DK174512B1 - Anvendelse af transgluataminaser som immunosuppresiva samt præparater indeholdende en transglutaminase og en plasminogen-aktivator-inhibitor - Google Patents

Description

i DK 174512 B1

Den foreliggende opfindelse angår anvendelse af en transglutaminase ved en fremgangsmåde til fremstilling af et immunosuppresivum.

Makrofager og polymorfkernede neutrofile leukocyter 5 (PMN) deltager i organismens immunreaktion på væsentlig måde. De råder over et angrebssystem, som for det første består af proteaser og for det andet af potente oxidanter (N-chloraminer og oxygenradikaler) . Via disse proteaser og oxidanter påvirker og forstærker de immunreaktionen.

10 Ved immunreaktion skal forstås reaktionen af immun kompetente celler, såsom monocyt/makrofagsystemet, på betændelses-, infektions-, vævsforandrings- og vævsreparationspåvirkninger. Der tilkommer monocyt/makrofagsystemet mangfoldige opgaver i den samlede organisme, da blodmonocyter 15 vandrer ind i de mest forskellige væv for ikke mindst at overtage specifikke immunologiske opgaver her. Således differentierer monocyterne sig i lungerne til a1veo1armakrofager, i leveren til von Kupfferske stjerneceller, i knogler til osteoklaster, i det centrale nervesystem til mikroglia-20 celler, i nyrerne til mesangialmakrofager, i ledslimhinden til synovialdækceller og i legemshulerne til pleura- eller peritonealmakrofager.

Inhibitorer af disse makrofager og PMN er af stor klinisk interesse, da mange humane sygdomme er forbundet 25 med forhøjet makrofagaktivitet.

Der kan forekomme tilstande, hvor den funktionelle undertrykkelse af ét eller flere områder af immunsystemet er ønskværdig. Sådanne tilstande kan være en reaktion af immunsystemet, der går ud over den normale grænse (hypererg 30 tilstand), eller en reaktion af immunsystemet overfor legemets eget væv.

Stoffer, der er i stand til at inhibere den biologiske virkning af makrofager, kan virke immunosuppressivt. Der er et stort behov for immunosuppressorer, som a) har få bivirk-35 ninger og b) er høj specif ikke. De klinisk i vidt omfang anvendte koritkoidderivater opfylder hverken a) eller b).

i 2 DK 174512 B1

Da der ved in vitro-testsystemer med makrofager blev afprøvet stoffer for oxygenradikal-sekretions-inhiberende virkning, viste det sig overraskende nok, at inhibitorer af ornithyldecarboxylase, især af transglutaminasetypen, for-5 trinsvis F XIII, både af placentar og af plasmatisk oprindelse, i fysiologiske koncentrationer virkede stærkt inhiberende på den på oxygenradikal-frigørelse beroende chemi-luminescensreaktion af makrofager.

Det har desuden overraskende vist sig, at F XIII 10 virker immunosuppressivt in vivo på transplantationsmodeller.

Den foreliggende opfindelse angår således anvendelse af en transglutaminase, fortrinsvis af faktor XIII, til fremstilling af et immunosuppressivum.

Sygdomsbilleder, hvor der kan anvendes et sådant 15 immunosuppressivum, er f.eks. sådanne med kronisk betæn-delsesagtig forekomst, såsom rheumatoid arthritis, morbus crohn, colitis ulcerosa, multipel sclerose, Guillan-Barré--syndrom, psoriasis og andre autoimmunsygdomme, degenerative sygdomme, såsom morbus parkinson, arteriosclerose, neoplas-20 tiske sygdomme, hyperergisk-allergiske sygdomme, graft versus host-reaktioner, choksyndrom, såsom ARDS (Adult Respiratory Distress Syndrome), forbrændingssygdom, forbrugskoagulopati og sepsis. Også ved infektiøse sygdomme, såsom AIDS, kan et sådant middel få betydning.

25 Også efter transplantation af legemsfremmed væv sker der en immunologisk reaktion overfor det som fremmed erkendte transplanterede organ eller overfor modtagerorganismen indenfor rammerne af en graft versus host-reaktion, hvilket fører til en afstødning. Sådanne afstødningskriser kan også 30 vise sig i forbindelse med placentart væv, som af moderorganismen tildels også erkendes som fremmed og kan føre til placentathrophoblastforstyrrelser og for tidlig placentaløsning. Det er derfor nødvendigt at undertrykke organmodtagerens eller transplantatets immunsystem for at sikre 35 transplantatets eller modtagerens overlevelse.

I modsætning til den klinisk anvendte superoxiddis- 3 DK 174512 B1 mutase, som formår at neutralisere opståede superoxidioner, forhindrer F XIII dannelsen af superoxidioner. Transglut-aminaser virker også ved allergisk encephalomyelitis (AE), der gælder som modelsygdom ved den humane sygdom multipel 5 sclerose.

Også neoplastiske sygdomme kan være medbetinget gennem ^ et pathologisk øget aktivitet af leukocyter. Hertil hører f.eks. histiocytose X, leukemier, fortrinsvis af myeloid type, og visse tumorer, der opfører sig som makrofager, 10 eller tumorer, der er henvist til støtte fra makrofager (f.eks. til forsyning af tumorstoma indenfor rammerne af angiogenese). Ved disse neoplastiske sygdomme anbefales derfor ligeledes den her omhandlede immunosupprimerende terapi.

15 Reaktioner af immunsystemet ud over det normale og dermed forbundet pathologisk forhøjet oxygenradikal- og/eller plasminogenaktivator-frigørelse forekommer også ved reper-fusionstilstande, dvs. pludselig blodgennemstrømning af et tidligere mindre perfunderet væv, ved oxygenbehandling, 20 hvor oxygenprocentdelen er høj, ved klinisk anvendelse eller forgiftning med f.eks. paraquat, behandling med cis-platin, adriamycin, nitrofurantoin, bleomycin, streptozotocin og andre diabetogene stoffer, bestrålingsbehandling og dermed forbundne vævsskader.

25 Til de kendte foranstaltninger, der er egnede til undertrykkelse af immunsystemet, hører behandling med antistoffer overfor lymfatisk væv, ioniserende stråler og kemiske stoffer. En sådan aggressiv behandling er forbundet med udprægede bivirkninger: organotoksicitet, sterilitet ved 30 cytostatika og ioniserende stråler, hjerneødem ved tranexam-syre, anti-antistofdannelse med risiko for en serumsygdom ved behandling med antistoffer.

Anvendelse af human fysiologisk F XIII har derimod ingen bivirkninger og virker allerede væsentligt mere effek-35 tivt ved lave doser. Selv høje koncentrationer af F XIII i humant plasma synes ikke at udløse nogen ufordelagtige virk- i 4 DK 174512 B1 ninger, således at dette protein viser sig at have en stor terapeutisk bredde (mindst indtil 10 gange den normale plasmakoncentration) .

En virksom mængde af transglutaminaser til inhibering 5 af skader ved truet væv under reperfusion, ved betændelsesagt ige tilstande, subarachnoidealblødninger, autoimmunsyg-domme, degenerative sygdomme, arteriosclerose, neoplastiske sygdomme (såsom leukemier, histiocytose X og andre), hyper-ergisk-allergiske sygdomme, forbrændingssygdom, transplantat -10 uforenelighed, for tidlig placentaløsning og præeklampsi, samt choksyndrom afhænger af en række faktorer, f.eks. patientens alder og vægt samt den kliniske tilstand.

En virksom dosis af en transglutaminase, fortrinsvis F XIII, udgør ca. 0,7 til 3000, især 7 til 300 E*/kg/24 15 timer, applicerbar i.v. eller opløsningsformidlet i.m.. Transglutaminaser, såsom F XIII, kan stabiliseres ved tilsætning af stabilisatorer, såsom albumin, polygelin eller en aminosyre, såsom glycin (* 1 E svarer til mængden af F XIII i 1 ml humant citratplasma).

20 Transglutaminaser, såsom F XIII, kan også indgives topisk til lokal behandling og profylakse af sårhelingsforstyrrelser, transplantatafstødninger, asthmoide bronchial-sygdomme, forbrændinger og andre med forhøjet makrofagak-tivitet forbundne sygdomme.

25 Medicinsk indiceret er kombinationer af transglut aminaser og et fibrinolytikum, såsom vævs-plasminogenak-tivator (t-PA), urokinase, streptokinase eller plasminogen--streptokinase-aktivatorkompleks, til lyseterapi, fortrinsvis ved arterielle tillukninger, såsom ved myokardinfarkt eller 30 apopleksi. En kombineret anvendelse af transglutaminaser og fibrinolytikum muliggør en hurtig inhibering af vævsskader (f.eks. nekroser) under og efter akut reperfusion betinget af hyperaktive hvide blodlegemer.

Indiceret er yderligere kombinationer af transglut-35 aminaser med antithrombin III af human plasmatisk eller genteknologisk oprindelse til anvendelse som immunosuppres- 5 DK 174512 B1 sivum.

Medicinsk indiceret er fortrinsvis kombinationer af transglutaminaser med plasminogen-aktivator-inhibitor af placentar oprindelse (PAI-2) til anvendelse som immunosup-5 pressivum. Såfremt PAI-2 anvendes i en kombination med transglutaminaser, udgør en virksom dosis af PAI-2 almindeligvis 7 til 3.000 urokinase-inhiberende enheder/kg/24 timer, dvs.

525 til 225.000 enheder til en patient med en vægt på 75 kg til systemisk applikation.

10 I det følgende er eksempelvis vist virkningen af transglutaminaser på immunreaktionen hos mus og mennesker i de udvalgte in vivo- og in-vitro-standardtestmetoder, der som bekendt anvendes til bedømmelse af immunosuppressorer.

Forsøgene gennemføres med renset placentar F XIII.

15 En kontrol med renset plasmatisk F XIII fører til sammenlignelige resultater.

Eksempel 1

Indflydelse af faktor XIII på stimuleringen af humane 20 fagocyter in vitro - additiv virkning af F XIII plus plasminogen- aktivator- inhibitor- 2 .

Der udvindes polymorfkernede granulocyter og mono-nucleære fagocyter fra perifert blod fra sunde donorer, og efter tilsætning af præparatet undersøges der for forskellige 25 funktioner. Som parameter for fagocytfunktion undersøges chemiluminescensreaktionen og sekretionen af lysosomale enzymer. Desuden måles virkningen af faktor XIII på de ikke--aktiverede (-IC) såvel som på de af immunkomplekser aktiverede fagocyter (+IC).

30 Sammenlignet med fagocyter fra tilsvarende kontrol- j grupper (ubehandlede celler) er chemiluminescensreaktionen (dannelse af oxygen-radikaler) både ved humane granulocyter og ved monocyter (fagocyter) dosisafhængigt sænket signifikant (tabel I) .

35 Denne supprimerende virkning af faktor XIII er endnu mere udpræget ved en co-stimulering in vitro med immunkom- 6 DK 174512 B1 plekser IC (50 μ9/πι1) . Humane mononucleære fagocyter, der behandles med stoffet, udmærker sig især ved, at sekretionen af lysosomale enzymer ved disse inhiberes tydeligt (tabel II) ·

5 Såfremt der anvendes 0,05 E F XIII sammen med 0,1 E

placentar plasminogen-aktivator-inhibitor (PAI)-2 under IC--stimulering, viser der sig en inhibering på under 40% trods / en inhibering på ca. 50% for såvidt angår de enkelte stoffer, hvilket forklarer en additiv-synergistisk virkningsmåde for 10 begge stoffer.

Eksempel 2

Virkning af faktor XIII på aktiviteten af muse-peri-tonealmakrofager in vivo.

15 NMRI hunmus (18-20 g) indgives parenteralt faktor XIII i koncentrationer på 0,25 til 2,5 E/dyr. Kontrollerne modtager samme rumfang (0,5 ml) opløsningsmiddel (fysiologisk pufret kogsaltopløsning, pH-værdi 7,2). To timer og 24 timer senere aflives musene, og makrofagerne udtages fra bughulen, 20 og der gennemføres en aktivitetsbestemmelse ved hjælp af chemiluminescens som beskrevet i eksempel 1. Som det ses af tabel III, sænker faktor XIII aktiviteten af makrofager, der er udtaget fra mus, som forinden er behandlet med præparatet. Suppressionen iagttages in vitro ved chemilumine-25 scens både 2 timer og 24 timer efter applikation af stoffet med og uden tilsætning af immunkomplekser.

Eksempel 3

Indflydelse af F XIII på overlevelsestiden for trans-30 planteret rottehalehud.

Ved indledningen til dette forsøg transplanteres små halehudstykker fra Lewis-rotter med en størrelse på ca. 0,5 x 1,0 cm til halen på Fischer-rotter. De transplanterede hudstykker erkendes af immunsystemet hos modtagerdyrene som 35 fremmed og afstødes. Som det ses af tabel IV, er transplantatoverlevelsestiden ved Lewis-Fischer-rottemodellen i kon- 7 DK 174512 B1 trolgrupperne, der er behandlet udelukkende med opløsningsmiddel, mellem 16 og 18 dage. Faktor XIII {5 E/dyr) indgives intraperitonealt i 7 på hinanden følgende dage, idet der begyndes enten dag 1 eller dag 10 efter transplantationen.

5 Herved viser det sig overraskende, at faktor XIII i den anvendte koncentration forøger overlevelsestiderne for trans-, plantaterne fra 17,0 ± 1,4 til hhv. 24,8 ± 1,9 og 26,8 ± 2,2.

8 DK 174512 B1

TABEL I

Indflydelse af faktor XIII på det oxidative stofskifte (che-miluminescens) med og uden immunkompleksstimulering (50 //g/ml) in vitro 5

Chemiluminescens

Celletype Faktor XIII Integral af RLU/15 min.(xlO3)

(E/ml) -IC +IC

10 Humane 0 1674 ± 245 19775 ± 1450 monocyter 2,5 252 + 48 947 + 152 (fagocyter) 1,2 384 + 95 1294 ± 58 lxlO6 celler 0,6 474 ± 61 2195 ± 35 0,3 575 ± 61 5195 ± 488 15 0,03 637 ± 81 6850 ± 354 0,01 873 + 75 10055 + 629

Humane 0 2678 ± 353 58650 + 2124 granulocyter 2,5 148 + 24 6448 ± 1505 20 2x1O3 celler 1,2 342 ± 31 9583 ± 1193 0,6 645 ± 68 15733 ± 2035 0,3 863 ± 51 18700 ± 1114 0,03 1075 ± 134 26900 ± 1556 0,01 1226 ± 186 37400 ± 2851 25 - RLU = Relative lysenheder

DK 174512 B1 I

9

TABEL II

Indflydelse af faktor XIII på makrofagaktiviteten (human--monocyter, 3 x 10^ celler) in vitro.

5 Faktor XIII Enzymfrigørelse (N-Ac-Glu, mU/ml)

k (enheder/ml) -IC +IC

0 8365 + 219 16205 + 1703 I " 2, 5 2514 ± 574 2723 ± 333 10 0,6 4254 ± 541 6428 ± 1112 0,3 6358 ± 632 10320 ± 1030 0,03 7703 ± 288 13483 ± 794

15 TABEL III

Indflydelse af faktor XIII på makrofagaktiviteten (1 x 10^) celler) in vivo.

Faktor XIII Chemiluminescens 20 E/dyr Integral af RLU/15 min. (x 103)

l x i.p. -IC +IC

2 timer 24 timer 2 timer 24 timer 25 2,5 268 ± 54 496 ±79 - 4463 ± 567 1,0 512 ± 103 959 ± 163 - 8485 ± 707 0,5 981 + 111 1290 ± 240 - 11300 ± 1424 0,25 1113 ± 67 2105 ± 276 - 16233 ± 2706 0 2775 ± 375 4480 ± 453 - 36767 + 3227 30 -- i 10 DK 174512 B1

TABEL IV

Effekt af faktor XIII på hudtransplantation ved Fischer--rotter 5 Stof Dage inden transplantat- Middelværdi (dage) afstødning (x ± s)

Kontrol 19, 18, 16, 16, 16 17,0 ± 1,4

J

10 Faktor XIII 22, 27, 24, 26, 25 24,8 ± 1,9 5 E/dyr, 7 x i . p . dag 1-7 15 Faktor XIII 30, 27, 24, 27, 26 26,8 ± 2,2 5 E/dyr, 7 x i.p. dag 10-17

Claims (10)

1. Anvendelse af en transglutaminase ved en fremgangsmåde til fremstilling af et middel til immunosuppression.

2. Anvendelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at transglutaminasen er faktor XIII.

, 3. Anvendelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der fremstilles et middel til behandling og profylakse af transplantatafstødningskriser og placentatropho-10 blastforstyrrelser og graft versus host-reaktioner.

4. Anvendelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der fremstilles et middel til behandling af auto-immunsygdomme.

5. Anvendelse ifølge krav 1, kendetegnet 15 ved, at der fremstilles et middel til behandling af sygdomsprocesser, der er forbundet med forhøjet oxygenradikal-dannelse.

6. Anvendelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der fremstilles et middel til behandling og profyl- 20 akse af vævsskader under og efter akut reperfusion.

7. Anvendelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der fremstilles et middel til topisk anvendelse.

8. Anvendelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der fremstilles et middel, som indeholder 52,5 til 25 225.000 enheder/dosis (75 kg legemsvægt) transglutaminase.

9. Præparat, kendetegnet ved, at det indeholder en transglutaminase og en plasminogen-aktivator-inhibitor, fortrinsvis PAI-2.

10. Præparat ifølge krav 9, kendetegnet * 30 ved, at det indeholder 52,5 til 225.000 enheder/dosis (75 kg legemsvægt) transglutaminase og 525 til 225.000 enheder plasminogen-aktivator-inhibitor pr. dosis. i