CS217857B1

CS217857B1 - Immobilized yeast cells and method for their production

Info

Publication number: CS217857B1
Application number: CS82081A
Authority: CS
Inventors: Vladimir Jirku; Budimir Veruovic; Jaroslava Turkova; Vladimir Kubanek
Original assignee: Vladimir Jirku; Budimir Veruovic; Jaroslava Turkova; Vladimir Kubanek
Priority date: 1981-02-04
Filing date: 1981-02-04
Publication date: 1983-01-28

Abstract

Vynález se týká imobilizovanýeh kvasinkových buněk vázaných na nosiěe, která jsou tvořeny polymerní látkou, například na bázi polyetyléntereftalátu, polykapro- laktamu, polyfenylenoxidu, blokového kopolymeru polyetylánoxid - polykaprolaktam, melaminoformaldehydové pryskyřice, který má mikroporézní strukturu o specifickém povrchu 1 až 700 m2/g. Obzvláště výhodná je, jestliže se na polymerní nosič nejprve sorbuje sitovací činidlo, například glutar- aldehyd, a pak se vzniklý produkt nechá reagovat s hubkami. Déle výhodný je postup, kdy se na polymerní nosič adsorbuje glutar- aldehyd a na vzniklou kompozici ee vážou celé kvasinkové buftky a znovu zeeítují glutaraldehydem. Imobilizaci buněk je vhodné provádět při teplotě 4 až 30 °C a pH prostředí od 4 do 7,5 po dobu 1 až 48 hodin. Kvasinkové bufiky se permeabili- zují před imobilizaci nebo po ní.BACKGROUND OF THE INVENTION The present invention relates to immobilized carrier-bound yeast cells consisting of a polymeric material, such as polyethylene terephthalate, polycaprolactam, polyphenylene oxide, polyethylene oxide-polycaprolactam, a melamine-formaldehyde resin having a microporous structure having a specific surface area of 1-700 m 2 / g. It is particularly preferred that the crosslinking agent, for example glutaraldehyde, is first adsorbed onto the polymeric support, and then the product formed is reacted with the sponges. It is further preferred that glutaraldehyde is adsorbed onto the polymeric support and the whole yeast is bound to the resulting composition and re-crosslinked with glutaraldehyde. Cell immobilization should be carried out at a temperature of 4 to 30 ° C and a pH of the environment of 4 to 7.5 for 1 to 48 hours. Yeast buffers are permeabiliated before or after immobilization.

Description

Vynález se týká imobilizovaných kvasinkových buněk vázaných na nosiči a způsobu jejich výroby.The invention relates to immobilized carrier yeast cells and to a process for their production.

Imobilizace kvasinkových buněk na nosiči, jakožto producentu enzymu, má význam v tom, že enzymy není nutné izolovat nákladným procesem, purifikovat a přechovávat za určitých podmínek. DalSí význam spočívá v zachování enzymů v intracelulárním prostředí buňky, což přispívá ke stabilizaci enzymové aktivity, zachováni optimálních podmínek enzymové reakce a vyloučeni negativních vlivů extracelulérního prostředí.The immobilization of yeast cells on a carrier as an enzyme producer is of importance in that enzymes do not need to be isolated by a costly process, purified and stored under certain conditions. Further importance lies in the preservation of enzymes in the intracellular environment of the cell, which contributes to stabilizing the enzyme activity, maintaining optimal conditions of the enzyme reaction and eliminating the negative effects of the extracellular environment.

Dosud se imobilizace buněk prováděla zakotvením buňky v gelu, membráně nebo mikropouzdru, zakotvením buňky specifickou adsorpcl, vazbou buněk jejich kovalentnlm zesltěnlm nebo zakotvením buňky kovalentnl vazbou na pevný nosič.To date, cell immobilization has been accomplished by anchoring the cell in a gel, membrane, or microcapsule, by anchoring the cell with specific adsorption, by binding the cells by their covalent crosslinking, or by anchoring the cell by covalent binding to a solid support.

Při zachyceni buňky v gelu, membráně či mikropouzdru, eventuálně při vazbě buněk jejich kovalentnlm zesltěnlm, je podstatně nlSSÍ kontakt zakotvených buněk vzhledem k difúznl bariéře gelu nebo membráně se substrátem.When the cell is captured in a gel, membrane or microcapsule, or when the cells are bound by their covalent cross-linking, the anchored cells are substantially less contacted by the diffusion barrier of the gel or membrane with the substrate.

Při zakotveni buněk specifickou adsorpcl je možnost snadného uvolněni buněk, což je častou příčinou nízké aktivity hmotové jednotky imobilizováného systému.When anchoring cells with specific adsorption, the possibility of easy cell release is a frequent cause of low activity of the mass unit of the immobilized system.

Zakotveni buněk kovalentnl vazbou na pevný nosič vyžaduje obvykle neúměrně vysoké náklady na chemickou modifikaci povrchu nosiče.Anchoring the cells by covalent binding to a solid support usually requires a disproportionately high cost of chemically modifying the surface of the support.

Uvedené nedostatky v imobilizaci kvasinkových buněk odstraňuje předkládaný vynález. Podstata vynélezu spočívé v tom, že imobilizované kvasinkové buňky jsou navázány na nosiče tvořené polymérní látkou, například na bázi polyetyléntereftalátu, polykaprolaktamu, polyfenylenoxidu, blokového kopolymerů polyetylénoxid-polykaprolaktam, meleminoformaldehydové pryskyřice, který má mikroporéznl strukturu o specifickém povrchu 1 až 700 m²/g.These drawbacks in the immobilization of yeast cells are overcome by the present invention. SUMMARY OF THE INVENTION The invention is based on immobilized yeast cells bound to a polymeric carrier, for example, based on polyethylene terephthalate, polycaprolactam, polyphenylene oxide, polyethylene oxide-polycaprolactam block copolymers, and a surface-to-micro-resin (MEM) ^1/2 .

Obzvláště výhodný je postup, kdy se na polymérní noeič nejprve sorbuje sllovacl činidlo například glutaraldehyd, a pak se vzniklý produkt nechá reagovat s buňkami.Especially preferred is a process whereby a binder, for example glutaraldehyde, is first sorbed onto the polymeric carrier and then reacted with the cells.

Dále je výhodné, jestliže se na polymérní nosič adsorbuje glutaraldehyd a na vzniklou kompozici se vážou celé kvasinkové buňky a znovu ze sítujl glutaraldehydem.It is further preferred that glutaraldehyde is adsorbed to the polymeric carrier and whole yeast cells are bound to the resulting composition and re-crosslinked with glutaraldehyde.

Imobilizaci buněk je vhodné provádět při teplotě 4 až 30 °C a pH prostředí od 4 do 7,5 po dobu 1 až 48 hodin. Kvasinkové buňky se permeabilizujl před imobilizaci nebo po nl.Cell immobilization is preferably carried out at a temperature of 4 to 30 ° C and a pH of the environment of 4 to 7.5 for 1 to 48 hours. Yeast cells were permeabilized before or after immobilization.

Výhodou přípravy imobilizovaných buněk podle vynálezu je, že se získá pevně zakotvený enzymový systém, který je nerozpustný a tedy snadno separovatelný od rozpustného substrátu a produktu, což umožňuje jeho opakované použiti.An advantage of the preparation of the immobilized cells according to the invention is that a firmly anchored enzyme system is obtained which is insoluble and thus readily separable from the soluble substrate and product, allowing its reuse.

Praktická aplikace imobilizovaných buněk, jakožto enzymového systému, se provádí jak veédkovým, tak i kolonovým způsobem. Imobilizace celých kvasinkových buněk na porézní polymerní sorbent podle vynálezu probíhá kombinací prosté sorbce a kovalentnl vazby. Aktivita připraveného zakotveného enzymového sy 3tému není negativně ovlivňována difúznl bariérou nebo dalělmi negativními vlivy, které se projevuji při použití jiných imobilizačnlch způsobech. Pro praktickou aplikaci imobilizovaných buněk podle vanálezu je rozhodující i to, že se využívá vhodného a laciného nosiče tj. sorbentu a jednoduchého způsobu provedení imobilizace. Polymérní sorbenty, tj. nosiče pro imobilizaci kvasinkových buněk podle předkládaného vynálezu se vyrábějí postupy, které spočívají v tom, že se polymer rozpustí v roztaveném rozpouštědle a po ochlazení roztoku na kompaktní hmotu, která se podrobí dalěímu mechanickému zpracováni a potom 8e tavné rozpouštědlo dokonale vyextrahuje z polymérní struktury extrakčnlm činidlem, které dobře rozpouětl tavné rozpouštědlo a neatakuje polymer.The practical application of immobilized cells as an enzyme system is carried out both in a leader and a column manner. The immobilization of whole yeast cells to the porous polymeric sorbent of the invention takes place by a combination of simple sorption and covalent bonding. The activity of the prepared anchored enzyme system is not adversely affected by the diffusion barrier or other negative effects that occur when using other immobilization methods. It is also crucial for the practical application of the immobilized cells according to vanalysis that a suitable and cheap carrier, i.e., a sorbent, and a simple method of carrying out the immobilization are employed. The polymeric sorbents, i.e. the yeast cell immobilization carriers according to the present invention, are produced by the method of dissolving the polymer in a molten solvent and cooling the solution to a compact mass which is subjected to further mechanical treatment and then completely extracting the melt solvent from a polymeric structure with an extraction agent that dissolves the melt solvent well and does not attack the polymer.

Získá se polymer obvykle v práškové formě s mikroporéznl strukturou a vysokým měrným povrchem.The polymer is usually obtained in powder form with a microporous structure and a high specific surface area.

Tímto postupem byl připraven polymerní sorbent na bázi polyetyléntereftalátu Za použití 6-kaprolaktamu jako rozpouštědla a vody jako extrakěního činidla. Specifický povrch u takto připraveného sorbentu se pohybuje obvykle od 70 do 100 m^/g, velikost částic se pohybuje od 20 až 30 jum. Tento polymerní sorbent je bílá, práškovitá hmota s dobrou chemickou a fyzikální stabilitou s bodem tání 255 °C.Polymeric polyethylene terephthalate based polymeric sorbent was prepared using 6-caprolactam as solvent and water as extraction agent. The specific surface area of the sorbent thus prepared is usually from 70 to 100 m ^ / g, the particle size being from 20 to 30 µm. This polymeric sorbent is a white, pulverulent mass with good chemical and physical stability with a melting point of 255 ° C.

Mikroporézní sorbent na bázi alkalického póly-6-kaprolaktamu se připravuje rozpuštěním polykaprolaktamu v kaprolaktamu při teplotě 190 °C a jako extrakění' činidlo pro kaprolaktam se používá voda. Tento sorbent má specifický povrch kolem 15 m^/g a střední průměr sférických částic 110 A s pravidelnou mikroporézní strukturou. Je chemicky a fyzikálně stálý, o bodu tání 216 °C.The microporous sorbent based on alkaline-6-caprolactam is prepared by dissolving polycaprolactam in caprolactam at 190 ° C, and water is used as the extraction agent for caprolactam. This sorbent has a specific surface area of about 15 m ^ / g and an average diameter of 110 A spherical particles with a regular microporous structure. It is chemically and physically stable with a melting point of 216 ° C.

Obdobným způsobem se připravuje i sorbent na bázi blokového kopolymerů polyetylenoxid-polykaprolaktam, přičemž se vychází z hotového kopolymerů. Měrný povrch tohoto sorbentu se pohybuje kolem 8 m²/g.In a similar manner, a sorbent based on polyethylene oxide-polycaprolactam block copolymers is prepared starting from the finished copolymers. The specific surface area of this sorbent is about 8 m ² / g.

Sorbent na bázi poly-2,6-dimetylfenyloxidu se připravuje za použití kaprolaktamu jako rozpouštědla polyfenylenoxidu při teplotě 145 °C a extrakěního činidla vody. Sorbent má pravidelnou mikroporézní strukturu s úzkou distribucí pórů o specifickém povrchu kolem 700 m²/g.A poly-2,6-dimethylphenyloxide sorbent is prepared using caprolactam as a polyphenylene oxide solvent at 145 ° C and extracting water. The sorbent has a regular microporous structure with a narrow pore distribution with a specific surface area of about 700 m ² / g.

Polykondenzační sorbent se připravuje polykondenzací melaminu s formaldehydem za přítomnosti anorganických solí, které se zabuduji do polykondenzačního gelu a pro jeho vytvrzeni se tato sůl vyextrahuje obvykle vodou. Tento sorbent má velikost zrna od 0,1 do 0,5 mmThe polycondensation sorbent is prepared by polycondensation of melamine with formaldehyde in the presence of inorganic salts which are incorporated into the polycondensation gel and are usually extracted with water to cure it. This sorbent has a grain size of 0.1 to 0.5 mm

Q a měrný povrch 200 m /g.Q and specific surface area 200 m / g.

V dalším je vynález blíže objasněn na příkladech, které však rozsah vynálezu nijak neomezují.In the following, the invention is illustrated by the following non-limiting examples.

PřikladlHe did

Na sorbentu na bázi polyetyléntereftalátu o povrchu 550 m²/g a průměrné velikosti částic 0,25 mm byl adsorbován glutaraldehyd podle následujícího postupu: 1 g sorbentu byl suspendován v 10 ml 5 % objemových glutaraldehydu. Po 24 hodinách míchání za laboratorní teploty byla suspenze převedena do kolonky a sorbent byl promýván destilovanou vodou až do negativní reakce, kterou byla sledována přítomnost glutaraldehydu v jednotlivých promývkách. Po vymytí volného glutaraldehydu byl sorbent promyt 200 ml 50 mM fosfátového pufru, který má pH 7,2, Takto připravený sorbent byl převeden do 50 mM fosfátového pufru, který obsahoval 10^ permeabilizovaných buněk Kluyveromyoes lactis na 100 ml sorbentu. Z hlediska přechodu beta-galaktosidasové aktivity na nosič a její stability bylo konstatováno, že imobilizace buněk byla v podmínkách míchané suspenze dokončena při teplotě 20 °C, přibližně za 6 hodin. Lokalizace buněk na povrchu nosiče byla sledována mikrofotograficky.Glutaraldehyde was adsorbed on a polyethylene terephthalate-based sorbent with a surface area of 550 m ² / g and an average particle size of 0.25 mm as follows: 1 g of the sorbent was suspended in 10 ml of 5% by volume glutaraldehyde. After stirring at room temperature for 24 hours, the suspension was transferred to a column and the sorbent was washed with distilled water until a negative reaction was observed to monitor the presence of glutaraldehyde in each wash. After washing out the free glutaraldehyde, the sorbent was washed with 200 ml of 50 mM phosphate buffer having a pH of 7.2. With respect to the transition of beta-galactosidase activity to the carrier and its stability, it was noted that the cell immobilization under complete suspension conditions was completed at 20 ° C, in about 6 hours. The localization of the cells on the carrier surface was monitored by photomicrography.

Permeabilizace imobilizovaných buněk je nutnou podmínkou využití jejioh intracelulární enzymatické aktivity. Za tím účelem byla provedena permeabilizace buněk následujícím způsobem: Buněčná suspenze byla po 0,1 ml nanáSena na střed membránového filtru, přičemž každé následující nanesení bylo provedeno vždy po úplném odsátí média. Po nanesení 1 ml objemu byly filtry přeneseny na skleněnou desku a zachycené buňky byly vystaveny účinku proudu teplého vzduchu o konstantní teplotě 60 °C po dobu 70 sekund. Permeabilizované buňky byly z povrchu filtrů smyty 0,05 M fosfátovým pufrem, který měl pH 7,0.Permeabilization of immobilized cells is a prerequisite for utilizing its intracellular enzymatic activity. For this purpose the cells were permeabilized as follows: 0.1 ml of the cell suspension was applied to the center of the membrane filter, each subsequent application being carried out after the medium had been completely aspirated. After application of 1 ml volume, the filters were transferred to a glass plate and the captured cells were exposed to a stream of warm air at a constant temperature of 60 ° C for 70 seconds. The permeabilized cells were washed off the surface of the filters with 0.05 M phosphate buffer having a pH of 7.0.

Příklad 2Example 2

Příprava zakotvených permeabilizovaných buněk byla provedena způsobem popsaným V příkladu 1 s tím rozdílem, že bylo použito buněk permeabilizovaných dimetylsulfoxidem. Suspenze buněk v 0,05 M fosfátovém pufru majícím pH 7,0 byla vystavena účinku'*40 % dime tyl sulfoxidu při teplotě 20 °C. Po 30minutovém kontaktu byly buňky promyty, resuapendovány v uvedeném pufru a imobilizovény.Preparation of the anchored permeabilized cells was carried out as described in Example 1, except that dimethylsulfoxide permeabilized cells were used. A suspension of cells in 0.05 M phosphate buffer having a pH of 7.0 was exposed to 40% dimethyl sulfoxide at 20 ° C. After 30 minutes of contact, the cells were washed, resuspended in the buffer and immobilized.

Přiklad 3Example 3

Příprava imobilizovaných permeabilizovaných buněk byla provedena způsobem popsaným v přikladu 1 s tlm rozdílem, že bylo použito jako nosiče polyetyléntereřtalát o měrném povrchu 80 m²/g a průměrné velikosti částic 0,25 mm a buněk Torulopsis casei. Permeabilizace buněk byla provedena účinkem toluenu a etanolu. K 5 ml vytemperované suspenze buněk při 37 °C bylo přidáno 0,5 ml směsi toluenu a etanolu (1:3). Po 7minutovém míchání byly buňky promyty použitým pufrem a imobilizovány.The preparation of immobilized permeabilized cells was performed as described in Example 1 except that polyethylene terephthalate having a specific surface area of 80 m ² / g and an average particle size of 0.25 mm and Torulopsis casei cells were used as carriers. Cell permeabilization was performed with toluene and ethanol. To 5 ml of the tempered cell suspension at 37 ° C was added 0.5 ml of a 1: 3 mixture of toluene and ethanol. After stirring for 7 minutes, the cells were washed with the buffer used and immobilized.

Přiklad 4Example 4

Postupem uvedeným v příkladu 1 byly imobilizovány nepermeabilizované buňky (Paboepora fragilis) na alkalickém poly-6-kaprolaktamovám sorbentu o povrchu 12 m²/g a velikosti částic 0,5 mm. Takto imobilizované buňky byly dodatečně permeabilizovány postupem uvedeným v příkladu 2 s tlm rozdílem, že bylo použito suspenze nosiče s navázanými buňkami. Suspenze imobilizovaných buněk byla převedena do 1% roztoku glutaraldehydu, jehož sekundárním účinkem bylo dosaženo po 30 minutách zesítění buněk.Non-permeabilized cells (Paboepora fragilis) were immobilized on an alkaline poly-6-caprolactam sorbent having a surface area of 12 m ² / g and a particle size of 0.5 mm as described in Example 1. The cells thus immobilized were additionally permeabilized as described in Example 2, except that a cell suspension of the bound cell was used. The immobilized cell suspension was transferred to a 1% glutaraldehyde solution, whose secondary effect was achieved after 30 minutes of cell cross-linking.

Příklad 5Example 5

Postupem uvedeným v příkladu 1 byly imobilizovány buňky Saceharomyces lactle na polykondenzačním sorbentu melaminu s formaldehydem o měrném povrchu 200 m²/g a velikosti částic 0,45 mm. Permeabilizace buněk byla provedena ve směsi toluenu a etanolu 1:3 po dobu 7 minut Potom buňky byly promyty použitým pufrem a imobilizovány popsaným postupem.As described in Example 1, Saceharomyces lactle cells were immobilized on a polycondensation sorbent of melamine with formaldehyde having a specific surface area of 200 m ² / g and a particle size of 0.45 mm. The cells were permeabilized in toluene / ethanol 1: 3 for 7 minutes. The cells were washed with the buffer used and immobilized as described.

Přiklad 6Example 6

K imobilizaci buněk (Candida pseudotropicalis) byl použit sorbent na bázi blokového kopolyméru polyetylénoxid-kaprolaktam o celkovém měrném povrchu 8 m /g a průměrné velikosti částic 1 mm. Postup imobilizace je popsán u příkladu 1 β tím rozdílem, že permeabilizace buněk byla provedena dimetylsulfoxidem tímto postupem: suspenze buněk v 0,05 M fosfátovém pufru, který má pH 7,0 byla vystavena účinku 40 % dimetylsulfoxidu při teplotě 20 °C. Po 30minutovém působení byly buňky promyty, resuspendovány v uvedeném pufru a použity k imobilizaci.For the immobilization of cells (Candida pseudotropicalis) a polyethylene oxide-caprolactam block copolymer sorbent with a total specific surface area of 8 m / g and an average particle size of 1 mm was used. The immobilization procedure is described in Example 1 β except that cell permeabilization was performed with dimethylsulfoxide as follows: a suspension of cells in 0.05 M phosphate buffer having a pH of 7.0 was exposed to 40% dimethylsulfoxide at 20 ° C. After treatment for 30 minutes, the cells were washed, resuspended in the buffer and used for immobilization.

Claims

CLAIMS 1. Immobilized yeast cells bound to a carrier, characterized in that the cells are bound to a carrier comprising a polymeric substance, for example based on polyethylene terephthalate, polycaprolactam, polyphenylene oxide, polyethylene oxide-polycaprolactam block copolymer, melamine-formaldehyde resin structure with microporous surface. up to 700 m ² / g.

2. A process for the preparation of immobilized yeast cells according to claim 1, characterized in that the crosslinking agent, for example glutaraldehyde, is first sorbed onto the polymeric carrier and then reacted with the cells.

3. The method of claim 2, wherein glutaraldehyde is adsorbed to the polymeric carrier and whole yeast cells are bound to the resulting composition and re-crosslinked with glutaraldehyde.

4. The method according to items 2 and 3, characterized in that: The method according to claim 1, wherein the immobilization of the cells is carried out at a temperature of 4 to 30 ° C and a pH of the medium of from 4 to 7.5 for 1 to 48 hours.

5. A method according to claim 2, wherein the yeast cells are permeabilized.