CS217857B1 - Imobilizované kvasinkové buňky a způsob jejich výroby - Google Patents

Abstract

Vynález se týká imobilizovanýeh kvasinkových buněk vázaných na nosiěe, která jsou tvořeny polymerní látkou, například na bázi polyetyléntereftalátu, polykapro- laktamu, polyfenylenoxidu, blokového kopolymeru polyetylánoxid - polykaprolaktam, melaminoformaldehydové pryskyřice, který má mikroporézní strukturu o specifickém povrchu 1 až 700 m2/g. Obzvláště výhodná je, jestliže se na polymerní nosič nejprve sorbuje sitovací činidlo, například glutar- aldehyd, a pak se vzniklý produkt nechá reagovat s hubkami. Déle výhodný je postup, kdy se na polymerní nosič adsorbuje glutar- aldehyd a na vzniklou kompozici ee vážou celé kvasinkové buftky a znovu zeeítují glutaraldehydem. Imobilizaci buněk je vhodné provádět při teplotě 4 až 30 °C a pH prostředí od 4 do 7,5 po dobu 1 až 48 hodin. Kvasinkové bufiky se permeabili- zují před imobilizaci nebo po ní.

Description

Vynález se týká imobilizovaných kvasinkových buněk vázaných na nosiči a způsobu jejich výroby.

Imobilizace kvasinkových buněk na nosiči, jakožto producentu enzymu, má význam v tom, že enzymy není nutné izolovat nákladným procesem, purifikovat a přechovávat za určitých podmínek. DalSí význam spočívá v zachování enzymů v intracelulárním prostředí buňky, což přispívá ke stabilizaci enzymové aktivity, zachováni optimálních podmínek enzymové reakce a vyloučeni negativních vlivů extracelulérního prostředí.

Dosud se imobilizace buněk prováděla zakotvením buňky v gelu, membráně nebo mikropouzdru, zakotvením buňky specifickou adsorpcl, vazbou buněk jejich kovalentnlm zesltěnlm nebo zakotvením buňky kovalentnl vazbou na pevný nosič.

Při zachyceni buňky v gelu, membráně či mikropouzdru, eventuálně při vazbě buněk jejich kovalentnlm zesltěnlm, je podstatně nlSSÍ kontakt zakotvených buněk vzhledem k difúznl bariéře gelu nebo membráně se substrátem.

Při zakotveni buněk specifickou adsorpcl je možnost snadného uvolněni buněk, což je častou příčinou nízké aktivity hmotové jednotky imobilizováného systému.

Zakotveni buněk kovalentnl vazbou na pevný nosič vyžaduje obvykle neúměrně vysoké náklady na chemickou modifikaci povrchu nosiče.

Uvedené nedostatky v imobilizaci kvasinkových buněk odstraňuje předkládaný vynález. Podstata vynélezu spočívé v tom, že imobilizované kvasinkové buňky jsou navázány na nosiče tvořené polymérní látkou, například na bázi polyetyléntereftalátu, polykaprolaktamu, polyfenylenoxidu, blokového kopolymerů polyetylénoxid-polykaprolaktam, meleminoformaldehydové pryskyřice, který má mikroporéznl strukturu o specifickém povrchu 1 až 700 m²/g.

Obzvláště výhodný je postup, kdy se na polymérní noeič nejprve sorbuje sllovacl činidlo například glutaraldehyd, a pak se vzniklý produkt nechá reagovat s buňkami.

Dále je výhodné, jestliže se na polymérní nosič adsorbuje glutaraldehyd a na vzniklou kompozici se vážou celé kvasinkové buňky a znovu ze sítujl glutaraldehydem.

Imobilizaci buněk je vhodné provádět při teplotě 4 až 30 °C a pH prostředí od 4 do 7,5 po dobu 1 až 48 hodin. Kvasinkové buňky se permeabilizujl před imobilizaci nebo po nl.

Výhodou přípravy imobilizovaných buněk podle vynálezu je, že se získá pevně zakotvený enzymový systém, který je nerozpustný a tedy snadno separovatelný od rozpustného substrátu a produktu, což umožňuje jeho opakované použiti.

Praktická aplikace imobilizovaných buněk, jakožto enzymového systému, se provádí jak veédkovým, tak i kolonovým způsobem. Imobilizace celých kvasinkových buněk na porézní polymerní sorbent podle vynálezu probíhá kombinací prosté sorbce a kovalentnl vazby. Aktivita připraveného zakotveného enzymového sy 3tému není negativně ovlivňována difúznl bariérou nebo dalělmi negativními vlivy, které se projevuji při použití jiných imobilizačnlch způsobech. Pro praktickou aplikaci imobilizovaných buněk podle vanálezu je rozhodující i to, že se využívá vhodného a laciného nosiče tj. sorbentu a jednoduchého způsobu provedení imobilizace. Polymérní sorbenty, tj. nosiče pro imobilizaci kvasinkových buněk podle předkládaného vynálezu se vyrábějí postupy, které spočívají v tom, že se polymer rozpustí v roztaveném rozpouštědle a po ochlazení roztoku na kompaktní hmotu, která se podrobí dalěímu mechanickému zpracováni a potom 8e tavné rozpouštědlo dokonale vyextrahuje z polymérní struktury extrakčnlm činidlem, které dobře rozpouětl tavné rozpouštědlo a neatakuje polymer.

Získá se polymer obvykle v práškové formě s mikroporéznl strukturou a vysokým měrným povrchem.

Tímto postupem byl připraven polymerní sorbent na bázi polyetyléntereftalátu Za použití 6-kaprolaktamu jako rozpouštědla a vody jako extrakěního činidla. Specifický povrch u takto připraveného sorbentu se pohybuje obvykle od 70 do 100 m^/g, velikost částic se pohybuje od 20 až 30 jum. Tento polymerní sorbent je bílá, práškovitá hmota s dobrou chemickou a fyzikální stabilitou s bodem tání 255 °C.

Mikroporézní sorbent na bázi alkalického póly-6-kaprolaktamu se připravuje rozpuštěním polykaprolaktamu v kaprolaktamu při teplotě 190 °C a jako extrakění' činidlo pro kaprolaktam se používá voda. Tento sorbent má specifický povrch kolem 15 m^/g a střední průměr sférických částic 110 A s pravidelnou mikroporézní strukturou. Je chemicky a fyzikálně stálý, o bodu tání 216 °C.

Obdobným způsobem se připravuje i sorbent na bázi blokového kopolymerů polyetylenoxid-polykaprolaktam, přičemž se vychází z hotového kopolymerů. Měrný povrch tohoto sorbentu se pohybuje kolem 8 m²/g.

Sorbent na bázi poly-2,6-dimetylfenyloxidu se připravuje za použití kaprolaktamu jako rozpouštědla polyfenylenoxidu při teplotě 145 °C a extrakěního činidla vody. Sorbent má pravidelnou mikroporézní strukturu s úzkou distribucí pórů o specifickém povrchu kolem 700 m²/g.

Polykondenzační sorbent se připravuje polykondenzací melaminu s formaldehydem za přítomnosti anorganických solí, které se zabuduji do polykondenzačního gelu a pro jeho vytvrzeni se tato sůl vyextrahuje obvykle vodou. Tento sorbent má velikost zrna od 0,1 do 0,5 mm

Q a měrný povrch 200 m /g.

V dalším je vynález blíže objasněn na příkladech, které však rozsah vynálezu nijak neomezují.

Přikladl

Na sorbentu na bázi polyetyléntereftalátu o povrchu 550 m²/g a průměrné velikosti částic 0,25 mm byl adsorbován glutaraldehyd podle následujícího postupu: 1 g sorbentu byl suspendován v 10 ml 5 % objemových glutaraldehydu. Po 24 hodinách míchání za laboratorní teploty byla suspenze převedena do kolonky a sorbent byl promýván destilovanou vodou až do negativní reakce, kterou byla sledována přítomnost glutaraldehydu v jednotlivých promývkách. Po vymytí volného glutaraldehydu byl sorbent promyt 200 ml 50 mM fosfátového pufru, který má pH 7,2, Takto připravený sorbent byl převeden do 50 mM fosfátového pufru, který obsahoval 10^ permeabilizovaných buněk Kluyveromyoes lactis na 100 ml sorbentu. Z hlediska přechodu beta-galaktosidasové aktivity na nosič a její stability bylo konstatováno, že imobilizace buněk byla v podmínkách míchané suspenze dokončena při teplotě 20 °C, přibližně za 6 hodin. Lokalizace buněk na povrchu nosiče byla sledována mikrofotograficky.

Permeabilizace imobilizovaných buněk je nutnou podmínkou využití jejioh intracelulární enzymatické aktivity. Za tím účelem byla provedena permeabilizace buněk následujícím způsobem: Buněčná suspenze byla po 0,1 ml nanáSena na střed membránového filtru, přičemž každé následující nanesení bylo provedeno vždy po úplném odsátí média. Po nanesení 1 ml objemu byly filtry přeneseny na skleněnou desku a zachycené buňky byly vystaveny účinku proudu teplého vzduchu o konstantní teplotě 60 °C po dobu 70 sekund. Permeabilizované buňky byly z povrchu filtrů smyty 0,05 M fosfátovým pufrem, který měl pH 7,0.

Příklad 2

Příprava zakotvených permeabilizovaných buněk byla provedena způsobem popsaným V příkladu 1 s tím rozdílem, že bylo použito buněk permeabilizovaných dimetylsulfoxidem. Suspenze buněk v 0,05 M fosfátovém pufru majícím pH 7,0 byla vystavena účinku'*40 % dime tyl sulfoxidu při teplotě 20 °C. Po 30minutovém kontaktu byly buňky promyty, resuapendovány v uvedeném pufru a imobilizovény.

Přiklad 3

Příprava imobilizovaných permeabilizovaných buněk byla provedena způsobem popsaným v přikladu 1 s tlm rozdílem, že bylo použito jako nosiče polyetyléntereřtalát o měrném povrchu 80 m²/g a průměrné velikosti částic 0,25 mm a buněk Torulopsis casei. Permeabilizace buněk byla provedena účinkem toluenu a etanolu. K 5 ml vytemperované suspenze buněk při 37 °C bylo přidáno 0,5 ml směsi toluenu a etanolu (1:3). Po 7minutovém míchání byly buňky promyty použitým pufrem a imobilizovány.

Přiklad 4

Postupem uvedeným v příkladu 1 byly imobilizovány nepermeabilizované buňky (Paboepora fragilis) na alkalickém poly-6-kaprolaktamovám sorbentu o povrchu 12 m²/g a velikosti částic 0,5 mm. Takto imobilizované buňky byly dodatečně permeabilizovány postupem uvedeným v příkladu 2 s tlm rozdílem, že bylo použito suspenze nosiče s navázanými buňkami. Suspenze imobilizovaných buněk byla převedena do 1% roztoku glutaraldehydu, jehož sekundárním účinkem bylo dosaženo po 30 minutách zesítění buněk.

Příklad 5

Postupem uvedeným v příkladu 1 byly imobilizovány buňky Saceharomyces lactle na polykondenzačním sorbentu melaminu s formaldehydem o měrném povrchu 200 m²/g a velikosti částic 0,45 mm. Permeabilizace buněk byla provedena ve směsi toluenu a etanolu 1:3 po dobu 7 minut Potom buňky byly promyty použitým pufrem a imobilizovány popsaným postupem.

Přiklad 6

K imobilizaci buněk (Candida pseudotropicalis) byl použit sorbent na bázi blokového kopolyméru polyetylénoxid-kaprolaktam o celkovém měrném povrchu 8 m /g a průměrné velikosti částic 1 mm. Postup imobilizace je popsán u příkladu 1 β tím rozdílem, že permeabilizace buněk byla provedena dimetylsulfoxidem tímto postupem: suspenze buněk v 0,05 M fosfátovém pufru, který má pH 7,0 byla vystavena účinku 40 % dimetylsulfoxidu při teplotě 20 °C. Po 30minutovém působení byly buňky promyty, resuspendovány v uvedeném pufru a použity k imobilizaci.

Claims (5)

1. Imobilizované kvasinkové buňky vázané na nosič vyznačující se tím, že buňky jsou vázané na nosič, který je tvořen polymerní látkou, například na bázi polyetyléntereftalátu, polykaprolaktamu, polyfenylenoxidu, blokového kopolyméru polyetylénoxid-polykaprolaktam, melaminoformaldehydové pryskyřice, s mikroporézní strukturou o specifickém povrchu 1 až 700 m²/g.

2. Způsob přípravy imobilizovaných kvasinkových buněk podle bodu 1 vyznačující se tím, že se na polymerní nosič nejprve sorbuje síťovací činidlo, například glutaraldehyd, a pak se vzniklý produkt nechá reagovat s buňkami.

3. Způsob podle bodu 2, vyznačující se tím, že se na polymerní nosič adsorbuje glutaraldehyd a na vzniklou kompozici se vážou celé kvasinkové buňky a znovu zesiluji glutaraldehydem.

4. Způsob podle bodů 2 a 3 vyznačujíc! se tlm, že se imobilieeee buněk provádí při teplotě 4 až 30 °C a pH prostředí od 4 do 7,5 po dobu 1 až 48 hodin.

5. Způsob podle bodů 2, 3 a 4 vyznačující se tlm, že kvasinkové buňky se permeabilieu tfí·