DK174067B1 - Humant reg-protein og fremgangsmåde til fremstilling deraf - Google Patents

Description

DK 174067 B1

Den foreliggende opfindelse angår et humant reg-protein omfattende en aminosyresekvens fra Ala (nr. 1), GIy (nr. 21), Gin (nr. 22), Glu (nr. 23), Ala (nr. 24), Gin (nr. 25), Gin (nr. 30), Ala (nr. 31) eller Ile (nr. 33) til Gly (nr. 144) samt en aminosyresekvens fra Gin (nr.

5 146) til Asn (nr. 165) i den i figur 1 viste aminosyresekvens eller en aminosyresekvens, der yderligere har Met ved N-terminal en af nævnte aminosyresekvens, samt en fremgangsmåde til dets fremstilling.

Insulinproducerende pancreas ø B-celler har yderst begrænset evne til at regenerere sig, hvilket skaber en forhåndsdisposition for udvik-10 ling af diabetes. I 1984 lykkedes det for Okamoto og hans kolleger for første gang at fremkalde regenerering af pancreas ø B-celler ved daglig injektion af poly(ADP-ribose)syntetaseinhibitorer såsom nicotinamid til 90% depancreaserede rotter (Yonemura, Y et al., Diabetes 33, 401, 1984). Desuden er det for nylig blevet rapporteret, at remissionsfasen af human 15 insulinafhængig diabetes kan forlænges ved oral administrering af nicotinamid i store doser. (Ph. Vague et al., Lancet Vol. I, No. 8533, 619-620, 1987).

Den differentielle hybridiseringsmetode, der anvendes ifølge opfindelsen, er allerede blevet etableret af Takasawa et al. (Diabetes 35» 20 1178, 1986). Det vil sige, at et gen, der specifikt udtrykkes i pancreas B-celle tumorer, er blevet identificeret med godt resultat ved differentiel screening af et rotte B-celle tumor cDNA bibliotek ved anvendelse af cDNA fremstillet ud fra poly(A)+RNA fra B-celle tumorer og cDNA fra poly(A)+ RNA fra normale pancreas øer som prober.

25 Opfinderne af den foreliggende opfindelse har tidligere fundet et gen, der udtrykkes specifikt i rotter, der regenerer pancreas ø B-celler, og har ydermere konstateret, at et fra human pancreas hidrørende cDNA bibliotek indeholder en homolog til genet, og genet blev kaldt "reg" (regenereringsgen) (J. Biol. Chem. 263, 2111-2114, 1988).

30 Administrering af insulin er den eneste diabetesterapi, som aner kendes i øjeblikket. Orale hypoglykæmimldler såsom sulfonylurinstof, som engang forventedes at ville være virksomme, har vist sig at udvise ugunstige bivirkninger, herunder forstyrrelse af pancreas B-cellers evne til at producere insulin og fremkaldelse af koronar arteriosklerose ved 35 langtidsadministrering.

Som beskrevet ovenfor blev det påvist, at pancreas ø B-celler kunne bringes til at blive regenereret i den tilbageværende pancreas i 90% de- 2 DK 174067 B1 pancreaserede rotter, der modtog daglig administrering af poly(ADP-ribose)syntetaseinhibitorer såsom nicotinamid. Opfinderne af den foreliggende opfindelse har tidligere fundet rotte reg, som udtrykkes specifikt i rotter, der regenererer pancreas ø B-celler og humant igg, som er 5 et humant gen, der er homologt med rotte reg. De synes nøje at være relateret til regenereringen af pancreas ø B-celler.

Det lykkedes senere for opfinderne at udtrykke rotte reg og humant reg i en mikroorganisme ved anvendelse af genteknologi. Den foreliggende opfindelse tilvejebringer således et humant reg-protein, som indkodes af 10 det humane reg samt dets fremstilling.

Det humane reg-protein ifølge opfindelsen anses også for at stå i nær relation til regenereringen af insulinproducerende pancreas B-celler. Ved masseproduktion af proteinet, for hvilket det humane reg koder, og udvikling af dem til en klinisk anvendelig medicin, kan det 15 være muligt at tilføre diabetesbehandlingen en ny dimension, som overgår den konventionelle insulinadministreringsterapi, d.v.s. ved fremkaldelse af regenerering af de insulinproducerende pancreas B-celler hos patienter med diabetes.

Opfindelsen beskrives nærmere i det følgende under henvisning til 20 tegningen, hvor figur 1 viser basesekvensen for det humane reg cDNA og den deraf afledte aminosyresekvens, figur 2 viser basesekvensen for rotte reg cDNA og den deraf afledte aminosyresekvens, 25 figur 3 viser en udformning af ekspressionspiasmidet for humant reg, der forkortes som hu reg, og figur 4 viser resultaterne af SDS-PAGE for 3-5 dages kultur af gær, som bærer ekspressionspiasmidet for humant reg.

Med det formål at afsløre mekanismen for regenerering og prolifera-30 tion af pancreas ø B-celler søgte opfinderne efter et gen, der specifikt udtrykkes i rotte, der regenererer pancreas ø B-celler, og opdagede et sådant gen kaldet "reg", regenereringsgen. Opfinderne søgte yderligere efter et humant gen, som var homologt med rotte reg ved anvendelse af rotte reg som probe, og fandt det humane reg fra et humant pancreas cDNA 35 bibliotek. Derefter lykkedes det for opfinderne at udtrykke det humane reg i en mikroorganisme og udvinde det humane reg-protein.

Det som probe anvendte rotte reg fremstilledes på følgende måde.

3 DK 174067 B1 I. Isolering af regenererende pancreas øer fra rotte.

1) 90% pancreas ektomi 5 Wistarrotter af hankøn med en vægt på 200 til 300 g laparotomi- seredes under anesthesi med ether, og pancreas udtoges bortset fra det parabiliære segment (svarende til 90% af hele pancreas), og den inciserede del lukkedes. 90% pancreas ektomien blev etableret af V.G. Foglia (Rev. Soc. Argent. Biol. 20, 21-37, og den anvendes i vid udstrækning 10 til fremstilling af modeller for insulinafhængig diabetes. Rotterne overgår til en diabetisk tilstand indenfor en måned efter, at de har været udsat for 90% pancreas ektomi.

2) Administrering af nicotinamid 15 Nicotinamid (50 mg/ml fysiologisk saltvand) administreredes intra- peritonalt en gang daglig i en dosis på 0,5 g/kg legemsvægt fra 7 dage før til 3 måneder efter den 90%ige pancreas ektomi. Administreringen af nicotinamid forebyggede og bedrede de 90% depancreaserede rotters diabetiske tilstand.

20 3) Isolering af regenererende øer

Ved ovennævnte trin 1) og 2) fremkaldtes regenereringen af øer i den tilbageværende pancreas, og både antallet af øer pr. enhedsvol umen pancreas og størrelsen pr. ø øgedes, idet forøgelsen af antallet af ø 25 celler er ansvarlig for forøgelsen i deres størrelse. Størsteparten af tilvæksten i celler var insulinproducerende B-celler, og antallet af glucagonproducerende A-celler og somatostatinproducerende D-celler ændredes ikke (Yonemura, Y. et al. Diabetes 33, 401, 1984). Tre måneder efter operationen laparatomiseredes de 90% pancreaserede og nicotin-30 amidadministrerede rotter under anesthesi med Nembutal, og den tilbageværende pancreas eksstirperedes efter at være kvæl det med Hanks opløsning. Den udtagne pancreas udskares i stykker i 5 ml Hanks opløsning pr. to tilbageværende pancreas, 150 mg bovinserumalbumin (Sigma, Type V) og 40 mg collagenase (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Type IV) tilsat-35 tes, og blandingen rystedes ved 37“C i 3 til 5 minutter for nedbrydning.

Efter nedbrydningen suspenderedes opløsningen i 50 ml Hanks opløsning og henstilledes i 5 minutter, for at øerne kunne præcipitere. Efter at den 4 DK 174067 B1 øvre halvdel af Hanks opløsning var fjernet og yderligere 25 ml frisk Hanks opløsning tilsat, suspenderedes blandingen igen. Efter at henstand, fjernelse og resuspension var udført otte gange, opsamledes de regenererende øer under et stereomikroskop. Oerefter opsamledes 1355 5 regenererende øer fra 32 rotter, som var blevet 90% depancreaseret og havde fået administreret nicotinamid. Ovenstående metode svarer i hovedtraekkende til den af Okamoto rapporterede metode (H. Okamoto,

Molecular and Cellular Biochemistry 37, 43-61, 1981).

10 II. Fremstil ing af komplementær DNA (cDNA) bibliotek af regenererende pancreas øer fra rotte.

1) Isolering af RNA

Isolerende regenererende øer blev brudt ved lydbehandling i 4M 15 guanidinthiocyanat, 10 mM natriumcitrat (pH 7,0), 0,5% natriumlauryl sarcosin, 0,1 M 2-mercaptoethanol og 1% Antifoam A (Sigma). Blandingen lagdeltes på cæsiumtrifluoreddikesyre med en densitet på 1,64 (Pharmacia) og centrifugeredes ved 25”C og 40.000 opm i 14 til 16 timer.

Efter centrifugeringen udvandtes RNA præcipitatet. Fra 1355 20 regenererende øer opnåedes 885 μg RNA (Chirgwin, J. M. et al.,

Biochemistry 1979, 18: 5294-99).

2) Isolering af poly(A)+ RNA

Fra det i trin 1) ovenfor opnåede RNA isoleredes 17,2 μ$ poly(A)+ 25 RNA ved oligo (dT) cel 1ulosesøjlechromatografi (H. Aviv. & P. Leder,

Proc. Natl, Acad, Sci. 69, 1408-1412, 1972).

3) Fremstilling af cDNA bibliotek

Ved anvendelse af 2 μ§ poly(A)+ RNA fra regenererende øer som tem-30 plat og oligo (dT) som primer og ved inkubation med 40 enheder revers-transkriptase 1 en time ved 42"C, synthetiseredes først 182 ng cDNA (første streng). Den opnåede cDNA-RNA hybrid behandledes med 0,75 enheder RNaseH, 46 enheder DNA polymerase I og 4 enheder T4 DNA polymerase til opnåelse af 284 ng dobbeltstrenget cDNA. Ovennævnte cDNA syntese 35 udførtes i hovedtrækkende i henhold til U. Gubier et al.s metode (Gene 25, 263-269, 1983).

cDNA (dobbeltstrenget) behandledes med 15 enheder EcoRI methyl ase DK 174067 B1 5 (New England Biolabs) og ligeredes til EcoRI linker (450 ng) med 175 enheder T4 DNA ligase (Takara Shuzo) ved 13°C i 45 timer.

Ovennævnte produkt blev nedbrudt med 76 enheder EcoRI (Takara Shuzo) ved 37*C i to timer og sat til Sephacryl S-1000 (Pharmacia) for 5 at blive adskilt i cDNA og nedbrudt linker. Ved ovennævnte trin udvandtes 214 ng EcoRI methylasebehandlet EcoRI fragment (dobbeltstrenget cDNA).

Af ovennævnte cDNA ligeredes 20 ng med 1,23 Mg Agt10 arme (dephosphoryleret ved 5'terminalen med alkalisk phosphatase efter ned-10 brydning med EcoRI, Stratagene) ved anvendelse af T4 DNA ligase (Takara Shuzo, 116 enheder) ved 13*C i 15 timer. Det ligerede Agt10 regenererende ø cDNA emballeredes ved anvendelse af Gigapack (Stratagene) og indførtes i E. coli K12 afledt Y1089 (DNA cloning, vol. 1, 49-78, 1985, 6 IRL Press), hvorved i alt 2,8 x 10 transformanter opnåedes.

15 III. Differentiel binding af regenererende ø cDNA bibliotek.

Isolering af gener, der specifikt udtrykkes i regenererende øer.

Fra hver af 5000 uafhængige kulturer udvalgt arbitrært blandt rege-20 nererende ø cDNA biblioteker fremstillet i ovennævnte trin II inokulere-des fager med tandstikkere i NZY-o,2% maltosemedium (1% NZ amin, 0,5% Bacto-gærekstrakt, 0,5% natriumchlorid og 0,2% maltose) indeholdende Y1089 svarende til 0,5 OD600 i mikrotiterplader (96 brønde) og inkuberedes natten over ved 37eC for proliferation. To μ1 af hver opnået 25 fagopløsning anbragtes som pletter på nitrocellulosefiltre (Schleicher and Schuel, BA85) og hybridiseredes med rotteinsulin II cDNA mærket med 32 P ved nicktranslation. Som resultat identificeredes 16% af klonerne som insulin cDNA kloner, og de resterende 84% ikke-insul in cDNA kloner var tilgængelige for efterfølgende screening.

30 Poly(A)+ RNA (150 ng) fra regenererende øer fra rotte eller fra ubehandlede normale øer fra rotte inkuberedes ved 37*C i to timer med 15 enheder reverstranskriptase (Seikagaku Kogyo) i nærvær af 41 ng oligo (dT)12 ,8, 20 mM dATP, 20 mM dTTP, 20 mM dGTP, 2 μΜ dCTP og 60 3 2 μϋι[ατ- P]dCTP (Amersham). Efter at RNA kæden var dekomponeret med 35 0,3N natriumhydroxid (ved 100’C i 2 minutter) udvandtes det frembragte 32 P mærkede enkeltstrengede cDNA ved hjælp af ethanolpræcipitation.

Ved denne metode opnåedes prober med en specifik aktivitet på 1 til 2 x 8 6 DK 174067 B1 10 cpm/pg poly(A)+ RNA.

To sæt nitrocellulosefiltre plettedes med 2 pi prøver af hver fagopløsning af ikke-insul in cDNA kloner, behandledes ved stuetemperatur med 0,5 N natriumhydroxid/1,5 M natriumchlorid i 5 minutter og derefter 5 med 0,5 M tris-saltsyre (pH 8,0)/1,5 M natriumchlorid i yderligere 5 minutter, dyppedes derefter i 2 x SSC (1 x SSC: 0,15 M natriumshlorid og 0,015 M natriumcitrat) og bagtes ved 80*C i to timer.

De bagte nitrocellulosefiltre fik lov til at reagere i 3 x SSC i 30 minutter ved 65°C og derefter i 3 x SSC og 1 x FBP (Denhard's opløsning, 10 0,02% Ficoll 400, 0,02% bovinserumalbumin og 0,02% polyvinylpyrrolidon) i en time ved 65°C og præhybridi seredes ved 65eC i en time i 1 M natriumchlorid, 50 mM tris-saltsyre (pH 7,4), 10 mM EDTA, 0,1% SDS, 1 x FBP, 10 /ig/ml laksetestis DNA og 250 /xg/ml poly(U) (Pharmacia). Hybridisering udførtes ved anvendelse af cDNA (1,5 x 10 cpm) fremstillet fra rege-15 nererende ø poly(A)+ RNA fra rotte som probe for et sæt filtre (tidligere anført) og cDNA (1,5 x 10 cmp) fremstillet fra normal ø poly(A)+ RNA isoleret fra ubehandlede rotter som probe (anført før) for et andet sæt filtre i 1 M natriumchlorid, 50 mM tris-saltsyre (pH 7,4), 10 mM EDTA (pH 8,0), 0,1% SDS og 250 pg/ml poly(U) ved 65°C i 16 timer.

20 Efter hybridiseringen vaskedes filtrene to gange med 2 x SSC ved stuetemperatur i 1 til 2 minutter og vaskedes yderligere 4 gange med 0,1 x SSC/0,1% SDS ved 65°C i 40 minutter og tørredes ved 80*C i en time og autoradiografien udførtes ved -80°C natten over. Som følge deraf opnåedes en type klon som konsekvent hybridiseredes specifikt med rege-25 nererende ø cDNA.

Når opfindelsen reproduceres kan denne screening let opnås ved anvendelse af en probe fremstillet ved hjælp af den i figur 2 viste basesekvens .

30 IV. Sekvensanalvse af det gen, der specifikt udtrykkes i regenererende ø B-cellerne.

Fag DNA rensedes fra cDNA klonen af genet, der specifikt udtrykkes i de i ovennævnte trin III opnåede regenererende øer (se "Molecular 35 Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982)), blev nedbrudt med EcoRI, og cDNA indskud i soleredes fra fagvektorarmene ved 1% agarosegelelektroforese. Basesekvensen af det isolerede cDNA bestemtes 7 DK 174067 B1 ved Sangers metode under anvendelse af M13 (mpl8 og mp!9, Pharmacia) (Methods in Enzymology 101. 20-78, 1983).

Som resultat fandtes det, at det transkript, der udtrykkes specifikt i regenererende øer, omfatter 749 nukleotider i alt heri ikke med-5 regnet poly(A) delene og koder for et protein sammensat af 165 amino-syrerester begyndende med methionin og sluttende med alanin. Basesekvensen og den deraf afledte aminosyresekvens er vist i figur 2.

Computeranalyse af nukleinsyre- og proteindatabaserne (fremgangsmåde ifølge Wibur, W.J. & Lipman, D.J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1983, 10 80, 726-730) fra European Molecular Biology Laboratory (Heidelberg),

GenBank (Cambridge, Massachusetts) og National Biomedical Research Foundation (Washington, DC) afslørede, at basesekvensen og den deraf afledte aminosyresekvens af det netop klonede cDNA ifølge opfindelsen var forskellig fra alle kendte gener og genprodukter, og at intet gen eller 15 genprodukt med en homologi på 50% eller derover kunne findes i databaserne.

Det fra regenererende ø cDNA biblioteket klonede cDNA blev derfor anset for at svare til et fuldstændig nyt gen, som aldrig tidligere er blevet rapporteret, og genet benævntes "req" (regenererende gen eller 20 regenerer!ngsgen).

Humant reg opnåedes fra et human pancreas cDNA bibliotek på følgende måde under anvendelse af en del af ovennævnte rotte reg som probe.

25 I. Isolering af humant ren 1. Fremstilling af human pancreas cDNA bibliotek a) Det er umuligt at fremstille humane regenererende Langerhans øer, og et cDNA bibliotek fremstilledes derfor ud fra human pancreas væv, som 30 var opnået ved operation. I rottepancreas væv påvises reg mRNA.

b) Isolering af RNA

Human pancreas opnået kirurgisk blev sønderdelt med Polytron i 4M guanidiniumthiocyanat, 10 mM natriumcitrat (pH 7,0), 0,5% natriumiauryl-35 sarcosin, 0,1 M 2-mercaptoethanol og 1% Antifoam A (Sigma).

Blandingen lagdeltes på cæsiumtri fluoreddikesyre (Pharmacia) med en densitet på 1,64 og centrifugeredes ved 25*C og 44.000 opm i 14 til 16 8 DK 174067 B1 timer. Efter centrifugering udvandtes RNA præcipitatet. Ud fra 500 mg pancreas væv opnåedes 2,526 mg RNA (Chirgwin, J.M. et al., Biochemistry 1979, 18: 5294-99).

5 c) Isolering af poly(A)+ RNA

Ud fra det i ovennævnte trin b) opnåede RNA i soleredes 17,56 μς poly(A)+ RNA ved oligo (dT) cel lul osesøj lekromatografi (H. Aviv. & P.

Leder, Proc, Natl. Acad. Sci. 69, 1408-1412, 1972).

10 d) Fremstilling af cDNA bibliotek

Ved anvendelse af 1 /xg humant pancreas poly(A)+ RNA som tempi at og oli go(dT) som primer og ved inkubation med 40 enheder revers transkrip-tase ved 42°C i en time syntetiseredes først ca. 100 ng cDNA (første streng). Den opnåede cDNA-RNA hybrid behandledes med 0,75 enheder 15 RNaseH, 46 enheder DNA polymerase I og 4 enheder T4 DNA polymerase til opnåelse af ca. 150 ng dobbeltstrenget cDNA. Den ovenfor beskrevne cDNA syntese udførtes i hovedtrækkene i henhold til U. Gubier et al.s metode (Gene 25, 263-269, 1983).

cDNA (dobbeltstrenget) behandledes med 15 enheder EcoRI methyl ase 20 (New England Biolabs) og ligeredes til EcoRI linker (450 ng) med 175 enheder T4 DNA ligase (Takara Shuzo) ved 13“C i 45 timer.

Ovennævnte produkt blev nedbrudt med 76 enheder EcoRI (Takara Shuzo) ved 37°C i to timer og sat til Sephacryl S -1000 (Pharmacia) for at blive adskilt i cDNA og nedbrudt linker. Ved ovennævnte trin 25 udvandtes 17,6 ng EcoRI methylasebehandlet EcoRI fragment (dobbeltstrenget cDNA).

Ovennævnte cDNA ligeredes til 1,0 /xg XgtlO arme (dephosphoryleret ved 5' terminalen med alkalisk phosphatase efter at være nedbrudt med EcoRI, Stratagene) med T4 DNA ligase (Takara Shuzo, 116 enheder) ved 30 13*C i 15 timer. Det ligerede XgtlO-humane pancreas cDNA emballeredes

med Gigapack (Stratagene), indførtes i E. col i K12 afledt Y1089 (DNA

5 kloning, vol. 1, 49-78,1985, IRL Press) og i alt 6 x 10 transfor-manter opnåedes på denne måde.

35 2. Kloning af humant reg cDNA fra humant pancreas cDNA bibliotek a) Fra hver koloni af det fremstillede humane pancreas cDNA bibliotek 9 DK 174067 B1 inokuleredes fager med mal tosemedium (0,2% maltose, 1% NZ amin, 0,5% Bactogærekstrakt og 0,5% natriumchlorid) indeholdende Y1089 svarende til 0,5 OD600 og inkuberedes natten over ved 37*C for proliferation.

Som resultat dannedes 10 kolonier på et agarmedium (150 mm i 5 diameter) og overførtes til nitrocellulosefiltre.

b) 01igodeoxyribonucleotid (60 baser) svarende til basesekvensen fra nr. 76 til nr. 135 i rotte reg (Fig. 2) syntetiseredes med en dNA synte-tisator (Applied Biosystems Model 380 B) og dets 5' terminal mærkedes 32 3 2 10 med P ved anvendelse af [γ- P] ATP og T4 polynucleotidkinase.

c) Nitrocellulosefiltre opnået i ovennævnte trin a) behandledes ved stuetemperatur med 0,5 N natriumhydroxid/1,5 M natriumchlorid i 5 minutter og derefter med 0,5 M tris-saltsyre (pH 8,0)/1,5 M natrium- 15 chlorid i yderligere 5 minutter, dyppedes derefter 1 2 x SSC (1 x SSC: 0,15 M natriumchlorid og 0,015 M natriumcitrat) og bagtes ved 80"C i to timer.

De bagte nitrocellulosefiltre præhybidiseredes ved 50*C i fire timer i 6 x SSC, 5 x FBP (1 x FBP; 0,02% Ficoll 400, 0,02% bovinserum-20 albumin og 0,02% polyvinyl pyrrol i don), 0,1% SDS og 200 /ig/ml E. coli 32 tRNA, hybridiseredes med det P-mærkede oligodeoxyribonucleotid ved 50"C i 12-16 timer i 6 x SSC, 1 x FBP, 0,1% SDS og 100 jig/ml E. coli 3 2 tRNA indeholdende 2 ng/ml P-mærket oligodeoxyribonucleotid og vaskedes 4 gange, hver gang i 30 minutter ved 50*C med 6 x SSC og 0,1% SDS.

25 6 d) Som resultat hybridiseredes 58 kloner blandt 10 humant pancreas cDNA kloner med en rotte reg probe på 60 baser.

e) Ud fra de positive kloner udvalgtes klonen med det længste cDNA 30 indskud (ca. 900 nukleotider). DNA indskuddet isoleredes fra klonen, blev nedbrudt med EcoRI og subklonedes derefter i pBS vektor (Stratagene) på EcoRI stedet. Da humant reg har et indre EcoRI sted, opdeltes det i to fragmenter, dvs. 5'- og 3'- terminal halvdel ene ved EcoRI nedbrydning. Disse to fragmenter subklonedes hver for sig i pBS vektor.

35 10 DK 174067 B1

II. Sekvensanalvse af det humane req cDNA

a) Basesekvensen af det i pBS vektor subklonede cDNA bestemtes ved Sangers metode (Methods in Enzymology 10I> 20-78, 1983).

5 b) Som resultat fandtes det, at det humane ieg cDNA omfatter 749 nukleotider i alt, heri ikke medregnet poly(A) delene og koder for et protein opbygget af 166 aminosyrerester begyndende med methionin og sluttende med asparagin.

10 c) Det protein, det humane reg koder for, er en aminosyrerest længere end det af rotte reg kodede protein, som er opbygget af 165 aminosyrerester. Basesekvensen af kodningsområdet af det humane reg og den deraf afledte aminosyresekvens udviser henholdsvis 75% og 68% homologi med 15 rottereg.

d) Sekvensen omkring det humane reg-proteins N-terminal er rigt på hydrofobe aminosyrerester. Dette er hovedkendetegnet for sekretionsproteiners signalpeptider. I det humane reg-protein blev den sekvens, 20 der begynder med Met (-1) og slutter med enten Gin (20, Gly (21), Gin (22), GIu (23), Ala (24), Pro (29), Gin (30), Arg (32) følgelig anset for at være et signalpeptid.

Det opnåede cDNA kan bringes til udtryk på sædvanlig måde. For 25 eksempel kan cDNAet bringes til udtryk, når det indføres i en passende ekspressionsvektor (pKK223-3, pBS, pDR540, pDR720, pPL-lambda etc.) under kontrol af en passende promotor (lac, Tac, Trp, Py m.fl.) og indføres i en vært (E. col i K-12 AG-1, MM294, DH1, HB101, C600 etc.).

Når eukaryotiske celler såsom gær- og abeceller anvendes som vært, er 30 det lettere at udvinde det ønskede protein fra kulturen, da det er muligt at udskille det ønskede protein i et medium. Når f.eks. gær anvendes, kan forskellige kendte vektorer såsom pGPD-1, pMFcr8, AAR6, ABade8, AH5, YEp52, pACF301 og pAM82 anvendes som ekspressionsvektorer.

Hvis abecelle COS anvendes, kan pKSV-10 og andre anvendes som ekspres-35 sionsvektorer. Udover ovennævnte vært-vektorsystemer er de fleste af de kendte vært-vektorsystemer egnede til ekspression af req.

Det udtrykte nag-protein kan renses ved en konventionel rensemetode 11 DK 174067 B1 ved passende kombination af centrifugering, kromatografi, dialyse, udsaltning og andre metoder.

Det af req-genet ifølge opfindelsen kodede reg-protein er ikke begrænset til det protein, der har den i figur 1 viste aminosyresekvens.

5 Der forekommer en signal sekvens ved aminosyresekvensens aminoterminal, og det modne reg-protein synes at begynde med Gly (nr. 21), Gin (nr. 22)

Glu (nr. 23), Ala (nr. 24), Gin (nr. 25), Gin (nr. 30), Ala (nr. 31) eller Ile (nr. 33). Et sådant modent reg-protein er derfor omfattet af opfindelsen. Når et protein fremstilles ved anvendelse af genteknologi, 10 føjes methionin ofte til proteinets N-terminal. Proteiner, hvor methionin er føjet til ovennævnte proteiner ved N-terminalen, er derfor også omfattet af opfindelsen.

Opfindelsen belyses nærmere i det følgende eksempel.

15 EKSEMPEL

Ekspression af "humant req11 1 Saccharomvces cerevlsiae Materialer og metoder 20

Stammer og medier

Escherichia col i K-12* stamme C600 (F-, hsdR+, hsdM+, recA+, thr, leu, thi, lacY, supE, tonA) anvendtes som vært for plasmidkonstruk-tioner.

25 Saccharomvces cerevisiae. stamme AH22 (a leu2, his4, canl, cir+) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 7$, 1929-1933 (1978)) anvendtes som redpiensstamme for et plasmid.

Gærceller dyrkedes ved 30eC i YPDA medium (1% gærekstrakt, 2% poly-pepton, 2% glucose og 20 mg/1 Adenin).

30 Burkholders minimummedium (Proc. Nat!. Acad. Sci. USA 77, 4504-4508 (1980)) forstærket med histidin (20 mg/1) anvendtes til fremstilling af Pi-beriget medium indeholdende 1,5 g KH2P04 pr. liter (forkortet Pi(+) medium) eller Pi-manglende medium indeholdende 1,5 g KC1 pr. liter i stedet for Pi (forkortet Pi(-) medium).

35 Enzymer og linker

Restriktionsenzymer, T4DNA ligase og Klenow Fragment blev leveret fra Takaro Bio Chemicals (Kyoto, Japan). Xho I linker leveredes fra 12 DK 174067 B1

Pharmacia (Tokyo, Japan).

PI asmi der

En gær-E.coli shuttle vektor pAM82 (Proc. Nat!. Acad. Sci. USA 80, 1-5, (1983) europæisk patentpublikation nr. 0 103 201 og japansk patent-5 publikation nr. 61-55951) anvendtes. Saccharomvces cerevisiae AH22 med vektoren pAM82 har i henhold til Budapest-traktaten været deponeret ved Fermentation Research Institute, 1-3, Higashi 1-chome Tsukuba-shi Ibaraki-ken 305, Japan som Saccharomvces cerevisiae AH22/pAM82 med løbenummeret FERM BP-313 siden 16. august 1982. Den består af et 5,5 kb 10 fragment af S.cerevlsiae DNA med ARSI, 2-/im ori og Leu 2 sammen med et

D

3,7 kb fragment af E.coli plasmid pBR322 med Ap markøren og dets ori.

Desuden har den et 2,7 kb gær DNA fragment med PH05 promotorområdet.

Plasmid pGEM4 blev leveret fra Promega Biotec (U.S.A.).

Humant reg cDNA (J. Biol. Chem. 261, 2111-2114 (1988)) har et EcoRI 15 sted i strukturgenet, og to EcoRI fragmenter blev derfor indført i pBS vektorens EcoRI position.

Transformation af gærceller

Transformation udførtes som beskrevet af Kimura et al (J.

Bacteriol. 153, 163-168 (1983)). Leu+ transformanterne udvalgtes på 20 Burkholders minimum medium indeholdende 2% agar.

Gærcellevækst og induktion

Sur phosphatasepromoteren (PH05) vises at være styret af Pi koncentrationen i mediet (EMBO Journal I, 675-680 (1982)).

Først dyrkedes gærceller i Pi(+) Burkholders minimummedium sup-25 pieret med histidin (20 /zg/ml) ved 30°C og under beluftning i to dage, hvorefter en portion (200μ1) overførtes til 10 ml Pi(-) medium suppleret med histidin (20 μg/m]).

Det tog ca. 3 til 5 dage, før humant reg-protein kunne påvises i dyrkningsmediet.

30 Konstruktion af ekspressionspiasmidet

Standard DNA teknikker anvendtes (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982)). Humant reg ekspressionsplasmid konstrueredes som vist i figur 3.

Humant r£g cDNA subklonet i pBS vektor bestod af to dele, dvs. 5'-35 og 3'- terminalhalvdelene (første og sidste halvdel).

Først blev 5'- terminalhalvdelen nedbrudt med Afl II, behandlet med Klenow Fragment, tilsat Xho I linker og derefter nedbrudt med EcoRI.

13 DK 174067 B1

Derefter blev 3'- terminal halvdel en nedbrudt med EcoRI og Xba I.

De resulterende to fragmenter af humant reg cDNA indførtes i pGEM4(Xho I), hvis Sac I sted tidligere var udskiftet til et Xho I sted ved anvendelse af Xho I linker.

5 Derefter blev pGEM4(Xho I) humant reg nedbrudt med Xho I og Hine II, indført i pAM82 (nedbrudt med Xho I og Pvu II) vektor.

Dette plasmid betegnedes PAM82-humant req.

Hver restriktionsendonuklease anvendtes i en koncentration på 3u/ø gDNA og indkuberedes ved 37*C i en time.

10 Fremstilling af humane req-proteiner

Ekspressionspiasmidet for humant reg cDNA konstrueret som ovenfor beskrevet, transformeredes i E.coli K-12, stamme C600, og ampicillin resistente kolonier udvalgtes. Ved hjælp af disse transformanter fremstilledes en stor mængde plasmid DNA.

15 Det i E.coli celler propagerede rekombinante plasmid trans formeredes til en gærrecipient S.cerevisiae stamme AH22 ved standard transformationsprocedure efterfulgt af udvælgelse på grundlag af Leu+ kolonier.

Gærceller med plasmider dyrkedes i Pi(+) medium i to dage og 20 induceredes ved overførsel til Pi(-) medium.

I både Pi(+) og Pi(-) medium inkuberedes gærceller ved 30®C under kraftig rystning.

På tredje-, fjerde- og femtedagen efter inkubation i Pi(-) medium udtoges en portion af substratet og centrifugeredes for at fjerne cel-25 ler. Således opnået dyrkningsmedium koncentreredes ca. 100 fold ved hjælp af Centricon-10 (Amicon) og N2 gas gennembobling.

De kondenserede prøver (svarende til 0,75 ml dyrkningsmedium) analyseredes på 16% SDS-PAGE ved farvning med Coomassie Brilliant Blue R.

Som vist i figur 4 fandtes humant reg-protein at blive produceret 30 og udskilt fra celler i dyrkningsmedium.

Som det fremgår af figur 4 påvistes der overvejende humant reg-protein, men en lille mængde ledsageproteiner udskiltes også.

Immunologisk påvisning af humane req-proteiner 1 dyrkningsmedium Gærkulturmedium koncentreredes 100 fold ved hjælp af Centricon-10 35 (Amicon) og N? gas gennembobling.

Det kondenserede medium underkastedes elektroforese på 16% SDS-polyacrylamidgel (SDS-PAGE) (FEBS Lett. 58, 254-258 (1975)) (Nature 14 DK 174067 B1 (London) 227, 680 (1970)), hvorefter western aftryksanalyse (J. Virol.

10, 211 (1972)) udførtes under anvendelse af antistof, som er specifikt for humant reg-protein.

Som vist i figur 4 blev to forskellige bånd med ca. 15K-Da og 16K-5 Da synliggjort, hvorved hovedproteiner udskilt fra gær identificeredes som reg-protein.

Rensning og karakterisering af reg-protein

Rensning af reg-protein fra gærkulturmedium

En liter gærkulturmedium indeholdende rgg-protein indstilledes til 10 pH 3,4 ved tilsætning af 1 N HC1 og fortyndedes med destilleret vand til en slutkonduktivitet på 0,3 mohm. Til denne opløsning sattes 100 ml S-Sepharose (af hurtigstrømningstype) som på forhånd var bragt i ligevægt med 5 mM natriumacetatpuffer (pH 3,4) (puffer A) og blandingen omrørtes forsigtigt ved 4®C i 16 timer. S-Sepharose, som adsorberede reg-protein.

15 pakkedes til en søjle (5x8 cm) og vaskedes med puffer A indeholdende 0,3 M NaCl og reg-protein elueredes fra søjlen med puffer A indeholdende 0,6 M NaCl. reg-protein fraktionerne, som udviser to forskellige molekylvægte på ca. 15.000 og ca. 16.000 ved SDS-polyacrylamidgel elektro-forese (SDS-PAGE) (15% gel) sammenblandedes og dialyseredes overfor 20 puffer A ved 4®C i 16 timer. Det dialyserede materiale sattes til en S-Sepharosesøjle (0,7 x 25 cm) bragt i ligevægt med puffer A, og søjlen vaskedes med puffer A indeholdende 0,3 M NaCl. reg-proteinet elueredes med en lineær gradient af 10 søjlevolumener puffer A indeholdende 0,3 M NaCl til puffer A indeholdende 0,6 M NaCl. reg-proteiner på 15K og 16K 25 elueredes med puffer A indeholdende NaCl koncentrationer på henholdsvis 0,47 M og 0,44 M, der hver var homogene ved SDS-PAGE (15% gel).

De rensede reg-proteiner koncentreredes og afsaltedes ved ultrafiltrering med Amicon YM-10 membran og opbevaredes i 10 mM AcOH ved en koncentration på 0,1 mg/ml. Ca. 200 μg reg-protein opnåedes med en liter 30 gærkulturmedium.

Karakterisering af renset reg-protein a) Molekylvægt

Molekylvægte af rensede reg-proteiner på 15K og 16K bestemtes ved SDS-PAGE til at være ca. 14.500 og ca. 16.000, hvilket stemte overens 35 med de teoretiske molekylvægte på 15.023 og 16.275 beregnet ud fra den af cDNA afledte aminosyresekvens (15K-r£g-proteinets og 16-reg-proteinets N-terminaler sluttedes henholdsvis at være Ile i position 33 15 DK 174067 B1 og Gin i position 22 i figur 1.).

b) Aminosyresammensætning

En del 16K-reg-protein afsaltedes med HPLC (Brownlee, Aquapore RP-300 søjle) og hydrolyseredes med 4 M methansulfonsyre (indeholdende 0,2% 5 3-(2-aminoethyl)indol) ved 110'C i 24 timer. Aminosyreanalyse udførtes med en Hitachi aminosyreanalysator (model 835).

Som vist i tabel 1 stemte 16K-rgg-proteinets aminosyresammensætning næsten fuldstændig overens med de teoretiske værdier.

c) Delvis N-terminal aminosyresekvens af reg-protein.

10 16K-reg-proteins aminosyresekvens søgtes bestemt med en sekvensanalysator af typen Applied Biosystems 477A Protein Sequencer. N-terminalen og de følgende aminosyrer påvistes imidlertid ikke. Efter behandling med pyroglutamataminopeptidase sekvensanalyseredes 16K-reg-proteinet derfor på ovennævnte måde. Som vist i tabel II bestemtes de 29 15 aminosyrerester ved det enzymbehandlede proteins N-terminal. Proteinets N-terminal aminosyre var glutaminsyre og aminotermi nal sekvensen (GIu-2 til Glu-30) svarer til den ud fra cDNA udledte.

16K-reg-proteinets N-terminal aminosyre sluttedes derfor at være Gin (nr. 22) eller Glu (nr. 23). Opfinderne har i øvrigt tidligere af-20 sløret, at N-terminal aminosyren i et af rotte reg-proteinerne er Glu svarende til Glu (nr. 23) i humant reg-protein.

For 15K-reg-proteinets vedkommende blev det udledt, at efter ekspression udsættes 16K-rgg-proteinet for trypsinlignende enzym for at blive til 15K-reo-proteln. N-terminal aminosyren i 15K-reg-proteinet 25 sluttedes derfor at være Ile (nr. 33) efter Arg (nr. 32).

30 35 16 DK 174067 B1 TABEL 1 5 Aminosyre_Iagttaget_Teoretisk

Asp 17,1 17

Thr 6,9 7

Ser 15,7 17 10 Glu 14,8 14

Pro 6,4 6

Gly 10,2 10

Ala 8,0 8 l/2Cys 5,5 6 15 Val 9,9 10

Met 1,0 1

Ile 3,9 4

Leu 8,1 8

Tyr 7,1 7 20 Phe 7,0 7

Lys 9,1 9

His 2,2 2

Arg 4,8 5

Trp _5J3_6 25 I alt_144 30 35 17 DK 174067 B1

TABEL II

Nedbrvdninqstrin req-proteinrest Genvinding (%) I (Gin)*1 5 2 Glu 17,3 3 Ala 18,1 4 Gin 20,6 5 Thr 11,9 6 Glu 14,9 10 7 Leu 16,8 8 Pro 15,2 9 Gin 14,7 10 Ala 14,2 II Arg 7,9 15 12 Ile 9,8 13 Ser 35,6 14 (Cys)*2 15 Pro 7,5 16 Glu 5,7 20 17 Gly 8,6 18 Thr 12,2 19 Asn 5,9 20 Ala 6,8 21 Tyr 5,6 25 22 Arg 3,5 23 Ser 22,0 24 Tyr 4,5 25 (Cys)*2 26 Tyr 4,8 30 27 Tyr 6,4 28 Phe 4,4 29 Asn 4,1 30 Glu 2,7 35 ** Uidentificeret rest (Gin) udledt ud fra pyroglutamataminopepti- daseforsøg z * Uidentificeret rest (Cys udledt ud fra cDNA)

Claims (7)

18 DK 174067 B1

1. Protein, KENDETEGNET ved, at det omfatter en aminosyresekvens fra Ala (nr. 1), Gly (nr. 21), Gin (nr. 22), Glu (nr. 23), Ala (nr. 24),

2. Protein ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at det omfatter en aminosyresekvens fra Ala (nr. 1), Gly (nr. 21), Gin (nr. 22), Glu (nr. 23), Ala (nr. 24), Gin (nr. 25), Gin (nr. 30), Ala (nr. 31) eller Ile (nr. 33) til Asn (nr. 165) i den i figur 1 viste aminosyresekvens eller en aminosyresekvens, der yderligere har Met ved nævnte aminosyre- 15 sekvenses N-terminal.

3. Protein Ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at, AT den første aminosyresekvens er fra Gin (nr. 22), Glu (nr. 23) eller Ile (nr. 33) til Gly (nr. 144) i den i figur 1 viste aminosyresekvens. 20

4. Protein ifølge krav 2, KENDETEGNET ved, at den første aminosyresekvens er fra Gin (nr. 22), Glu (nr. 23) eller Ile (nr. 33) til Asn (nr. 165) i den i figur 1 viste aminosyresekvens.

5. Protein ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, KENDETEGNET ved, at den teoretiske aminosyresammensætning af sekvensen fra Gin (nr. 22) til Gly (nr. 144), aminosyre nr. 145 samt sekvensen fra Gin (nr. 146) til Asn (nr. 165) er som anført i Tabel I.

5 Gin (nr. 25), Gin (nr. 30), Ala (nr. 31) eller Ile (nr. 33) til Gly (nr. 144. samt en aminosyresekvens fra Gin (nr. 146) til Asn (nr. 165) i den i figur 1 viste aminosyresekvens eller en aminosyresekvens, der yderligere har Met ved første aminosyresekvenses N-terminal.

6. Fremgangsmåde til fremstilling af et protein ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, KENDETEGNET ved, at man dyrker en vært, hvori der er indført en ekspressionsvektor, som har et gen, der koder for proteinet, og udvinder proteinet fra kulturen.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, KENDETEGNET ved, at værten er Saccharomyces cerevisiae.