DK173938B1 - Antistof, immunoassay og testkit - Google Patents

Antistof, immunoassay og testkit Download PDF

Info

Publication number
DK173938B1
DK173938B1 DK198803056A DK305688A DK173938B1 DK 173938 B1 DK173938 B1 DK 173938B1 DK 198803056 A DK198803056 A DK 198803056A DK 305688 A DK305688 A DK 305688A DK 173938 B1 DK173938 B1 DK 173938B1
Authority
DK
Denmark
Prior art keywords
antibody
substance
enzyme
labeled
monoclonal
Prior art date
Application number
DK198803056A
Other languages
English (en)
Other versions
DK305688A (da
DK305688D0 (da
Inventor
Kouichi Tamura
Mineo Niwa
Tsutomu Kaizu
Masakazu Kobayashi
Original Assignee
Fujisawa Pharmaceutical Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fujisawa Pharmaceutical Co filed Critical Fujisawa Pharmaceutical Co
Publication of DK305688D0 publication Critical patent/DK305688D0/da
Publication of DK305688A publication Critical patent/DK305688A/da
Application granted granted Critical
Publication of DK173938B1 publication Critical patent/DK173938B1/da

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D498/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D498/12—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains three hetero rings
    • C07D498/18—Bridged systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1267—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
    • C07K16/1292—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Actinomyces; from Streptomyces (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/188—Heterocyclic compound containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen atoms and oxygen atoms as the only ring heteroatoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/81—Packaged device or kit
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/807—Apparatus included in process claim, e.g. physical support structures
    • Y10S436/808—Automated or kit
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/808—Materials and products related to genetic engineering or hybrid or fused cell technology, e.g. hybridoma, monoclonal products
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/808—Materials and products related to genetic engineering or hybrid or fused cell technology, e.g. hybridoma, monoclonal products
    • Y10S530/809—Fused cells, e.g. hybridoma
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
    • Y10S530/815—Carrier is a synthetic polymer
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/863—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving IgM
    • Y10S530/864—Monoclonal
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/868—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving autoimmunity, allergy, immediate hypersensitivity, delayed hypersensitivity, immunosuppression, or immunotolerance

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Compositions Of Macromolecular Compounds (AREA)

Description

DK 173938 B1
Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte antistoffer, en særdeles sensitiv immunoassayfremgangsmåde og et testkit til udførelse af denne fremgangsmåde.
Den foreliggende opfindelse angår især antistoffer, der er i stand til 5 at genkende en antigen determinant/antigene determinanter, der er lokaliseret på et FR-900506-stof, en særdeles sensitiv enzymimmunoassay-fremgangsmåde, der udnytter et immobiliseret antistof imod FR-900506-stoffet (direkte fremgangsmåde), en særdeles sensitiv enzymimmunoas-sayfremgangsmåde til bestemmelse af lavmolekylære stoffer, hvilken 10 fremgangsmåde omfatter anvendelsen af et første antistof, der er i stand til at genkende et teststof, der skal analyseres, og et immobiliseret andet antistof, der er i stand til at genkende det første antistof (indirekte fremgangsmåde), og et testkit til måling af koncentrationen af FR-900506-stoffet ved den ovennævnte direkte eller 15 indirekte fremgangsmåde.
FR-900506-stoffet er en forbindelse, der fremstilles af stammer af slægten Streptomvces, særlig Streptomvces tsukubaensis nr. 9993 (deponeret i Fermentation Research Institute, Japan, i henhold til Bu-dapesttraktaten med deponeringsnummeret FERM BP-927), og som har far-20 makologiske aktiviteter såsom immunosuppressiv aktivitet og anti- mikrobiel aktivitet. Det er kendt, at denne forbindelse har følgende strukturelle formel (Japansk Kokai Tokkyo Koho JP 61-148181): oKp° Am*
H eOA C
y Y /''Me OMe OMe DK 173938 B1 2 FR-900506-stoffet udviser meget effektiv immunosuppressiv aktivitet i meget små doser. Til effektivt og kontinuert at suppressere afstødel-sesreaktionen i forbindelse med transplantation, fx organtransplantation, er der derfor behov for en enkel og nem teknik, som vil muliggø-5 re særdeles sensitiv måling af den nævnte forbindelses blodkoncentration, efter at forbindelsen er blevet administreret til levende individer. Til en sådan måling menes det, at etablering af en teknik til præcis bestemmelse af meget lave koncentrationer af den nævnte forbindelse er af stor vigtighed.
10 Der er imidlertid endnu ikke udviklet en teknik til bestemmelse af meget lave koncentrationer af FR-900505-stoffet på en enkel og nem måde og med høj sensitivitet. Der er heller ikke endnu udviklet antistoffer, der er i stand til at genkende FR-900506-stoffet, og som spiller en vigtig rolle i påvisning af FR-900506-stoffet.
15 De hidtil anvendte fremgangsmåder til analyse de små mængder lavmolekylære stoffer, der er indeholdt i biologiske prøver og lignende, omfatter gaschromatografi, højtryksvæskechromatografi, radioimmunoassay og enzymimmunoassay osv.
Disse fremgangsmåder er imidlertid ufordelagtige på en eller anden 20 måde, fx (1) er sensitiviteten utilstrækkelig til analyse af særdeles aktive farmakologiske stoffer, der eksisterer i meget lave koncentrationer, (2) fremgangsmåden er kompliceret, (3) et stort apparat er nødvendigt, og (4) der skal anvendes en farlig radioisotop.
Som resultat af omfattende undersøgelser lykkedes det nærværende op-25 findere at opnå et antistof, der er i stand til at genkende FR-900506-stoffet, og de fandt derefter, at meget små mængder FR-900506-stoffet kan påvises på en enkel og nem måde med god sensitivitet, når antistoffet immobiliseres, og FR-900506-stoffet indeholdt i en prøve og et enzymmærket FR-900506-stof efterfølgende lades reagere kompetitivt med 30 antistoffet.
Som et resultat af yderligere omfattende undersøgelser fandt nærværende opfindere, at der kan tilvejebringes en enkel, nem og endnu mere sensitiv assayfremgangsmåde til bestemmelse af meget små mængder af et teststof når et første antistof, der er i stand til at genkende 35 teststoffet, og et immobiliseret andet antistof, der er i stand til at genkende det første antistof, anvendes, og teststoffet, der er indeholdt i en prøve, og en enzymmærket form af det samme teststof lades reagere kompetitivt med det første antistof. Et hensigtsmæssigt testkit til udførelse af de ovennævnte fremgangsmåder blev også frem- 3 DK 173938 B1 stillet og tilvejebragt. Nærværende opfindere har nu udviklet den foreliggende opfindelse på basis af de ovennævnte erkendelser.
Den foreliggende opfindelse kan karakteriseres ved fire aspekter, nemlig: 5 (I) et antistof, der er i stand til at genkende en antigen determi- nant/antigene determinanter, der er lokaliseret på FR-900506-stoffet; (II) en særdeles sensitiv enzymimmunoassayfremgangsmåde til bestemmelse af FR-900506-stoffet, hvilken fremgangsmåde omfatter, at et antistof, der er i stand til at genkende en antigen determinant/antigene 10 determinanter, der er lokaliseret på FR-900506-stoffet, immobiliseres, at FR-900506-stoffet indeholdt i en prøve og et enzymmærket FR-900506-stof lades reagere kompetitivt med det immobiliserede antistof, og at det enzymmærkede FR-900506-stof, der er bundet til det immobiliserede antistof, påvises (direkte fremgangsmåde); 15 (III) en særdeles, sensitiv immunoassayfremgangsmåde, der omfatter, at et første antistof, der er i stand til at genkende et teststof, der skal analyseres, og et immobiliseret andet antistof, der er i stand til at genkende det første antistof, anvendes, at teststoffet, der er indeholdt i en prøve, og en enzymmærket form af det samme teststof 20 lades reagere kompetitivt med det første antistof, og at det enzymmærkede teststof, der er bundet til det første antistof, der igen er bundet til det andet antistof, påvises (indirekte fremgangsmåde); (IV) et testkit til påvisning af FR-900506-stoffet, hvilket testkit omfatter et antistof, der er i stand til at genkende en antigen deter-25 minant/antigene determinanter, der er lokaliseret på FR-900506-stof-fet, og en enzymmærket form af FR-900506-stoffet.
I det følgende vil den foreliggende opfindelse blive beskrevet i yderligere detaljer.
(I) Et antistof, der er i stand til at genkende en antigen determi-30 nant/antigene determinanter, der er lokaliseret på FR-900S06-stoffet
Det ovennævnte antistof omfatter et polyklonalt antistof og et mono-klonalt antistof.
Det polyklonale antistof kan klassificeres efter dets H-kæde (tunge kæde) i sådanne klasser som IgG, IgA, IgM, IgD eller IgE og yderligere 35 i underklasser af hver klasse. De kan være af en hvilken som helst klasse, når blot de er i stand til at genkende en antigen determi- 4 DK 173938 B1 nant/antigene determinanter, der er lokaliseret på FR-900506-stoffet.
En særlig foretrukken klasse er imidlertid IgG.
Det polyklonale antistof oprenses fra dets antiserum, der er opnået ved immunisering af et dyr med et stof, der tjener som immunogen (fx 5 FR-900506-stoffet).
Immuniseringstrinnet udføres ved en konventionel fremgangsmåde-
Der er ikke nogen særlig begrænsning, hvad angår de dyrearter, der skal immuniseres. Generelt anvendes kaniner, marsvin, rotter, mus, geder og lignende, og blandt disse er kaniner særlig foretrukne.
10 Stoffet, der tjener som immunogen (fx FR-900506-stoffet), anvendes generelt i form af et konjugat med en bærer såsom bovint serumalbumin (i det følgende betegnet BSA), gelatine eller hæmocyanin, således at immunogeniciteten kan øges. Når det immunogene stof er FR-900506-stoffet, kan et konjugat med BSA (BSA-FR-900506-stof-konjugat) opnås 15 fx ved at omdanne FR-900506-stoffet til en halvester af en dicarboxyl-syre såsom ravsyre, derefter at omsætte halvesteren med N-hydroxysuc-cinimid eller lignende i nærværelse af et kondenserende middel såsom dicyclohexylcarbodiimid, og yderligere at omsætte den resulterende aktiverede ester med BSA.
20 Det polyklonale antistof oprenses fra det således opnåede antiserum på traditionel måde såsom ved udsaltning med ammoniumsulfat eller lignende, centrifugering, dialyse eller søjlechromatografi.
Selvom det monoklonale antistof kan klassificeres efter dets H-kæde, således som det er tilfældet for polyklonale antistoffer, kan en hvil-25 ken som helst type monoklonale antistoffer anvendes, så længe det kan genkende en antigen determinant/antigene determinanter, der er lokaliseret på FR-900506-stoffet. En særlig foretrukken klasse er imidlertid igG.
Det monoklonale antistof fremstilles generelt ved cellefusions- og 30 kloningsteknikker. Det kan også fremstilles under anvendelse af gen splej sningsteknikker.
De antistofproducerende celler, der skal anvendes i cellefusionstrinnet (fx anti-FR-900506-stof-antistofproducerende celler), er fx miltceller, lymfeknudeceller og perifere lymfocytter fra et dyr (fx mus, 35 rotte, kanin, ged), der er immuniseret med det immunogene stof, der har forøget immunogenicitet (fx BSA-FR-900506-stof-konjugat). Antistofproducerende celler, der er opnået ved at lade immunogenet virke i 5 DK 173938 B1 et dyrkningsmedium på de ovennævnte celler eller lymfocytter eller lignende, der forud er isoleret fra de ikke-immuniserede dyr, kan også anvendes. Når den sidstnævnte fremgangsmåde anvendes, er det også muligt at fremstille human-afledte antistofproducerende celler. De 5 antistofproducerende celler og myelomaceller kan, hvis de kan fusionere, stamme fra forskellige dyrearter, men stammer fortrinsvis fra den samme dyreart.
Fremstillingen af monoklonalt antistof under anvendelse af cellefusionsteknikken udføres ved en traditionel fremgangsmåde, fx ved Kohler 10 og Milsteins principale metode [Nature, 256, 495 (1975)].
1 en særlig foretrukken udførelsesform fremstilles hybridomer ved cellefusion mellem miltceller, der er opnået fra mus, der er immuniseret med et BSA-FR-900506-stof-konjugat, og musemyelomaceller, og der screenes til opnåelse af hybridomer, der fremstiller et monoklonalt 15 antistof, der er specifikt imod FR-900506-stoffet. Hybridomet dyrkes i mus' peritonale caviteter, og det monoklonale anti-FR-900506-stof-antistof opnås fra musens ascitesvæske.
(II) Enzymimmunoassay for FR-900506-stoffet (direkte fremgangsmåde)
Den direkte fremgangsmåde udføres ved at immobilisere et antistof, der 20 er i stand til at genkende en antigen determinant/antigene determinanter, der er lokaliseret på FR-900506-stoffet, at lade FR-900506-stoffet, der er indeholdt i en prøve, og et enzymmærket FR-900506-stof reagere kompetitivt med det immobiliserede antistof, og at påvise det enzymmærkede FR-900506-stof, der er bundet til det immobiliserede an-25 tistof. Antistoffet, der er i stand til at genkende en antigen determinant/antigene determinanter, der er lokaliseret på FR-900506-stof-fet, er det, der er beskrevet i det første aspekt (I) af den foreliggende opfindelse. Både et polyklonalt og et monoklonalt antistof kan anvendes, men et monoklonalt antistof foretrækkes, fordi det har 30 en høj specificitet, og der ikke er nogle specificitetsforskelle mellem produktionspartier. Som første fase til immobilisering er plader (plader til immunologisk anvendelse, etc.), perler (perler til immunologisk anvendelse, etc.), polystyrenkugler og reagensglas fx anvendelige, immunologiske plader er foretrukne ud fra et simpelt 35 driftssynspunkt. Som enzym til mærkning af FR-900506-stoffer kan de enzymer, der generelt anvendes i forskellige kendte enzymimmunoassay-fremgangsmåder, nævnes. Således er fx peroxidase, β-D-galactosidase, alkalisk phosphatase, glucoseoxidase, acetylcholinesterase, glucose-6-phosphatdehydrogenase, malatdehydrogenase og urease anvendelige.
40 Blandt dem er peroxidase (i det følgende benævnt POD) et foretrukket enzym.
6 DK 173938 B1
Det enzymmærkede FR-900506-stof kan fremstilles ved en normal fremgangsmåde. Fx, når der anvendes et koblingsmiddel, omsættes halvesteren af FR-900506-stoffet med en dicarboxylsyre såsom ravsyre som beskrevet ovenfor under det første aspekt (I) af opfindelsen således med 5 N-hydroxysuccinimid eller lignende, og den resulterende aktiverede ester af denne halvester omsættes med et enzym, der er anvendeligt til mærkningsformål, fx POD.
Det enzymmærkede stof, der er bundet til det immobiliserede antistof, påvises ved måling af enzymets aktivitet på normal vis. Når det an-10 vendte mærkningsenzym er POD, kan det POD, der er bundet til det immobiliserede antistof, analyseres ved at anvende en enzymsubstratop-løsning af O-phenylendiamid og hydrogenperoxid og ved at måle den farvningsgrad, der skyldes oxidation af substratet som en optisk densitet. Farvningsgraden er proportional med den mængde POD-FR-900506-15 stof, der er bundet til det immobiliserede antistof.
Denne direkte fremgangsmåde kan kvantitativt og kvalitativt analysere FR-900506-stoffet i meget lave koncentrationer på 10'1 - 103 ng/ml på en enkel og nem måde.
(III) Enzymimmunoassay (indirekte fremgangsmåde) 20 Den indirekte fremgangsmåde udføres under anvendelse af et første antistof, der er i stand til at genkende et teststof, der skal analyseres, og et immobiliseret andet antistof, der i stand til at genkende det første antistof, idet teststoffet, der er indeholdt i en prøve, og en enzymmærket form af det samme teststof lades reagere kompetitivt 25 med det første antistof, og det enzymmærkede teststof, der er bundet til det første antistof, der igen er bundet til det andet antistof, påvises.
Denne indirekte fremgangsmåde kan analysere forskellige stoffer såsom peptider, steroider, prostaglandiner, polysaccharider og makrocycliske 30 forbindelser, og den er særlig anvendelig til koncentrationsbestemmelser af makrocycliske forbindelser, mere specifikt FR-900506-stoffet.
Det første antistof kan være et polyklonalt antistof eller et mono-klonalt antistof forudsat, at det kan genkende teststoffet, men er fortrinsvis et monoklonalt antistof, idet dette har en høj specifici-35 tet, og idet der ikke er nogen specificitetsforskelle mellem produktionspartier. Det første antistof fremstilles på samme måde som beskrevet i det første aspekt (I) af den foreliggende opfindelse. Når teststoffet er FR-900506-stoffet, er det antistof, der er beskrevet ovenfor i det første aspekt (I) af opfindelsen, anvendeligt.
7 DK 173938 B1
Et antistof, der er fremstillet ved brug af en traditionel fremgangsmåde, ved hvilken det første antistof eller et antistof af den samme art som det første antistof anvendes som et immunogen og også et antistof, der er kommercielt tilgængeligt, er anvendelige som det andet 5 antistof, der er i stand til at genkende det første antistof. Et hvilket som helst af disse, enten polyklonalt eller monoklonalt, kan anvendes under forudsætning af, at de ikke vil interferere med antigen-antistofreaktionen mellem det første antistof og teststoffet, men at det kan genkende det første antistof. Når det første antistof er et 10 antistof af klassen IgG, der er opnået fra en kanin, foretrækkes det, at gedeanti-kanin IgG anvendes som det andet antistof. Når det første antistof er et antistof af klassen IgG, der er opnået fra en mus, foretrækkes anvendelsen af kaninanti-muse IgG.
Den faste fase til immobilisering, enzymet til mærkning af teststoffer 15 og fremgangsmåden til påvisning af enzymet er de samme som de, der er beskrevet ovenfor i opfindelsens andet aspekt (II).
Når denne indirekte fremgangsmåde anvendes, kan påvisningsgrænsen for teststoffer varieres ved at regulere mængden af det første antistof, der skal genkendes af det immobiliserede andet antistof. Det er såle-20 des blevet påvist, at FR-900506-stoffet, der i nærværende beskrivelse og krav er beskrevet som et typisk eksempel på et teststof, kvantitativt og kvalitativt kan analyseres med høj sensitivitet og på en enkel og nem måde ned til meget lave koncentrationer i størrelsesordenen 10'2 ng/ml.
25 (IV) Testkit
Dette testkit er til påvisning af FR-90050$-stoffet og omfatter et antistof, der er i stand til at genkende en antigen determinant/antigene determinanter, der er lokaliseret på FR-900506-stoffet, og et enzymmærket FR-900506-stof.
30 Det "antistof, der er i stand til at genkende en antigen determinant/ antigene determinanter, der er lokaliseret på FR-900506-stoffet", er enten et polyklonalt antistof eller et monoklonalt antistof som beskrevet ovenfor i opfindelsens første aspekt (I), men er fortrinsvis et monoklonalt antistof. Antistoffet kan tilføres i fast tilstand el-35 ler i opløsning.
Det "enzymmærkede FR-900506-stof" er det stof, der er beskrevet ovenfor i opfindelsens andet aspekt (II), men er fortrinsvis et peroxida-semærket FR-900506-stof.
8 DK 173938 B1
Dette stof kan også tilføres i fast tilstand eller i opløsning.
Det foreliggende testkit kan omfatte andre bestanddele, der er anvendelige, når nærværende særdeles sensitive enzymimmunoassay anvendes.
Fx kan det være en kendt mængde FR-900506-stof som standard til kvan-5 titative målinger.
Andre bestanddele er et antistof, der er i stand til at genkende "det antistof, der er i stand til at genkende en antigen determinant/anti-gene determinanter, der er lokaliseret på FR-900506-stoffet", som beskrevet ovenfor i opfindelsens tredje aspekt (III). Og en anden yder-10 ligere bestanddel kan være et substrat for det enzym, der anvendes som mærke for FR-900506-stoffet.
9 DK 173938 B1 EKSEMPEL 1
Fremstilling af polyklonalt anti-FR-900506-stof-antistof 1) Syntese af aktiveret ester af FR-900506-stof-hemisuccinat FR-900506-Stof .1 H00C(CH2)2C00v^\ • M.O-^Sj ?· w 1,0 oKs>° . AMe
V
OHe OMe 5 q FR-900506-stof-hemisuccinat
^%OOC(CH2)2COO\^v I
MeO [1 i ¢0¾ °V C^Me
Ke,J<0H V
1 °\ OMe OHe
Aktiveret ester af FR-900506-stof-hemisuccinat FR-900506-stoffet (248 mg) blev opløst i pyridin (7 ml). Ravsyrean-hydrid (145 mg) og 4-dimethylaminopyridin (7 ml) blev tilsat opløs- 10 DK 173938 B1 ningen. Blandingen blev omrørt ved stuetemperatur i 18 timer. Reaktionsblandingen blev koncentreret til tørhed under reduceret tryk, og remanensen blev underkastet silicagelsøjlechromatografi. Eluering med ethylacetat gav FR-900506-stof-hemisuccinat (90 mg). i en opløsning af 5 denne halvester (90 mg) i ethylacetat (10 ml) blev N-hydroxysuccinimid (12,6 mg) opløst, og dicydohexylcarbodiimid (22 mg) blev efterfølgende tilsat under isafkøling. Den resulterende blanding blev omrørt natten over ved stuetemperatur. Præcipitatet blev filtreret fra, og filtratet blev inddampet til tørhed under reduceret tryk. Remanensen 10 blev oprenset ved silicagel-tyndtlagschromatografi.
Eluering med ethylacetat gav den aktiverede ester af den ovennævnte forbindelse (udbytte 74,1 mg) IR v (ren) : 1813, 1784, 1735, 1640, 1200 cm'1 2) Fremstilling af BSA-FR-900506-stof-konjugat 15 Den aktiverede ester af FR-900506~stof-hemisuccinat (37 mg), opnået som beskrevet ovenfor, blev opløst i dioxan (4 ml). En opløsning af BSA (Armour Pharmaceutical Co.) (30,1 mg) i 0,05 M phosphatbuffer (pH 7,3) (10 ml) blev tilsat opløsningen. Efter 3 dages omrøring ved 4°C blev reaktionsblandingen dialyseret mod 0,05 M phosphatbuffer 20 (pH 7,3) i 24 timer. Således blev et BSA-FR-900506-stof-konjugat fremstillet.
3) Fremstilling af POD-mærket FR-900506-stof
Til en opløsning af den aktiverede ester af FR-900506-stof-hemisucci-nat (0,48 mg), som opnået i trin 1) , i dioxan (10 /ti) blev sat en op-25 løsning af peberrodsperoxidase (type VI, Sigma Chemical Co.) (10 mg) i dioxan-0,5% natriumhydrogencarbonat (1:1 v/v)-opløsning (0,36 ml), og den resulterende blanding blev omrørt ved 4°C i 2,5 timer. Efter tilsætning af 0,1* vægt/volumenprocent gelatine-0,05 M phosphatbuffer (pH 7,0) (1,77 ml) blev blandingen dialyseret mod 0,05 M phosphatbuffer 30 (pH 7,0), hvilket gav en POD-mærket FR-900506-stof-opløsning.
4) Fremstilling af polyklonalt anti-FR-900506-stof-antistof
En opløsning (2,5 ml) af BSA-FR-900506-stof-konjugatet (1,6 mg som BSA), der blev opnået i trin 2), i phosphatbufferet fysiologisk saltvand (i det følgende betegnet PBS) blev emulgeret i et ligeså stort 35 volumen af Freund's komplette adjuvans, og emulsionen blev anvendt til at immunisere syv newzealandske hvide hunkaniner henholdsvis ved injektion i fodpuden i en dosis på 5 ml og ved subkutan injektion i en dosis på 5 ml. Efter to uger og tre uger blev der foretaget suppleren- DK 173938 B1 αι de immuniseringer ved injektion i trædepuden og ved subkutan injektion, hver i en dosis på 5 ml, af en emulsion af den samme BSA-FR-900506-stof-konjugatopløsning i PBS som nævnt ovenfor i et ligeså stort volumen af Freund's ukomplette adjuvans.
5 Tre uger efter den sidste boosting blev den afsluttende immunisering udført på samme måde. Ni dage efter den sidste immunisering udførtes exsanguinering. Til det således opnåede antiserum (340 ml) blev PBS og 100%-mættet ammoniumsulfat tilsat, hver i et lige stort volumen, til udsaltning. Det resulterende præcipitat blev opsamlet ved centri-10 fugering (10.000 omdr./min. x 10 minutter), opløst i 20 mM phosphat-buffer (pH 8,0) (200 ml), grundigt dialyseret mod den samme buffer (pH 8,0) og oprenset på DEAE-cellulosesøjle (DE52, Whatman Chemical Separation), der var ækvilibreret med den samme buffer. En fraktion (IgG fraktion), der løb gennem DEAE-cellulosesøjlen, og som indeholdt 15 et polyklonalt anti-FR-900506-stof-antistof (5,6 g), blev opnået på denne måde (antistofmængden blev beregnet på basis af absorbansværdien ved bølgelængden 280 nm).
PBS-opløsningen, der blev anvendt i dette eksempel, var en opløsning, der pr. liter vand indeholdt de nedenfor anførte salte. Det samme gæl-20 der i de følgende eksempler.
NaCL 8,0 g na2hpo4 1,15 g KC1 0,2 g KH2P04 0,2 g 25 EKSEMPEL 2
Fremstilling af monoklonalt anti-FR-900506-stof-antistof 1) Fremstilling af monoklonalt anti-FR-900506-stof-antistofproduce-rende hybridoma
En opløsning af det BSA-FR-900506-stof-konjugat, der blev opnået i 30 trin 2) i eksempel l, (50 μg som BSA) i PBS (0,2 ml) blev emulgeret i et ligeså stort volumen af Freund's komplette adjuvans, og opløsningen blev administreret til en BALB/c-hunmus ved intraperitoneal injektion. Derefter blev den anden og tredje immunisering (boosting) udført med to ugers intervaller, hver gang ved intraperitoneal injektion af en e-35 mulsion af den samme mængde af BSA-FR-900506-stof-konjugatopløsningen i PBS i et ligeså stort volumen af Freund's ukomplette adjuvans.
Derefter blev en emulsion af en 10-gange koncentreret PBS-opløsning 12 DK 173938 B1 (0,2 ml) af BSA-FR-900506-stof-konjugatet (500 μg som BSA) i Freund's ukomplette adjuvans administreret til musen ved subkutan injektion til den fjerde immunisering.
Derudover blev der, til den sidste boosting, administreret en opløs-5 ning af BSA-FR-900506-stof-konjugatet (200 μg som BSA) i PBS (0,2 ml) til musen ved intravenøs injektion i den caudale vene, og milten blev udtaget efter 3 dage.
Denne milt blev splittet ad med en pincet, og de opnåede miltceller blev fusioneret med musemyelomaceller (P3 x 63Ag8U.l) ved den nedenfor 10 nævnte fremgangsmåde.
Miltcellerne blev således opslæmmet i Dulbeccos modificerede Eagle's minimale essentielle medium (i det følgende betegnet D-MEM). Erythro-cytterne i opløsningen blev sprængt ved behandling med en blandet opløsning af 0,83% ammoniumchloridopløsning (9 volumener) og 0,17 M 15 tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochloridbuffer (pH 7,65; 1 volumen) ved 4°C i 5 minutter og fjernet ved centrifugering. Musemyelomaceller-ne, der var dyrket i D-MEM beriget med 10% føtal kalveserum, og miltcellerne blev vasket flere gange med D-MEM.
En opslæmning af miltcellerne (2 x 108 celler) blev sat til en op-20 slæmning af musemyelomaceller (4 x 107 celler) , og den blandede opslæmning blev grundigt rystet i et 50 ml plastrør (Corning Glass Work's 50 ml Corning centrifugerør). Mediet blev fjernet ved centrifugering, og cellerne blev opvarmet til 37°C på et vandbad. En 45% polyethylenglycol(Merck; middelmolekylvægt 4.000)-opløsning (1 ml) 25 blev gradvist sat til cellerne i løbet af 1 minut under omrystning.
Den resulterende blanding fik lov til at stå ved stuetemperatur i 5 minutter. Cellefusionsreaktionen blev standset ved dråbevis at sætte 15 ml D-MEM til reaktionsblandingen i løbet af 5 minutter. Derefter blev en stor mængde D-MEM tilsat, og den resulterende blanding blev 30 centrifugeret. Supernatanten blev taget fra. Til sedimentet blev sat et komplet medium (i det følgende betegnet CM) bestående af D-MEM beriget med 15% føtal kalveserum (Centaurus; lot 757), 2 mM glutamin, 2 x 10'5 M 2-mercaptoethanol, 100 μg/ml streptomycinsulfat, 100 U/ml penicillin G, 80 μg/mg gentamycinsulfat og Fungison (amphotericin B; 35 Gibco Laboratories). Blandingen blev omrystet i nogen tid, og den resulterende fusionerede cellesuspension blev fordelt i brøndene af 10 24 brøndes plader (Nunc) (1 ml (1 x 10® celler) pr. brønd) . Cellerne blev inkuberet ved 37°c i en atmosfære indeholdende 5% carbondioxid i 1 dag. Derefter blev 1 ml CM indeholdende aminopterin (4 x 10*7 M), 40 thymidin (1,6 x 10'5 M) og hypoxanthin (l x ΙΟ"4 M) (HAT-medium) tilsat hver brønd. Efter en dag blev halvdelen af mediet aspireret fra hver 13 DK 173938 B1 brønd, og HAT-medium blev tilsat som kompensation derfor. Derefter fortsattes mediumudskiftningen med to eller tre dages intervaller.
Blandt 161 brønde, i hvilke der blev observeret hybridomavækst, blev der udvalgt 14 brønde, i hvilke supernatanter udviste reaktivitet over 5 for et immobiliseret BSA-FR-900506-stof-konjugat på en fast fase og specifik reaktivitet over for FR-900506-stoffet. Blandt de 14 brønde blev der yderligere valgt 8 brønde, i hvilke supernatanterne udviste relativ høj antistoftiter, og hybridomacelleme deri blev klonet ved brug af den begrænsede fortyndingsfremgangsmåde under anvendelse af 10 mikrotiterplader med hver 96 fladbundede brønde (Nunc) idet BALB/C- musethymocytter blev anvendt som fodercellelag (5 x 106 celler/ml). Således blev der opnået tre hybridomastammer, der er i stand til at producere et monoklonalt antistof, der udviser specificitet over for FR-900506-stoffet.
15 Antistoffet i hver af de ovenfor nævnte brønde blev analyseret ved den nedenfor nævnte fremgangsmåde, således at en klon kunne udvælges, når dens dyrkningsvæske var reaktiv over for det immobiliserede BSA-FR-900506-stof-konjugat på en fast fase, som nævnt nedenfor, og den pågældende reaktion på samme tid blev antagoniseret af et overskud af 20 FR-900506-stoffet.
Til bekræftelse af reaktiviteten over for BSA-FR-900506-stof-konjuga-tet blev dyrkningsvæsken (100 μΧ) således tilsat hver brønd med et fast fase-overtræk af konjugatet (overtræksbetingelser: tilsætning af 100 μΐ/brønd af en 20 jig/ml opløsning i PBS og efterfølgende 2 timers 25 henstand ved 37°C) og fik lov til at stå ved 37eC i 2 timer. Efter fjernelse af væsken ved aspiration og den efterfølgende vask blev en 2000-gange fortynding (100 μΐ) af et POD-mærket anti-muse IgG (Miles; kode 61-204.1) [fortynder: PBS indeholdende 1% BSA (i det følgende betegnet 1% BSA-PBS)] sat dertil og fik lov til at stå ved 37°C i 1 30 time. Efter aspiration og vask blev POD-aktiviteten målt ved brug af en traditionel colorimetrisk fremgangsmåde. Til bedømmelse af, hvorvidt det pågældende antistof var specifikt reaktivt med FR900506-stoffet, blev en opløsning af FR-900506-stoffet i 1% BSA-PBS (50 μΐ) i koncentrationen 100 μg/ml sat til hver brønd, der havde et fastfase-35 overtræk af BSA-FR-900506-stof-konjugatet, derefter blev dyrkningsvæsken (100 μΐ) tilsat, og efter reaktion blev den samme reaktion og farvningsfremgangsmåde med POD-mærket antimuse IgG, som nævnt ovenfor, fulgt. Hvis hybridomadyrkningsvæsken indeholdt et specifikt monoklonalt antistof imod FR-900506-stoffet, ville der ikke observeres nogen 40 farve i nærværelsen af et overskud af FR-900506-stoffet.
14 DK 173938 B1 2) Isolering og oprensning af monoklonalt antistof
De tre hybridomastammer, der blev opnået i trin 1) i eksempel 2, blev transplanteret til de peritoneale cavititer i B ALB / c - hunmus i en immu-nosuppresseret tilstand, der var fremkommet ved administration af 5 2,6,10,14-tetramethylpentadecan, i en dosis på l x 107 celler pr. mus.
Efter 10-14 dage blev ascitesvæsken opsamlet og fraktioneret med 50* mættet ammoniumsulfat. Antistoffraktionen blev dialyseret mod 10 mM phosphatbuffer {pH 8,0) og derefter underkastet søjlechromatografi på en DEAE-cellulosescjle, der var ækvilibreret med 10 mM phosphatbuffer 10 (pH 8,0). Eluering med den lineære gradient af natriumchlorid (0-150 mM i 10 mM phosphatbuffer, pH 8,0) gav fraktioner af IgG, der var produceret af hvert hybridoma. Underklasserne af hvert IgG blev bestemt ved Ouchterlonys dobbeltimmunodiffusionsfremgangsmåde (tabel 1) .
15 TABEL 1
Ascites- Antistof-
Monoklonalt antistof Underklasse væske (ml) udbytte (mg) 20 FR-900506-1-40-56 IgGl 11 125,5 FR-900506-1-53-19 IgG2b 6 18,7 FR-900506-1-60-46 IgGl 40 175,0 EKSEMPEL 3 25 Enzymimmunoassay for FR-900506-stoffet (direkte fremgangsmåde) 1) Adsorption af antistof på fast fase
En monoklonal antistof- eller polyklonal antistofopløsning (20 μg/ml i PBS) blev i 200 μΐ portioner fordelt i brøndene i ELISA-plader S (MS-349F; Sumitomo Bakelite). Efter henstand natten over ved 4°C blev 30 antistofopløsningen isoleret, og pladerne blev vasket 3 gange med PBS.
2) Inhibering af ikke-specifik binding
Hver plade, der var behandlet på den ovenfor angivne måde, blev fyldt med 1* BSA-PBS, og efter 30 minutters henstand ved 37°c blev PBS-op-løsningen aspireret af.
15 DK 173938 B1 3) Antigen-antistofreaktion (1) Standard-FR-900506-stof-opløsninger (fortynder: 1% BSA-PBS indeholdende 10% normalt serum) blev i 100 μΐ portioner fordelt i brøndene i hver af de ovennævnte plader.
5 (2) En 2 x 105-gange fortynding af POD-mærket FR-900506-stof-opløsning, der blev fremstillet i trin 3) i eksempel 1 (fortynder: 1% BSA-PBS), blev i 100 μΐ portioner fordelt i brøndene.
(3) Indholdet af hver brønd blev omrørt med en plademixer i 10 sekunder og fik derefter lov til at stå natten over ved 4eC.
10 4) Enzymatisk reaktion
Hver brønd blev vasket to gange med PBS indeholdende 0,05% Tween 20 og yderligere to gange med PBS. En enzymsubstratopløsning, der var fremstillet som beskrevet nedenfor, blev i 200 μΐ portioner fordelt i hver plades brønde, og reaktionen fik lov til at forløbe ved stuetem-15 peratur i 30 minutter. Enzymsubstratopløsningen blev fremstillet lige før brug.
Ensymsubstratopløsning: O-phenylendiamin (100 mg) og 30% vandigt hydrogenperoxid (50 μΐ) blev opløst i Mcllvaines buffer (o,l M dinatriumhydrogenphosphat 20 indstillet til pH 5,4 ved tilsætning af 0,1 M citronsyre) (100 ml).
5) Reaktionstermineringsfremgangsmåde
Reaktionen blev standset ved at fordele 4 N svovlsyre i 50 μΐ portioner i brøndene i hver af de ovennævnte plader.
6) Måling 25 Absorbansen af hver reaktionsblanding blev målt ved bølgelængden 492 nm på et Multiskan (varemærke Titertek), idet substratopløsningen blev anvendt som kontrol.
Resultaterne for det polyklonale anti-FR-900506-stof-antistof ifølge eksempel 1 og de tre monoklonale anti-FR-900506-stof-antistoffer i-30 følge eksempel 2, der var opnået ved at følge den ovennævnte assay- fremgangsmåde under anvendelse af en normal beagle-hanhunds serum som det normale serum, er angivet i tabel 2.
16 DK 173938 B1 TABEL 2 Resultater af enzymimmunoassay af FR-900506-stof ved direkte fremgangsmåde
Koncentration af 5 FR-900506-stof OD492 nm (ng/ml) Po-AB Mo-Ab(l) Mo-Ab(2) Mo-Ab(3) 103 0,019 0,022 0,015 3.3 x 102 0,070 0,067 0,038 0,006 10 1,0 x 102 0,173 0,315 0,168 0,050 3.3 X 10 0,258 0,500 0,375 0,090 10 0,385 0,879 0,512 0,256 3,3 0,493 0,993 0,714 0,579 1 0,657 0,970 0,768 0,855 15 3,3 X ΙΟ'1 0,747 0,952 0,782 0,916 1,0 X 10'1 0,797 1,001 0.799 0,878
Po-Ab ..... Polyklonalt anti-FR-900506-stof-antistof
Mo-Ab(l)... Monoklonalt antistof FR-900506-1-40-56 20 Mo-An(2)... Monoklonalt antistof FR-900506-1-53-19
Mo-Ab(3)... Monoklonalt antistof FR-900506-1-60-46 EKSEMPEL 4
Enzymimmunoassay af FR-900506-stof (indirekte fremgangsmåde) 1) Adsorption af antistof på fast fase 25 En anden antistofopløsning (3 μg/ml, i PBS) blev i 200 μΐ portioner fordelt i brøndene i ELISA-plade H (MS-3596F; Sumitomo Bakelite).
Efter henstand natten over ved 4®C blev antistofopløsningen isoleret, og pladen blev vasket tre gange med PBS.
2) Inhibering af ikke-specifik binding 30 Hver plade, der var behandlet på den ovennævnte måde, blev fyldt med 1% BSA-PBS (300 μΐ pr. brønd). Efter 30 minutters henstand ved 37°C blev PBS'et aspireret af.
3) Antigen-antistofreaktion (1) En fortyndet POD-mærket FR-900506-stof-opløsning (fortynder: 1% 35 BSA-PSB; 5 x 104-gange fortynding, når det første antistof var et ___ j DK 173938 B1 17 polyklonalt antistof; 2 x 105-gange fortynding, når det første antistof var et monoklonalt antistof) blev i 100 μΐ portioner fordelt i brøndene i hver af de ovennævnte plader.
(2) Standard-FR-900506-stof-opløsninger (fortynder: 1% BSA-PBS inde-5 holdende 10% normalt serum) blev i 100 μΐ portioner fordelt i brøndene .
(3) En første antistofopløsning, der var fremstillet med 1% BSA-PBS (400 ng/ml når det første antistof var et polyklonalt antistof; 10 ng/ml når det første antistof var et monoklonalt antistof), blev i 10 50 μΐ portioner fordelt i brøndene.
(4) Hver brønds indhold blev omrørt ved hjælp af en plademixer i 10 sekunder og fik derefter lov til at stå natten over ved 4eC.
4) Enzymatisk reaktion
Den samme som beskrevet i eksempel 3's trin 4).
15 5) Reaktionsterminering
Den samme som beskrevet i eksempel 3's trin 5).
6) Måling
Den samme som beskrevet i eksempel 3's trin 6).
Resultaterne for det polyklonale anti-FR-900506-stof-antistof ifølge 20 eksempel 1 og det monoklonale antistof FR-900506-1-60-46 ifølge eksempel 2 (hver blev anvendt som det første antistof), som opnået ved at følge den ovenfor beskrevne assayfremgangsmåde, er henholdsvis anført i tabel 3 og tabel 4. FR-900506-stof-opløsningen med en hensigtsmæssig koncentration blev fremstillet ved at opløse FR-900506-stoffet i serum 25 fra en normal beagle-hanhund.
DK 173938 B1 1Θ TABEL 3 Resultater af enzymimmunoassay af FR-900506-stof ved indirekte fremgangsmåde under anvendelse af polyklonalt anti-FR-900506-stof-antistof 5 Koncentration af FR-900506-stof (ng/ml) 0D492nm 103 0,009 102 0,030 10 10 0,067 1 0,148 1 X 10'1 0,219 1 x 10‘2 0,262 1 X 10'3 0,303 15 _ TABEL 4 Resultater af enzymimmunoassay af FR-900506-stof ved indirekte fremgangsmåde under anvendelse af monoklonalt anti-FR-900506-stof-antistof 20 Koncentration af FR-900506-stof (ng/ml) OD492nm 5 0,003 2 0,063 25 1 0,168 5 X 10*! 0,359 2 X 10'1 0,660 1 X 10'1 1,879 5 x 10’2 1,088 30 2 x 10'2 1,232
Det andet anvendte antistof var gedeanti-kanin IgG [Miles' antiserum (kode 64-331-1), der var oprenset ved udsaltning med ammoniumsulfat og behandling på DEAE-cellulosesøj le] , når det anvendte første antistof 35 var det polyklonale anti-FR-900506-stof-antistof, og kaninanti-muse
IgG (EY laboratories; katalog nr. AF-011), når det anvendte første antistof var det monoklonale antistof FR-900506-1-60-46.
19 DK 173938 B1 EKSEMPEL 5
Plasmakoncentrationsassay ved indirekte metode
En enkelt dosis (1 mg/kg) af en fast dispersionsformulering af FR-900506-stoffet med den nedenfor angivne sammensætning blev admini-5 streret oralt til tre beagle-hanhunde, og plasmakoncentrationen for hvert dyr blev målt ved at følge den assayfremgangsmåde, der er beskrevet i eksempel 4 {systemet, hvor det monoklonale antistof FR-900506-stof-1-60-46 blev anvendt som det første antistof), og under anvendelse af en 10-gange fortynding af plasmaprøven (fortynder: 1% 10 BSA-PBS) i stedet for standard-FR-900506-stof-opløsninger fortyndet med l% DSA-PBS indeholdende 10% normalt serum. De således opnåede data (hver en middelværdi for tre dyr) er anført i tabel 5. I tabellen angiver "tid" tiden efter administration af den FR-900506-stofholdige faste dispersionsformulering.
15 Sammensætning af fastfase-dispersionsformulering {pr. gram) ί FR-900506-stof 0,2 g
Hydroxypropylmethylcellulose 2910 (TC-5R) 0,2 g
Croscarmellosenatrium (AC-Di-Sol) 0,2 g
Lactose 0,4 g 20 TABEL 5 Resultater af plasmakoncentrationsmålinger af FR-900506-stoffet ved indirekte framgangsmåde
Tid (hr) Koncentration af FR-900506-stof (ng/ml) 25 0,5 1,94 1 1,99 2 1.02 4 0,97 6 0,83 30 8 0,46 24 0,07 20 DK 173938 B1 EKSEMPEL 6
Et testkit (I) til udførelse af en indirekte fremgangsmåde
Kitbestanddele (til 1.000 prøver) (1) En første antistoffet monoklonalt anti-FR-900506-stof-anti-
5 stof)-opløsning (500 μΙ)1); 1 /ig/ml i 1% BSA-PBS
(2) POD-mærket FR-900506-stof-opløsning (500 μ1)2); en 1000-gange fortyndet opløsning med 1% BSA-PBS af opløsningen, der er fremstillet i eksempel 1 trin 3) (3) Standard-FR-900506-stof-opløsning (l ml)3*; 1 mg/ml i methanol 10 (4) En anden antistof(kaninanti-muse IgG)-opløsning (600 μΐ)1*:
1 mg/ml i PBS
1) anvendes efter 100-ganges fortynding med 1% BSA-PBS.
2) anvendes efter 200-ganges fortynding med 1% BSA-PBS.
3) anvendes efter hensigtsmæssig fortynding med 1% BSA-PBS.
15 4) anvendes efter 333-ganges fortynding med PBS.
Det foreliggende testkit anvendes til udførelse af en indirekte fremgangsmåde ifølge fremgangsmåden i eksempel 4.
EKSEMPEL 7
Et testkit (II) til udførelse af en indirekte fremgangsmåde 20 [Kitbestanddele (til 1.000 prøver)]
(1) En første antistoffet monoklonalt anti-FR-900506-stof-anti-stof)-opløsning (l ml)1): i μg/ml i 1% BSA-PBS
(2) POD-mærket FR-900506-stof-opløsning (700 μ1)2): En 1000-gange fortyndet opløsning med 1% BSA-PBS af den opløsning, der blev 25 fremstillet i eksempel 1 trin 3).
(3) FR-900506-stof-standardopløsninger (henholdsvis 1 ml): 100, 50, 20, 10, 5, 2, 1, 0,5, 0,2 og 0 ng/ml i methanol
En anden antistof(kaninanti-muse IgG)-opløsning (1 ml)3):
1 mg/ml i PBS
21 DK 173938 B1 1) den anvendes efter 50-gange fortynding tned 1% BSA-0,05%
Tween 20-PBS.
2) den anvendes efter 300-gange fortynding med 1% BSA-0,05%
Tween 20-PBS.
5 3) den anvendes efter 200-gange fortynding med PBS.
Det foreliggende testkit (II) anvendes til udførelse af en indirekte fremgangsmåde ved følgende søjlemetode eller ekstraktionsmetode.
[Søjlemetode] l. Sæt 0,1 N saltsyre (1,0 ml) og methanol (10 μΐ) til plasma- eller 10 serumprøver (100 μΐ) og omrør i flere sekunder.
1'. Fremstilling af FR-900506-stof-standardopløsningen Sæt 0,1 N saltsyre (1,0 ml) og den pågældende FR-900506-stof-standardopløsning (10 /il) til normalt plasma eller serum (100 μΐ) og omrør i flere sekunder.
15 2. Søjlebehandling i) Konditionering af søjlen
Sep-Pak-søjle (varemærke CI8 cartledge-søjle. Waters Associates (US)) aktiveres ved vask med 5 ml methanol og vaskes efterfølgende med 20 ml 4% vandig eddikesyre.
20 ii) Adsorption Sæt 1 ml af prøven eller standardopløsningen, der er beskrevet i trin 1 eller 1', til den konditionerede Sep-Pak-søjle.
iii) Vask
Vask Sep-Pak-søjlen med 20 ml 4% vandig eddikesyre.
25 iv) Eluering
Eluer det absorberede FR-900506-stof med 3 ml methanol og opsaml eluatet i et reagensglas med V-formet bund.
3. Koncentrer eluatet i en tør nitrogengasstrøm.
4. Opløs remanensen med 200 μΐ POD-mærket FR-900506-stof-opløsning af 30 1% BSA-0,05% Tween 20-PBS.
22 DK 173938 B1 5. Den anden antistofopløsning (200 μΐ) tilsættes hver brønd i en fladbundet mikrotiterplade med 96 brønde, og pladen inkuberes ved 4°C natten over.
6. Efter inkubering fjernes den anden antistofopløsning fra brøndene 5 ved sugning.
7. Pladen vaskes 3 gange med PBS.
8. Umiddelbart efter den tredje vask fyldes hver brønd med 300 μΐ 1% BSA-0,05% Tween 20-PBS (den blokerende opløsning).
9. Pladen inkuberes i 1 time ved stuetemperatur.
10 10. Den blokerende opløsning aspireres fra en brønd, og 180 μΐ af prøven eller standarden, der blev opnået i trin 4, sættes umiddelbart efter til pladens brønd. Denne erstatning af den blokerende opløsning med prøven eller standarden skal gøres brønd efter brønd, indtil alle prøverne er sat til de behørige brønde.
15 11. En første antistofopløsning (50 μΐ) sættes til hver brønd.
12. Pladen inkuberes natten over på en pladerotator ved 4°C, 13. Efter inkubering aspireres opløsningen af, og pladen vaskes 2 gange med 0,05% Tween 20-PBS og 2 gange med PBS.
14. Umiddelbart efter sættes 200 μΐ af den substratopløsning, der 20 er beskrevet i eksempel 3's trin 4), til hver brønd, og pladen inkuberes ved stuetemperatur i 15 minutter.
15. 4N svovlsyre tilsættes hver brønd for at stoppe POD's reaktion med hydrogenperoxid og O-phenylendiamin.
16. Den optiske densitet ved 492 nm (OD492) af prøven i hver 25 brønd måles, idet brøndens baggrunds OD492 fratrækkes.
[Ekstraktionsmetode] 1. Methanol (10 μΐ), 0,2 M phosphatbuffer (pH 7,0) (l μΐ) og dichlor-methan (6,0 ml) tilsættes til plasma- eller serumprøve (100 μΐ).
1'. De respektive FR-900506-stof-standardopløsninger (10 μΐ) blandes 30 med plasma (100 μΐ) fra normale respektive dyrearter, 0,2 M phos- phatbuffer (pH 7,0) (1,0 ml) og dichlormethan (6,0 ml).
23 DK 173938 B1 2. Hver blanding omrøres i 10 minutter og centrifugeres i 10 minutter ved 3000 omdr./min.
3. Bundlaget af dichlormethan (5,0 ml) skilles fra og inddampes til tørhed under en tør nitrogengasstrøm.
5 De tørrede remanensekstrakter, der blev opnået i trin 3, behandles efterfølgende til den indirekte fremgangsmåde på lignende måde som det, der er beskrevet i trinene 4-16 af den ovennævnte søjlemetode.

Claims (15)

  1. 23 DK 173938 B1
  2. 1. Antistof, kendetegnet ved, at det er i stand til at genkende en antigen determinant/antigene determinanter, der er lokaliseret på et FR-5 900506-stof.
  3. 2. Antistof ifølge krav l, kendetegnet ved, at det er et polyklonalt antistof eller et monoklonalt antistof.
  4. 3. Antistof ifølge krav 2, kendetegnet ved, at det polyklonale eller monoklonale antistof er af klassen IgG.
  5. 4. Antistof ifølge krav 3, kendetegnet ved, at det er et monoklonalt anti-FR-900506-stof-antistof, der er fremstillet af en hybridomacellelinie, der resulterer fra cellefusion mellem en anti-FR-900506-stof-antistofpro-^ ducerende celle, der stammer fra et dyr, fx en mus, såsom en miltcellelinie, og en myelomacelle.
  6. 5. Særdeles sensitiv enzymimmunoassayfremgangsmåde til bestemmelse af FR-900506-stoffet, kendetegnet ved, at et antistof, der er i stand til at genkende en antigen determinant/antigene determinanter, der er lokalise-20 ret på FR-900506-stoffet, immobiliseres, at FR-900506-stoffet indeholdt i en prøve og et enzymmærket FR-900506-stof lades reagere kompe-titivt med det immobiliserede antistof, og at det enzymmarkede stof, der er bundet til det immobiliserede antistof, påvises.
  7. 6. Særdeles sensitiv enzymimmunoassayfremgangsmåde ifølge krav 5, 25 kendetegnet ved, at antistoffet er et polyklonalt antistof eller et monoklonalt antistof.
  8. 7. Særdeles sensitiv enzymimmunoassayfremgangsmåde, kendetegnet ved, at et første antistof, der er i stand til at genkende et teststof, der skal analyseres, og et immobiliseret andet antistof, der er i stand til at genkende det første antistof, anvendes, idet teststoffet indeholdt i en prøve og en enzymmærket form af det samme teststof lades reagere kompetitivt med det første antistof, og at den enzymmærkede form af teststoffet, der er bundet til det første antistof, der igen er bundet til det andet antistof, på- vises. 35 24 DK 173938 B1
  9. 8. Særdeles sensitiv enzymimmunoassayfremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at det første antistof er et polyklonalt antistof. 5 9. Særdeles sensitiv enzymimmunoassayfremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at det første antistof er et monoklonalt antistof.
  10. 10. Særdeles sensitiv enzymimmunoassay fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 7-9, 10 kendetegnet ved, at enzymet er en peroxidase.
  11. 11. Særdeles sensitiv enzymimmunoassayfremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 7-10, kendetegnet ved, at det andet antistof er immobiliseret på en plade. 15
  12. 12. Særdeles sensitiv enzymimmunoassayfremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 7-11, kendetegnet ved, at teststoffet er FR-900506-stoffet.
  13. 13. Testkit til påvisning af FR-900506-stoffet, kendetegnet ved, at det omfatter et anti-FR-900506-stof-20 antistof ifølge krav l, fx et monoklonalt anti-FR-900506-stof-anti-stof, og et enzymmærket FR-900506-stof, fx et peroxidasemærket-FR-900506-stof, og testkittet fortrinsvis yderligere omfatter en kendt mængde FR-900506-stof som en standard.
  14. 14. Testkit ifølge krav 13, 25 kendetegnet ved, at det yderligere omfatter et antistof, der er i stand til at genkende et anti-FR-900506-stof-antistof.
  15. 15. Fremgangsmåde til fremstilling af et monoklonalt antistof ifølge krav 2, kendetegnet ved, at en hybridomacellelinie, der er i stand 30 til at producere anti-FR-900506-stof-antistof, dyrkes, og at antistoffet isoleres fra dyrkningsvæsken.
DK198803056A 1987-06-05 1988-06-03 Antistof, immunoassay og testkit DK173938B1 (da)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP14177687 1987-06-05
JP14177687 1987-06-05

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DK305688D0 DK305688D0 (da) 1988-06-03
DK305688A DK305688A (da) 1988-12-06
DK173938B1 true DK173938B1 (da) 2002-02-25

Family

ID=15299904

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DK198803056A DK173938B1 (da) 1987-06-05 1988-06-03 Antistof, immunoassay og testkit

Country Status (6)

Country Link
US (1) US5532137A (da)
EP (1) EP0293892B1 (da)
AT (1) ATE98700T1 (da)
DE (1) DE3886265T2 (da)
DK (1) DK173938B1 (da)
ES (1) ES2060621T3 (da)

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991013899A1 (en) * 1990-03-12 1991-09-19 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Tricyclo compounds
WO1994024568A1 (en) * 1993-04-20 1994-10-27 Abbott Laboratories Stable aqueous fk506 standards
US5164495A (en) * 1991-09-18 1992-11-17 Abbott Laboratories Method for preparing a dicarboxylic acid half-acid ester of FK506
WO1993025533A1 (en) * 1992-06-05 1993-12-23 Abbott Laboratories Methods and reagents for the determination of immunosuppressive agents
USRE40596E1 (en) * 1993-04-08 2008-12-02 Novartis Ag Rapamycin assay
GB9307491D0 (en) 1993-04-08 1993-06-02 Sandoz Ltd Organic compounds
ES2295093T3 (es) 1993-04-23 2008-04-16 Wyeth Conjugados y anticuerpos de rapamicina.
US7279561B1 (en) 1993-04-23 2007-10-09 Wyeth Anti-rapamycin monoclonal antibodies
GB2281294A (en) * 1993-08-23 1995-03-01 Fujisawa Pharmaceutical Co Process for producing half esters of the macrolide FK506
US6187547B1 (en) 1993-09-08 2001-02-13 Novartis Ag Assay kit
GB9318612D0 (en) * 1993-09-08 1993-10-27 Sandoz Ltd An assay
US5457182A (en) * 1994-02-15 1995-10-10 Merck & Co., Inc. FK-506 cytosolic binding protein, FKBP12.6
US5635406A (en) * 1995-06-07 1997-06-03 Abbott Laboratories Stabilized standards and calibrators containing rapamycin and tacrolimus bound to anti-rapamycin and anti-tacrolimus antibodies
US5650288A (en) * 1995-07-14 1997-07-22 Macfarlane; Gordon D. Immunophilin-bound immunosuppressant assay
KR100244164B1 (ko) * 1997-07-15 2000-03-02 김용옥 수용성 고분자-타크로리무스 접합체 화합물 및 그의 제조 방법
US7078495B1 (en) * 1999-08-03 2006-07-18 Dade Behring Inc. Monoclonal antibodies to tacrolimus and immunoassay methods for tacrolimus
US7186518B2 (en) 2003-11-21 2007-03-06 Dade Behring Inc. Method and composition useful for determining FK 506
US20050176080A1 (en) * 2004-02-10 2005-08-11 Vani Bodepudi Hapten, immunogens and derivatives of ascomycin useful for preparation of antibodies and immunoassays
US8022188B2 (en) * 2006-04-24 2011-09-20 Abbott Laboratories Immunosuppressant binding antibodies and methods of obtaining and using same
US7883855B2 (en) 2006-07-21 2011-02-08 Abbott Laboratories Immunosuppressant drug extraction reagent for immunoassays
WO2008082982A1 (en) 2006-12-29 2008-07-10 Abbott Laboratories Improved assay for immunosuppressant drugs
US7914999B2 (en) 2006-12-29 2011-03-29 Abbott Laboratories Non-denaturing lysis reagent
EP2118657B1 (en) 2006-12-29 2014-05-21 Abbott Laboratories Non-denaturing lysis reagent for use with capture-in-solution immunoassay
WO2008082979A2 (en) 2006-12-29 2008-07-10 Abbott Laboratories Diagnostic test for the detection of a molecule or drug in whole blood
WO2009078875A1 (en) 2007-12-19 2009-06-25 Abbott Laboratories Immunosuppressant drug extraction reagent for immunoassays
US20110165699A1 (en) * 2009-12-08 2011-07-07 Salamone Salvatore J Irinotecan immunoassay
US20110136253A1 (en) * 2009-12-08 2011-06-09 Salamone Salvatore J Irinotecan Immunoassay
US8563298B2 (en) 2010-10-22 2013-10-22 T2 Biosystems, Inc. NMR systems and methods for the rapid detection of analytes
AU2011317073B2 (en) 2010-10-22 2016-04-07 T2 Biosystems, Inc. NMR systems and methods for the rapid detection of analytes
US8409807B2 (en) 2010-10-22 2013-04-02 T2 Biosystems, Inc. NMR systems and methods for the rapid detection of analytes
WO2012067670A1 (en) * 2010-11-18 2012-05-24 Saladax Biomedical Inc. Irinotecan immunoassay
EP2839038B1 (en) 2012-04-20 2019-01-16 T2 Biosystems, Inc. Compositions and methods for detection of candida species
EP3368900B1 (en) 2015-10-29 2020-12-23 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Sandwich assay for small molecules
JP2019512208A (ja) 2016-01-21 2019-05-16 ティー２ バイオシステムズ，インコーポレーテッド 細菌を迅速に検出するｎｍｒ法及びシステム
EP3873509A4 (en) * 2018-11-02 2021-12-08 Siemens Healthcare Diagnostics, Inc. BINDING COMPETITORS FOR USE IN MACROPHILINE BINDING PHARMACEUTICAL ASSAYS AND METHODS OF USING THEREOF

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL62965A0 (en) * 1980-07-17 1981-07-31 Scripps Miles Lab Inc Monoclonal antibodies to drugs and theri production
US4894366A (en) * 1984-12-03 1990-01-16 Fujisawa Pharmaceutical Company, Ltd. Tricyclo compounds, a process for their production and a pharmaceutical composition containing the same

Also Published As

Publication number Publication date
DE3886265T2 (de) 1994-04-28
US5532137A (en) 1996-07-02
DE3886265D1 (de) 1994-01-27
EP0293892A3 (en) 1990-01-31
EP0293892B1 (en) 1993-12-15
EP0293892A2 (en) 1988-12-07
ES2060621T3 (es) 1994-12-01
DK305688A (da) 1988-12-06
ATE98700T1 (de) 1994-01-15
DK305688D0 (da) 1988-06-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK173938B1 (da) Antistof, immunoassay og testkit
EP0487289B1 (en) Cyclosporin immunoassay
US5202234A (en) Myocardial infarction immunoassay
DK165326B (da) Monoklonale antistoffer mod humanrenin og derivater deraf samt fremgangsmaade til deres fremstilling, hybridoma-cellelinier samt fremgangsmaade til deres fremstilling, anvendelse af de monoklonale antistoffer og deres derivater samt testsaet indeholdende antistofferne og/eller deres derivater
KR100243536B1 (ko) Fk506-결합 단백질을 인식하는 모노클로날 항체, fk506-결합 단백질의 농도를 분석하는 방법 및 이를 위한 키트
JP3154724B2 (ja) 下痢性貝毒に特異的なモノクローナル抗体、ハイブリドーマ及び下痢性貝毒の検出方法
DK172801B1 (da) Monoklonale antistoffer over for IFN-omega, hybridomcellelinier til produktion heraf, fremgangsmåde til fremstilling af mo
EP0690071B1 (en) Inhibitor and anti-inhibitor monoclonal antibodies specific for horseradish peroxidase
US5264556A (en) Monoclonal antibodies for measuring okadaic acid
US4900661A (en) Method for immunological determination of amines, monoclonal antibodies and kit of reagents for carrying out the method
JPH0192659A (ja) 抗ｆｒ−９００５０６物質抗体、および高感度酵素免疫測定法
CA2355893C (en) Antiuracil monoclonal antibody
JP3026942B2 (ja) ダイアジノンのハプテン化合物、抗体及び測定方法
JP4221119B2 (ja) ドウモイ酸に対する特異的抗体及びドウモイ酸の免疫学的分析方法
JP3336033B2 (ja) 抗ヒト精液γ−グルタミルトランスペプチダーゼモノクローナル抗体、ハイブリドーマおよび前立腺疾患検出方法
CA2047298A1 (en) Myocardial infarction immunoassay
US5290680A (en) Monoclonal antibody, method of production thereof and use thereof
JP2004091454A (ja) 抗体及びその製造方法並びに抗体を用いた抗原の定量方法
JPH0543358B2 (da)
Banerjee et al. Monoclonal antibody to amphomycin. A tool to study the topography of dolichol monophosphate in the membrane
RU2049816C1 (ru) Штамм гибридных культивируемых клеток мыши mus musculus l., используемый для получения моноклональных антител к тироксину
US5352584A (en) Monoclonal antibodies which bind (E)-5- (2-bromovinyl)-arabinofuranosyluracil and diagnostic methods based thereon
JPH0690784A (ja) モノクローナル抗体及びその利用
EP0352817A2 (en) Monoclonal antibody to catecholamine metabolite and quantitative assay for catecholamine metabolite
JP2001039953A (ja) ピリミノバックメチルのハプテン化合物、抗体及び測定方法

Legal Events

Date Code Title Description
B1 Patent granted (law 1993)
PUP Patent expired