Przedmiotem wynalazku jest srodek do radio¬ logicznego oznaczania zawartosci kwasu foliowe¬ go, jego metabolitów lub pochodnych, majacych zdolnosc wiazania sie z ,/ff-laktoglobina, w cieczach biologicznych, np. takich jak surowica.Znane sposoby mierzenia zawartosci kwasu fo¬ liowego i jego pochodnych w cieczach biologicz¬ nych wymagaja stosowania mikroorganizmów, któ¬ rych wzrost jest calkowicie uzalezniony od obec¬ nosci kwasu foliowego lub jego pochodnych w srodowisku hodowlanym, które poza tym powinno tez zawierac i inne skladniki niezbedne dla wzro¬ stu. Prowadzenie takich badan jest klopotliwe i wymaga stosowania urzadzen i aparatów nie za¬ wsze stojacych do dyspozycji w zwyklych labora¬ toriach.Znane sa wprawdzie równiez sposoby oznaczania kwasu foliowego lub jego pochodnych nieco prost¬ sze od wyzej opisanych, ale zwiazane z koniecz¬ noscia stosowania kwasu foliowego albo jego po¬ chodnych znaczonych promieniotwórczym wodo¬ rem, to jest trytem. Pomiar promieniotwórczosci trytu ma tez te wade, ze trzeba stosowac licznik scyntylacyjny cieczy, a poza tym, jezeli bada sie ciecze biologiczne nie ekstrahowane, nie oczysz¬ czone, wówczas wystepuje szereg bledów pomiaru.Wad tych nie ma srodek wedlug wynalazku, który umozliwia radiologiczne okreslanie zawar¬ tosci kwasu foliowego i jego metabolitów w bio¬ logicznych cieczach nie poddawanych oczyszcza¬ niu, przy uzyciu licznika scyntylacyjnego gamma zamiast licznika scyntylacyjnego cieczy.Cecha srodka wedlug wynalazku jest to, ze za¬ wiera nowy zwiazek o ogólnym wzorze 1, w któ- rym n oznacza liczbe calkowita 1—3, R oznacza promieniotwórczy jod J125 lub J181. Zwiazki o wzorze 1 sa to pteroiloglutamylotyrozyny majace do 3 reszt glutaminianu i sa w grupie tyrazyno- wej podstawione promieniotwórczym jodem w pozycji orto do grupy wodorotlenowej. Szczegól¬ nie korzystne wlasciwosci maja zwiazki o wzorze 1, w którym n oznacza liczbe 1 a R oznacza J125.Produkt wyjsciowy do wytwarzania zwiazków o wzorze 1, w którym n i R maja wyzej podane znaczenie, wytwarza sie droga szeregu reakcji, których przebieg przedstawia schemat podany na rysunku. Chroniony przy azocie kwas pteroesowy o wzorze 2 poddaje sie najpierw reakcji z chlo- romrówczanem izobutylu w srodowisku obojetne- go rozpuszczalnika organicznego, takiego jak dwu- metyloformamid lub chlorek metylenu i w obec¬ nosci trzeciorzedowej aminy, takiej jak trójetylo- aimina lub N-metylomorfolina. Otrzymany mieszany bezwodnik poddaje sie reakcji z estrem dwupep- tydowym o wzorze 3, po czym otrzymany dwu- ester pteroilotrójpeptydowy chroniony przy azocie o wzorze 4 hydrolizuje sie za pomoca wodoro¬ tlenku metalu alkalicznego, np. wodorotlenku so¬ dowego, otrzymujac wolny trójpeptyd o wzorze 5, jo W analogiczny sposób, stosujac poliglutamylopep- 99 5743 99*74 4 tydy odpowiadajace dwuestrowi dwupeptydowemu o wzorze 3, otrzymuje sie zwiazki o wzorze 6, w którym n oznacza liczbe wieksza niz 1. Reakcje te prowadzi sie znanymi sposobami.Zwiazki o wzorze 1, w którym n i R maja wy¬ zej podane znaczenie, wytwarza sie korzystnie przez dzialanie jodkiem sodowym NaJ125 lub NaJ181 na zwiazki o wzorze 6, w którym n ma wyzej podane znaczenie. Reakcje te prowadzi sie w sposób oparty na pracy F. C. Greenwooda i W. M. Huntera, Biochem. J. 89, 114 (1963).Wytwarzanie pteroilo-y-glutamylotyrozyny. 1. 2-acetamido-4-hydroksypterydynal-6. Do roz¬ tworu 250 g {0,19 mola) 1,3,3-trójmetyloksy-l-pro- panu w 75 ml eteru dodaje sie w temperaturze °C w ciagu 40 minut 22,4 g (0,14 mola) bromu, przy czym pod koniec dodawania barwa bromu utrzymuje sie. Nastepnie odparowuje sie rozpusz¬ czalnik pod zmniejszonym cisnieniem w tempera¬ turze 25°C i pozostala bezbarwna ciecz wkrapla, mieszajac w temperaturze 0°—5°C, do mieszaniny g wodoroweglanu sodowego i 80 ml 75p/o dio¬ ksanu. Miesza sie dalej w ciagu 30 minut, po czym ekstrahuje mieszanine 200 ml i nastepnie 150 ml eteru. Wyciag suszy sie nad siarczanem magnezu, odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem i pozo¬ stalosc przedestylowuje w kolumnie Vigreux, otrzymujac aldehyd 2-bromo-3,3-dwumetoksypro- pionowy o temperaturze wrzenia 70—73°C/8 mm Hg.Do roztworu 24 g (0,286 mola) wodoroweglanu sodowego w 470 ml wody dodaje sie powoli 16,8 g (0,078 mola) dwuchlorowodorku 2,5,6-trójamino-4- -hydroksypirymidyny, po czym w ciagu 10 minut, silnie mieszajac, dodaje sie w temperaturze 20°C 14,0 g (0,071 mola) bromoaldehydu przygotowanego w wyzej opisany sposób. Nastepnie miesza sie w ciagu 1 godziny, po czym dodaje sie roztwór 16,8 ml SO^/o nadtlenku wodoru w 360 ml wody i po uplywie 1,5 godziny dalsza porcje roztworu 8,4 ml 30% nadtlenku wodoru w 180 ml wody i miesza w ciagu 15 godzin w temperaturze poko¬ jowej. Otrzymany osad o zabarwieniu ciemnonie¬ bieskim odsacza sie, przemywa woda, rozpuszcza w 56 ml 10°/o roztworu wodorotlenku sodowego, dodaje 13 g stalego wodorotlenku sodowego i mie¬ sza az do uzyskania roztworu. Roztwór ten chlo¬ dzi sie w ciagu 5 godzin, odsacza, rozpuszcza w 500 ml cieplej wody i zakwasza do wartosci pH 6—7. Wytracony osad odsacza sie, przemywa woda i suszy, otrzymujac 2-amino-4-hydroksy-6-dwume- toksymetylopterydyne.Mieszanine 5,2 g otrzymanego acetalu, 0,4 ml pirydyny i 80 ml bezwodnika octowego utrzymuje sie w temperaturze 100—110°C w ciagu 6 godzin, po czym szybko przesacza na goraco i przesacz pozostawia w temperaturze pokojowej na okres godzin. Wykrystalizowany osad odsacza sie, przemywa bezwodnikiem octowym i suszy, otrzy¬ mujac 2-acetajmido-4-hydroksy-6-dwumetoksymety- lopterydyne. 4,8 g otrzymanego produktu rozpusz¬ cza sie w 24 ml 90% kwasu mrówkowego, pozo¬ stawia na okres 4 godzin, odsacza wydzielony osad, przemywa go eterem i suszy, otrzymujac 2-aceta- mido-4-hydroksypterydynal-6 w postaci solwatu z kwasem mrówkowym. Produkt ten miesza sie z ml dwumetyloformamidu, ogrzewa do tempera¬ tury 120°C i chlodzi, otrzymujac solwat dwumety- loformamidowy tego aldehydu. 2. Kwas pteroesowy. Mieszanine 3,07 g (10 mili- moli) solwatu dwumetyloformamidowego 2-aceta- mido-4-hydroksypterydynalu-6, 3,30 g (20 milimoli) estru etylowego kwasu p-aminobenzoesowego i 50 ml lodowatego kwasu octowego miesza sie w tem¬ peraturze pokojowej w ciagu 30 minut i do otrzy¬ manej zawiesiny wkrapla 1,00 g borodwumetylo- aminy w 15 ml kwasu octowego. Mieszanine mie¬ sza sie dodatkowo w ciagu 20 minut, ogrzewa w temperaturze 60°C w ciagu 10 minut i chlodzi do temperatury 25°C. Wydzielony osad odsacza sie, przemywa kwasem octowym i eterem, a nastepnie suszy. Surowy produkt krystalizuje sie z 50 ml dwumetyloformamidu, wytracajac 20 ml eteru i otrzymujac ester etylowy kwasu N2-acetyloptero- esowego. 2,64 g otrzymanego estru poddaje sie hydrolizie ogrzewajac z 35 ml 0,1 n wodorotlenku sodowego w temperaturze 100°C w ciagu 30 mi¬ nut w atmosferze azotu i bez dostepu swiatla.Otrzymany roztwór chlodzi sie do temperatury °C, zakwasza stezonym kwasem solnym do war¬ tosci pH 3, odsacza osad w wirówce o 300 obro¬ tach/minute, przemywa dwukrotnie woda i suszy przez wymrazanie, otrzymujac kwas pteroesowy. 1,80 g kwasu pteroesowego i 40 ml bezwodnika kwasu trójfiuorooctowego utrzymuje sie w stanie wrzenia pod chlodnica zwrotna w ciagu 6 go¬ dzin, po czym odparowuje i pozostalosc wytrawia woda, otrzymujac pochodna 10-trójfluoroacetylo- wa. 2,60 g tego produktu i 60 ml bezwodnika oc¬ towego miesza sie w temperaturze 115°C w ciagu 6 godzin, po czym odparowuje rozpuszczalnik pod zmniejszonym cisnieniem i pozostalosc rozpuszcza w 20 ml goracego dwumetyloformamidu. Do roz¬ tworu dodaje sie 25 ml goracej wody i pozostawia na okres 24 godzin, odsacza wydzielony osad i ponownie przekrystalizowuje. Po przemyciu osadu woda i wysuszeniu otrzymuje sie kwas N2-acetylo- -N10-trójfluoroacetylopteroesowy o wzorze 2. 3. Ester dwumetylowy-v-glutamylotyrozyny. Mie¬ szanine 28,1 g kwasu L-N-karbobenzoksyglutami- nowego, 5,0 paraformaldehydu, 1,0 g kwasu p-to- luenosulfonowego i 700 ml benzenu utrzymuje sie w stanie wrzenia pod chlodnica zwrotna w ciagu 7 godzin. Otrzymany roztwór przemywa sie 3 por¬ cjami po 250 ml 5°/o wodoroweglanu sodowego, polaczone wyciagi zakwasza sie 6 n kwasem sol¬ nym chlodzac lodem i ekstrahuje 3 porcjami po 250 ml octanu etylu. Wyciag plucze sie 3 porcjami po 200 ml wody, suszy nad siarczanem magnezo¬ wym i odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem, otrzymujac N-karbobenzoksy-4-{^-karboksyetylo)- -oksazolidynon-5. 20,5 g. (70 milimoli) otrzymanego produktu i 7,1 g (70 milimoli) trójetyloaminy roz¬ puszcza sie w 320 ml dwuchloroetanu i do roz¬ tworu wkrapla mieszajac w temperaturze —15°C roztwór 9,5 g (70 milimoli) chloromrówczanu izo- butylu w 320 ml dwuchlorometanu. Po uplywie minut dodaje sie roztwór 16,2 g (70 milimoli) chlorowodorku estru metylowego L-turozyny i 7,1 g (70 milimoli) trójetyloaminy w 80 ml dwu- 40 45 50 559© 574 chlorometanu i mieszanine utrzymuje w tempe¬ raturze pokojowej w ciagu 20 godzin. Otrzymany roztwór przemywa sie 1 n kwasem solnym, 5°/o roztworem wodoroweglanu sodowego i woda, po czym suszy nad siarczanem magnezowym i odpa¬ rowuje rozpuszczalnik, otrzymujac pozostalosc o konsystencji syropu. Produkt ten rozpuszcza sie w 400 ml metanolu, rozciencza 300 ml 1 n roztwo¬ ru wodorotlenku sodowego i pozostawia w tem¬ peraturze pokojowej w ciagu 5 godzin, po czym zakwasza 2 n kwasem solnym do wartosci pH 2, odparowuje metanol pod zmniejszonym cisnieniem i wodny roztwór ekstrahuje 3 porcjami po 200 ml octanu etylu. Wyciag ekstrahuje sie nastepnie 3 porcjami po 250 ml 5€/o roztworu wodorowegla¬ nu sodowego i otrzymany wyciag zakwasza do wartosci pH 2 i ekstrahuje 3 porcjami po 200 ml octanu etylu. Organiczny wyciag plucze sie woda, suszy nad siarczanem magnezu i odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem, otrzymujac N-karboben- zoksy-7-glutamylotyrozyne. 3,00 g otrzymanego kwasu N-karbobenzoksypep- tydowego rozpuszcza sie w 80 ml l,5p/o roztworu chlorowodoru w metanolu i utrzymuje w tempe¬ raturze pokojowej w ciagu 18 godzin, po czym od¬ parowuje rozpuszczalnik w temperaturze 25°C pod zmniejszonym cisnieniem i pozostalosc wytrzasa z 20 ml wody i 25 ml chloroformu, a nastepnie powtórnie z 25 ml chloroformu. Wyciag chloro¬ formowy plucze sie 5% roztworu wodorowegianu sodowego, 20 ml wody, suszy nad siarczanem mag¬ nezu i odparowuje rozpuszczalnik pod zmniejszo¬ nym cisnieniem, otrzymujac ester dwumetylowy N-karbobenzoksy-^-glutamylotyrazyny o konsys¬ tencji przezroczystego syropu. Mieszanine 2,61 g tego estru, 260 mg 10% palladu na weglu, 6,0 ml 1 n kwasu solnego i 50 ml metanolu wytrzasa sie z wodorem pod cisnieniem wodoru 3 atm w ciagu 4 godzin. Nastepnie odsacza sie katalizator i od¬ parowuje rozpuszczalnik pod zmniejszonym cis¬ nieniem, otrzymujac chlorowodorek estru dwume- tylowego y-glutamylotyrozyny o wzorze 3. Pro¬ dukt ma konsystencje przezroczystego syropu. 4. Pteroilo-y-glutamylotyrozyna. Do roztworu 1,80 g (4,0 milimole) otrzymanego w sposób wyzej opisany kwasu N2-acetylo-N10-trójfluoroacetylopte- roesowego w 35 ml dwumetyloformamidu dodaje sie 0,61 g (6,0 milimola) trójetyloaminy i 0,55 g (4,0 milimola) chloromrówczanu izobutylu. Mie¬ szanine miesza sie w temperaturze 25—30°C w cia¬ gu 1 godziny, po czym dodaje sie dalsza porcje 1,0 g (9,9 milimola) trójetyloaminy i 3,75 g (10,0 milimoli) otrzymanego w wyzej opisany sposób chlorowodorku estru dwumetylowego y-glutamylo- tyrozyny i miesza w temperaturze pokojowej w ciagu 25 godzin. Nastepnie odparowuje sie rozpusz¬ czalnik pod zmniejszonym cisnieniem, pozostalosc plucze mieszajac kolejno z 75 ml 0,5 n kwasu solnego i 80 ml 5% roztworu wodoroweglanu so¬ dowego. Otrzymany produkt posredni o wzorze 4, zawierajacy grupy ochronne, hydrolizuje sie na¬ stepnie za pomoca 30 ml 0,1 n wodorotlenku so¬ dowego w temperaturze 95—100°C, w atmosferze azotu, w ciagu 25 minut, po czym wartosc pH o- trzymanego roztworu o barwie zóltej doprowadza 40 45 50 55 sie do 2—3 za pomoca 6 n kwasu solnego i drob- nokrystaliczny osad oddziela w wirówce o 3000 obrotów/minute. Produkt przemywa sie trzykrotnie woda i liofilizuje, otrzymujac pteroilo-y-glutamy- lotyrozyne o wzorze 5. Próbke 19 mg produktu chromatografuje sie na celulozie DEAE (8 g ab- sorbentu, kolumna 1 cm X 25 cm, swiatlo nadfio¬ letowe o dlugosci fali 270 milimikronów), eluujac 0,01 m roztworem fosforanowej substancji buforo¬ wej o wartosci pH 7,2, zawierajacym 0,2 chlorku sodowego. Analiza wykazuje obecnosc jednego tyl¬ ko skladnika, przy czym po zakwaszeniu otrzymu¬ je sie czysty zwiazek. ¦ * . Jodowanie pteroilo-y-glutamylotyrozyny. Do roztworu skladajacego sie z 100 mikrolitrów 0,1 n wodorotlenku sodowego zawierajacego 1 m Ci NaJ125, 20 mikrolitrów 0,5 roztworu NaH2P04 i mikrolitrów 0,5 m roztworu fosforanu sodowe¬ go, majacego wartosc pH 7,4, dodaje sie 10 mi- krogramów pteroilo-7-glutamylotyrozyny w fosfo¬ ranowym roztworze buforowym (0,05- m, wartosc pH 7,4) i 20 mikrolitrów roztworu zawierajacego w 1 ml 5 mg swiezo przyrzadzonej chloraminy T w 0,05 m fosforanowego roztworu buforowego o wartosci pH 7,4. Po uplywie 15 sekund dodaje sie mikrolitrów roztworu zawierajacego w 1 ml mg pironarezynu sodowego Na2 A 05 w 0,05 m fosforanowym roztworze buforowym o wartosci pH 7,4. Mieszanine wprowadza sie w calosci na kolumne 1X20 cm z preparatu BioGel — P2 (Bio Rad Laboratories, Richmond, Kalifornia, St. Zjedn.Am.) i eluuje roztworem buforowym, skladajacym sie z 0,1 m roztworu chlorku sodowego, 0,02 m roztworu fosforanu sodowego ó wartosci pH 6,7 i 0,1% merkaptoetanolu. Próbke wprowadza sie do kolumny za pomoca 6 ml wyrównujacego roz¬ tworu buforowego i kojumne rozwija najpierw 11,5 ml 0,4 m roztworu chlorku sodowego w 0,0? ,m fosforanowym roztworze buforowym o wartosci pH 6,7, zawierajacym 0,1% merkaptoetanolu, a na¬ stepnie 80 ml roztworu buforowego utworzonego |z liniowego gradientu chlorku sodowego od 0,4 ni do 0,1 m w 0,02 m buforowym roztworze fosfora¬ nowym o wartosci pH 6,7, zawierajacym 0,lfl/t merkaptoetanolu. Zbiera sie frakcje po 3 ml i gromadzi frakcje zaiwierajace jodowana pteroilo- -y-glutainylotyrozyne (zwykle frakcje 24—34).Badanie pochodnych kwasu foliowego. Istnieja liczne metody radiologicznego oznaczania kwasu foliowego i jego pochodnych w cieczach biologicz¬ nych. Ponizej opisano metode oparta na metodzie R. T. Dunn i L. B. Foster Clinical Chem. 19, 1101 (1973), ale do radiologicznego badania cieczy bio¬ logicznych za pomoca zwiazków wytwarzanych sposobem wedlug wynalazku mozna tez stosowac i inne znane metody. 1. Do kazdej z probówek stosowanych w próbie dodaje sie 0,5 ml roztworu zawierajacego w 200 ml wody 1,2 g chlorowodorku lizyny i majacego war¬ tosc pH 10,5. 2. Do odpowiednio oznaczonych probówek dodaje sie po 200 mikrolitrów cieczy wzorcowej, zawiera¬ jacej po 1,25, -2,5, 5,0, 10,0 i 20 nanogramów/ml kwasu N5 metyloczterowodorofoliowego w 0,01 m roztworu fosforanu potasowego, zawierajacego 8,6 g7 99 574 8 chlorku sodowego i 10 g albuminy surowicy wolo¬ wej. Wszystkie probówki utrzymuje sie we wrza¬ cej wodzie w ciagu 15 minut, po czym chlodzi do temperatury pokojowej. 3. Do kazdej probówki dodaje sie 0,5 ml roz¬ tworu zawierajacego w 0,4 m buforowym roztwo¬ rze fosforanowym o wartosci pH 7,6 znaczona za pomoca J125 pteroilo-p-glutamylotyrozyne o radio¬ aktywnosci odpowiadajacej okolo 30 000 impul¬ sów/minute. 4. Do kazdej probówki dodaje sie 200 mikroli- trów roztworu zawierajacego 100 miikrogramów j#-laktoglobiny w 1 ml 0,4 m buforowego roztworu fosforanu potasowego o wartosci pH 7,6.. Próbki poddaje sie hodowli w temperaturze pokojowej w ciagu 45 minut, po czym do kazdej probówki dodaje sie 0,5 ml zawiesiny, zawieraja¬ cej w 1 ml 2,5 g dekstranu i 25 mg aktywowanego wegla (Norit A). Nastepnie kontynuuje sie hodowle w ciagu 5 minut, po czym wszystkie probówki odwirowuje w ciagu 10 minut w wirówce o 2000 obrotów na 1 minute, dekontuje ciecz z nad osadu do odpowiednich probówek i za pomoca spektro¬ metru scyntylacyjnego gamma ustala radioaktyw¬ nosc. 6. Biologiczne próbki traktuje sie w taki sam sposób jak próbki kontrolne. Wyniki podane w ta¬ blicy I mozna nanosic na wykres, otrzymujac ty¬ powa krzywa.Tablica I Stezenie w próbce wzorco¬ wej nanogramy/ml (po¬ czatkowa aktywnosc dodana) 0 0,625 1,25 ,0 ,0 ,0 Liczba impulsów na minute w zdekantowanej cieczy (31 200) 22 263 669 19135 14 390 7 287 4 382 | Stezenie kwasu foliowego w cieczy biologicznej okresla sie przez porównanie otrzymanych wyni¬ ków z wielkosciami z krzywej dla typowych pró¬ bek kontrolnych.Korzystnie jest stosowac produkt wytworzony sposobem wedlug wynalazku w postaci zestawu do wykonywania analiz. Zestaw taki, który wy¬ starcza do przygotowania 100 probówek do badan i umozliwia wykonanie wykreslenia 5 typowych krzywych, ma nastepujacy sklad: 1. 5 ampulek zawierajacych wzorcowy kwas N5- ^metyloczterowodorofoliowy, majacy postac liofili¬ zowanego preparatu, który-nastepnie rozpuszcza sie w 1,5 ml wody, otrzymujac roztwór zawierajacy w 1 ml 20 nanogramów kwasu N5-metylocztero- wodorofojiowego. 2. 1 ampulka lizynowego roztworu buforowego, który przygotowuje sie w postaci proszku i który rozpuszczony w 55 ml wody daje roztwór o war¬ tosci pH 10,5, zawierajacy 6 mg lizyny w 1 ml. 3. 1 ampulka typowego rozcienczalnika, zawie¬ rajacego granulowana albumine z surowicy wolo¬ wej. Zawartosc ampulki rozpuszczona w 20 ml wody daje 6f/o albuminy z surowicy wolowej o wartosci pH 7,4. 4. 5 ampulek /Maktoglobiny w postaci granulo¬ wanego proszku, który po rozpuszczeniu w 10 ml wody daje roztwór zawierajacy 200 nanogramów /7-laktoglobiny w 1 ml 0,4 m roztworu buforowego z fosforanem potasowym o wartosci pH 7,6. . 1 ampulka z rozpuszczalnikiem izotopu w po¬ staci granulowanego proszku, który rozpuszczony w 55 ml wody daje 0,4 m roztwór fosforanu po¬ tasowego o wartosci pH 7,6. 6. 1 ampulka z J125-pteroilo-}-glutamylotyrozyna w postaci liofilizowanego preparatu, który po roz¬ puszczeniu w rozpuszczalniku izotopu daje roz¬ twór, którego 0,5 ml odpowiada okolo 3X104 im¬ pulsów na 1 minute. 7. 1 ampulka ze sproszkowanym dekstranem, który po rozpuszczeniu w 55 ml wody daje roz¬ twór o stezeniu dekstranu 2,5 mg/ml. 8. 1 ampulka ze sproszkowanym weglem akty¬ wowanym, który po zmieszaniu z 55 ml roztworu dekstranu daje zawiesine zawierajaca w 1 ml 25 mg wegla aktywowanego (i 2,5 mg dekstranu).Po przygotowaniu wszystkich roztworów z po¬ danych wyzej produktów wyjsciowych, stosujac do kazdej próby po 1 ampulce typowego produktu, próbe prowadzi sie w nastepujacy sposób. 1. Przygotowanie wzorców. Dodajac 0,6 ml roz¬ tworu wzorcowego kwasu o stezeniu 20 nanogra- mów/ml do 0,6 ml wzorcowego rozpuszczalnika, otrzymuje sie wzorzec o stezeniu 10 ng/ml. Z tego roztworu odmierza sie 0,6 ml i dodaje do 0,6 ml wzorcowego rozpuszczalnika, otrzymujac roztwór o stezeniu 5 ng/ml. Postepujac dalej w analogicz¬ ny sposób przygotowuje sie roztwory o stezeniu 2,5 ng/ml i 1,25 ng/ml. 2. W odpowiednio oznakowanych szklanych pro¬ bówkach 13X100 cm umieszcza sie po 0,5 ml lizy¬ nowego roztworu buforowego. 3. Do probówek oznaczonych „próba slepa" i „próba zerowa" dodaje sie po 0,2 ml wzorcowego rozpuszczalnika, a do kazdej z pozostalych probó¬ wek dodaje sie 0,2 ml odpowiedniej surowicy wzorcowej lub surowicy pacjenta. 4. Probówki utrzymuje sie w ciagu 15 minut we wrzacej wodzie, po czym chlodzi do tempera¬ tury pokojowej.. Do kazdej probówki dodaje sie 0,5 ml roz¬ tworu izotopu. 6. Do kazdej probówki, za wyjatkiem oznako¬ wanej jako slepa próba, dodaje sie 100 ml roz¬ tworu /?-laktoglobiny. 7. Prowadzi sie hodowle w ciagu 45 minut w temperaturze pokojowej. 8. Dodaje sie po 0,5 ml zawiesiny wegla akty¬ wowanego i dekstranu, mieszajac zawiesine przed dodaniem. Zawartosc kazdej probówki miesza sie dokladnie i poddaje hodowli w ciagu 5 minut w temperaturze pokojowej. 9. Odwirowuje sie w ciagu 10 minut w tempe¬ raturze pokojowej przy 2000 obrotach/minute.. Ciecz z nad osadu z kazdej probówki dekan- 40 45 50 55 6099 574 tuje sie do odpowiednio oznakowanych fiolek do liczenia impulsów i okresla radioaktywnosc za pomoca spektrometru scyntylacyjnego gamma. 11. Od liczby impulsów na minute, ustalonej dla kazdej próbki, odejmuje sie liczbe impulsów usta¬ lona dla slepej próby i otrzymane wartosci nanosi na wykres odpowiednio do stezenia. Wartosci dla nieznanych próbek mozna okreslic z wzorcowej krzywej.Stosujac J125 albo J181-pteroilo-y-glutarnylotyro- zyny mozna analizowac dowolny metabolit lub pochodna kwasu foliowego, która wiaze /?-lakto- globine. Znanymi zwiazkami wiazacymi /Maktoglo- bine sa takie jak metotreksat, kwas N5-formylo- czterowodorofoliowy, kwas N10-metylopteroiloglu- taminowy, diopteryna, kwas N5-metyloczterowodo- rofoliowy (zwykle stosowany jako wzorzec do ana¬ liz) oraz sam kwas foliowy. 6'5 CHrCO-NH-CH-COOH Schemat WZGraf. Z-<1 2, zam. 1365/78, A4, iOO Cena 45 zt PL