DK173666B1

DK173666B1 - Thyroninderivater, deres fremstilling og anvendelse

Info

Publication number: DK173666B1
Application number: DK198704409A
Authority: DK
Inventors: Helmut Strecker; Hans Wissmann; Guido Simons
Original assignee: Aventis Pharma Gmbh
Priority date: 1986-08-25
Filing date: 1987-08-24
Publication date: 2001-05-28
Also published as: NO169176B; ATA259887A; EP0257572B1; JPS6392647A; EP0257572A2; EP0257572A3; NO873564D0; DE3750891D1; ES2066756T3; US4820860A; DK440987D0; NO873564L; DE3628795A1; DK440987A; NO169176C; AT388373B; CA1296019C; ATE115980T1

Description

DK 173666 B1

Opfindelsen angår hidtil ukendte thyroninderivater med den almene formel (I) 5 A-0-((-NH-CH-CH2-/^ y -o- —0H (1* COOR3 ' \ τ ' \2 karakteriseret ved, at A betyder R-(0-CH2-CH2)n-10 R betyder hydrogen eller C(1-6)alkyl, R1 og R2 er ens eller forskellige og betyder iod eller hydrogen, R3 betyder hydrogen eller C(1-6)alkyl, og n er et helt tal mellem 10 og 400, samt deres fysiologisk acceptable salte med kationer.

15

Foretrukne er forbindelser med den almene formel (I), i hvilke R1 og R2 er defineret som ovenfor, og n er 10-140, især 35-70, R betyder C(1-4)alkyl, især methyl, eller hydrogen, og R3 betyder hydrogen eller C(1-4)alkyl, især methyl eller ethyl.

20 Ved salte af forbindelserne med den almene formel (I) forstås især alkalimetal-, jordalkalimetal- og ammoniumsalte.

Ved en med kemiske eller fysiske metoder kvantificerbar gruppe forstås en organisk gruppe, der ved en immunoanalyse tjener til markering. En sådan gruppe kan være 25 fluorescerende, luminescerende, elektroaktivt, spin- eller radioaktivt-mærket (jfr. Neumuller, Rompps Chemie Lexikon, 8. oplag, Stuttgart 1983; Gunzer, Rieke,

Kontakte Merck 1980, nr. 3, side 3-11; Eckert, Angew. Chem. 88 [1976] 565-574).

Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af thyroninderivater 30 med den almene formel (I), hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man i en forbindelse med den almene formel II

R-(0-CH2-CH2-)n-0H (II) 35 hvori R og n har den ovenfor angivne betydning, omsætter den fri alkoholiske OH- gruppe enten som carbonsyreesterchlorid eller som med egnede aktivestergrupper

substitueret ester af carbonsyre med en forbindelse med den almene formel III

DK 173666 B1 2 αι _^ R1 H x> -OH (Ifl) I R·^ hvori R1 og R2 har den ovenfor angivne betydning, og R3 betyder hydrogen, eller eventuelt anvender en ester med formel III (R3 # H), eventuelt omdanner dannede 10 estere med formel I (R3 # H) til de fri syrer med formel I (R3 = H), og eventuelt omdanner den således dannede forbindelse med formel I til dens salte.

Fortrinsvis behandles de ovenfor nævnte forbindelser med den almene formel (II) med phosgen i indifferente vandfrie opløsningsmidler (f.eks. chlorcarbonhydrider) analogt 15 med de i Houben-Weyl, Metoden der Organischen Chemie (Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1952 bind 8/lil, side 103) til omsætning af lavmolekylære forbindelser af W.

Krey beskrevne fremgangsmåder. De således fremkomne carbonylchloridderivater omsættes herefter med de beskrevne di-, tri- eller tetraiodthyroninderivater med den almene formel (III).

20 I stedet for chloriderne kan der også anvendes andre aktiverede derivater af carbonsyren, f.eks. N-hydroxy-succinimidesteren, pentachlorphenylesteren, nitro-phenylesteren og lignende.

25 Omsætningen af de ovenfor nævnte carbonsyrederivater med forbindelser med den almene formel (ill) finder sted i et blandet vandigt medium ved et pH på 7-10, fortrinsvis 8,5-10. Som opløsningsmidler anvendes dimethylformamid/vand eller dimethylacetamid/vand. Uomsat thyroninderivat med den almene formel (III) fraskilles ved dialyse, Sephadex-chromatografi eller ultrafiltrering, f.eks. over en UM 2-membran 30 (Fa. Amicon).

Afhængig af fremstillingsmåden fås i reglen blandinger af to eller flere forbindelser med den almene formel (I).

35 Opfindelsen angår endvidere anvendelsen af forbindelser med den almene formel (I) eller blandinger heraf ved gennemførelsen af en immunoanalyse, fortrinsvis en radio-immunoanalyse.

DK 173666 B1 3

Nedenstående eksempler tjener til illustration af den foreliggende opfindelse.

Eksempel 1 5 PolyethyIengIycol-bis-oxycarbonyl-L-3,3',5-triiodthyronin 220 mg (0,3 mmol) L-triiodthyronin opløses under tilsætning af vandig 2 N NaOH på en autotitrator ved pH 10 under omrøring i en blanding af 4 ml dimethylformamid og 4 ml vand. Herefter sættes hertil DMF og derefter portionsvis inden for 1 time 1 g 10 polyethylenglycol-bis-oxycarbonylchlorid med molvægten 6000. Reaktionsblandingen efterreagerer 12 timer ved stuetemperatur og pH 9,5, hvorefter en lille mængde tungtopløseligt materiale frafiltreres, og herefter bringes opløsningen til tørhed under højvakuum ved stuetemperatur, remanensen optages i 100 ml vand, hvorefter der symes med vandig 1 N HCI til pH 3. Den således fremkomne opløsning dialyseres 15 mod i alt 30 liter vand, og slutproduktet isoleres ved frysetørring. Det således fremkomne svagt gullige faste stof har et iodindhold på 11%, hvilket svarer til et indhold afbundet triiodthyronin på ca. 1,7 mol pr. molthyroninderivat.

Udbytte: 975 mg 20 Eksempel 2

Monomethyl~polyethylenglycolyloxycarbonyl-L-3,5-diiodthyroninforbindelse 940 mg (2 mmol) L-diiodthyronin opløses i en blanding af 6 ml dimethylformamid og 3 ml vand ved pH 8,8-9,5 på en autotitrator. Herefter sættes hertil portionsvist inden for 25 1 time 1 g monomethyl-polyethylenglycoloxycarbonylchlorid (molvægt 750). Der omrøres i 30 minutter ved stuetemperatur, hvorefter der endnu engang tilsættes 1 g af det i det foregående beskrevne carbonylchlorid. Efter omrøring natten over er opløsningen næsten klar. Opløsningsmidlet afdampes under højvakuum ved stuetemperatur, og remanensen optages i 30 ml vand, hvorefter der syrnes med 30 fortyndet saltsyre til pH 3, hvorefter vandfasen ekstraheres flere gange med methylenchlorid, og methylenchloridfasen tørres over magnesiumsulfat, og efter en fradestillering fås en farveløs olie, der ifølge elementaranalysen (C,H,I) indeholder ca.

30% af monomethylpolyethylenglycol-diiodthyroninforbindelsen.

Udbytte: 2,5 g.

35 DK 173666 B1 4

Den videre oprensning sker ved søjlechromatografi på "®Sephadex G 10" i vandig 0,1 molær eddikesyre.

Udbytte: 0,5 g af et ifølge elementaranalysen 80%'s præparat.

5 Eksempel 3

Monomethyl-polyethylenglycoIyloxycarbonyl-L-S.S’.S.S'-tetraiodthyroninforbin- delse 350 mg L-3,3,,5,5'-tetraiodthyronin opløses under tilsætning af vandig 0,5 N 10 natriumhydroxid ved pH 9,5 i en blanding af 4 ml dimethylformamid og 4 ml vand. Til denne opløsning dryppes under omrøring en opløsning af 1 g polyethylenglycol-methylether-carbonylchlorid (molvægt ca. 1900) i 4 ml dimethylformamid i løbet af 1 time, idet pH holdes konstant på 9,5. Under tilsætningen af syrechlorid bliver den i begyndelsen fremkomne suspension igen klar. Efter at have stået natten over symes 15 reaktionsblandingen med fortyndet saltsyre til pH 3, og opløsningsmidlet fradestilleres under højvakuum ved stuetemperatur. Remanensen tørres i en ekssikkator, og herefter koges den ud tre gange med absolut ether. Herefter optages med 16 ml kogende methylchlorid, og uopløste forbindelser frafiltreres, hvorefter reaktionsblandingen afkøles i et isbad.

20

Det udfældede faste stof frafiltreres ved sugning: 565 mg. Ved koncentrering af moderluden fås en restfraktion: 200 mg. Begge fraktioner har identiske og fra 3,^,5,5-tetraiodthyronin forskellige vandringslængder i TC-systemet chloroform/methanol/20% myresyre (69:30:7,5) og identiske elemtaranalyseresultater, der henviser til ca. 1 mol 25 bundet 3,3',5,5'-tetraiodthyronin pr. mol af forbindelsen.

Eksempel 4

Polyethylenglycolyloxycarbonyl-diiodthyroninforbindelse 30 470 mg 3,3-diiodthyronin og 2,2 g polyethylenglycol-bis-oxycarbonylchlorid (molvægt 6000) omsættes som beskrevet under eksempel 2, dog oparbejdes der allerede efter 1 times reaktionstid. Der fås 2,8 g af et farveløst fast stof med en voksagtig konsistens, der ifølge elementaranalysen (iod.C.H) indeholder ca. 80% af den med 1 mol 3,3-diiodthyronin substituerede polymere. Tyndtlagschromatografien, der er beskrevet i 35 eksempel 3, viser reaktionsproduktets forskellighed fra udgangsmaterialet.

Eksempel 5

Monomethyl-polyethylenglycolyloxycarbonyl-L-3,5-diiodthyroninforbindeIse DK 173666 B1 5

Forbindelsen fremstilles som beskrevet i eksempel 2, men under anvendelse af 5 carbonylchloridet af en monomethyl-polyethylenglycol med molvægten 3000. Det rå produkt indeholder ifølge en elementaranalyse 50% af titelforbindelsen.

Udbytte: 3,1 g farveløst halvfast stof.

Eksempel 6 10 Polyethylenglycoloxycarbonyl-L-S.S'.S-trilodthyroninmethylester

Forbindelsen fremstilles som beskrevet i eksempel 1, men under anvendelse af L-triiodthyroninmethyl-ester i stedet for L-triiodthyronin, og under anvendelse af et polyethylenglycol-bis-oxycarbonylchlorid med molvægten 15000. Reaktionstiden 15 forkortes til 2 timer. Det fremkomne reaktionsprodukt viser ifølge elementaranalysen en indbygning af 1 mol L-triiodthyroninmethylester/mol polyethylenglycol.

Udbytte ved samme vægtmængde af reaktionsblandingen som i eksempel 1:700 mg.

Eksempel 7 20

Arbejdsforskrift til bestemmelse af FT4 efter 2-trins-fremgangsmåden (jfr. Eckert,

Angew. Chem. 8§> [1976] 565-574).

I testrør, der er belagt med T4-antistoffer (20 ng antistof pr. testrør) bringes 200 pliter 25 af en standardrække (humansera med stigende FT4-indhold) og 1000 pliter puffer i kontakt i en halv time under omrystning.

Efter udrystning af reaktionsopløsningen sættes 1000 pliter af den ud fra forbindelsen ifølge eksempel 3 fremstillede tracer (aktivitet ca. 60.000 impulser pr. minut) til det 30 forinkuberede testrør. Der inkuberes i 1 time, hvorefter den ikke bundne tracer fraskilles, og den måles i en y-tæller.

Fig. 1 viser standardforløbet af humansera med stigende FT-4-indhold. Traceren fremstilles ud fra det i eksempel 3 beskrevne derivat.

35 DK 173666 B1 6

Fig, 2 og 3 viser resultater af undersøgelsen af humansera (anført som "x")- Seraene fra gravide kvinder (anført som "o") tages med i betragtning i undersøgelsen, da der hos disse foreligger et højt tota!-T4-indhold. Begge korrelationerne viser, at der ikke er nogen direkte forbindelse mellem indholdet af fri T4 og det samlede T4-lndhold.

5 Korrelationerne viser endvidere, at R4/TBG-kvotienten i første tilnærmelse stemmer overens med forløbet af det fri T4.

Claims

1. Thyroninderivater med den almene formel I A-O-C-NH-CH-CH,-^-\ -O- {fy-OH (I) COOR’X=<.I kendetegnet ved, at A betyder R-(0-CHrCH2)n-10 R betyder hydrogen eller C(1 -6)alkyl R1 og R2 er ens eller forskellige og betyder iod eller hydrogen, R3 betyder hydrogen eller C(1-6)alkyl, og n er et helt tal mellem 10 og 400, samt deres fysiologisk acceptable salte med kationer. 15

2. Thyroninderivater ifølge krav 1, kendetegnet ved, at n = 35-70, R betyder H eller C(1-4)alkyl, og R3 betyder hydrogen eller C(1-4)alkyi.

3. Thyroninderivater ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at R3 betyder hydrogen, 20 methyl eller ethyl.

4. Thyroninderivater ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at mindst et af iodatomerne er radioaktivt mærket.

5 COOR3 j V_^' r2 hvori R1 og R2 har den i krav 1 angivne betydning, og R3 betyder hydrogen, eller eventuelt anvender en ester med forme! Ill (R3 # H), eventuelt omdanner dannede estere med formel I (R3 # H) til de fri syrer med formel I (R3 = H), og eventuelt 10 omdanner den således dannede forbindelse med formel 1 til dens salte.

5. Thyroninderivater ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at R\ Rz, R3 og n har den i krav 1 angivne betydning, og R betyder en med kemiske eller fysiske metoder kvantificerbar gruppe.

6. Fremgangsmåde til fremstilling af thyroninderivater med formel I ifølge krav 1, 30 kendetegnet ved, at man i en forbindelse med den almene formel II R-(0-CH2-CH2-)n-0H (II) hvori R og n har den i krav 1 angivne betydning, omsætter den fri alkoholiske OH-35 gruppe enten som carbonsyreesterchlorid eller som med egnede aktivestergrupper substitueret ester af carbonsyre med en forbindelse med den almene formel III DK 173666 B1 8 ^N-CH-CHrfT^-O-l/^-OH (III)

7. Avendelse af thyroninderivater ifølge kravene 1-5 ved gennemførelsen af en immunoanalyse.