DE2535558A1 - Folsaeurederivate, ihre verwendung und laborreagens - Google Patents

Description

SMITH KLINE INSTRUMENTS, INC.,
Sunnyvale, Kalifornien, V.St.A.

¹¹ Folsäurederivate, ihre Verwendung und Laborreagens ⁿ Priorität: 9- August 1974, V.St.A., Nr. 495 982

Früher wurden zur Bestimmung von Folsäure und ihrer Derivate in biologischen Flüssigkeiten Mikroorganismen benötigt, deren Wachstum allein von der Gegenwart der Folsäure und ihrer Derivate in einem Nährmedium abhängig ist, das sonst alle anderen zum Wachstum nötigen Komponenten enthält. Diese Methode ist umständlich, da sie spezielle Vorrichtungen benötigt, die in üblichen Laboratorien nicht zur Verfügung stehen.

Die etwas einfachere radioaktive Bestimmung von Folsäure und ihrer Derivate erforderte Folsäure oder ihre Derivate, die mit radioaktivem Wasserstoff (Tritium) markiert waren. Zur Messung der Radioaktivität von Tritium wurde zusätzlich ein Flüssigkeitsscintillationszähler benötigt, der eine Quelle zahlreicher Fehler ist, sofern nicht extrahierte und gereinigte biologi-

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sehe Flüssigkeiten benutzt werden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Folsäurederivate zu schaffen, die zur radioaktiven Bestimmung von Folsäure und ihrer Metaboliten in biologischen Flüssigkeiten verwendet werden können.

Gegenstand der Erfindung sind Folsäurederivate der allgemeinen Formel I

H₂NH-/ __VCO

NH-CH-COOH ι

CH₀

CH--CO

(D

NH-CH-COOH

in der η eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 bis 3 ist und R ein radioaktives Jodatom, beispielsweise J oder J , bedeutet. Die Verbindungen der allgemeinen Formel I sind PteroylgLutamyl-tyrosine, die bis zu drei Glutaraatgruppen besitzen und in der Tyrosingruppe mit einem radioaktiven Jodatom in o-Stellung zur Hydroxylgruppe substituiert sind. Bevorzugt sind Verbindungen der allgemeinen Formel I, in der η einen Wert von 1

hat und R ein radioaktives Jodatom J

125

bedeutet.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in einem mehrstufigen Verfahren hergestellt werden, das am Beispiel der Herstellung

_Ldes Zwischenprodukts Pteroyl-^-glutamyl-tyrosin in folgendem J

6Ö9809/0977

Reaktionsschema 1 erläutert ist.

Reaktionsschema 1

OH

COOH + H₉N-CH-COOCH.

CH₂

CH₅-CO-NH-CH-COOCIU ^ί ι

CH₂

III

CH

2-CO-NH-Ch-COOCH₃

CO-NH-CH-COOH CHo

CH₂-CO-NH-CH-COOh

OH

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Die in der N-Stellung geschützte Pteroinsäure der allgemeinen Formel II wird zuerst mit Chlorameisensäureisobutylester in einem inerten organischen Lösungsmittel, wie Dimethylformamid oder Methylenchlorid, und in Gegenwart eines tertiären Amins, wie Triäthylamin oder N-Methylmorpholin, umgesetzt. Es wird das gemischte Anhydrid erhalten, das anschließend mit dem Dipeptiddiester der allgemeinen Formel III umgesetzt wird, wobei der in der N-Stellung geschützte Pteroyltripeptiddiester der allgemeinen Formel IV erhalten wird. Dieses Zwischenprodukt wird mit einem Alkalimetallhydroxid, wie Natriumhydroxid, hydrolysiert, wobei das freie Tripeptid der allgemeinen Formel V erhalten wird.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel I werden bevorzugt aus nichtkodierten Zwischenprodukten, wie der Verbindung der allgemeinen Formel V, nach einer Methode hergestellt, die auf Arbeiten von F. C. Greenwood und W. M. Hunter, Biochem. J., Bd. 89 (1963)» S. 114 beruht. Pteroyl-o)-glutamyl-tyrosin der allgemeinen Formel V wird beispielsweise nach dieser Methode mit Natrium (J¹²⁵)3odid oder Natrium (J¹³¹)jodid jodiert, wobei die kodierten Tripeptidprodukte der allgemeinen Formel I erhalten werden.

In ähnlicher Weise ergeben Polyglutamylpeptide, die der allgemeinen Formel III entsprechen und vorstehend verwendet v/erden, mit der allgemeinen Formel V vergleichbare Derivate. Nach dem Jodieren dieser Derivate werden Produkte der allgemeinen Formel I erhalten, in der η eine ganze Zahl mit einem Wert von größer

L -J

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2 b 3 5 5 5 δ

als 1 ist. Solche Polyglutamylp ep ti de v/erden in an sich bekann ter Weise hergestellt.

Die nicht-jodierten Verbindungen sind wertvolle Zwischenprodukte zur Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel I. Als solche stellen sie einen Teil der Erfindung dar. Diese Zwischenprodukte werden durch die allgemeine Formel VI dargestellt

OH

NH-CH-COOH

Jh CH

OLj- CO

(VI)

-NH-CH-COOH

in der η eine ganze Zahl mit einem Viert von 1 bis 3 ist.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Pterovl- o.)- glutamyl- tyrosin
a) 2-Acetamido-4-hvdroxypteridin-6-aldehvd Eine Lösung von 25,0 g (0,19 M) 1,3,3-Trimethoxy-1-propen in 75 ml Diäthyläther wird innerhalb von 40 Minuten bei 5°C mit 22,4 g (0,14 M) Brom versetzt. Bei dieser Zugabemenge beginnt die Bromfarbe bestehen zu bleiben. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck bei 25°C abdestilliert. Der farblose flüssige

L -J

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Rückstand wird bei einer Temperatur von O bis 5⁰C tropfenweise und unter Rühren zu einem Gemisch von 25 g Natriunibicarbpnat

und 80 ml 75prozentigera wäßrigen Dioxan (Volumenanteile) ge gegerührt ben. Das Gemisch wird weitere 30 Minuten/und sodann mit 200 ml- und 150 ml-Portionen Diäthyläther extrahiert. Die Extrakte werden vereinigt, über Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird über einen Vigreux-Kolonnenkopf destilliert, wobei der 2-Brom-3,3-diir.ethoxypropionaldehyd mit einem Siedepunkt von 70 bis 73°C/8 Torr erhalten wird.

Eine Lösung von 24 g (0,286 M) Natriumbicarbonat in 470 ml V/asser wird langsam mit 16,8 g (0,078 M) 2,5,6-Triamino-4-hydroxypyrimidin-dihydrochlorid versetzt. Dieses Gemisch wird innerhalb von 10 Minuten bei 20⁰C mit 14,0 g (0,071 M) des erhaltenen Bromaldehyds unter starkem Rühren versetzt. Das Gemisch v/ird 1 Stunde weiter gerührt und anschließend mit 16,8 ml einer 30prozentigen Wasserstoffperoxidlösung in 360 ml Wasser versetzt. Nach 90 Minuten werden weitere 8,4 ml der 30prozentigen Wasserstoffperoxidlösung in 180 ml Wasser zugegeben. Danach wird das Gemisch 15 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der dunkelblaue Peststoff wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und in 56 ml 1Oprozentiger Natronlauge gelöst. Es werden weitere 13 g Natriumhydroxid zugegeben, und das Gemisch wird gerührt, bis alles in Lösung gegangen ist. Die Lösung wird abgekühlt und 5 Stunden stehengelassen. Das ausgefallene Natriumsalz wird abfiltriert und anschließend in 500 ml warmem Wasser gelöst. Der pH-Wert der Lösung wird auf einen Wert von 6 bis 7

L ' J

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mm f m»

eingestellt. Der Niederschlag wird abiiltriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Es wird das 2-Amino-4-hydroxy-6-dimethoxymethylpteridin erhalten.

Ein Gemisch von 5,2 g des erhaltenen Acetals, 0,4 ml Pyridin und 80 ml Essigsäureanhydrid wird 6 Stunden auf 100 Ms 110⁰C erhitzt. Das heiße Gemisch wird rasch filtriert, das Filtrat 15 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Der kristalline Niederschlag wird abfiltriert, mit Essigsäureanhydrid gewaschen und getrocknet. Es wird das 2-Acetamido-4-hydroxy-6-dimethoxymethylpteridin erhalten.

4,8 g des Acetals werden in 24 ml 90prozentiger Ameisensäure gelöst. Nach 4 Stunden wird der ausgefallene Feststoff abfiltriert, mit Diäthyläther gewaschen und getrocknet. Es wird das Ameisensäureaddukt des 2-Acetamido-4-hydroxypteridin-6-aldehyds erhalten. Dieses Produkt wird in 35 ml Dimethylformamid suspendiert. Die Suspension wird auf 120°C erwärmt und anschließend abgekühlt. Es wird das entsprechende Dimethylformamidaddukt erhalten.

b) Pteroinsäure

Ein Gemisch von 3,07 g (10 mM) des Diraethylformamidaddukts des 2-Acetamido-4-hydroxypteridin-6-aldehyds, 3,3 g (20 mM) des p-Aminobenzoesäureäthylesters und 50 ml Eisessig wird 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Die entstandene Suspension wird tropfenweise mit 1,0 g Dimethylaminboran in 15 ml Essigsäure versetzt. Das Gemisch wird weitere 20 Minuten gerührt, an-

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schlieSend 10 Minuten auf 60⁰C erhitzt und danach auf 25°C abgekühlt. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert, mit Essigsäure und Diäthyläther gewaschen und getrocknet. Das erhaltene Rohprodukt v/ird aus 50 ml Dimethylformamid, das mit 20 ml Diäthyläther verdünnt wird, kristallisiert. Es wird der

N -Acetylpteridinsäureäthylester erhalten.

2,64 g des Esters werden durch 30minütiges Erhitzen in 350 ml 0,1 N Natronlauge bei 100⁰C unter Stickstoff und Lichtausschluß hydrolysiert. Die Lösung wird auf 20⁰C abgekühlt und der pH-Wert der Lösung mit konzentrierter Salzsäure auf einen Wert von 3 eingestellt. Der Niederschlag wird bei 300 U/min abgeschleudert, zweimal mit Wasser gewaschen und gefriergetrocknet. Es wird die Pteroinsäure erhalten. 1,8 g der Pteroinsäure werden mit 40 ml Trifluoressigsäureanhydrid 6 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Eindampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand mit Wasser digeriert, wobei die 10-Trifluoracetylpteroinsäure erhalten wird. Ein Gemisch von 2,6 g dieser Säure und 60 ml Essigsäureanhydrid wird 6 Stunden bei 115°C gerührt. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird in 20 ml heißem Dimethylformamid aufgelöst« Die Lösung wird anschließend mit 25 ml heißem Wasser versetzt und 24 Stunden stehengelassen. Der Niederschlag wird abfiltriert, in ähnlicher Weise wie vorstehend beschrieben umkristallisiert, zum Schluß mit Wasser gewaschen und getrocknet,

2 10

• wobei die N -Äcetyl-N -trifluoracetylpteroinsäure der allgemeinen Formel II erhalten wird.

L -I

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c) ω -Glutamyl-tyrosindimethylester

Ein Gemisch von 28,1 g L-N-Carbobenzoxyglutaminsäure, 5,0 g Paraformaldehyd, 1,0 g p-Toluolsulfonsäure und 700 ml Benzol v/ird 7 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Die Lösung.wird dreimal mit je 200 ml Wasser gewaschen und dreimal mit je 250 ml 5prozentiger Natriumbicarbonatlösung extrahiert. Die Bicarbonatextrakte werden vereinigt, unter Eiskühlung mit 6 N Salzsäure auf einen pH-Wert von 2 bis 3 angesäuert und dreimal mit je 250 ml Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatextrakte werden vereinigt, dreimal mit je 200 ml Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Es wird das N-Carbobenzoxy-4-(ß-carboxyäthyl)-oxazolidin-5-on erhalten. Das Oxazolidinon (20,5 g, 70 mM) und 7,1 g (70 mM) Triäthylamin werden in 320 ml Methylenchlorid aufgelöst. Diese Lösung wird tropfenweise unter Rühren bei -15°C mit einer Lösung von 9»5 g (70 mM) Chlorameisensäureisobutylester in 320 ml Methylenchlorid versetzt. Die Lösung wird nach 15 Minuten mit einer Lösung von 16,2 g (70 mM) L-Tyrosinmethylester-hydrochlorid und 7,1 g (70 mM) Triäthylamin in 80 ml Methylenchlorid versetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur 20 Stunden stehengelassen, danach mit 1 N Salzsäure, 5prozentiger Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels wird ein Sirup erhalten. Dieses Produkt wird in 400 ml Äthanol aufgelöst. Die Lösung wird mit 300 ml 1 N Natronlauge verdünnt, anschließend bei Raumtemperatur 5 Stunden stehengelassen und mit 6 N Salzsäure auf einen pH-Wert von 2 angesäuert. Das Methanol wird unter vermindertem Druck entfernt. Die wäßrige Lösung wird

L -J

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-ίο

dreimal mit Je 200 ml Äthylacetat extrahiert; Der Extrakt wird wiederum dreimal mit je 250 ml 5prozentiger Natriumbicarbonatlösung extrahiert. Die Bicarbonatextrakte werden auf einen pH-Wert von 2 angesäuert und dreimal mit je 200 ml Äthylacetat extrahiert. Der organische Extrakt wird mit Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. ^Es wird das N-Carbobenzoxy-^'-glutamyl-tyrosin erhalten.

Eine Lösung von 3 g des nicht veresterten N-Carbobenzoxypeptids in 80 ml 1,5 % Chlorwasserstoff enthaltendem Methanol wird 18 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Das Lösungsmittel wird bei 25°C unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird zwischen 20 ml Wasser und 25 ml Chloroform verteilt. Nach einer weiteren Extraktion mit 25 ml Chloroform werden die Chloroformphasen vereinigt, mit 20 ml 5prozentiger Na-

und

triumbicarbonatlösung /20 ml Wasser gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck wird ein klarer Sirup, der N-Carbobenzoxy-tJ-glutamyl-tyrosin-dimethylester, erhalten.

Ein Gemisch von 2,61 g des vorstehend hergestellten N-Carbobenzoxyesters, 260 mg lOprozentigem Palladium-auf-Kohle, 6 ml 1 N Salzsäure und 50 ml Methanol wird 4 Stunden mit Wasserstoff gas von 3 Atmosphären Druck geschüttelt. Der Katalysator wird abfiltriert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck eingedampft, wobei ein klarer Sirup, das ω-Glutamyl-tyrosindimethylester-hydrochlorid der allgemeinen Formel III erhalten l_ wird. _j

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_ _ΛΛ .

d) Pterovl- <J -glutamvl- tyro sin

Eine Lösung von 1,8 g (4,0 mM) der vorstehend hergestellten

ο iß

N -Acetyl-N -trifluoracetylpteroinsäure in 35 ml Dimethylformamid wird mit 0,61 g (6,0 mM) Triethylamin und anschließend mit 0,55 g (4,0 mM) Chlorameisensäureisobutylester versetzt. Danach wird das Gemisch mit weiteren 1,0 g (9>9 mM) Triäthylamin und 3,75 g (10,0 mM) des vorstehend hergestellten ^-Glutamyl-tyrosin-dimethylester-hydrochlorids versetzt und 1 Stunde bei Temperaturen von 25 bis 30⁰C und 25 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wird ur-.ter vermindertem Druck abgedampft. Der Rückstand wird unter stufenweisem Rühren mit 75 ml 0,5 N Salzsäure und 80 ml 5prozentiger Natriumbicarbonatlösung gewaschen. Das geschützte Zwischenprodukt der allgemeinen Formel IV wird anschließend mit 30 ml 0,1 N Natronlauge 25 Minuten bei Temperaturen von 95 bis 100⁰C unter Stickstoff hydrolysiert. Die gelb gefärbte Lösung wird auf einen pH-Wert von 2 bis 3 mit 6 N Salzsäure eingestellt. Der mikrokristalline Niederschlag wird bei 3000 U/min abgeschleudert. Das Produkt wird dreimal mit Wasser gewaschen. Beim Lyophilisieren wird das Pteroyl-u5-glutamyl-tyrosin der allgemeinen Formel V in Form von Kügelchen erhalten. 19 mg dieser Verbindung werden auf einer mit 8 g DEAE-Cellulose beschickten Säule der Abmessung 1 cm χ 35 cm unter UV-Kontrolle bei 270 nm chromatographiert, wobei als Elutionsmittel 0,01 M Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,2 und einem Zusatz von 0,2 M Natriumchlorid verwendet wird. Die Chromatographie zeigt nur eine einzige Komponente und liefert nach dem Ansäuern eine reine Verbindung.

L -I

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Be iS'piel '2

Jodierung; des Pteroyl-^^lutamyl-tyrosins Eine Lösung, die sich aus 100^0. 0,1 N Natronlauge mit eine®

-lpe

Gehalt von 1 »Ci Natrium (J ) jodid und aus eine» Gemisch von 20 ul 0,5 M Jfetriuadihydrogenphospfaatlösui^ und 10 pl. 0,5 M Natriuisphosphatiösung mit einem pH-¥ert von 7_t4 zusammensetzt, wird mit 10 ug Pteroyl-«*? -glutamyl-tyrosin in 0,05 H Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,4 und 20 ul einer Lösung von 5 mg frisch präparierte» Chloramin T pro 1 al 0,05 M Phosphatpuffer sit einea pH-¥ert von 7,4 versetzt- Ifech 15 Sekunden werden 2O jlL einer Lösung von 5 ng Hatriusraetabisulfit (Na₂S₂Oc) pro 1 ml 0,05 M Phosphatpuffer mit einem pH-¥ert von 7,4 zugegeben. Das gesamte Reaktionsgeraisch wird auf eine mit BioGel-P2 (hergestellt von Bio ßad Laboratories, Richmond, California) beschickte Säule der Abmessung 1 χ 20 cm aufgesetzt. Als Elutionsmittel wird ein Puffer verwendet, der aus 0,1 M natriumchlorid, 0,02 H !fetriuaphosphatpaff er lösung aiit einem pH-¥ert von 7,4 und 0,1 % Me:rcaptoäthanol besteht. Fraktionen von jeweils 0,25 ®1 werden gesammelt. Die Fraktionen, die das kodierte Pteroyl-«^ -glutaiayl-tyrosin (gewöhnlich die · Fraktionen Hr. 68 bis 104) enthalten, werden gesammelt und vereinigt. Die vereinigten Fraktionen werden auf eine mit DEAE-Ionenaustauschharz beschickte Säule der Abmessungen 1 χ 20 cm aufgesetzt, die zu Beginn mit einer Lösung von 0,01 M natriumchlorid, 0,1 % Mercaptoäthanol und 0,02 M PhosphatpufferlSsung mit einem pH-Wert von 6,7 äquilifcriert wird. Die aufgesetzte Probe wird mit 6 ml dieses Paffers in die Säule gewaschen. Die Säule wird zuerst mit 11,5 al 0,02 M itettriumphosphatpuffer mit

L J

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r . ₁₃_ 2b35558 π

einem pH-Wert von 6,7, der 0,4 M Natriumchlorid und 0,1 % Mercaptoäthanol enthält, entwickelt und anschließend mit 80 ml 0,02 M Natriumphosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 6,7, der 0,1 % Mercaptoäthanol enthält, mit einem linearen Natriumchloridgradienten von 0,4 bis 1,0 M eluiert. Es v/erden Fraktionen von jeweils 3 ml gesammelt. Die Fraktionen Nr. 24 bis 34 enthalten gewöhnlich das jodierte Pteroyl-iW-glutamyl-tyrosin.

Beispiel 3 Radioaktive Bestimmung von Folsäurederivaten

Die nachstehend beschriebene Methode zur radioaktiven Bestimmung von Folsäure und ihren Derivaten in biologischen Flüssigkeiten beruht auf den Arbeiten von R. T. Dunn und L. B. Forster, (vgl. Clinical Chem., Bd. 19 (1973) S. 1101).

1. Alle Proberöhrchen werden mit 0,5 ml einer Lösung gefüllt, die 1,2 g Lysinhydrochlorid pro 200 ml Wasser mit einem pH-Wert von 10,5 enthält.

2. Je 200^0. von Standardlösungen, die 1,25, 2,5, 5,0, 10,0 und 20 ng N^-Methyl-tetrahydrofölsäure pro 1 ml 0,01 M Kaliumphosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,4 enthalten, der 8,6 g Natriumchlorid und 10 g Rinderserumalbumin enthält, werden zu eigens markierten Teströhrchen gegeben. Sämtliche Röhrchen werden 15 Minuten zur Siedetemperatur erhitzt und anschließend auf Raumtemperatur abgekühlt.

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r ■ 2b35558

J5. Jedes TestrÖhrchen wird mit 0,5 ml einer 0,4 M Kaliumphosphatpufferlösung mit einem pH-¥ert von 7,6 gefüllt, die

125

Pteroyl-^-glutamyl-tyrosin, das mit J radioaktiv markiert ist, mit einer radioaktiven Zählrate von ungefähr 30 000 Zählern/min enthält.

4. Sämtliche TestrÖhrchen werden mit 200 ul eines 0,4 M Kaliumphosphatpuffers mit einem pH-Wert von 7,6 gefüllt, in dem 100 ug/ml ß-Lactoglobulin gelöst ist.

5. Nach 45-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur werden 0,5 ml einer Suspension, die 2,5 mg/ml Dextran und 25 mg/ml Aktivkohle (Norit A) enthält, zu ,jedem TestrÖhrchen gegeben. Nach einer weiteren Inkubation von 5 Minuten werden sämtliche TestrÖhrchen 10 Minuten bei 2000 U/min abgeschleudert. Der flüssige Überstand wird in geeignete TestrÖhrchen abdekantiert und seine .Radioaktivität auf einem Gammascintillationsspektrometer ausgezählt.

6. Biologische Proben werden in gleicher Weise wie die Standardlösungen behandelt. Die Ergebnisse einer typischen Bestimmung sind in Tabelle I zusammengefaßt, die aufgetragen eine. Standardkurve ergeben.

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2B3S558

Tabelle I	Zahlrate im Überstand
Konzentration der Standard-	pro Minuten
lösung {ng/nl)	(31 200)
(zugegebene Anfangsaktivi tät)	22 263
0	20 669
0,625	19 135
1,25	14 390
2,50	11 030
5,0	7 287
10,0	4 382
20,0

Die Konzentration der Folsäure in der biologischen Flüssigkeit kann durch einen Vergleich mit der erhaltenen Standardkurve bestirnt werden.

Bevorzugt wird die erfindungsgemäße Testsubstanz in einem Laborreagens verwendet. Ein solches Reagens, das ausreicht, um 100 Teströhrchen vorzubereiten und um 5 Standardkurven herzustellen, hat folgende Bestandteile:

1.5 Fläschchen N-Methyltetrahydrof ölsäure als Standard. Das lyophilisierte Präparat ergibt nach Wiederauflösen in 1,5 al Wasser eine Lösung ύοώ. 20 ng/ml Ii -Methyltetrahydrofölsäure.

2. 1 Fläschchen Lysinpuf f er

Das Pulver ergibt nach Auflösen in 55 ml Wasser eine Lösung von 6 mg/ml Lysin mit einem pH-¥ert von 10,5.

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^Γ _ ₁₆_ 2b35558 ⁿ

3. 1 Fläschchen Standardverdünnungsmittel

Dies enthält granuliertes Rindersc-rumalbumin, das nach Auflösen in 20 ml Wasser eine 6prozentige Rinderserumalbuminlösung mit einem pH-Wert von 7,4 ergibt.

4. 5 Fläschchen ß-Lactoglobulin

Das granulierte Pulver ergibt nach Auflösen in 10 ml Wasser eine Löaung, die 20 ng/ml ß-Lactoglobulin in 0,4 M Kalium phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,6 enthält.

5. 1 Fläschchen Isotopen-Verdünnungsmittel

Das granulierte Pulver ergibt nach Auflösen in 55 ml Wasser eine 0,4 M Kaliumphosphatlösung mit einem pH-Wert von 7,6.

125

6. 1 Fläschchen J ^-Pteroyl-^-glutamyl-tyrosin

Das lyophilisierte Präparat ergibt nach Auflösen in 55 ml Isotopen-Verdünnungsmittel eine Lösung mit einer Zählrate von ungefähr 3 x 10 /min/0,5 ml.

7. 1 Fläschchen Dextran in pulverisierter Form

Dies ergibt nach Auflösen in 55 ml Wasser eine Lösung von 2,5 mg/iil Dextran.

S. 1 Fläschchen Aktivkohle in pulverisierter Form Nach Suspendieren in 55 ml Dextranlösung ergibt dies eine Lösung von 25 mg/ml Aktivkohle (und 2,5 mg/ml Dextran).

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r _ _ 2b35558

Nach dem Ansetzen aller Lösungen des Bestimmungsreagens (1 Fläschchen Standardlösung wird pro Bestimmungsversuch verwendet) wird die Bestimmung wie folgt ausgeführt:

1. Herstellung der Standardlösungen

Eine Verdünnungsreihe mit Konzentrationen von 1,25, 2,5, 5 und 10 ng/ml wird dadurch hergestellt, daß man 0,6 ml der Standardlösung mit einem Gehalt von 20 ng/ml N -Methyltetrahydrofölsäure mit 0,6 ml Standardverdünnungsmittel versetzt, Dies ergibt eine Standardlösung mit einem Gehalt von 10 ng/ml. Aus dieser Lösung werden 0,6 ml entnommen und zu 0,6 ml Standardverdünnungsmittel gegeben, wobei eine Standardlösung mit einem Gehalt von 5 ng/ml erhalten wird. Dieser Vorgang wird solange wiederholt, bis eine Standardlösung mit einem Gehalt von 1,25 ng/ml hergestellt ist.

2. 0,5 ml Lysinpuffer werden zu eigens markierten Teströhrchen mit einer Abmessung von 13 x 100 mm gegeben.

3. 0,2 ml Standardverdünnungsmittel wird zu den Teströhrchen gegeben, die als Blindversuch und Nullstandard dienen. Zu allen anderen Reagensgläsern werden 0,2 ml der geeigneten Standardlösung oder eines Serums gegeben.

4. Die Teströhrchen werden 15 Minuten in kochendem Wasser erhitzt und danach auf Raumtemperatur abgekühlt.

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^Γ _₁₈_ 2 b 3 5 5 5 8

5. Zu allen Teströhrchen werden 0,5 ml Isotopeillösung gegeben.

6. Zu allen Teströhrchen mit Ausnahme der Blindlösung werden 100 ml ß-Lactoglobulinlösung gegeben.

7. Die Teströhrchen werden 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.

8. Es werden 0,5 ml Aktivkohle-Dextran-Suspension zugegeben, die vor der Zugabe gut vermischt wurde. Danach wird jedes Teströhrchen gut vermischt und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.

9. Die Teströhrchen werden bei Raumtemperatur 10 Minuten bei 2000 U/min abgeschleudert.

10. Der Überstand wird in eigens markierte Zählfläschchen dekantiert. Die Radioaktivität wird mit einem Gammascintillationsspektrometer bestimmt.

11. Die Zählrate pro Minute einer jeden Standardlösung wird gegen die Konzentration einer jeden Standardlösung nach der Subtraktion der Zählrate/min der Blindlösung von der Zählrate einer jeden Standardlösung oder eines Serums aufgetragen. Die Konzentration unbekannter Proben kann aus der Standardkurve bestimmt werden.

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_Γ 2 b 3 5 5 5 8 π

Alle Folsäureinetaboliten oder -derivat^ die Bindungen mit

125 ß-Lactoglobulin eingehen, können unter Benutzung der J -

1^1
oder J -Pteroyl-glutamyl-tyrosine bestimmt v/erden. Unter den

bekannten Bindungspartnern von ß-Lactoglobulin sind Methotrexat,

5 10

N -Formyltetrahydrofölsäure, N -Methylpteroylglutaminsäure, Diopterin, Pteropterin, N -Methyltetrahydrofolsäure (normalerweise als Standard im Versuch verwendet) und Folsäure selbst.

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Claims (5)

Patentansprüche

1. Folsäurederivate der allgemeinen Formel I

QH

_ΝΑν/^Νγ0Η₂ΝΗ

NH-CH-COOH CH₂-CO-

(D

-NH-CH-COOH

in der η eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 bis 3 ist und R

«inc A -ζ*

ein radioaktives Jodatom J oder J bedeutet.

2. Folsäurederivate nach Anspruch 1 der allgemeinen Formel I, in der η den Wert 1 hat.

3. Folsäurederivate nach Anspruch 2 der allgemeinen Formel I,

125 in der R ein radioaktives Jodatom J ist.

4. Verwendung der Folsäurederivate nach Anspruch 1 zur radioaktiven Bestimmung von Folsäure, ihrer Metaboliten oder Derivate, die Bindungen mit ß-Lactoglobulin eingehen.

5. Laborreagens zur radioaktiven Bestimmung von Folsäure, ihrer Metaboliten und Derivate, die Bindungen mit ß-Lactoglobulin eingehen, bestehend aus

609809/097?

a) einem Folsäuredorivat nach Anspruch

b) N-Methyltetrahydrofölsäure als Standard

c) Lysinpuffer

d) Rinderserumalburainlösung als Standardverdünnungsmittel

e) ß-Lactoglobulin

f) einem Isotopen-Verdünnungsmittel

g) Dextran und

h) pulverisierter Aktivkohle.

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