DK166602B

DK166602B - Fremgangsmaade til fremstilling af membranstruktur og anvendelse af denne

Info

Publication number: DK166602B
Application number: DK397586A
Authority: DK
Inventors: Uwe B Sleytr; Margit Sara
Original assignee: Uwe B Sleytr; Margit Sara
Priority date: 1984-12-21
Filing date: 1986-08-20
Publication date: 1993-06-21
Also published as: JPH0557014B2; CA1307632C; DK397586A; IL77419A; HU202415B; DK166602C; ATE64544T1; EP0207100B1; EP0207100A1; DE3583298D1; WO1986003685A1; HUT44446A; US4886604A; JPS62501199A; DK397586D0

Description

i

DK 166602 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af en struktur med membraner med gennemgående porer, hvilke membraner omfatter proteinmolekyler eller proteinholdige molekyler, der er ordnet som et krystalgitter, og som stammer fra cellevægge fra mikro-5 organismer, idet membranerne eventuelt anbringes på eller indlejres i en bærer, og idet membranens proteinmolekyler eller proteinholdige molekyler, eventuelt ved behandling med mono- og/eller bifunktionelle fremmede molekyler og eventuelt covalent, tværbindes intramolekylært og/eller med hinanden og/eller med bæreren via deres reaktive grup-10 per.

En struktur af den ovenfor beskrevne type er kendt fra EP-A2-0154620.

De til opbygning af denne struktur anvendte membraner kan derved med fordel dannes ud fra proteinmolekyler eller proteinholdige molekyler, som især er vundet fra cellevægge fra prokaryoter ved en omkrystal-15 lisationsproces, der betegnes selvorganisation, og membranerne kan derefter fx af- eller indlejres på eller i en porøs bærer og til sidst underkastes en kemisk tværbinding. Den virksomme porestørrelse hos membranerne i denne struktur ligger derved især i diameterinter-vallet fra 1 til 200 nm (nanometer), hensigtsmæssigt dog i området 20 fra 1 til 8 nm.

Ved anvendelse af denne struktur som ultrafiltreringsmembran kan der opnås skarpe adskillelser mellem molekyler med ringe forskel i molekylvægt samt højere gennemstrømningshastigheder end for tidligere kendte ultrafiltreringsmembraner. Den ønskede porediameter opnås 25 væsentligst ved udvælgelse af den til membranfremstillingen anvendte mikroorganisme, hvis cellevægges ydre lag, de såkaldte S-lag (S-layer s=surface- layers) , har porer med omtrent den tilstræbte porediameter. Denne porediameter kan endvidere varieres ved, at der på proteinmolekylerne eller de proteinholdige molekyler aflejres fremmede 30 molekyler, der rækker ind i poreområdet.

Til grund for opfindelsen ligger den opgave at tilvejebringe en fremgangsmåde af den indledningsvis nævnte art, som er billigere end den kendte teknik. Ifølge opfindelsen opnås dette ved, at cellerne af mikroorganismerne, især celler af prokaryoter, som har mindst ét 35 cellevægslag, i hvilket proteinmolekyler eller proteinholdige moleky-

DK 166602 B

2 ler støder op til hinanden og er forbundet med hinanden, idet de i disse cellevægslag mellem de som et krystalgitter ordnede molekyler som et gitter ordnede porer forbliver frie, eventuelt sprænges, og cellevæggene opdeles i fragmenter, og at de - efter fjernelse af 5 celleindholdet og eventuelt af andre cellevægs- eller membranlipidlag - tilbageblevne cellevægge eller cellevægsfragmenter, som består af det eller de af proteinmolekyler bestående lag og eventuelt af de op til disse stødende cellevægslag, anbringes på eller indlejres i en bærer.

10 Derved kan der med fordel også gås ud fra cellevægge af mikroorganismer, der som cellevægslag har to lag opbygget af proteinmolekyler eller proteinholdige molekyler og mellem disse har lag, der eventuelt består af peptidoglycan, pseudomurein eller cellulose, idet disse cellevægslag henholdsvis indføres på eller i bæreren i form af celle-15 vægsfragmenter.

Ifølge en fordelagtig udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen gås der ud fra cellevægge af mikroorganismer, i hvilke de proteinholdige molekyler, der danner lagene, er glycoproteiner.

Ifølge en anden fordelagtig udførelsesform for fremgangsmåden ifølge 20 opfindelsen sprænges mikroorganismecellerne osmotisk og/eller mekanisk, eventuelt ved hjælp af en cellemølle eller ultralyd, og/eller ved trykudløsning og/eller kemisk, eventuelt ved hjælp af en French-presse eller enzymatisk.

I yderligere fordelagtige udførelsesformer for fremgangsmåden ifølge 25 opfindelsen kan der som bærer anvendes et porøst lag, eventuelt et mikrofilter, og/eller et hjælpelag, som eventuelt fjernes før anvendelse af membranen, eller legemer af ionotrope geler, som på alle sider omsluttes af de 30 cellevægsfragmenter, der skal anbringes.

DK 166602B

3

Ifølge endnu en fordelagtig udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen anbringes cellevægsfragmenterne på bæreren ved påsprøjtning og/ eller afsætning, og/eller 5 - anbringelsen af cellevægsfragmenterne på bæreren sker under tryk- og/eller sugevirkning, eller cellevægsfragmenterne presses mekanisk på bæreren.

Ifølge en yderligere udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen bliver cellevægsfragmenterne, ved anvendelse af bærere be-10 stående af polymerer, under bærerens polymerisations- eller størkningsforløb indlejret i det sig porøst dannende bæremateriale.

Ifølge endnu en fordelagtig udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen forstærkes forbindelsen mellem cellevægsfragmenterne og bæreren ved en eventuelt overfladisk varmebehandling.

15 Ifølge en yderligere fordelagtig udførelsesform for opfindelsen er fremgangsmåden ifølge opfindelsen ejendommelig ved, at behandlingen med mono- og/eller bifunktionelle fremmede molekyler sker ved påføring af gasformige og/eller flydende tværbindingsmidler. Herved kan behandlingen med de gasformige eller flydende tværbindingsmidler 20 med fordel foretages efter hinanden.

I en anden fordelagtig udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen behandles bæreren og/eller cellevægsfragmenterne før anbringelse af sidstnævnte på bæreren med tværbindingsmidlerne, og disse aktiveres først efter anbringelse af cellevægsfragmenterne på 25 bæreren.

Ifølge endnu en fordelagtig udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen bliver der før anbringelsen af cellevægsfragmenterne på bæreren frilagt og/eller indført reaktive grupper på bæreren og/eller cellevægsfragmenternes molekyler, hvilke grupper er bestemt til en 30 covalent tværbinding og/eller sekundær valensbinding.

DK 166602B

4

Ifølge en yderligere fordelagtig udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen udføres den covalente tværbinding af cellevægs-fragmenterne samtidig med den covalente tværbinding af de anbragte cellevægsfragmenters molekyler eller proteinholdige molekyler.

5 I endnu en fordelagtig udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen tildækkes de på bæreren anbragte cellevægsfragmenter ved hjælp af et porøst beskyttelseslag inden påføringen af tværbindings-midlet/tværbindingsmidlerne, hvilket beskyttelseslag eventuelt fjernes efter afslutning af tværbindingsprocessen.

10 Ifølge en sidste fordelagtig udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen sprænges cellevæggene ikke, idet de til opbygning af strukturen ikke nødvendige cellekomponenter såsom cytoplasmamembran, cytoplasma eller lignende i stedet opløses ud gennem porerne i cellevæggen .

15 Endelig angår opfindelsen anvendelser ifølge opfindelsen af den ved den ovenfor beskrevne fremgangsmåde fremstillede struktur, nemlig anvendelse af strukturen som ultrafilter eller som separationsorgan for en gasseparation eller som separationsorgan for en ionbytningsfremgangsmåde; 20 - anvendelse af strukturen som bærer for andre semipermeable membraner, der strækker sig hen over porerne i strukturens membran, idet disse andre semipermeable membraner eventuelt er tværbundet med proteinmolekyler eller proteinholdige molekyler i strukturens membraner via carboxygrupper og/el- 25 ler aminogrupper og/eller sulfhydrylgrupper og/eller hy- droxygrupper direkte eller via bifunktionelle fremmede molekyler. Disse andre semipermeable membraner kan med fordel være: Hyperfiltreringsmembraner, eventuelt tensideller tensidagtige lipoid-hyperfiltreringsmembraner, eller 30 separationsorganer for en gasseparation eller separations- organer for en ionbytnings fremgangsmåde eller separations-organer for en pervaporationsfremgangsmåde eller opløsningsdiffus ionsmembraner;

DK 166602 B

5 anvendelse som separationsmateriale til gennemtrængnings-chromatografi, hvor den opnåede struktur består af ikke-sprængte cellevægge, ud fra hvilke de ikke nødvendige komponenter er blevet opløst, og de tilbageblevne celle-5 vægge der efter er blevet tværbundet.

Ved en yderligere anvendelse ifølge opfindelsen kan der ved ændring af miljøbetingelserne bevirkes en ændring af membranmolekylernes konformation, som bestemmer poreformen og porestørrelsen, og/eller en ændring af ladningerne på molekylerne i membranernes poreområde, og 10 der dermed bevirkes en ændring af membranporemes virksomme gennemgangsbredde. Konformations - og/eller ladningsændringen kan med fordel bevirkes gennem ændring af pH-værdien, ionstyrken og/eller sammensætningen eller temperaturen af det medium, der omgiver strukturen, og/eller med fordel også ved ændring af arten af den flydende fase.

15 En yderligere fordelagtig anvendelse ligger i, at værdifulde stoffer såsom enzymer, farmaceutisk aktive stoffer, pesticider eller lignende indesluttes i strukturen, og/eller disse værdifulde stoffer bringes ud af denne struktur.

Ifølge en fordelagtig udførelsesform for anvendelsen ifølge opfindel-20 sen anvendes der en struktur, som danner et hylster, der indeslutter de værdifulde stoffer, og hvis overflade delvis er belagt med strukturens membraner og delvis er forsynet med et uigennemtrængeligt lag.

Ifølge en anden fordelagtig udførelsesform for anvendelsen ifølge opfindelsen anvendes der en struktur, som har membraner i vesikel-25 form.

En fordelagtig udførelsesform for denne anvendelse ifølge opfindelsen er endvidere ejendommelig ved, at de vesikulære membraners porer udvides ved hjælp af en miljøændring til indføring af de værdifulde stoffer i strukturen, de værdifulde stoffer derefter gennem de ud-•30 videde porer bringes ind i vesiklernes indre, og disse porer derefter formindskes ved en yderligere miljøændring.

DK 166602 B

6

En yderligere fordelagtig anvendelse af en ifølge opfindelsen fremstillet membran kan ligge i, at opløsningen eller suspensionen af proteinmolekyler eller proteinholdige molekyler eller fragmenter af lag af sådanne molekyler bringes i kontakt med et værdifuldt stof, at 5 selvorganisationen af proteinmolekylerne eller de proteinholdige molekyler sker langs med det værdifulde stofs overflade, og at mem-branens molekyler - eventuelt ved behandling med mono- og/eller bifunktionelle fremmede molekyler - substitueres på reaktive grupper og/eller via disse reaktive grupper tværbindes covalent intramoleky-10 lært og/eller med hinanden. Der kan også med fordel anvendes et værdifuldt stof, som er bundet på eller indlejret i et bærestof eller et bærelegeme.

EKSEMPEL 1

Intakte celler af Bacillus stearothermophilus PV 72 med en vådvægt på 15 10 g blev suspenderet i 40 ml tris-HCl-puffer (50 mM, pH 7,2) og blev sprængt ved indvirkning af ultralyd. Til undgåelse af autolytiske processer blev suspensionen derefter afkølet i et isbad. Cellevægs-fragmenterne fra denne suspension blev pelleteret ved centrifugering ved 20.000 x g, og den nedre del af pelleterne, der består af endnu 20 intakte celler, resuspenderes og underkastes endnu en ultralydbehandling. De i suspensionen foreliggende cellevægsfragmenter sedimenteres derefter ved centrifugering ved 20.000 x g, resuspenderes og befries for deres cytoplasmamembran (et lipidt dobbeltlag) ved hjælp af 0,5% Triton® X-100 (i 50 mM tris-HC1-puffer, pH 7,2) i 20 minutter 25 ved 20°C ("Triton® X-100" betegner her og i det følgende octylphe-nyl-polyethylen-glycolether, et mildt detergent), hvorefter cellevægsfragmenterne vaskes flere gange. De således oprensede cellevægs-fragmenter består nu af det af glycoproteinmolekyler opbyggede S-lag og det derunder liggende støttelag af peptidoglycan.

30 Størrelsen af disse cellevægsfragmenters flademål kontrolleres elektronmikroskopisk, idet de skal være i gennemsnit 500 nm.

DK 166602 B

7

Ved hjælp af disse cellevægsfragmenter fremstilles der nu en ultrafiltreringsmembran, som i det væsentlige har samme egenskaber som den i eksempel 2 i EP-A2-0154620 beskrevne ultrafiltreringsmembran.

Som bæremembraner for den ultrafiltreringsmembran, der skal frem-5 stilles, tjener en nylonmikrofiltreringsmembran fra firmaet Pali,

Cortland, New York, U.S.A., type Ultripor Ngg med en gennemsnitlig porediameter på 100 nm. Bærematerialet har frie amino- og carboxyl-grupper i forholdet 1:1. For at frigøre yderligere reaktionsdygtige amino- og carboxylgrupper underkastes den mikrofiltreringsmembran, 10 der skal anvendes, en behandling med saltsyre (3,6N) ved 50°C i 60 minutter, vaskes med destilleret vand og anbringes i en ultrafiltreringsindretning i lighed med den i eksempel 1 og fig. 5 i EP-A2-0154620 beskrevne.

Anbringelsen af cellevægsfragmenterne på bæreren og i bærerens matrix 15 sker - analogt med eksempel 1 og 2 i EP-A2-0154620 - ved en aflejringsproces. For at opnå en så regelmæssig aflejring af cellevægsfragmenterne som mulig sættes der 50 ml destilleret vand til 5 ml af udgangs suspens ionen, som så fyldes i ultrafiltrerings indretningen, hvorved denne suspension først befinder sig som et lag over den 20 indlagte mikrofiltreringsmembran. Over suspensionen påføres der nu ved tilledning af nitrogen et overtryk på 2 x lO^Pa, hvorved den flydende fase presses gennem mikrofilteret, og cellevægsfragmenterne af- henholdsvis indlejres på eller i mikrofiltreringsmembranen med en Λ belægning svarende til en proteinmængde på 30 μg/cm . Via en i ultra-25 filtreringsindretningens øvre del anbragt dyse påsprøjtes der deref ter ved hjælp af trykluft med 3 x lO^Pa overtryk glutardialdehyd som tværbindingsmiddel (0,5% i 0,1M natrium-cacodylat-puffer, pH 7,0) i fint fordelt form på de på bæreren afsatte cellevægsfragmenter.

Eftersom tværbindingsmidlet efter påsprøjtning på cellevægsfragmen-30 terne ved hjælp af det påførte overtryk kontinuerligt presses gennem cellevægsfragmenterne og mikrofiltreringsmembranen, danner der sig over cellevægsfragmenterne ingen stærkere væskefilm. En fordel ved denne type tværbindingsmiddelanbringelse består i, at der i den allerhøjst meget tynde væskefilm næppe kan ske hvirveldannelse, som 35 ville bevæge de på bæreren afsatte cellevægsfragmenter og derved kunne forstyrre deres endelige fiksering. Efter en sprøjtnings- og

DK 166602B

8 trværbindingsvarighed på 10 minutter vaskes den således fremstillede ultrafiltreringsmembran 3 gange med destilleret vand, og separationskurven og gennemstrømningshastigheden - som beskrevet i eksempel 1 i EP-A2-0154620 - bestemmes. Derved viser det sig, at tilstedeværelsen 5 af peptidoglycan-støttelaget ikke har nogen indflydelse på ultrafiltreringsmembranens separationsevne.

Ifølge en fordelagtig variant af dette eksempel anvendes der som udgangsmateriale til fremstilling af en ultrafiltreringsmembran intakte celler af mikroorganismen Clostridium thermohydrosulfuricum 10 (stamme Llll-69). Intakte celler af denne mikroorganisme blev først overført til 50 mM tris-HCl-puffer (pH 7,2) og sprængt i en French-presse (fra firmaet American Instruments Corp., Silver Springs, Maryland) . Derved blev de i pufferopløsningen suspenderede celler kompri-meret under højt tryk og oplever derefter ved passage gennem en dyse 15 en pludselig ekspansion på grund af den derved optrædende trykudløsning, hvilket har en sønderrivning af cellerne til følge. De således vundne cellevægsfragmenter befries for celleindholdsstoffer ved vaskning 3 gange med pufferopløsningen, og cytoplasmamembranen blev sønderdelt ved behandling med 1%'s Triton®X-100 i destilleret vand i 20 30 minutter ved 37°C. Cellevægsfragmenterne skilles derefter fra lipiderne og andre forureninger ved centrifugering og videreforarbej-des derefter analogt med det i første variant af dette eksempel beskrevne.

I det følgende angives der nogle fordelagtige varianter og eksempler 25 på enkelte fremgangsmådetrin af fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Til udvælgelse og forberedelse af bæreren:

Anvendelse af nylonmikrofiltreringsmembraner, ved hvilke den hydrolytiske spaltning af peptidbindingen i nylon udføres ved behandling med HCl eller med N,N-dimethylpro-30 pandiamin for at opnå en forøgelse af antallet af frie amino- og/eller carboxylgrupper på nylon. Eksempler på sådanne nylonfiltreringsmembraner er fx følgende typer fra firmaet Pall, Cortland, New York, U.S.A.

DK 166602 B

9

Pall Biodyne med frie amino- og carboxylgrupper i forholdet 1:1;

Pali Aminodyne med frie aminogrupper;

Pali Carboxydyne med frie carboxylgrupper.

5 Til anbringelse af cellevægsfragmenterne på en bæremembran:

En suspension af cellevægsfragmenterne i CH3OH udvalses ved en temperatur på 50°C på en glat bærer, fx en glasplade, hvorved der ved afdampning af CH3OH sker en kondensering af suspensionen,indtil der til sidst bliver et 10 fugtigt lag med en tykkelse på maksimalt 200 nm tilbage på bæreren. Den således belagte bærer anbringes i en med formaldehyd mættet atmosfære og inkuberes i ca. 30 minutter, hvorved der sker en intra- og intermolekylær tværbinding af cellevægsfragmenterne. Den ved tværbindingen af 15 cellevægsfragmenterne opståede sammenhængende tynde film løsnes fra bæreren ved forsigtig påsprøjtning af destilleret vand (4°C) og kan da i et fugtigt kammer overføres til en stabil, grovporet bærer, fx et mikrofilter.

Til mekanisk fiksering af cellevægsfragmenterne på eller i bæreren: 20 På den aktive, dvs. med cellevægsfragmenter belagte side af en ultrafiltreringsmembran - fremstillet som beskrevet i eksempel 1 - hældes der en agar (2% i destilleret vand) i flydende form ved en temperatur på 45° C i en lagtykkelse på 0,5-2 mm. Ved afkøling til 20°C sker der en størkning af 25 agaren i form af et gellag. Dette gellag danner nu et beskyttelseslag for ultra filtreringsmembranen og tjener eventuelt som forfilter for større forureninger. Det kan til enhver tid, fx efter opslidning eller tilsmudsning af gelporerne, igen trækkes af og fornyes.

30 Til fremstilling af en ultrafiltreringsmembran suspenderes intra- og intermolekylært tværbundne cellevægsfragmenter

DK 166602 B

10 ifølge en anden variant med en blanding af acrylamid, bisacrylamid, starter og accelerator, og blandingen lades polymerisere og gelere i form af et lag ved 20°C. Der danner sig derved en porøs bærer, i hvilken cellevægsfrag-5 menterne er indlejrede, og som kan anvendes som ultrafil treringsmembran.

Til binding af cellevægsfragmenternes proteinmolekyler eller protein-holdige molekyler på bæreren:

De frie aminogrupper på en bæremembran aktiveres ved hjælp 10 af glutardialdehyd (5% i 0,1M Na-boratpuffer, pH 8,0) som tværbindingsmiddel. Efter aflejring af de i suspensionen værende cellevægsfragmenter på bæremembranen, fx ved sugevirkningen fra et vakuum på 5-6 x lO^Pa (fx opnået ved hjælp af en vands trålepumpe) på ultrafiltrerings indret-15 ningens undertryks s ide sker der en binding af cellevægs-

fragmenterne til de med glutardialdehyd aktiverede aminogrupper på bæremembranen. Den covalente intra- og inter-molekylære tværbinding af proteinmolekylerne eller de pro-teinholdige molekyler i cellevægsfragmenterne udføres ved 20 hjælp af 2% dimethylsuberimidat i 0,1M triethanolamin, pH

8,7.

Ifølge en anden variant aktiveres bæremembranens frie car-boxylgrupper med EDC, der er en forkortelse af l-ethyl-3-(dimethylaminopropyl)carbodiimid (0,1M, pH 4,75). Efter 25 fjernelse af overskydende middel og standsning af reaktio nen ved hjælp af 0,01M Na-acetatpuffer, pH 4,75, vaskes med destilleret vand. Efter tilsætning af hexamethylendiamin og 0,1M EDC aflejres de i destilleret vand suspenderede cellevægsfragmenter på bæremembranen ved påføring af et vakuum 30 på 5 x lO^Pa på ultrafiltrerings indretningens undertrykssi de. Via de ved hjælp af EDC aktiverede carboxylgrupper og via hexamethylendiamin som brodannere tværbindes cellevægs-fragmenternes proteinmolekyler eller proteinholdige molekyler intra- og intermolekylært og bindes covalent til bære-35 membranen. Ved en sådan covalent binding af cellevægsfrag-

DK 166602 B

11 menterne med bæremembranen forøges ultra filtreringsmembranens stabilitet væsentligt; på denne måde forhindres fjernelse af de for ultrafiltreringen væsentlige cellevægs -fragmenter på grund af mekaniske kræfter, således som de fx 5 optræder ved Cross-flow-drift med strømningshastigheder på op til 7 m/s.

Til tværbinding:

Ved anvendelse af tværbindingsmidler i flydende fase skal tværbindingsmidlet ved tværbindingsprocessen presses gennem 10 cellevægsfragmenternes porer, hvorved der består den fare, at den opnåede strømning bevæger de på eller i bæreren af-eller indlejrede cellevægsfragmenter, hvorved deres endelige fiksering på bæreren besværliggøres. For at undgå dette kan en tværbinding eller fortværbinding med fordel også 15 udføres ved hjælp af et gasformigt tværbindingsmiddel.

Til dette formål anvendes der som bærer en nylon mikrofil-treringsmembran med en porestørrelse på 100 nm i en ultrafiltreringsindretning. Cellevægsfragmenterne af-henholdsvis indlejres på eller i bæremembranen ved påføring 20 af et vakuum på 5 x lO^Pa på ultrafiltreringsindretningens undertryksside. I ultrafiltrerings indretningen er der oven over bæremembranen installeret en beholder med formaldehyd. Til tværbindingsforløbet opvarmes ultrafiltrerings indretningens trykkammer sammen med formaldehydet til 80°C.

25 Det derved fordampende formaldehyd, som ved denne tempera tur ud over sin monomere form også foreligger i oligomer form, kommer nu i kontakt med de på bæremembranen afsatte cellevægs fragmenter, hvorved der især som følge af de oligomere former af formaldehydet, som på grund af deres 30 større kædelængde spænder over større områder på celle vægsfragmenternes overflade, sker en intra- eller inter-molekylær tværbinding af cellevægsfragmenternes proteinmolekyler eller proteinholdige molekyler samt en binding deraf til bæremembranen. Anvendelse af et gas- eller damp-35 formigt tværbindingsmiddel har den fordel, at der her ikke

DK 166602 B

12 sker nogen hvirveldannelse, som eventuelt kunne fremkalde en bevægelse af de afsatte cellevægsfragmenter og således kunne forstyrre deres en delige fiksering på bæremembranen.

Efter en tværbindings tid på 2 timer udvaskes det resterende 5 formaldehyd ved hjælp af destilleret vand i 1 time.

Ifølge en fordelagtig variant af dette fremgangsmådetrin kan der endvidere og efter en sådan tværbinding ved hjælp af et gas-eller dampformigt tværbindingsmiddel finde en yderligere tværbinding sted med flydende tværbindingsmidler. Til dette 10 formål dryppes dette flydende tværbindingsmiddel med fordel på de fortværbundne cellevægsfragmenter og suges gennem disses porer eller gennem den porøse bæremembran ved hjælp af et på bæremembranens bagside tilført vakuum. Derved sker der ingen mekanisk beskadigelse af cellevægsfragmenterne. Som flydende 15 tværbindingsmidler, der hensigtsmæssigt anvendes efter en fortværbinding med formaldehyd, kommer fx dimethylsuberimidat (angreb på -NH2-grupperne i proteinet) eller EDC (til tværbinding via -C00H-grupper i proteinet) på tale.

I følgende eksempel 5 beskrives en struktur med vesikulære membraner, 20 som er fremstillet af cellevægge fra mikroorganismer, uden at der er sket en sprængning af cellevæggene.

EKSEMPEL 2

Intakte celler af mikroorganismen Bacillus stearothermophiles NRS 1536 (10 g vådvægt) suspenderes i 50 ml 1%’s Triton® X-100 i 50 mM 25 tris-HC1-puffer (pH 7,2), og suspensionen omrøres i 30 minutter ved 37°C. Triton® X-100, som er et mildt ikke-ionisk detergent, trænger på grund af koncentrationsligevægten gennem S-lagets porer og det derunder liggende cellespecifikke og af peptidoglycan bestående støttelag ind i cellen og ødelægger den op til peptidoglycanlaget 30 stødende cytoplasmamembran. Eftersom cytoplasmamembranen udgør cellevæggens væsentligste diffusionsbarriere, kan cellens indholdsstoffer nu efter membranens ødelæggelse diffundere ud af cellen. Efter behandling med Triton® X-100 centrifugeres cellerne ved 20.000 x g,

DK 166602 B

13 underkastes en yderligere ekstraktion med Triton® X-100 i 10 minutter ved 60°C til ødelæggelse af endnu tilstedeværende cytoplasmamembran-rester og centrifugeres igen ved 20.000 x g. De således fremstillede cellevægshylstre underkastes derefter fire på hinanden følgende 5 vasketrin, som i hvert tilfælde består af omrøring af cellevægshylstrene i destilleret vand i 10 minutter og en derpå følgende centrifugering ved 20.000 x g. Til nedbrydning af endnu tilstedeværende celleindholdsstoffer såsom ribosomer og nucleinsyrer sættes der 2 mg ribonuclease og 2 mg deoxyribonuclease til en suspension af de vaske-10 de cellevægshylstre i 40 ml destilleret vand, og der inkuberes i 20 minutter ved 30°C under omrøring. Suspensionen centrifugeres derefter ved 20.000 x g, og cellerne underkastes derefter nogle vaske trin med destilleret vand.

Efter centrifugering ved 20.000 x g resuspenderes de således vundne 15 cellevægshylstre i 0,1M triethanolamin (pH 8,5), hvorefter der til 10 ml af denne suspension under omrøring sættes 100 mg af et tværbindingsmiddel, fx dimethylsuberimidat. Efter en reaktionstid på 60 minutter ved 20°C udvindes de tværbundne cellevægshylstre ved centrifugering ved 20.000 x g, vaskes med destilleret vand og kan, som 20 beskrevet i eksempel 4, fyldes med enzymproteiner som værdifulde stoffer.

EKSEMPEL 3 I dette eksempel anvendes der en ultrafiltreringsmembran, som er fremstillet på basis af Bacillus stearothermophilus PV 72 som be-25 skrevet i eksempel ovenfor og i eksempel 2 i EP-A2-0154620. Her skal proteinerne carboarihydratase (30kD), ovalbumin (43kD) og glycerinaldehyd- 3-phosphatdehydrogenase (140kD) adskilles ved filtreringsprocesser:

Disse proteiner foreligger først opløst i destilleret vand. I et 30 første filtreringstrin skilles carbohydratase først fra i koncentrationsområdet, hvorved carbohydratasen kommer ud i permeatet, hvorimod ovalbumin næsten fuldstændig og glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase helt forbliver i rententatet. Rententatet ompufres derefter fra

DK 166602 B

14 destilleret vand til PBS. I den således ompufrede opløsning, i hvilken ultrafiltreringsmembranens tilbageholdelsesevne over for ovalbumin sænkes fra ca. 90% til ca. 25%, udvaskes ovalbuminet derefter i et yderligere diafiltreringstrin, hvorved glycerinaldehyd-3-phosphat-5 dehydrogenase yderligere forbliver i retentatet og kan udvindes fra dette.

Disse ultrafiltreringsmembraner indeholder membraner, der er opbygget af op til hinanden stødende glycoproteinmolekyler, idet hver af membranporerne er afgrænset af seks tilgrænsende glycoproteinmoleky-10 ler. Analogt med proteinmolekyler, der befinder sig i opløsning, og som kun eksisterer i to tilstande, nemlig helt udfoldet og helt foldet, og ved en miljøændring kun ændrer sig med hensyn til antallet af de molekyler, der befinder sig i den ene eller den anden tilstand, formodes det nu, at den ved en miljøændring bevirkede ændring af 15 membranporernes gennemgangsstørrelse beror på en lignende virkning.

Med hensyn til konformationen af glycoproteinerne i poreområdet og/eller de derpå bundne ladninger består der til enhver tid et relativt lille antal diskrete tilstande, hvis hyppigheder afhænger af miljøbetingelserne, nemlig fx af pH-værdien eller af ionstyrken.

20 Dette kan derfor give sig udslag i, at størstedelen af porerne ved én bestemt miljøbetingelse har den mindst mulige porestørrelse, og ved en anden miljøbetingelse har størstedelen af porerne den størst mulige porestørrelse. Til filtreringer, til hvis udførelse kun porerne med den største porestørrelse er virksomme, ville da den virksomme 25 poretykkelse af disse største porer kontinuerligt ændre sig med ændringen af miljøbetingelserne.

De i det følgende beskrevne filtreringsforsøg påviser eksperimentelt disse antagelser. Disse forsøg blev i hvert tilfælde udført i destilleret vand samt i forskellige pufferopløsninger, nemlig PBS (en phos-30 phatpufret fysiologisk kogsaltopløsning) med Sørensen-puffer (en nøjagtig normeret phosphatpuffer) , med 0,9% NaCl og med 0,1M CaC^-Til opnåelse af en ligevægtstilstand med den relevante pufferopløsning blev ultrafiltreringsmembranen først inkuberet i denne i 2 timer. De således forbehandlede ultrafiltreringsmembraner blev til 35 filtreringsforsøg derefter anvendt i en ultrafiltreringsindretning, fx som beskrevet i eksempel 1 i forbindelse med fig. 5 i ovennævnte

DK 166602 B

15 EP-A2-0154620, hvorefter - hver gang i samme pufferopløsning som anvendt til inkubation - tilbageholdelsesevnen (% R) af filteret over for ovalbumin og bovint serumalbumin (i det følgende benævnt BSA) blev bestemt. Endvidere blev der med de samme stoffer udført 5 sammenligningsforsøg i destilleret vand. Alle forsøg gav med et fil-termembranovertryk på 2 x lO^Pa og en proteinkoncentration på 0,8 mg protein pr. ml en 80%’s koncentration af retentatet, hver gang under de samme omrøringsbetingelser (300 omdr./minut). Resultaterne af disse forsøg er opsummeret i nedenstående tabel.

10 Tilbageholdelsesevne i R(%)

Destilleret Sørensen- 0,9% 0,1M

Miljø vand PBS puffere NaCl CaCl2 pH 5,5 7,2 6,8 5,5 5,5 15 Ovalbumin 83-87 25-30 27 27 27 (43kD) BSA (66kD) 95-97 52-56 57 53 57

Som det ses af tabellen, går værdierne for tilbageholdelsesevnen for 20 de anvendte pufferopløsninger stærkt tilbage i sammenligning med forholdene ved destilleret vand og er endvidere i vid udstrækning uafhængig af den anvendte puffer. Heraf ses det, at - fx ved sammenligning af værdierne i første kolonne med værdierne i de to sidste kolonner - indflydelsen af pH-værdien her åbenbart er væsentligt rin-25 gere end indflydelsen af ionstyrken.

Lignende forsøg, der blev udført med en ultrafiltreringsmembran, som var blevet fremstillet på basis af Bacillus stearothermophilus 3c/NR.c 1536 (jfr. endvidere eksempel 1 i EP-A2-0154620), gav ved udskiftning af destilleret vand med en puffer såsom PBS og Sørensen-puffer væ-30 sentlig mindre ændringer i tilbageholdelsesevnen. Ændringen var her kun ca. 7-10%.

DK 166602 B

16

Udvælgelsen af mikroorganismer, hvis S-lag eller de ved omkrystallisation af proteinmolekylerne eller proteinholdige molekyler fra disse S-lag opnåede membraner (som i det følgende samt i EP-A2-0154620 betegnes P-membraner) viser en til anvendelsesformålet 5 optimal ændring af den virksomme porestørrelse ved en ændring af miljøbetingelserne, udføres hensigtsmæssigt ved afprøvning af egenskaberne hos et større antal mikroorganismer.

EKSEMPEL 4 I dette eksempel beskrives fremstilling af membraner, der har vesiku-10 lære gennemgående porer, samt anbringelse af værdifulde stoffer i disse vesikler.

Der gås herved ud fra celler af mikroorganismen Bacillus stearother-mophilus (stamme PV 72) eller Clostridium thermohydrosulfuricum (stamme Llll-69), hvis S-lag består af glycoproteiner og har en 15 hexagonal gitterstruktur (p6-symmetri) med en periodicitet på 14 nm og en porestørrelse i destilleret vand på ca. 4 nm. 1 g cellevægspræparationer omrøres med 5 ml af en 5M guanidinhydrochloridopløsning (i 50 mM tris-HCl-puffer, pH 7,2) i 2 timer ved 25°C. "Tris" står her og i det følgende som en forkortelse for tris(hydroxymethyl)aminomethan.

20 Herved opløser glycoproteinmolekyler fra de såkaldte S-lag sig fra cellevæggenes overflade. De således ekstraherede cellevægge sedimenteres ved centrifugering (1 time ved 20.000 x g), hvorved glycopro-teinmolekylerne forbliver i supernatanten. Guanidinhydrochloridet fjernes nu fra den glycoproteinmolekyleholdige ekstrakt ved dialyse 25 mod destilleret vand (pH 5,5) eller 50 mM tris-HCl-puffer (pH 7,2), hvorved der ved selvorganisation af glycoproteinerne sker dannelse af vesikulære membraner. Disse i destilleret vand suspenderede membran-vesikler behandles derefter med 2%'s glutaraldehyd som tværbindings-middel (i 50 mM phosphatpuffer, pH 7,2) ved 20°C i 2 timer. Derved 30 sker der en intra- henholdsvis intermolekylær tværbinding af glycoproteinerne.

Efter udvaskning af tværbindingsmidlet er membranvesiklerne anvendelige til fyldning med værdifulde stoffer. Til dette formål blev

DK 166602 B

17 membranvesiklerne suspenderet i en opløsning af et værdifuldt stof, fx i en opløsning af 10 mg/ml af et protein med en molekylvægt på 65-70 kD i en 0,9%'s opløsning af NaCl (pH 5,5). Under disse miljøbetingelser trænger det værdifulde stof gennem membranvesiklernes 5 nu udvidede porer ind i disse, indtil der indstiller sig en koncentrationsligevægt. Efter bortcentrifugering af vesiklerne (fx 1 time ved 15.000 x g) resuspenderes disse i destilleret vand (pH 5,5). Ved denne opnåede miljøændring af NaCl-opløsningen til destilleret vand sker der en formindskelse af membranvesiklernes virksomme porestør-10 relse på en sådan måde, at det værdifulde stof ikke mere kan komme ud gennem porerne og således fastholdes i membranvesiklerne. Til frigørelse af det værdifulde stof fra membranvesiklerne anbringes disse igen i et miljø, hvis ionstyrke har ca. den samme værdi, som har muliggjort fyldning af membranvesiklerne med det værdifulde stof.

15 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til ændring af den virksomme porestørrelse af en struktur, der har membraner med gennemgående porer, kan også med fordel anvendes ved en struktur, der er fremstillet ved en fremgangsmåde, ved hvilken de værdifulde stoffer samtidig med dannelsen af denne struktur er blevet ind- eller påført i eller på 20 denne struktur. Det følgende eksempel 5 illustrerer en fordelagtig udførelsesform for denne fremgangsmåde.

EKSEMPEL 5

Til fiksering af et enzymprotein, der danner det værdifulde stof, på en bærer, anvendes der som bærer en polyacrylamidgel fra firmaet Bio-25 rad, Richmond, Californien, U.S.A., som på sin poreoverflade har frie carboxylgrupper. Denne bærer behandles først med dicyclohexylcar-bodiimid og N-hydroxysuccinimid i et vandfrit opløsningsmiddel såsom dioxan, hvorved bærerens carboxylgrupper aktiveres. Opløsningsmidlet samt de overskydende reagenser vaskes derefter ud, og bæreren overfø-30 res til 0,1M natriumphosphatpuffer (pH 7,8). Derefter tilsættes der 10 mg af enzymproteinet pr. 1 g bærer og inkuberes i 5 timer ved 20°C, hvorved enzymproteinet via bærerens aktiverede carboxylgruppe bindes covalent til denne.

DK 166602 B

18

Ud fra en cellevægspræparation af mikroorganismen Clostridium thermohydro sulfuricum (stamme Lill-69) fremstilles der P-membraner efter løsning af glycoproteinmolekylerne fra mikroorganismens S-lag med 5M guanidinhydrochlorid og dialyse mod destilleret vand. 10 mg af disse 5 P-membraner opdeles derefter ved tilsætning af 10 ml 0,01M HC1 i deres glycoproteinmolekyler, og disse blev ekstraheret. 10 ml af denne ekstrakt blev blandet med 10 g af bæreren, på hvilken enzymproteinet er covalent bundet, og blandingen dialyseres ved 37°C mod 10 mM CaCl2-opløsning. Ved den derigennem opnåede pH-værdiændring danner 10 der sig ved selvorganisation af glycoproteinerne på gellegemernes ydre overflade membraner, som omhyller gellegemerne og det derpå fikserede enzym. De således dannede membraner tværbindes derefter intra-henholdsvis intermolekylært analogt med det i eksempel 4 beskrevne.

Visse fordelagtige anvendelser af fremgangsmåderne ifølge opfindelsen 15 og de ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede strukturer er beskrevet i de ovenstående eksempler. Disse strukturer, især dem, hvis fremstilling er illustreret i eksempel 1 samt disses varianter og i eksempel 2, kan hensigtsmæssigt anvendes på samme måde, som allerede er beskrevet i EP-A2-0154620.

Claims

1. Fremgangsmåde til fremstilling af en struktur med membraner med gennemgående porer, hvilke membraner omfatter proteinmolekyler eller proteiriholdige molekyler, der er ordnet som et krystalgitter, og som 5 stammer fra cellevægge fra mikroorganismer, idet membranerne eventuelt anbringes på eller indlejres i en bærer, og idet membranens proteinmolekyler eller proteiriholdige molekyler, eventuelt ved behandling med mono- og/eller bifunktionelle fremmede molekyler og eventuelt covalent, tværbindes intramolekylært og/eller med hinanden 10 og/eller med bæreren via molekylernes reaktive grupper, kendetegnet ved, at cellerne af mikroorganismerne, især celler af prokaryoter, som har mindst ét cellevægslag, i hvilket proteinmolekyler eller proteinholdige molekyler støder op til hinanden og er forbundet med hinanden, idet de i disse cellevægslag mellem 15 de som et krystalgitter ordnede molekyler som et gitter ordnede porer forbliver frie, eventuelt sprænges, og cellevæggene opdeles i fragmenter, og at de - efter fjernelse af celleindholdet og eventuelt af andre cellevægs- eller membranlipidlag - tilbageblevne cellevægge eller cellevægsfragmenter, som består af det eller de af protein-20 molekyler bestående lag og eventuelt af de op til disse stødende cellevægslag, anbringes på eller indlejres i en bærer.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der gås ud fra cellevægge af mikroorganismer, der som cellevægslag har 2 af proteinmolekyler eller pro-25 teinholdige molekyler opbyggede krystallinske lag og mellem disse har eventuelt af peptidoglycan, pseudomurein eller cellulose bestående lag, og at disse cellevægslag i form af cellevægsfragmenter på- eller indføres på eller i bæreren.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, 30 kendetegnet ved, at der gås ud fra cellevægge af mikroorganismer, hvori de proteinholdige molekyler, der danner lagene, er glycoproteiner. DK 166602 B

4. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, kendetegnet ved, at mikroorganismecellerne sprænges osmotisk og/eller mekanisk, eventuelt ved hjælp af en cellemølle eller ultralyd, og/eller ved trykudløsning og/eller kemisk, eventuelt ved 5 hjælp af en French-presse eller enzymatisk.

5. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4, kendetegnet ved, at der som bærer anvendes et hjælpelag, som eventuelt fjernes før anvendelse af membranen.

6. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-5, 10 kendetegnet ved, at der som bærer anvendes legemer af ionotrope geler, som på alle sider omsluttes af de cellevægsfragmenter, der skal anbringes.

7. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-6, kendetegnet ved, at cellevægsfragmenterne anbringes ved 15 påsprøjtning og/eller aflejring på bæreren.

8. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-7, kendetegnet ved, at anbringelse af cellevægsfragmenterne på bæreren sker ved tryk- og/eller sugevirkning.

9. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-6, 20 kendetegnet ved, at cellevægsfragmenterne presses på bæreren mekanisk.

10. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-9, kendetegnet ved, at de på bæreren anbragte cellevægsfragmenter overlejres af en yderligere bærer.

11. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-10, kendetegnet ved, at cellevægsfragmenterne ved anvendelse af bærere, der består af polymerer, under polymerisations- og/eller størkningsforløbet af bæreren indlejres i det porøse bæremateriale, der dannes. DK 166602 B

12. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-10, kendetegnet ved, at forbindelsen mellem cellevægsfragmenterne og bæreren forstærkes ved en eventuelt overfladisk varmebehandling.

13. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-11, kendetegnet ved, at behandlingen med mono- og/eller bi-funktionelle fremmede molekyler udføres ved påføring af gasformige og/eller flydende tværbindingsmidler.

14. Fremgangsmåde ifølge krav 13, 10 kendetegnet ved, at behandlingen med de gasformige eller flydende tværbindingsmidler udføres efter hinanden med hensyn til tid.

15. Fremgangsmåde ifølge krav 12 eller 13, kendetegnet ved, at bæreren og/eller cellevægsfragmenterne 15 før anbringelse af sidstnævnte på bæreren behandles med tværbindings-midlerne, og disse først aktiveres efter anbringelse af cellevægs-fragmenterne på bæreren.

16. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-15, kendetegnet ved, at de reaktive grupper på bæreren og/el- 20 ler cellevægsfragmenternes molekyler, som er bestemt til covalent tværbinding og/eller sekundær valensbinding, frilægges og/eller indføres før anbringelse af cellevægsfragmenterne på bæreren.

17. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 13-16, kendetegnet ved, at den covalente tværbinding af celle- 25 vægsfragmenterne med bæreren udføres samtidig med den covalente tværbinding af de påførte cellevægs fragmenters proteinmolekyler eller proteinholdige molekyler.

18. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 13-17, kendetegnet ved, at de på bæreren eller bærerne anbragte 30 cellevægs fragmenter tildækkes ved hjælp af et porøst beskyttelseslag før anbringelse af tværbindingsmidlet/tværbindingsmidlerne, hvilket DK 166602B beskyttelseslag eventuelt fjernes efter afslutning af tvær-bindings -forløbet.

19. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1, 13 og 14, 5 kendetegnet ved, at cellevæggene ikke sprænges, men at de til opbygning af strukturen ikke-nødvendige komponenter fra cellerne, såsom cytoplasmamembran, cytoplasma eller lignende, opløses ud gennem porerne i cellevæggen.

20. Anvendelse af en ved en fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst 10 af kravene 1-19 fremstillet struktur, kendetegnet ved, at den anvendes som ultrafilter eller som separationsorgan for en gasseparation eller som separationsorgan for en ionbytningsfremgangsmåde.

21. Anvendelse af en ved en fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst 15 af kravene 1-19 fremstillet struktur, kendetegnet ved, at den anvendes som bærer for andre semipermeable membraner, der spænder over strukturens porer og/eller cellevægsfragmenter, idet disse andre semipermeable membraner eventuelt er tværbundet med proteinmolekyler eller proteinholdige moleky-20 ler i strukturens cellevægsfragmenter via carboxylgrupper og/eller aminogrupper og/eller sulfhydrylgrupper og/eller hydroxygrupper, enten direkte eller via bifunktionelle fremmede molekyler.

22. Anvendelse ifølge krav 21, kendetegnet ved, at disse andre semipermeable membraner er 25 hyperfiltreringsmembraner, eventuelt tensid- eller tensidagtige lipoid-hyperfiltreringsmembraner.

23. Anvendelse ifølge krav 21, kendetegnet ved, at disse andre semipermeable membraner er separationsorganer for en gasseparation.

24. Anvendelse ifølge krav 21, kendetegnet ved, at disse andre semipermeable membraner er separationsorganer for en ionbytningsfremgangsmåde. DK 166602 B

25. Anvendelse ifølge krav 21, kendetegnet ved, at disse andre semipermeable membraner er separationsorganer for en pervaporationsfremgangsmåde.

26. Anvendelse ifølge krav 21, 5 kendetegnet ved, at disse andre semipermeable membraner er opløsningsdiffusionsmembraner.

27. Anvendelse af en ved fremgangsmåden ifølge krav 19 fremstillet struktur, kendetegnet ved, at den anvendes som separationsmateriale 10 til gennemtrængningschromatografi.

28. Anvendelse af en ifølge et hvilket som helst af kravene 1-19 fremstillet membran, kendetegnet ved, at der ved ændring af miljøbetingelserne bevirkes en ændring af membranmolekylernes konformation som bestemmer 15 poreformen og porestørrelsen, og/eller bevirkes en ændring af ladningerne på molekylerne i membranens poreområde og dermed en ændring af membranporernes virksomme gennemgangsdiameter.

29. Anvendelse ifølge krav 28, kendetegnet ved, at konformations- og/eller ladningsæn-20 dringen bevirkes ved ændring af pH-værdien i det miljø, der omgiver strukturen.

30. Anvendelse ifølge krav 28, kendetegnet ved, at konformations- og/eller ladningsændringen bevirkes ved ændring af ionstyrken og/eller ionsammensæt-25 ningen af det miljø, der omgiver strukturen.

31. Anvendelse ifølge krav 28, kendetegnet ved, at konformations- og/eller ladningsændringen bevirkes ved ændring af temperaturen af det milj ø, der omgiver strukturen. DK 166602 B

32. Anvendelse ifølge krav 28, kendetegnet ved, at konformations- og/eller ladningsændringen bevirkes ved ændring af arten af den flydende fase.

33. Anvendelse ifølge et hvilket som helst af kravene 28-32, 5 kendetegnet ved, at værdifulde stoffer såsom enzymer, farmaceutisk aktive stoffer, pesticider eller lignende indesluttes i strukturen og/eller disse værdifulde stoffer bringes ud af strukturen ved en ændring af den virksomme gennemgangsdiameter af strukturens porer.

34. Anvendelse ifølge krav 33, kendetegnet ved, at der anvendes en struktur, som danner et hylster, der indeslutter de værdifulde stoffer, og hvis overflade til dels er belagt med strukturens membraner og til dels er forsynet med et uigennemtrængeligt lag.

35. Anvendelse ifølge krav 33 eller 34, kendetegnet ved, at der anvendes en struktur, som har membraner i vesikelform.

36. Anvendelse ifølge krav 35, kendetegnet ved, at porerne i de vesikulære membraner til 20 indføring af de værdifulde stoffer i strukturen udvides ved en miljøændring, at de værdifulde stoffer derefter føres ind gennem de udvidede porer i vesiklens indre, og at disse porer derefter ved en yderligere miljøændring igen formindskes.

37. Anvendelse af en membran fremstillet ved fremgangsmåden ifølge et 25 hvilket som helst af kravene 1-19, kendetegnet ved, at en opløsning og/eller suspension af partikler, der danner et krystallinsk lag, bringes i kontakt med et værdifuldt stof, at selvorganisationen af proteinmolekylerne eller de proteinholdige molekylerne sker langs med overfladen af det værdi-30 fulde stof, og at molekyler i denne membran - eventuelt ved behandling med mono- og/eller bifunktionelle fremmede molekyler - substitueres på reaktive grupper og/eller via disse reaktive grupper, eventuelt covalent, tværbindes intramolekylært og/eller med hinanden. DK 166602B

38. Fremgangsmåde ifølge krav 37, kendetegnet ved, at der anvendes et værdifuldt stof, som er bundet på eller i et bærestof eller et bærelegeme.