrevet i litteraturen f.eks. af D.C. Ward ved det i 1981 afholdte ICN-UCLA symposium i Keystone, Colorado fra den 15. til den 20. marts og publiceret i. "Developmental Biology Using Purified Genes”, 1981 XXIII, 1981 side 647-658, Academic 30 Press, udgiver Donald D. Brown et al. og af A.O. B. Malcolm et al., Abstracts of the 604 th Biochemical Society Metting, Cambridge, England (møde den 1. juli 1983). Sonder mærket med biotin er også i udpræget grad blevet beskrevet i litteraturen.

i I 35 i I Biotin er af særlig interesse ved mærkning af o 1igonuk1eoti - der, da det er i stand til at danne en stærk vekselvirkning med avidin, hvorved der muliggøres at f.eks. enzymatisk akti-

I DK 175706 B1 I

I I

verede signaleringssystemer eller enzymmærker bliver hensigtsmæssigt bundet til en I

I oligonukleotidhybridiseringssonde. I

Is I

I En almindelig fremgangsmåde til vedhæftning af multiple biotinrester er beskrevet i I

I J.L. Ruth, Chemical Synthesis of Non-Radioactively-Labeled DNA Hybridisation Pro- I

I bes., fjerde årlige Kongress for Rekombinant DNA forskning, og involverer fremstil- I

I ling af nukleosidderivater specifikt fimktionaliserede på den heterocykliske base for I

I 10 herved at resultere i en reaktiv funktionel gruppe ved afbeskyttelse. De funktionalisere- I

I de nukleosider inkorporeres enten enzymatisk eller kemisk, og et yderligere trin er I

I nødvendigt for at omdanne de funktionelle grupper til de passede biotinylerede arter. I

I 15 fremgangsmåder til fæstnelse af en biotinrest til oligonukleo- I

tider via en phosphatbinding er kendte og har f.eks. været I

I beskrevet i ansøgerens europæiske patentansøgning nr. 202.758. I

Sådanne fremgangsmåder involverer phosphotriesterkemi, som in- I

ter alia er uforligelig med phosphoramiditkemi, der kan anven- I

des ved den automatiserede syntese af nukleotidsekvenser, I

20 f-eks. i et ONA-synteseapparat. Endvidere har der hidtil ikke I

I V*ret beskrevet nogen hensigtsmæssig metode til binding af I

I ' biotin i beskyttet form til en nukleotidsekvens under anven- I

I delse af phosphoramiditkemi. I

I 0en '<”··"ββ*ι«<Ιβ opfindelse er baseret på opdagelsen af frem- ' I

25 gangsmåder som i det mindste delvis undgår de ovenfor nævnte _ I

vanskeligheder og mellemprodukter dertil I

3 DK 175706 B1 Således tilvejebringes der ifølge et aspekt ved den foreliggende opfindelse en fremgangsmåde til fremstillingen af en forbindelse med formlen la som vist herefter [hvori m er 4 eller 5, X betegner en direkte binding, -0-P(0)(0R6a)-0-/ -S-, -0-, -C0NH-, -NHC0NH- eller N-R8 (hvor R8 betegner en ligekæ-5 det eller forgrenet Ci_ioalkylgruppe)» P ®r et helt tal fra 0 til 16 med det forbehold, at hvor X er forskellig fra en direkte binding, er p et helt tal på mindst 2, R®a betegner et hydrogenatom eller en phosphatbeskytte 1 sesgruppe, og Z' betegner en nukleotidsekvens i ubeskyttet form eller i en form, hvor base- og/eller phosphatdelene bærer en eller flere be-10 skyttelsesgrupper og nukleotidsekvensen er eventuelt bundet til en bærer], hvilken fremgangsmåde omfatter, at man afbeskytter en forbindelse med formlen Π som vist herefter [hvori m, p, X, R6, og Z' er som ovenfor defineret, og J og K, som kan være ens eller forskellige, hver betegner et hydrogenatom eller en beskyttelsesgruppe, som er forligelig med nukleotidphosphorylering, hvilken gruppe forøger lipofiliciteten af forbindelsen, idet i det mindste 15 en blandt J og K er forskellig far hydrogen], hvorved enhver J- eller K-gruppe, som er forskellig fra hydrogen, fjernes til opnåelse af en forbindelse med formlen la.

Betingelserne, under hvilke afbeskyttelsen udøves, vil nødvendigvis være afhængig af naturen af beskyttelsesgrupperne J 20 og/eller K. Således kan f.eks. syrelabile beskyttelsesgrupper fjernes i nærværelse af en eller flere vandige syrer, f.eks. en organisk syre, såsom eddikesyre, eller mineralsyre, såsom saltsyre, medens baselabile beskyttelsesgrupper kan fjernes i nærværelse af en eller flere baser, såsom en vandig base, 25 f.eks. ammoniumhydroxid.

Der anvendes fortrinsvis en forbindelse med formlen II, hvori J og/eller K betegner tetrahydropyrany 1, f.eks. tetrahydropy-ran-2-yl, 6-methoxy-tetrahydropyrany1, f.eks. 6-methoxy-tetra-hydropyran-2-y1, furyl, f.eks. 2-furyl, dimethoxytrityl, ^ f.eks. 4,4’-dimethoxytrityl, xanthenyl, f.eks. 9-phenylxanthe-nyl, tetrahydrothiopyrany1, f.eks. tetrahydrothiopyran-2-yl, 4-methoxytetrahydrothiopyranyl, f.eks. 4-methoxytetrahydro-thiopyran-2-yl, benzoyl eller en acylgruppe, f.eks. med op til 6 carbonatomer, f.eks. 3-6 carbonatomer. Foretrukne beskyttelsesgrupper er tetrahydropyran-2-yl-, 6-methoxy-tetrahydropy-

I DK 175706 B1 I

i 4 I

I ran-2-yl- eller dimethoxytri ty1 grupper. En forbindelse roed I

I formlen II, hvori i det mindste en blandt J og K er diraethoxy- I

I trityl, kan være fordelagtig, da der opnås en farveændring ved I

I dens fjernelse. Når J og/eller K betegner en dimethoxytri ty 1 - I

I 5 gruppe, kan denne hensigtsmæssigt fjernes ved behandling roed I

I en vandig syre, f.eks. vandig trif1uoreddikesyre eller vandig I

I eddikesyre, fortrinsvis vandig eddikesyre, eller en vandig mi- I

H neralsyre, såsom vandig saltsyre. Når J og/eller K betegner en I

I tetrahydropyrany1 gruppe, kan denne hensigtsmæssigt fjernes ved I

I 10 behandling med en vandig syre, såsom en vandig mineralsyre, I

H f.eks. vandig saltsyre. I

I Hensigtsmæssigt repræsenterer kun en blandt J og K en beskyt- I

telsesgruppe, idet den anden blandt J og K repræsenterer hy- I

I 15 drogen. I

Der anvendes hensigtsmæssigt en forbindelse med formlen II, I

hvori X er forskellig fra gruppen med formlen N-R8, som oven- I

I for defineret. Normalt, når X er -C0NH- eller -NHCONH-, da er I

20 m 4. X er fortrinsvis en direkte binding eller gruppen I

-0-P(0)(0R5a)-0-. Således kan f.eks. en forbindelse med form- I

len II anvendes, hvori X er en direkte binding, m er 5 og p er I

0 eller endda, hvori X er -0-P(0)(0R6a)~0-» m er 5 og p er 8. I

25 Når der anvendes en forbindelse med formlen II, hvori R6a I

betegner en phosphatbeskyttelsesgruppe (R8 som refereres til I

I herefter), vil den gruppe generelt være i stand til at tjene I

både som en phosphatbeskyttelsesgruppe og som en phosphitbe- I

skyttelsesgruppe. Sådanne grupper omfatter f.eks. en methyl-, I

H 30 2-cyanoethy1 -, 2-chlorphenyl-, 2,2,2-tri halogen-1,1-dimethyl- I

ethyl-, 5-chlorquinolin-8-yl-, 2-raethy1thioethyIgruppe eller I

en 2-phenylthioethylgruppe, hvori phenylringen eventuelt kan I

have en substituent valgt blandt f.eks. halogen, f.eks. chlor, I

eller NO2. Almindeligvis vil R8 betegne methyl eller 2-cyano- I

H 35 ethyl. I

H Når der ønskes en forbindelse med formlen II, hvor R6a er et I

hydrogenatom, da kan phosphatbeskyttelsesgruppen fjernes under I

5 DK 175706 B1 anvendelse af kendte fremgangsmåder per se, f.eks. under anvendelse af fremgangsmåderne beskrevet i de ovenfor nævnte fremstillinger af forbindelser med formlen I.

5 Z' i forbindelse med formlen II eller la kan være en ubeskyttet eller i beskyttet form. Det vil forstås, at længden af nu-kleotidsekvensen, som udgør Z', kun er begrænset ved længden af sekvensen, som kan konstrueres på f.eks. et DNA-synteseap-parat. Polynukleotidsekvenser på op til 150 nukleotider, 10 f · eks. op til 100 nukleotider, kan fremst i lies. Almindeligvis betegner Z' en ol igonukleotidsekvens med f.eks. 6 til 30 nu-kleotidenheder, hensigtsmæssigt 12 til 25 nukleotidenheder.

Når det er påtænkt, at oligonukleotidsekvensen skal anvendes til påvisning af f.eks. genetiske forstyrrelser, er oligonu-15 kleotidsekvensen fortrinsvis med 17 til 20 nukleotidsekvenser.

Den omhandlede opfindelse kan således f.eks. være af interesse ved fremstilling af oligonukleotidprimerer til anvendelse inden for PCR-teknik (polymerasekædereaktionsteknik) som beskrevet i US patentskrifterne nr. 4.683.195 og nr. 4.683.203.

20 Når nuk1eotidsekvensen er i beskyttet form, kan hver nukleoti-denhed bære en phosphatbeskyttelsesgruppe for phosphatgrupper-ne i nukleotidsekvensens sukker-phosphat-rygrad, idet sådanne beskyttelsesgrupper er veldokumenterede i litteraturen (N.D.

25 Sinha et al., Nucleic Acids Research (1984), 12, side 4539, J.L. Fourrey og J. Varenne, Tetrahedron Letters (1984) 25, 4511-4514 eller E. Ohtsuka et al., Nucleic Acids Research, 1982, 10, 6553-6570). Endvidere er passende phosphatbeskyttel -sesgrupper indlysende for nukleotidkemikeren og kan f.eks. om-30 fatte de i forbindelse med R® ovenfor beskrevne phosphatbesky ttel sesgrupper , f.eks. methyl eller 2-cyanoethy 1. Endvidere nukleotidsekvenser, soro kan omfatte enhver af de konventionelle nukleosider (desoxy)cytidin, (desoxy)adenosin, (desoxy)gua-nosin og enten thymidin eller (desoxy)ur i din såvel som basemo-35 dificerede nukleosider i stand til baseparring med en af de ovenfor beskrevne konventionelle nukleosider. Sådanne basemodificerede nukleosider omfatter (desoxy)i nos in og (desoxy)8- azaguanosin. Når hensigtsmæssigt kan basedelen i et nukleotid,

I DK 175706 B1 I

6 I

som er til stede i nukleotidsekvensen, bære en beskyttelses- I

gruppe. Således kan f.eks. aminsubstituenten i adenin, cytosi η I

og guanin bære en hvilken soid helst hensigtsmæssig beskyttel- I

sesgruppe, idet sådanne beskyttelsesgrupper er veldokumentere- I

H 5 de i litteraturen (f.eks. E. Ohtsuka et al. Nucleic Acids Re-

I search (1982), 10, 6553-6570). I

H Endvidere er passende basebeskyttelsesgrupper indlysende for

nukleotidkemikeren og omfatter især isobutyryl og benzoyl, I

10 idet isobutyrylgruppen er særlig hensigtsmæssig som en beskyt- I

telsesgruppe for guanin, og benzoylgruppen er særlig hensigts- I

mæssig som en beskyttelsesgruppe for cytosin og adenin. Be- I

I skyttede baser kan således f.eks. omfatte N4-benzoylcytosiη, I

N®-benzoyladenin og N2-isobutyry1guanin. Det vil forstås, at I

15 ikke alle baser vil nødvendiggøre beskyttelse, således nødven- H

digger f.eks. thymin og uracil muligvis ikke beskyttelsesgrup- I

per.

De ovenfor nævnte phosphatbeskyttelsesgrupper, nukleotidphos- I

20 phatbeskyttelsesgrupper og basebeskyttelsesgrupper kan alle I

fjernes ved hjælp af teknikker, som er veldokumenterede i lit- I

H teraturen. Sådanne afbeskyttelsesfremgangsmåder er indlysende I

I for nukleotidkemikeren. I

I 25 Når phosphatbeskyttelsesgruppen indeholder en sulfidbinding, I

I vil denne binding hensigtsmæssigt være oxideret til det til- I

I svarende sulfoxid eller den tilsvarende sulfon før fjernelse. H

Som beskrevet for beskyttelsesgrupperne J og K ovenfor, vil de H

I 30 betingelser, under hvilke afbeskyttelsen udøves, nødvendigvis H

I være afhængig af naturen af phosphat-, nukleotidphosphat- og I

I basebeskyttelsesgrupperne. I

7 DK 175706 B1 cyanoethylgruppe, kan denne fjernes ved behandling med en base, som ovenfor eksemplificeret.

Nukleotidsekvensen kan om ønsket være bundet til en bærer, 5 f.eks. en fast bærer, såsom en reguleret poregi asbærer. Teknik til afspaltning af nukleotidsekvensen fra bæreren er veldokumenteret i litteraturen og faktisk er nuk1eotidbærerafspaltningsteknikker indlysende for nukleotidkemikeren. Det kan ses, at når de valgte betingelser for den ovenfor nævnte afspalt-10 ning og afbeskyttelse er identiske eller lignende, da kan disse operationer foregå samtidigt.

Når afbeskyttelse af forbindelsen med formlen II resulterer i fremstillingen af en forbindelse med formlen la, som ikke er 15 en forbindelse med formlen I, kan hvilke som helst beskyttelsesgrupper om ønsket fjernes, f.eks. ved fremgangsmåder som er kendte per se og/eller når forbindelsen med formlen la er bundet til en bærer, kan forbindelsen om ønsket afspaltes fra bæreren, f.eks. ved fremgangsmåder som er kendte per se, hvor-20 ved der opnås en forbindelse med formlen I.

Det vil forstås, at fjernelsen af beskyttelsesgrupperne og afspaltningen af forbindelsen med formlen II eller la fra bæreren kan udføres i en hvilken som helst hensigtsmæssig række-25 følge, og denne kan være afhængig af de individuelle reaktionsbetingelser, som vælges i et hvilket som helst bestemt tilfælde.

Således kan f.eks. (a) en fuldt beskyttet forbindelse med 30 formlen II bundet til en bærer underkastes en reaktion, som fjerner phosphatbeskyttelsesgrupperne og afspalter nukleotidsekvensen fra bæreren. Den således opnåede forbindelse kan derefter underkastes et yderligere af beskytté1 sestrin , hvor basebeskyttelsesgrupperne fjernes, og til sidst kan den såled-35 es opnåede forbindelse underkastes et af beskyttelsestrin, hvor beskyttelsesgruppen eller beskyttelsesgrupperne J og/eller K fjernes til opnåelse af en forbindelse med formlen I.

DK 175706 B1 I

Alternativt (b) kan en fuldt beskyttet forbindelse med formlen I

II, som er bundet til en bærer, underkastes et afbeskytte 1 ses- H

trin, hvor beskyttelsesgruppen eller beskyttelsesgrupperne J I

og/eller K fjernes, hvorefter den således opnåede forbindelse I

5 underkastes en reaktion, som fjerner phosphatbeskyttelsesgrup- I

perne og afspalter nukleotidsekvensen til bæreren og til sidst I

den således opnåede forbindelse et yderligere afbeskyttelses- I

trin, hvor basebeskyttelsesgrupperne fjernes til dannelse af I

en forbindelse med formlen I. I

Alternativt kan f.eks. (c) en fuldt beskyttet forbindelse med I

formlen II, som er bundet til en bærer, underkastes et afbe- I

skyttelsestrin, hvor phosphatbeskytteisesgrupperne fjernes, i I

hvorefter den således opnåede forbindelse underkastes en af- H

15 spaltningsreaktion, hvor nukleotidet afspaltes fra dens bærer. H

Den således opnåede forbindelse underkastes derefter et afbe- H

skyttelsestrin, hvor basebeskyttelsesgrupperne fjernes, og ti 1 H

slut underkastes den således opnåede forbindelse et afbeskyt- H

telsestrin, hvor beskyttelsesgruppen eller beskyttelsesgrup- I

20 perne J eller K fjernes til opnåelse af en forbindelse med

formlen I. H

Alternativt kan f.eks. (d) en fuldt beskyttet forbindelse med H

formlen II, som er bundet til en bærer, underkastes en reak- I

25 tion, som fjerner phosphatbeskytteisesgrupperne og afspalter H

nukleotidsekvensen fra bæreren, idet den således opnåede for- H

bi ndel se underkastes et afbeskyttelsestrin, hvor beskyttelses- H

gruppen eller beskyttelselgrupperne J og/eller K fjernes og H

til slut underkastes den således opnåede forbindelse et afbe- I

30 skyttelsestrin, hvor basebeskyttelsesgrupperne fjernes til op- I

nåelse af en forbindelse med formlen I. I

Alternativt kan f.eks. (e) en fuldt beskyttet forbindelse med H

formlen II, som er bundet til en bærer, underkastes et afbe- j I

35 skyttelsestrin, hvor beskyttelsesgruppen eller beskyttelses- H

grupperne J og/eller K fjernes, den således opnåede forbin- H

del se underkastes derefter et yder 1 i gere afbeskyttelsestrin, hvor phosphatbeskytteisesgrupperne fjernes, den således opnå- 9 DK 175706 B1 ede forbi ndel se underkastes derefter en afspaltningsreaktion, hvor nukleotidsekvensen afspaltes fra bæreren og til slut underkastes den opnåede forbindelse et afbeskyttelsestrin, hvor basebeskyttelsesgrupperne fjernes til opnåelse af en forbin-5 delse roed formlen I.

Alternativt kan f.eks. (f) en fuldt beskyttet forbindelse med formlen II, som er bundet til en bærer, underkastes et afbe-skyttelsestrin , hvor phosphatbeskyttelsesgrupperne fjernes, 10 den således opnåede forbindelse underkastes derefter en reaktion, som fjerner basebeskyttelsesgrupperne og afspalter nukleotidsekvensen fra dens bærer og til slut underkastes den således opnåede forbindelse et afbeskyttelsestrin, hvor beskyttelsesgruppen eller beskyttelsesgrupperne J og/eller K 15 fjernes til opnåelse af en forbindelse med formlen I.

Alternativt kan f.eks. (g) en fuldt beskyttet forbindelse med formlen II, som er bundet til en bærer, underkastes et afbe-skyttelsestrin, hvor beskyttelsesgruppen eller beskyttelses-20 grupperne J og/eller K fjernes, og den således opnåede forbindelse underkastes en reaktion, som afspalter nukleotidsekvensen fra bæreren og fjerner phosphat- og basebeskyttelsesgrupperne.

25 En særlig sekvens til fjernelsen af beskyttelsesgrupperne og afspaltningen af forbindelsen med formlen II eller la fra bæreren er sekvens (a), som ovenfor beskrevet.

Ifølge et andet og uafhængigt træk ved den foreliggende opfin-30 delse tilvejebringes der en fremgangsmåde til fremstilling af en forbindelse med formlen II som ovenfor defineret eller en isoækvivalent deraf, hvilken fremgangsmåde omfatter, at man oxiderer en tilsvarende forbindelse med formlen III som vist herefter [hvor m, p, J, K, Z', X og R6a er soro ovenfor defi-35 neret).

Phosphitoxidationsmidler til anvendelse ved den ovenfor nævnte oxidation er kendte for fagmanden inden for området og kan

I DK 175706 B1 I

I 10 I

I hensigtsmæssigt vælges blandt blegemidler, persyrer; såsom perbenzoesyrer, hypochlo- I

I ritter, f.eks. natriumhypochlorit, permanganater, f.eks. kaliumpermanganat; peroxider, I

I såsom bis(trimethylsilyl)peroxid; eller jod, fortrinsvis vandigt jord. I

I 5 Ifølge et andet og uafhængigt aspekt ved den foreliggende opfindelse tilvejebringes en I

I fremgangsmåde til fremstilling af en forbindelse med den almene formel ΠΙ [som oven- I

I for defineret], hvor nævnte fremgangsmåde omfatter kobling af en forbindelse med I

formlen IV som vist herefter (hvor J, K, m, p, X er som ovenfor defineret, R4 og R5, I

I som kan være ens eller forskellige, hver betegner en ligekædet eller forgrenet 1-10C- I

I 10 alkylgruppe, fortrinsvis methyl eller isopropyl, eller R4 og R5 sammen med nitrogen- I

I atomet derimellem betegner en 5-7-leddet heterocyklisk ring indeholdende 1, 2, 3 eller I

4 heteroatomer, idet et hvilket som helst tilstedeværende heteroatom udover nitrogen I

vælges blandt oxygen, nitrogen og svovl, og R6 svarer til R6a som ovenfor defineret, I

men er forskellig fra hydrogen) med en nukleotidsekvens med formlen Z", som svarer I

I 15 til en nukleotidsekvens med formlen Z' som ovenfor defineret, men hvor forbindings- I

I punktet til forbindelsen med formlen IV er ubeskyttet, således at der muliggøres kob- I

I ling på dette punkt, hvorved der opnås en forbindelse med formlen III som ovenfor de- I

I fineret. Når der ønskes en forbindelse med formlen III, hvori Rea er et hydrogenatom, I

I da kan phosphatbeskyttelsesgruppen fjernet under anvendelse af fremgangsmåder, som I

I 20 er kendt per se. I

Når der anvendes en forbindelse med formlen IV, hvori r4 0g r5 I

sammen med nitrogenatomet derimellem repræsenterer en hetero- I

cyklisk ring, kan ringen være mættet eller mindre foretrukket I

I 25 umættet og har hensigtsmæssigt 5 eller 6 ringled, f.eks. 6 I

I ringled. Den heterocykli ske ring vil hensigtsmæssigt ikke in- I

deholde mere end 2 heteroatomer, idet sådanne ringe kan eksem- I

plificeres ved piperidino- og morpholinogrupper, fortrinsvis I

H eo morpholinogruppe, f.eks. 4-morpholinogruppen. I

11 DK 175706 B1

Den erfarne nukleotidkemiker vil udvælge passende betingelser for binding af nukleotidsekvensen til bæreren og frigivelse af ^ den derfra og for den ovenfor nævnte kobling. Et hensigtsmæssigt punkt for forbindelse af forbindelsen med formlen IV er 5'-enden af ol igonuk1eotidsekvensen . Hensigtsmæssigt er nukleotidsekvensen bundet til bæreren før koblingsreaktionen. Koblingsreaktionen udføres hensigtsmæssigt i et apparat til den automatiserede syntese af nukleotider, såsom et DNA-synte-jq seapparat. Koblingen kan f.eks. gentages, såsom en eller to gange. Koblingen kan eventuelt udføres i nærværelse af et eller flere organiske opløsningsmidler, f.eks. polære opløsningsmidler, såsom dichlorethan eller acetonitril eller en blanding deraf.

15 Ifølge et andet og uafhængigt aspekt ved den foreliggende opfindelse tilvejebringes en fremgangsmåde til fremstilling af en forbindelse med den almene formel IV [som ovenfor defineret], hvilken fremgangsmåde omfatter, at man omsætter en forbindelse med den almene formel VI (som vist herefter) [hvor J, K, m, p og X er som ovenfor defineret, men R6a ikke repræsenterer hydrogen] med en forbindelse med den almene 20 formel V (som vist herefter), hvor R4, R5 og R6 er som ovenfor defineret, og L er en fortrængelig gruppe, hvorved der dannes en forbindelse med formlen IV som ovenfor defineret.

Der anvendes hensigtsmæssigt en forbindelse med formlen V, 25 hvori L er et halogenatom, især et chlor- eller bromatom, især et chloratom. Egnede reaktionsbetingelser vil være indlysende for fagmanden inden for området. Reaktionen udføres hensigtsmæssigt i nærværelse af en eller flere opløsningsmidler, såsom et aprotisk opløsningsmiddel, såsom en ether, eller halogenal-kan, såsom methylenchlorid eller carbontetrachlorid, men især et di ha 1ogenmethanopløsningsmiddel, såsom dichlormethan.

I DK 175706 B1 I

I 12 I

En forbindelse med den almene formel VI [hvor X betegner en direkte binding og J, K, I

I m og p er som ovenfor defineret] tilvejebringes ved en fremgangsmåde som omfatter, I

I 5 at man reducerer en tilsvarende forbindelse med den almene formel VII som vist heref- I

ter [hvor J, K, m og p er som ovenfor defineret, og R betegner en gruppe, som er repro- I

I ducerbar for den tilsvarende alkohol], hvorved der dannes en forbindelse med formlen ; I

I VI som ovenfor defineret. Reduktionen udføres hensigtsmæssigt i nærværelse af et re- I

I duktionsmiddel. Passende reduktionsmidler vil være indlysende for fagmanden inden I I

I 10 for området og omfatter f.eks. et kompleksmetalhydrid, såsom lithiumaluminium- I

I hydrid; eller diboran, hensigtsmæssigt lithiumaluminiumhydrid [H.C. Brown og S. I

I Krishnamurphy, Tetrahedron (1979), 35, side 567-607). Reaktionen kan eventuelt ud- I

I føres i nærværelse af et eller flere opløsningsmidler, såsom organiske opløsningsmid- I

ler, f.eks. et aprotisk opløsningsmiddel, især tetrahydrofuran (THF). Der anvendes hen- I

B 15 sigtsmæssigt en forbindelse med formlen VII, hvor R betegner inter alia, et carboxylsy- I

B reanhydrid, imidazolid eller ester deraf, såsom en alifatisk ester, især en alkylester, så- I

I som en Cl-6-alkylester, f.eks. methyl-, ethyl-, propyl-, pentyl- og hexylestere, fortrins- I

B vis en methylester. I

B 20 En yderligere fremgangsmåde til fremstilling af en forbindelse med den almene formel I

I VI [hvor X betegner -0-P(0)(0R6a)-0- og J, K, m, p og R6a er som ovenfor defineret] I

B omfatter, at man omsætter et phosphoryleret biotinolderivat med den almene formel I

B XIX [hvor J, K, m og R6a er som ovenfor defineret] med en passende diol med den al- I

B mene formel IX [hvor n er som ovenfor defineret], hvorved der dannes en forbindelse I

B 25 med formlen VI som ovenfor defineret. I

B En forbindelse med formlen XIX kan opnås ved omsætning af en forbindelse med den almene for- I

13 DK 175706 B1 mel VIII (hvor j.Kogm er som ovenfor defineret) med et phosphoryleringsmiddel. Det vil: forstås, at udvælgelsen af et hensigtsmæssigt phosphoryleringsmiddel vil muliggøre, at der kan fremstilles forbindelser med formlen XIX, hvor R6a betegner en phosphatbeskyttelses-gruppe R6 (som ovenfor defineret). Hensigtsmæssige phosphory-leringsmidler vil være indlysende for fagmanden inden for området og omfatter phosphorylchlorid og (substitueret)arylphos-phorodi(1,2,4-triazolid)er, såsom f.eks. 2-chlor-pheny1phos-phorodi(1,2,4-triazolid) , dannet f.eks. ved omsætning af 1,2,4-triazo1 og 2-chlorpheny1phosphorodich1 or i dat i nærværelse af en base, såsom pyridin. Phosphory1 er ing kan udføres i nærværelse af en blanding af et eller flere organiske opløsningsmidler, såsom et aprotisk opløsningsmiddel, f.eks. pyridin og lignende. En forbindelse med formlen VI, hvor R6a betegner hydrogen, kan selektivt beskyttes under anvendelse af fremgangsmåder, som er kendte per se, til opnåelse af en tilsvarende forbindelse, hvor R6a betegner en phosphatbeskyttel-sesgruppe R^ som ovenfor defineret.

! En yderligere fremgangsmåde til fremstilling af en forbindelse med den almene formel VI [hvor X betegner -S-, -O- eller N-R8, og J, K, m, R8 og p er som ovenfor defineret] 20 omfatter, at man omsætter en forbindelse med den almene formel X [hvor J, K og m er som ovenfor defineret, og L’ betegner en fortrængelig gruppe] med en forbindelse med den almene formel XI [hvor p er som ovenfor defineret, og Q betegner anionen af en hydroxygruppe, en thiolgruppe eller en amingruppe med formlen N-R8 (hvor R8 er som ovenfor defineret)], hvorved der dannes en forbindelse med formlem VI som ovenfor 25 defineret.

Hensigtsmæssige fortrænge1 ige grupper med formlen L' vil være indlysende for fagmanden inden for området og omfatter halogenatomer, såsom chlor eller brom, mesylat- og tosy 1atgrupper, hensigtsmæssigt en tosy 1atgruppe. Reaktionen kan udføres i I DK 175706 B1 I 14

I nærværelse af en blanding af en eller flere organiske opløs- I

I ningsmidler, såsom et aprotisk opløsningsmiddel, f.eks. di- I

methyl formamid (DMF) og lignende. Forbindelser med den almene I

I formel X kan fremstilles ud fra de tilsvarende biotinolderi- I

5 vater med formlen VIII under anvendelse af kendte fremgangsmå- I

der per se. Når der f.eks. ønskes en forbindelse med formlen X I

I med en tosy 1atgruppe som den fortrængelige gruppe L’, kan den- I

I ne hensigtsmæssigt fremstilles ved omsætning af den tilsvaren- I

I de alkohol med formlen VIII med et tosylhalogenid, såsom to- I

I sylchlorid. I

10 I

En yderligere fremgangsmåde til fremstilling af en forbindelse med den almene formel I

I VI [hvor J, K, m og p er som ovenfor defineret, og X betegner -CONH-] omfatter, at I

I man omsætter en forbindelse med den almene formel XH [hvor J, K og m er som oven- I

for defineret, og R' betegner en carboxylsyregruppe eller et derivat deraf] med en hy- I

15 droxyalkylamin med formlen XIII [hvor p er som ovenfor defineret], hvorved der dan- I

nes en forbindelse med formlen VI som ovenfor defineret. Hensigtsmæssige carboxyl- I

I syrederivater omfatter estere, såsom alifatiske estere, f.eks. Ci-C6-alkylestere; anhydri- I

I der og syrechlorider. Hensigtsmæssige reaktionsbetingelser vil være indlysende for I

I fagmanden inden for området. I

I 20 I

En yderligere fremgangsmåde til fremstilling af en forbindelse med den almene formel I

I VI [hvor J, K, m og p er som ovenfor defineret, og X betegner -NHCONH-] omfatter, I

I at man omsætter en forbindelse med den almene formel XVII [hvor J, K og m er som I

25 ovenfor defineret] med en forbindelse med den almene formel XVIU [hvor p er som I

. ovenfor defineret, og W betegner en fortrængelig gruppe], hvorved der dannes I

I en forbindelse med formlen VI. Hensigtsmæssige fortrængelige grupper vil I

15 DK 175706 B1 v*re indlysende for fagmanden inden for området og omfatter aryloxygrupper, såsom phenyloxy.

Forbindelser med den almene formel XVII kan opnås ud fra for-^ bindeiser med den almene formel XII som ovenfor defineret under anvendelse af fremgangsmåder, som er kendte per se, f.eks. under anvendelse af fremgangsmåder baseret på Curtius-omlej-ring. Forbindelser med den almene formel XVIII kan opnås ud fra tilsvarende aminer med formlen XIII {hvor p er som ovenfor defineret) under anvendelse af fremgangsmåder, som er kendte 10 per se.

En yderligere fremgangsmåde til fremstilling af en forbindelse med den almene formel VII, VIII eller XII [hvor J, K, m, p, R og R' er som ovenfor defineret] omfatter, at man 15 omsætter et tilsvarende derivat med den almene formel XTV, XV eller XVI [hvor J, K, m, p, R og R' er som ovenfor defineret] med en gruppe med formlen J’ og/eller med en grupper med formlen K' [hvor forbindelserne Γ og K’ er forstadier til delene henholdsvis J og K som ovenfor defineret], hvorved der dannes en forbindelse med formlen VII, VIII eller XII som ovenfor defi-20 neret. Hensigtsmassige reaktionsbetingelser vil være indlysende for fagmanden inden for området. Udtrykket "forstadier" anvendes heri til at betegne forbindelser, som er valgt således at omsætningen deraf med en forbindelse med formlen VIII som ovenfor defineret resulterer i indføringen af den ønskede gruppe eller de ønskede grupper J og/eller K til opnåelse af 25 den tilsvarende forbindelse med formlen VII. Således er, især når den valgte gruppe J og/eller K er en tetrahydropyrangrup-pe, f.eks. tetrahydropyran-2-yl eller 6-methoxytetrahydropy-ran-2-yl hensigtsmæssige forstadier derfor henholdsvis 2,3-di-hydropyran og 2-methoxy-2,3-dihydropyran. Når den valgte gruppe J og/eller K er en dimethoxytritylgruppe, er et hensigts-30 mæssigt forstadie derfor dimethoxytritylchlorid eller dimeth-oxytritylbromid.

I DK 175706 B1 I

I 16 I

Forbindelser med den. almene formel VIII er kendte, inden for I

I området, se f.eks. europæisk patentansøgning nr. 86302750.4 I

(publikationsnr. 202.758) eller kan fremstilles under anven- I

delse af fremgangsmåder, som er kendte per se ud fra kendte I

I 5 biotinderivater. I

I Forbindelserne med de almene formler IV, III og II som ovenfor I

I defineret er hidtil ukendte, og hver af de førnævnte almene I

formler repræsenterer et yderligere og uafhængigt aspekt ved I

10 den foreliggende opfindelse. Forbindelser med formlen VI menes I

også at være hidtil ukendte og udgør et yderligere træk ved I

I den foreliggende opfindelse. Sådanne forbindelser med formlen I

I VI vil omfatte forbindelser, hvori hverken J eller K kan re- I

I præsentere Ci_3-alkyl, Ci_3~alkenyl, acetyl, methoxycarbonyl, I

15 phenyl, benzyl eller benzoyl. I

I Forbindelser med formlen VII, hvori hverken J eller K kan re- I

I præsentere Ci_3-alkyl, Ci_3-alkenyl, acetyl, methoxycarbonyl, I

phenyl, benzyl eller benzoyl, udgør et yderligere træk ved den I

20 foreliggende opfindelse. I

H Særlige grupper af forbindelser omfatter sådanne med de oven- I

for nævnte formler, hvor X er en direkte binding, eller hvor m I

er 5, eller hvor p er 0, eller hvor X er -0-P(0)(0H)-0-, eller I

I 25 p er 8. Nærmere bestemte grupper af forbindelser omfatter så- I

danne med de ovenfor nævnte formler, hvor X er en direkte bin- I

I ding, m er 5, og p er 0, eller hvor X er -0-P(0) {OH)-0-, og p I

I er 8. I

30 Den foreliggende opfindelse angår også en fremgangsmåde, som I

omfatter to eller flere af de ovenfor definerede fremgangsmå- I

der i rækkefølge. Hensigtsmæssigt kan en hvilken som helst en I

eller flere af de ovenfor definerede fremgangsmåder udføres i I

et DNA-synteseapparat og således tilvejebringes ifølge et I

35 yderligere træk ved den foreliggende opfindelse et DNA-synte- I

seapparat, som er programmeret til at udvirke i det mindste en I

af de ovenfor definerede fremgangsmåder. Med undtagelse af I

fjernelse af basebeskyttelsesgrupper er fremgangsmåderne til I

17 DK 175706 B1 fremstilling af forbindelserne med formlerne I, la, II og/el-ler III særligt egnede til brug i et DNA-synteseapparat.

De ifølge den foreliggende opfindelse fremstillede biotiny-5 lerede oligonukleotidsekvenser kan hensigtsmæssigt anvendes som sonder, f.eks. til at påvise komplementære sekvenser, f.eks. ved hybridiseringsanalyser, på lignende måde som de derivater, som er fremstillet ved fremgangsmåder, der er kendte inden for området. Hensigtsmæssige sonder, som kan fremstilles 10 ifølge opfindelsen er beskrevet i europæisk patentansøgning pub 1 i kat ionsnr. 202.758.

Opfindelsen er illustreret, men ikke begrænset ved hjælp af de følgende eksempler, hvori oligonukleotidsekvensen interferon-15 02-55 er som følger:

AAGAAATACAGCCCG

Bogstaverne A til M, som står i parenteser i eksemplerne, re-20 fererer til figurerne i beskrivelsen umiddelbart efter eksemplerne.

Sammensætningen af forskellige reagenser i eksemplerne er som følger: 25

PBS - 150 mM NaCl + 10 mM natriumphosphat ved pH-værdi 7,4 SSC - 0,15 M NaCl + 0,015 M natriumcitrat Denhardt's reagens 0,02¾ BSA

0,02% "F i c o1" 400.000 30 0,02% PVP

Følgende forkortelser anvendes: DMF - dimethylformamid 35 DNA - deoxyribonuklei nsyre PBS - phosphatpufret saltopløsning SDS - natriumdodecy1 sulfat BSA - bovint serumalbumin I DK 175706 B1 PVP - polyvinylpyrroliden I HEPES - (N-2-hydroxyethyl-Nl-2-ethansulfonsyre) TRIS - tris(hydroxymethyl)aminomethan I NBT - nitro-blåt tetrazoleum I 5 BCIP - 5-brom-4-chlor-3-indolylphosphat I De følgende er handelsnavne: I "Fractos i 1" "Partisil" 10-SAX "Ficol" 400.00 I 10 "Triton"-X-100 "Core Buffer" "Nonidet" P40 I "Tween" "018-μ "Bondapak" I Eksempel 1

Biot i noly1 hydroxy-[S *-(i nterferon-a2^S S)]phosphi noxid (A) I 15 I Saltsyre (0,1 N, 600 μΐ) blev sat til hydroxy-[5'-(interferon- θ2-55)3-Ν^· - (tetrahydro-2-pyranyl) bioti noly 1 phosphi noxid (B) 0,1 μιηοΐ, som var opnået som beskrevet nedenfor, og blandingen fik lov til at henstå i 45 minutter ved 22eC. Ammoniumhydroxid I 20 {massefylde 0,91, 126 μΐ) blev tilsat, og det biotinylerede oligonukleotidderivat (A) blev derefter oprenset ved hjslp af en totrins-højtryksvæskekromatografi fremgangsmåde (HPLC) (som beskrevet af C.R. Newton et al.. Anal. Biochem, 1983, 129, I side 22-30).

H 25

Den første HPLC på "Partisil" 10-SAX-ionbytterharpiks (under

anvendelse af puffersystem VI) gav det biotinylerede oligonu- I

kleotid (A) som den mest tilbageholdte top med en retentions- I

H tid på 29,8 minutter. Det biotinylerede oligonukleotidderivat I

30 (B) havde en retentionstid på 28,9 minutter og moderoligonu- I

H kleotidsekvensinterferon-a2~55 (C) havde en retentionstid på I

H 28,6 minutter, når analyseret under identiske betingelser. I

Den anden HPLC på μ-,,Bondapak,, C-18 (10-45% i 40') giver (A) I

35 med en retentionstid på 20,0 minutter, (B) og (C) havde reten- I

tionstider på henholdsvis 24,0 og 18 minutter, når analyseret |

under identiske betingelser. I

19 DK 175706 B1

Det beskyttede biotinylerede o 1 igonuk1eotid (8), der blev anvendt som udgangsmateriale, blev fremstillet på følgende måde: a) N^-ftetrahvdropyran-2-vllbiotinmethvlester 5

Toluen-4-su1 fonsyremonohydrat {11,4 g) blev sat til en omrørt opløsning af frisk destilleret 2,3-dihydro-4H-pyran (10,2 g) og D{+ )-bi ot inmethy1 ester (3 g) [E.A. Bayer og M. Wilcheke, Methods of Biochemical Analysis, 26, side 1] i dichlormethan 10 (40 ml) ved 0°C. Blandingen blev omrørt i 10 minutter ved den ne temperatur og derefter ved 22eC i 1,5 time. Opløsningen blev vasket i rækkefølge med vand (50 ml), mættet natriumbi-! carbonatop 1øsning (50 ml) og mættet saltopløsning (50 ml), derefter tørret over vandfrit magnesiumsulfat og inddampet.

15 Resten blev taget op i den minimale mængde diethylether og tritureret med petroleumsether (kogepunkt 40°-60eC) til opnåelse af 1,8 g Nl-(tetrahydropyranyl)biot i nmethylester med smp. 120-122°, 45% udbytte masseion (M+ = 342), NMR 6 ((CD3)2S=0, "Bruker" WH 400 MHz) 6,85 (IH, s, H-3); 4,80 (IH, dxd, H,l’); 20 4,48 (IH, m, H,6a); 4,10 (IH, m, H-3a); 3,87 (IH, dxd, H-5’); 3,40 (IH, dxd, H-5’); 3,61 (3H, S, 0CH3); 3,15 (IH, m, H-4); 3,10 (IH, d, H-6); 2,83 (IH, dxd, H-6) ; 2,33 (2H, t, 2x H-10); 1,9-1,3 (12H, kompleks m, 2x H-7, 2x H-8, 2x H-9; 2x H,2’; 2x H-3’ , 2x H-4’ ) .

25 ! b) N* - (tetrahydropvran-2-vlIbiotinovl

En opløsning af Ni-(tetrahydropyran-2-y1)biotinmethylester (0,5 g) i tørt destilleret tetrahydrofuran (25 ml) blev dråbe-30 vis sat til en suspension af lithiumaluminiumhydrid (0,27 g) i tetrahydrofuran (25 ml) omrørt ved 0°C under en nitrogenatmosfære. Omrøringen blev fortsat i 30 minutter og derefter blev overskydende lithiumaluminiumhydrid ødelagt ved forsigtig tilsætning af en blanding af vand:tetrahydrofuran 1:19 vol/vol 35 (20 ml). Butan-l-ol (150 ml) blev tilsat efterfulgt af 1 N

saltsyre, indtil blandingen var lettere sur (pH-værdi 5,0).

Det vandige lag blev kasseret, og butanolopløsningen blev vasket to gange med mættet natriumbicarbonatopløsning (150 ml).

I DK 175706 B1 I

I 20 I

I derefter to gange med mættet saltopløsning {150 ml). Vand (150 I

ml) blev sat til butanolopløsningen, og blandingen blev ind- I

dampet under reduceret tryk ved 40®C. Resten blev fraktioneret I

på en søjle af silicagel (50 g; Merck Art. 9385) under anven- I

I 5 delse af CH2C12:CH3OH, 9:1 (vol/vol) som elueringsmiddel. Ef- I

I ter inddampning af opløsningsmidlerne fra kombinerede passende I

I fraktioner (som vist ved tyndlagskromatografianalyse på sili- I

cagel) blev der således opnået Ni-(tetrahydropyran-2-yl)bioti- I

I nol (0,33 g, 70% udbytte) som en olie. Masseion (M+ = 314). I

1 10 I

c) Methoxvmorpholi no-ΓΝ*-(tetrahvdropyran-2-yl)-biotinolyll- I

phosphin (D) I

I Chlor(methoxy)morpholinophosphin (0,13 g) blev i løbet af en I

I 15 periode på 5 minutter sat til en opløsning af N'-(tetrahydro- I

I pyran-2-yl)-biotinol (0,2 g) og N,N-di isopropylethyl amin (0,35 I

I g) i tørt dichlormethan (5 ml) omrørt ved 0®C under en nitro- I

I genatmosfære. Reaktionsblandingens temperatur blev forøget til I

22°C i løbet af en periode på 1 time, hvorefter blandingen I

I 20 blev inddampet. Den tilbageværende olie blev opløst i dichlor- I

methan og fraktioneret på en søjle af silicagel (50 g; Merck I

I Art. 9385) under anvendelse af triethylamin:ethylacetat 87:3 I

I vol/vol) som elueringsmiddel. Efter inddampning af opløsnings- I

I midler fra kombinerede passende fraktioner blev der således I

25 opnået methoxymorpho 1 i no-[lil-(tetrahydropy ran-2-y 1) biot i no- I

I lyljphosphin (D) (50 mg, 17% udbytte). Masseion (M+H)+ = <62. I

d) Hydroxy[5'-(interferon-a2“55)]-Nl-tetrahydropyran-2-yl- I

bi ot inolvlphosphinoxid (Bl I

I

Oen fuldt beskyttede oligodesoxyribonukleotidsekvens (c), der I

er kendt som sekvens 55 i en interferon-a2~gensyntese beskre- I

I vet af M.D. Edge et al. (Nucleic Acids Res., 1983, 11, 6419- I

6435 bundet til en reguleret poregi asbærer blev fremstillet på I

I 35 et "Appied Biosystems" 380A-DNA-synteseapparat ud fra 5'-di- I

methoxytrityl-N2-isobutyryl-2'-desoxyguanosin 0,2 pmol bundet I

til reguleret poreglas (porestørrelse 500A; partikelstørrelse I

125-174 mi kron; belastning 20-50 mikromol/g fra BDH Limited) I

21 DK 175706 B1 og 2-cyanoethy1-N,N'-di isopropy1aminophosphoramidi ter af 5’-dimethoxytrityl-N6-benzoyl-2'-desoxyadenosin, 5' -d i methoxy t r i -tyl-N*-benzoyl-2'-desoxycytidin, 5 ' -dimethoxytrity1-N1 2-isobu- tyry1-2'-desoxyguanos i n og 5'-dimethoxytri ty 1thymidi η (BOH 5 Chemicals Ltd). [Alternativt kan den fuldt beskyttede oligo-desoxyribonukleotidsekvens fremstilles ved hjælp af manuelle fremgangsmåder som beskrevet af Atkinson og Smith i "Oligonucleotide Synthesis, a Practical Approach". (M.J. Gait udgiver, IRL Press, Oxford, Washington DC side 35-81)). En opløsning af 10 methoxymorpholi no-[Ni-{tetrahydropyran-2-y1)biotinolyl]phos- phin (0) 12,6 mg i 1,2-dichlorethan:acétonitri1 (2:3 vol/vol) (0,6 ml) blev anvendt i stedet for et konventionelt nukleosid-phosphoramidit i en modificeret koblingsreaktion på et "Applied Biosystems" 380A-DNA-synteseapparat og sat til 5'-enden af 15 den fuldt beskyttede oligodesoxyribonukleotidsekvens interfe-ron-<X2“55 (C) til opnåelse af en [5'-(interferon-a2-55)]-meth-oxy-N1-(tetrahydrofuran-2-yl)bi ot i no 1y1phosphi η (E), hvor oli-godesoxyribonukleotidsekvensen er fuldt beskyttet som beskrevet ovenfor. Den modificerede koblingsreaktion omfattede føl-20 gende: fjernelse af 5'-dimethoxytritylgruppen fra den fuldt beskyttede sekvens med 3¾ trichloreddikesyre i 1,2-dichlor-methan, og 25 2 dobbeltkobling i 20 sekunder og 5 sekunder af det ovenfor nævnte phosphin (D) til den ovenfor i (1) nævnte oligonukleo-tidsekvens. Derefter fulgte jodoxi dation af den således opnåede fuldt beskyttede [ 5 ' - (i n ter f eron-ct2-55 ) }met hoxy-N 1-(t et ra- 30 hydropyran-2-y1)bi ot i no 1y1phosphi η (E) til opnåelse af det tilsvarende phosphat (F). Dette phosphatderi vat blev derefter delvis afbeskyttet til fjernelse af alle phosphatbeskytte 1 sesgrupper og oligonukleotidsekvensen afspaltet fra den regulerede poreg1 asbærer. Begge operationer blev udført automatisk på 35 DNA-synteseapparatet under anvendelse af en passende mængde thiopheno1 at i on og derefter ammoniumhydroxid (massefylde 0,91). Den opnåede ammon iumhydroxi dopiøsning blev derefter opvarmet ved 55®C i 6 timer, derefter inddampet og resten inde-

I DK 175706 Bl I

I 22 I

holdende hydroxy-[5'-(interferon-a2-55]-Ni-(tetrahydropyran-2- I

I yl)-biotinolylphosphinoxid (B) opløst i ethanol/vand (3:7 I

I vol/vol. 1,5 ml). Denne opløsning blev derefter anvendt direk- I

te i det efterfølgende afbeskyttelsestrin. I

I 5 I

Eksempel 2 I

I Biotinolylhydroxy-[5'-(interferon-g2-55)3phosphinoxid (A) I

I Ni-(4,4'-dimethoxytri tyl)biot i noly1 hydroxy-[5'-(interferon-e2~ I

I 10 55]phosphinoxid (G) 0,1 pmol, der var opnået som beskrevet I

I nedenfor, blev behandlet med 2 ml 80% eddikesyre indeholdende I

I 4 dråber pyridin ved stuetemperatur i 20 minutter. Eddikesyre I

I blev fjernet ved inddampning ved reduceret tryk og derefter I

I azetropbehandlet med vand (2 ml) og n-butanol (0,5 ml). Det i I

I 15 overskriften nævnte oligonukleotid (A) blev taget op i 1,5 ml I

I 15% ethanol, H2O og oprenset ved en to-trins højtryksvæskekro- I

I matografi fremgangsmåde (HPLC) som beskrevet i eksempel 1. I

I Den første HPLC på "Partisil" 10-SAX (60% formamid, 0-100% i I

I 20 50', lineær gradient) gav det i overskriften nævnte biotiny- I

H lerede oligonukleotidet (A) som den mest tilbageholdte top med I

I en retentionstid på 17 minutter som sammenlignet med 16 minut- I

I ter for moderoligonukleotid (C). Den anden HPLC på p-"Bonda- I

I pak" C-18 gav retentionstider på henholdsvis 31,0 og 28,8 mi- I

I 25 nutter. Når gentaget med p-"Bondapak" (10-100% i 40') blev der I

henholdsvis iagttaget retentionstider på 29,3 og 14,4 minut- I

I I

I Det beskyttede biotinylerede oligonukleotid (G), der blev an- I

I 30 vendt som udgangsmateriale, blev fremstillet på følgende måde: I

I a) N*-(4.4 *-dimethoxytri tyl)bioti nmethyl ester I

I En opløsning af vandfrit D(+)biotinmethylester (5,0 g; tørret I

I 35 ved azeotrop destillation med vandfrit pyridin) og 4,4'-dime- I

I thoxytritylchlorid (7,25 g) i vandfrit pyridin (125 ml) blev I

I omrørt ved 22®C i 1 time. Methanol (20 ml) blev tilsat, og I

blandingen inddampet. Resten blev opløst i methy1ench1 or id I

23 DK 175706 B1 (300 ml) og vasket i rækkefølge med mættet natriumbicarbonat-opløsning (2 x 200 ml) og mættet saltopløsning (2 x 200 ml), derefter tørret over vandfrit magnesiumsulfat og inddampet.

Den tilbageværende olie blev opløst i methylenchlorid (80 ml) 5 og oprenset på et "Waters Prep" 500 HPLC 2 patronsystem (Waters Associates, Inc.) under anvendelse af en gradient på 0 til 8% methanol i methylenchlorid (81). Efter inddampning af passende fraktioner (300 ml; 14 til 16) blev der således opnået N1-(4,4 ’-dimethoxytri ty 1)bi ot inmethylester som et gylden-10 gult fast stof. Masseion (M+ = 560, NMR δ (CDC13, 200 MHz) 7,22 (9H, m, aromatiske protoner); 6,83 (4H, d, aromatiske protoner); 4,94 (IH, bred s, NH); 4,35 (2H, m, H3a,H6a); 3,78 (3H, s, methoxyprotoner); 3,68 (3H, s, methy1 esterprotoner); 3,11 (IH, m, H4); 2,47 (IH, dxd, J gem = 13 Hz, Ji6;6a = 1,7 15 HZ; H6) 2,29 (2H, t, J9;10 6,7 Hz, 2x H10); 2,27 (IH, dxd, J gem = 13 Hz Jgja® 5»3 Hz;Hg); 1,5 (6H, kompleks multiplet, 2x Hg, 2xH, 2 xHg). (4,4 g; udbytte 40%).

b) Nl-(4,4,-dimethoxvtrityl)biotinol 20

En opløsning af Nl-(4,4'-di methoxytr i tyl)biotinmethylester (4,0 g) i tørt destilleret tetrahydrofuran (300 ml) blev dråbevis sat til en suspension af lithiumalumini umhydr i d (1,3 g) i tetrahydrofuran (130 ml) ved 22eC. Omrøringen blev fortsat i 25 20 minutter, derefter blev overskydende 1ithiumaluminiumhydrid ødelagt ved forsigtig tilsætning af en blanding af vand:tetra-hydrofuran (1,19 vol/vol; 100 ml). Butan-l-ol (500 ml) blev tilsat, og blandingen vasket i rækkefølge med mættet natrium-sulfatopløsning (100 ml) og vand (100 ml) og derefter inddam-30 pet under reduceret tryk ved 40eC. Den tilbageværende brune olie blev opløst i methylenchlorid (80 ml) og fraktioneret på et "Waters Prep" 500 HPLC 1 patronsystem under anvendelse af methanol:methylenchlorid (1,9 vol/vol) som elueringsmiddel.

Efter inddampning af passende fraktioner (150 ml; 5 til 8) 35 blev der således opnået Ni-(4,4'-dimethoxytri ty 1)bioti nol som en brun olie. Masseion (,M+ = 532), (3,02 g, 80% udbytte).

i

I DK 175706 B1 I

I 24 I

c) ΓΝ*- (4,4 1 -dimethoxytr -i tyl )biotino1vl lmethoxymorphol i no- I

I phosphin (H> I

I På en måde svarende til den i eksempel 1 beskrevne del (c), I

5 men under anvendelse af N*-(4,4 '-dimethoxytrityl)biotinol i I

I stedet for N*-(tetrahydropyran-2-ylJbiotinol blev der opnået I

I [N*-(4,4’-dimethoxytri tyl)biotinolyllmethoxymorpholinophosphiη I

I (H) som en farveløs olie i et udbytte på 44% med de følgende I

I NMR-data: (CDCI3, 200 KHz) 7,22 (9H, m, aromat i ske protoner); I

I 10 6,80 (4H, d, aromatiske protoner); 4,92 (IH, s, NH); 4,33 (2H, I

m, H3a; Hea); 3,8 (3H, s, methoxyprotoner); 3,68 (IH, m, H4); I

I 3,6 (2H, t, J1 o; 11 * 4,2 Hz 2x Hn); 3,45 (3H, d, Jp, OCH3 = I

I 11,7 Hz, P-0CH3); 3,12 (4H, m, morpholinoprotoner); 2,47 (IH, I

dxd, J gem = 13,3 Hz, Je;6a * 15 Hz;Hg); 2,26 (IH, dxd, J gem I

I 15 = 11,7 Hz, J6;6a = 5,0 Hz;Hg), 1,52 (8H, kompleks multiplet, I

I 2x H7, 2x Hg, 2x Hg, 2 X H^q)· I

d) fNi-(4,41-dimethoxytri tylIbiotinolyl]hydroxy-[5’-(inter- I

H feron-a2“55]phosphinoxid (G) I

I I

I Den fuldt beskyttede interferon-a2~55-sekvens (C), der var I

bundet til en reguleret poreg1asbsrer, blev fremstillet som I

beskrevet i eksempel 1, del (d). [N1-(4,4'-dimethoxytri ty 1)- I

biotinolyl Jmethoxymorphol inophosphin (H.) som opnået i (c) I

' 25 ovenfor blev anvendt i stedet for et konventionelt nukleotid i I

en modificeret koblingsreaktion på et "Applied Biosystems" I

380A-DNA-synteseapparat og sat til 5’-enden af den ovenfor I

nævnte ol igodesoxyribonukleotidsekvens i nterferon-ot2-55 til I

opnåelse af et Nl-(4,4'-dimethoxytrityl)biotinolyl-[5'-(inter- I

30 feron-02~55)]methoxyphosphin (J), hvor oligodesoxyribonukleo- I

tidsekvensen er fuldt beskyttet som beskrevet ovenfor. I

Den modificerede koblingsreaktion omfattede følgende: I

(4,4’-dimethoxytri tyl)biotinolylJmethoxymorpholinophosphin I

35 (H) (100 mg) blev azetropbehandlet tre gange med vandfrit I

CH3CN og derefter opløst i 1,2-dichlorethan (333 μΐ); CH3CN I

I (222 μΐ). I

25 DK 175706 B1

Et "Applied Biosystems Synthesiser" synteseprogram i lille målestok abibc 103 med et 3 x 100 sekunders koblingstrin (normal procedure 1 x 30 sekunder) uden noget tiIdskningstrin og efterfulgt af jodoxidation af phosphitgruppen til opnåelse af et 5 phosphat (K). Phosphatbeskyttelsesgrupperne blev fjernet, og oligonukleotidet blev afspaltet på synteseapparatet fra bæreren under anvendelse af ammoniumhydroxid (massefylde 0,91) og basebeskyttelsesgrupperne blev derefter fjernet ved behandling med ammoniak med en massefylde på 0,910 (50°C og 4 til 5 ti-10 mer) til opnåelse af det i overskriften nævnte phosphinoxid (G) som blev anvendt direkte i det næste trin.

Eksempel 3

Bioti noly1 hydroxy-[5'-(interferon-a2“55)]phosphinoxid (A) 15

Hydroxy-[5'-(interferon-a2_55)-Nl-(6-methoxyte t rahydropyran-2-y1)bi ot i noly1phosphinoxid (L), der var opnået som beskrevet nedenfor, blev behandlet med saltsyre (0,1 N, 600 μΊ) , og blandingen fik lov til at henstå i 45 minutter ved 22°C. Ammo-20 niumhydroxid (massefylde 0,91, 126 μΐ) blev tilsat, og det i overskriften nævnte bi ot i ny 1erede o 1 igonuk1eotid (A) blev derefter oprenset ved hjælp af en højtryksvæskekromatografi fremgangsmåde (HPLC) som beskrevet i eksempel 1.

25 Den første HPLC på "Partisil" 10-SAX (60% formamid, 0-100% i 50', lineær gradient) gav det i overskriften nævnte biotiny- lerede oligonukleotid (A) som den mest tilbageholdte top med en retentionstid på 22,2 minutter sammenlignet med 21,5 minutter for modero 1 i gonukleot i det (C). Den anden HPLC på μ-’’Bonda-30 pak" C-18 (10-45% i 40’) gav re tent i onst i der på henholdsvis 17,5 og 16,0 minutter.

Det beskyttede biotinylerede oligonukleotid, der blev anvendt som udgangsmateriale, blev fremstillet på følgende måde: 35

DK 175706 B1 I

a) Nl-(6-methoxvtetrahvdropyran-2-vl)biotinmethvlester I

Den i eksempel 1, del (a) beskrevne fremgangsmåde blev genta- I

get med 2,3-dihydro-2-methoxy-4H-pyran som erstatning for 2,3- I

5 di hydro-4H-pyran. Det ubehandlede produkt blev oprenset ved H

flashsi 1icagelkroroatografi (Merck Kieselgel 60, Art. 9385) un- H

der anvendelse af methylenchloridrmethanol (94:6 vol/vol) som H

elueringsmidde1. Efter fjernelse af opløsningsmidlerne fra H

passende fraktioner blev den i overskriften nævnte forbindelse I

10 således opnået i et udbytte på 22% med de følgende NMR-data: I

6 (C0C13, 200 MHz) 5,78 og 5,63 (IH, 2s, NH proton), 5,46 (IH, I

dxd, methoxy-THP-proton); 4,77 (IH, br.d, methoxy-THP-proton); I

i 4,48 (IH, kompleks multiplet, H3a); 4,22 (IH, kompleks multi- I

15 plet, Hga); 3,68 (3H, s, methylesterprotoner); 3,68 (3H, d, I

methoxy-THP-protoner); 3,44 (3H, d; methoxy-THP-protoner); I

3,18 (IH, kompleks multiplet H4); 2,86 (2H, kompleks multi- I

plet, 2 xHø}; 2,32 (2H, t, 2 xH10); 1.58 (12H, m, methoxy-THP- I

protoner og 2 χΗγ, 2 xHg og 2 xHg).

b) Ni-(6-methoxvtetrahvdropyran-2-vl)bi ot i nol H

Den i eksempel 1, del (b) beskrevne fremgangsmåde blev gen- H

taget med N1-(6-methoxytetrahydropyran-2-y1)bi ot inmethylester H

25 som erstatning for Ni-{tetrahydropyran-2-y1)bi ot inmethylester H

til opnåelse af den i overskriften nævnte forbindelse i et H

udbytte på 42%. Masseion (M+H)+ = 345. H

c) Methoxy-[Ni-(6-methoxvtetrahvdropyran-2-vl1 bi ot i nolyl1 - H

30 morpholinophosphin (Ml H

Den i eksempel 1, del (c) beskrevne fremgangsmåde blev gen- H

taget med Ni-(6-methoxytetrahydropyran-2-y1)biotinol som er- H

statning for N^-(tetrahydropyran-2-y1)bi ot i nol og triethyl- H

35 amin;ethylacetat (4:1, vol/vol) som erstatning for tri ethyl- H

amin: ethyl acetat (7:3, vol/vol) som el ueringsmiddel til opnå- H

else af den i overskriften nævnte forbindelse (M) i et udbytte H

på 20%. Masseion (M+H)+ 492. I

27 DK 175706 B1 d) Hydroxy- [5- (interferon-a2-55)]-N1~(6-">ethoxytetrahydropy-ran-2-viIbiotinolvlphosphinoxid (L)

Den fuldt beskyttede interferon-02~55-sekvens, som var bundet 5 til en reguleret poregi asbærer, blev fremstillet som beskrevet ovenfor og blev anvendt i stedet for et konventionelt nu-kl eotidphosphoramid it i en modificeret koblingsreaktion på et "Applied Biosystems" 380A-DNA-synteseapparat og sat til 5'-en-den af oligodesoxyribonukleotidsekvensen interferon-02~55 (C) til opnåelse af en [5’-{interferon-a2-55)]methoxy-N1-(6-meth-oxy tet rahydropyran-2-y 1) b iot i’noly lphosph i η (N), hvor oligo-desoxyribonukleotidsekvensen er fuldt beskyttet som ovenfor beskrevet. Den modificerede koblingsreaktion omfatter følgende : 15

Methoxy-[Nl-(6-methoxytetrahydropyran-2-yl)biotinolyl]morpho-linophosphin (M) (78 mg) blev azeotropbehandlet tre gange med vandfrit CH3CN og derefter opløst i 1,2-dichlorethan (360 μΐ), CH3CN (240 μΐ ) .

20

Et "Applied Biosystems Synthesiser" synteseprogram i lille målestok abibc 103 med et 3 x 100 sekunder koblingstrin (normal procedure 1 x 30 sekunder) uden noget tildækningstrin og efterfulgt af jodoxidation af phosphi tgruppen til phosphat (P).

25 Phosphatbeskyttelsesgrupperne blev fjernet, og o 1 i gonukleot i -det blev afspaltet fra bæreren på synteseapparatet under anvendelse af ammoniumhydroxid (massefylde 0,91), og basebeskyttelsesgrupperne blev derefter fjernet ved behandling med ammoniak med massefylde på 0,910 (50°C og 4-5 timer) til opnåelse 30 af det i overskriften nævnte phosphinoxid (L), som derefter blev taget op i 1,5 ml 15% EtOH, H2O til anvendelse direkte i det næste trin.

Avidin-agarosebinding af bi ot i ny 1erede o 1 igonukleoti der ifølge 35 den foreliggende opfindelse er illustreret ved hjælp af det følgende:

Biotinyleret oligonukleotider i 0,5 ml puffer (PBS, 0,1% "Tween" 20) blev sat til en søjle (0,2 ml) af av i d i n-agarose

I OK 175706 B1 I

I 28 I

B (Sigma Chemical Company Ltd) indeholdende 7,4 enheder af et I

I avidin. Søjlen blev vasket med PBS, 0,1% ''Tween'* og fraktioner I

I (0,5 ml) blev opsamlet. Moderoligonukleotidsekvensen interfe- I

I ron-02-55 (C) passerede gennem søjlen uden at blive tilbage- I

I 5 holdt. I

I a) En opløsning af biotinyleret o 1 igonukleotid (A), som frem- I

stillet i eksempel 2, (0,43 OD2 60“en^ec,er) i puffer blev på- I

ført avidin-agarose-søjlen. I alt blev 0,06 OD260-enheder ud- I

I 10 vundet fra søjlen. Procent (A), som blev tilbageholdt, var så- I

I ledes 86%. I

I b) En opløsning af (A), som var fremstillet i eksempel 3, I

I (0,25 0D2S0“enheder) i puffer blev påført av id in-agarose-søj- I

15 len. I alt blev 0,041 0D260“enheder udvundet fra søjlen. Pro- I

cent tilbageholdt (A) i søjlen var således 84%. I

c) En opløsning af det beskyttede biotinylerede oligonukleotid I

I (L) (0,294 0D260"enheder) i puffer blev påført søjlen. I alt

I 20 blev 0,222 0D260-en^eder udvundet fra søjlen. Procent tilbage- I

I holdt (L) var således 24%. I

d) En opløsning (A), som fremstillet i eksempel 1, (0,42 I

I OD260-en^eder) i puffer (0,5 ml) blev påført avidin-agarose- I

I 25 søjlen (0,55 ml; 21 enheder avidin som ovenfor beskrevet. I I

I alt blev 0,076 00260-en^eder udvundet fra søjlen. Procent I

I tilbageholdt (A) var således 82%. I 1

Hybridiserinqseksempel I

I 30 I

I ( Flere fortyndinger af plasmider 1205 (indeholdende 02“ i nterfe- I

I ' rongensekvensen) og F6 (indeholdende gensekvensen fra F6 02- I

I interferonanalogen) (se f.eks. europæisk patentansøgning pub- B

I likationsnr. 202758) blev plettet på nitrocellulose (Schlei- I

I 35 cher & Schuell, BA 85-SB) under anvendelse af et Schleicher B

I Schuell Minofold" II (første plet 1 pg, derefter 3 gange for- B

I tyndinger). Før pletning blev hver piasmidfortynding alkalisk B

I denatureret ved lOO’C i 10 minutter i 300 μΐ 0,2 M NaOH, 7x B

29 DK 175706 B1 SSC, 56 mM Tris HC1 pH 7,4, derefter afkølet i et isbad og neutraliseret ved tilsætning af 70 μΐ 1M Tris HCl pH-værdi 7,0. DNA'et blev imroobi1 i seret ved bagning af nitrocellulosen ved 80°C i 2 timer under vakuum.

5

Filtre blev præhybridi seret i 1 time ved 65eC i 5X Denhardts, 5 x 55C, 50 mM natriumphosphat pH-værdi 7,0, 1% glycin, 0,1% SDS, 100 pg.ml lydbehandlet og kogt sildesperm DNA. Hybridi-seringen blev foretaget natten over ved stuetemperatur i 5x 10 SSC, 0,5% "Nonidet" P40 (BOH 56009), 250 pg/ml t RNA (Sigma Type X- 5, R0128), med ol i gonukleoti det til stede i 50 gange molært overskud. Præhybridi ser ing og hybridisering blev udført i lukkede plastposer.

15 Efter hybridisering natten over blev filtrene vasket to gange (idet hver vask varede 5 minutter) ved stuetemperatur i 6x SSC, 0,6% natriumpyrophosphat, 20 mM natriumphosphat, pH-værdi 7 og derefter en gang i den samme puffer ved 40eC i 3 minutter. Pletter af hybridiseret sonde blev visualiseret under an-20 vendelse af BRL DNA-påvisningssæt (kat. nr. 82395A). Filtrene undergik kortvarigt de følgende inkubationer: 1. Stuetemperatur 1 minut i 0,1 M Tris.HCl pH-værdi 7,5, 0,1 M NaCl, 2 mM MgCl2, 0,05% (vol/vol) "Triton" X-100 (puffer 25 1) 2. 37*C, 20 minutter i 3% (vol/vol) BSA i puffr 1 (puffer 2) 3. Stuetemperatur, 10 minutter i puffer 1 indeholdende 2 pg.ml streptavidin (omtrentlig 3 ml opløsning/100 cm* ni-trocellulose).

30 4. Stuetemperaturvask i 3 minutter i puffer 1.

5. Som 4.

6 . Som 5.

7. Stuetemperatur, 10 minutter i puffer 1 indeholdende 1 pg/ml biotinyleret alkalisk phosphatase (omtrentlig 3 ml 35 opløsning/100 cm* nitrocellulose) 8. Stuetemperaturvask i 3 minutter i puffer 1 9. Som 8.

10. Stuetemperaturvask i 3 minutter i 0,1 M Tris. HCl (pH-vær-

I DK 175706 B1 I

i I

di 9,5), 0,1 N NaCl, 50 mM MgCl2 (puffer 3). I

11. Som 10. I

12. Stuetemperatur med alkalisk phosphatasesubstratopløsning I

(NBT/BCIP i puffer 3)(f.eks. som beskrevet af Leary et I

5 al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1983), 80, 4046). I

Inkubationer 1-11 blev udført i sandwichkasser. Substrat i nku- I

bation 12 blev udført i en lukket plastpose i mørke. Farve fik I

lov til at udvikle sig i ¼ time, efter hvilket tidsrum den 37 I

I 10 ng 1205 plet var synlig på filteret. Færre F6-pletter var syn- I

lige på grund af destab i 1 i ser ing af hybridet forårsaget af de I

forkert matchede i denne analog.

I 15 I

B 20 I

B 25 I

B 30 I

35 I

31 DK 175706 B1

Formler, som der refereres til i eksemplerne o <A>

HN NH

Hc^-OH

^)>wr(ch2)5-o-p-o—^-a-g-a-a-a-t-a-c-a-g-c-c-c-g| o o \ /

HC3-£jH OH

^ sr^>iUt (CH2)5*°'J"°-^'a'g-a-a-a-t-a-C-A-G-C-C-C-g| 0

Ja-A-G-A-A-A-T-A-C-A-G-C-C-C-gJ

I DK 175706 B1 I

I 32. I

I CuA.

I °^\ / · I

HT vH fa3 _ (DJ I

i ” ^s>cra(CT2,5-0-P-/^0 I

I o jk . <*> I

I vP 7 I

» Hrå—-Ah och3

I C^s^3f(a(CH2)5-o-p-o—|a-a-g-a-a-a-t-a-c-a-g-c-c-c-g| I

I

Η I

I 0-\/ <« I

I 35 Η Λ H 0CH3 I

I ^ ^3(fff(CH2)5-0-P-0—^-a-g-a-a-a-t-a-c-a-g-c-c-c-g| I

o I

40

I 4S I

I O · I

I » <g> I

I I il 7—vH 0H I

I ^OCT k s ^ (frrira2)5'0“!“°'^“A-G-A“A-Å-T-A-C-A-G-C-C-C-Gj I

I o I

DK 175706 B1 il· /=jp («)

CH,0-<\ /Vc- N ^NH

3ΥΥΥ \ / Y Π Hci-éaH OCH, ,0 L jl / \ I 3 / \ Y C 3«ii(CH,)«.-0-F-0—N 0 0CH3 2 5 \_/ 15 O · 20 /- CHjO-Λ Λ-c- n ^nh (J) OCH..

'ss. U / \ If . η

25 C 3iai(CH,),.-o-p-o—|a-a-g-a-a-a-t-a-c-a-g-c-c-c-g I

OCH3 2 5 d{_ J

30 /=P (ϊ)

31 CH3°Y /)"C N

Jj Y ηΛ-fejH OCH3 C J^(Cf i (CH?) ς-0'P-O—Ta-A-G-A-A-A-T-A-C-A-G-C-C-C-g]

40 och3 II dL J

o 45 (L)

CH,0 _f 1- N KH

» \ /

H C>-£jH OH

^ ^(Hf (0^)5-0-^-0-^a-a-g-a-a-a-t-a-c-a-g-c-c-c-gJ

55 o

I DK 175706 B1 I

s n (M) I

5 CH30 -J N HH I

Hrå-fc]H 0CH3 I

„ Vs^K,iiCH2,5-°-'-i\_y° I

™30 -O- w I

H -£lH OCH I

20 7 \ 1 Γ 1 I

C· ^«fr(CH2)5-o-p-o—U-a-g-a-a-a-t-a-c-a-g-c-c-c-g I

S dl I

W —i

25 I

CH,0—f L N^^NH I

» 3 \ / (P) I

H/—\H f^3 I

^ (Ch2)5-o-p-o—|a-a-g-a-a-a-t-a-c-a-g-c-c-c-g1 I

3S O ^ I

Fomulaø I

40 O I

, ΗΗ^^ΝΗ I

HC^ H OK I

^^««(CBzVx-taijip-o-p-0-2 I

° I

50 I

DK 175706 B1 3Γ o

S HN^^NH

H ^-Å U OR6a ,e C. JWtCT^-X-fCH^p-O-P-O-Z' (la) s p o is

O

j-ν'""n-k 10 H ^-L H OR6 / \ I a <n> \s>( («2>B-X-(CH2)p-0-P-0-*' * · 0 o

30 J- Ν'"^H-K

η ^-Å H OR6 7 \ I 3 (III) ! o

J-N^^N-K

VH I ^ (IV) <s C >(t»iæ2>^X-Wp-0-P-N\R5

S

50 OR6 , L-P—HC 5 ^ΪΓ

SS

I DK 175706 B1 I

(VI) I

<Cs3«[,(c«2)„-i-(a'2)p-0H I

“ J-H K I

^ I

o

J-N'^^'K-K I

h4 £)H I

/ \ (VIII) I

30 <s^ ^W(CH2)a—0H I

o

hn^^nh I

Ek—(rv) I

Ks^{iif(CR2^™ I

o I

HN^^KH I

s> -/η (XVI) I

^JWiCV— **' i i DK 175706 B1 3> o

J-N *^N-K

hL-^h \s^(i(i(CH2)iTNH2 (XVII) 10

O

1 II

is V—C NH(CH2)—OH (XVIII)

O

- ^

N-K

H CS"-^1H O

/ \ II (m)

25 J(fff(CH2)~ O —B-OH

L·6 Λ 30 HO-(CH2)p-OH (IX) 35 o

J-N^^N-K

w ' -L' chch2)p-oh (XI) j o '

J-N ^N-K

—År SS / \ (XII) C^s^)fm(CH2)—R'

I DK 175706 B1 I

H2N-(CH2)p-OH (XIII) I

KN NH I

-L· (™) I

^Χ«(<χ2)ατ^Γ-R I

d I

H

Claims (15)

1. 5 JL HH NH H ^^ H øg® ^ S * " i P |j O 10 hvori m er 4 eller 5, X betegner en direkte binding -0-P(0)(0R6a)-0-, -S-, -O-, -CONH-, -NHCONH- eller N-R8, hvor R8 betegner en ligekædet eller forgrenet Cmo-alkylgruppe, p er et helt tal fra 0 til 16 med det forbehold, at når X er forskellig far en direkte binding, er p et helt tal på mindst 2, R6a betegner et hydrogenatom eller en phosphatbeskyttelsesgruppe, og Z’ betegner en nukleotidsekvens i ubeskyttet form eller 15 i en form, hvor base- og/eller phosphatdelene har en eller flere beskyttelsesgrupper og nukleotidsekvensen eventuelt er bundet til en bærer, hvilken fremgangsmåde omfatter, at man afbeskytter en forbindelse med formlen II: 0
2. 20 H{^-0R6a ^ s >CC(f (CH2)n-I-(CH2)p-0.P-0-2'· 0 hvori m, p, X, R6a og Z' er som ovenfor defineret, og J og K, som kan være ens eller forskellige, hver betegner et hydrogenatom eller en beskyttelsesgruppe, som er forlige-25 lig med nukleotidphosphorylering, hvilken gruppe forøger lipofiliciteten af forbindelsen, idet i det mindste en blandt J og K er forskellig far hydrogen, hvorved der ved fjernelse af enhver J- eller K-gruppe, som er forskellig fra hydrogen, opnås en forbindelse med formlen la. I DK 175706 B1 I I 40 I
3. 2. Fremgangsmåde ifølge krav I, hvori J og/eller K betegner tetrahydropyranyl, fu- I I ryl, dimethoxytrityl, xanthenyl, tetrahydrothiopyranyl, benzoyl eller en acylgruppe. I I I
4. 3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, hvori R6„ betegner hydrogen, methyl, 2- I I cyanoethyl, 2-chlorphenyl, 2,2,2-trihalogen-l,l-dimethylethyl, 5-chlorquinolin-8-yl, 2- I methylthioethyl eller en 2-phenylthioethylgruppe, valgfrit substitueret på phenylringen I I med halogen eller N02. I I I
5. 4. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, hvori J og/eller K be- I I tegner tetrahydropyran-2-yl, 6-methoxy-tetrahydropyran-2-yl, eller dimethoxytrityl. I
6. 5. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, hvori kun en af I I 15 J og K betegner en beskyttelsesgruppe, den anden af J og K betegner hydrogen. I
7. 6. Fremgangsmåde til fremstilling af en forbindelse med formlen Π: I I ° I
8. 20 I I 0R6a . I I V. 3f«t(CH2)B-I-(CH2) -0-P-0-Z' I * II som defineret i et hvilket som helst af kravene 1-5, hvilken fremgangsmåde omfatter, at I I 25 man oxiderer en tilsvarende forbindelse med formlen III: I I I I i I 7~f p‘. I
9. 30 P hvor m, p, J, K, Z', X og R68 er som ovenfor defineret. I I
10. 7. Forbindelse med formlen Π: o
11. 5. W" “ · o hvori m, p, X, R6,, Z\ J og K har de i et hvilket som helst af de foregående krav nævnte 10 betydninger.
12. 8. Fremgangsmåde til fremstilling af en forbindelse med formlen III: o j 15 ^fWf(CH2)n-X-(CH2)p-0-P-0^' hvori J, K, m, p, X, R6a og Z' har de i et hvilket som helst af kravene 1-5 nævnte betyd-20 ninger, hvilken fremgangsmåde omfatter, at man kobler en forbindélse med formlen IV: o J— Γ ^ hvori J, K, m, p og X er som ovenfor defineret, og R4 og R5, som kan være ens eller forskellige, hver betegner en ligekædet eller forgrenet l-10C*alkylgruppe, eller R4 og R5 sammen med nitrogenatomet derimellem betegner en 5-7-leddet heterocyklisk ring 30 indeholdende 1, 2, 3 eller 4 heteroatomer, idet et hvilket som helst tilstedeværende he-teroatom udover nitrogen vælges blandt oxygen, nitrogen og svovl, og R6 svarer til R6 I DK 175706 B1 I 42 som ovenfor defineret, men er forskellig fra hydrogen, med en nukleotidsekvens med I I formlen Z", som svarer til en nukleotidsekvens med formlen Z' som ovenfor defineret, I I men hvor forbindingspunktet til forbindelsen med formlen IV er ubeskyttet, således at I I der muliggøres kobling på dette punkt, hvorved der opnås en forbindelse med formlen I I 5 III som ovenfor defineret. I
13. 9. Forbindelse med formlen ΙΠ: I I I I I I 10 I I hvor J, K, m, p, X, R6a og Z1 har de i et hvilket som helst af kravene 1-8 ovenfor nævn- I te betydninger. I i I
14. 10. Fremgangsmåde til fremstilling af en forbindelse med formlen IV: I I I I I i -Åb OR6 I I 20 C^s3m,iCH2>B-X^CH2>p-°'P“N\H5 I I hvori J, K, m, p, X, R6, R4 og R5 har de i et hvilket som helst af kravene I -8 ovenfor I nævnte betydninger, hvilken fremgangsmåde omfatter, at man omsætter en forbindelse I I med formlen VI: I I 25 I I ^ I J—Η N-K I I I ^ JS««(CH2)B-X-{CH2)p-OH I 1 30 I I hvori J, K, m, p og X er som ovenfor defineret med en forbindelse med formlen V: I DK 175706 B1 OR6 , L“P*“<r3 j 5 hvor R4, R5 og R6 er som ovenfor defineret, og L er en fortrængelig gruppe, hvorved der dannes en forbindelse med formlen IV. Il 1. Forbindelse med formlen IV: i M J-N^^N-K OE6 , C s3 >· <'s hvori J, K, m, p, R4, R5, R6 og X har de i kravene 1-8 ovenfor nævnte betydninger.
15. 12. Fremgangsmåde som omfatter to eller flere af fremgangsmåderne som der er gjort krav på i et hvilket som helst af kravene 1 til 6, 8 og 10, idet fremgangsmåderne udføres i rækkefølge. 1 ψ