DK166354B

DK166354B - N-substituerede neuraminsyrederivater og fremgangsmaader til fremstilling af samme samt praeparat omfattende disse til regulering af immunsystemets forsvar

Info

Publication number: DK166354B
Application number: DK195685A
Authority: DK
Inventors: Shohei Shibayama; Shoji Yoshimura; Masayoshi Ito; Yoshiyasu Shitori; Tomoya Ogawa
Original assignee: Kanto Ishi Pharma Co Ltd
Priority date: 1984-05-01
Filing date: 1985-05-01
Publication date: 1993-04-13
Also published as: EP0160925B1; JPH0570635B2; EP0160925A2; FI79542C; KR880001233B1; FI851661L; KR850008348A; DE3578687D1; DK166354C; US4663443A; FI851661A0; ES8606374A1; HUT38623A; AU550918B2; HU194261B; EP0160925A3; DK195685D0; FI79542B; ATE54666T1; ZA853197B

Description

i

DK 166354 B

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte N-substituerede neuraminsyrederivater, fremgangsmåder til fremstilling af disse samt et præparat omfattende disse til regulering af immunsystemets forsvar.

5 Hidtil har det inden for fagområdet været kendt, at N-substitu erede neuraminsyrer forekommer i mange dyr og på celleoverfladen af adskillige bakterier som et sialinsyrekompleks, såsom i glycoprotein, glycol ipid, oligosaccharid eller polysaccharid.

N-substituerede neuraminsyrer er for nylig blevet vigtige stof-jO fer inden for medicinen og farmacien, hvad angår nervefunktion, cancer, inflammation, immunitet, viral infektion, differentiation, hormonreceptorer etc. De N-substituerede neuraminsyrers rolle i sialinsyrekomplekset er dog endnu ikke blevet erkendt.

N-Substituerede neuraminsyrer er endvidere blevet studeret af 25 mange organiske kemikere, og der er derfor blevet frembragt mange slags simple neuraminsyrederivater. Dog er der endnu ikke opnået noget derivat med nogen fremragende immunologisk aktivitet.

På den ene side er menneskets gennemsnitlige levetid blevet forøget som følge af forbedringer inden for lægebehandling af ond-2o artede svulster i hæmatopoietiske organer, af mange cancerformer og af collagene lidelser. På den anden side fremkommer der ved den store forøgelse af brugen af medicin, f.eks. medicin som adrenalt kortikohormon eller immunosuppressionsmidler, et antal uønskede bivirkninger sammen med nedsættelse og tab af immunologisk funktion.

25 Under disse omstændigheder har opfinderne af den foreliggende opfindelse vist si al i nsyren, som er en fast biologisk bestanddel, særlig opmærksomhed i deres fortsatte forskning i immunitetsregulerende stoffer med få bivirkninger, som følge af dens kemiske modifikations- og reguleringsvirkninger ved immunologisk overvågning.

30 Som et resultat af denne forskning er det lykkedes opfinderne at frembringe de hidtil ukendte forbindelser ifølge den foreliggende opfindelse, der har immunoregulerende virkning, ved at suppres-sionsT-celler aktiveres, og ved at produktion af immunoglobulin fra B-celler hæmmes.

__ Formålet med den foreliggende opfindelse er tilvejebringelse af

w O

hidtil ukendte forbindelser med fordelagtig immunologisk aktivitet, især med immunoregulerende virkning.

Dette formål opnås med de hidtil ukendte N-substituerede neuraminsyrederivater ifølge den foreliggende opfindelse, hvilke

DK 166354B

2 derivater har formlen (I): HO f 5 och3 // n — COOCH- W\ / m Y-NH /

H OH

10 H

o hvor Y betegner ch2oc — A,hvor A er en aminosyrerest med følgende formel: 15 * - NH - CHCO-R2 20 2 hvor er udvalgt blandt 25 -ch3/ —chch3, -ch2chch3/

i I

ch3 · CH3 30 -CH2CH2SCH3, ~ch2c6h5' ~CH2OH, ~chch3 , -ch2sh,

OH

35

DK 166354B

3 eller Y betegner A', hvor A' er en aminosyrerest med følgende formel * H0N - CHCO- 5 2 , R4 4 hvor R er udvalgt blandt -H, -CH3, -CHCHo, -CH2CHCH3,

I I

10 CH3 ch3 -CH2CH2SCH3, -CH2C6H5, ~CH2OH, -chch3, -ch2sh.

15 OH

Vedrørende den steriske konfiguration af asymetriske carbonato-mer indiceret ved et asterix (*), såsom som i * 20 - NH - CH - R2 i formler i beskrivelsen, kan forbindelser med det asymmetriske 25 carbonatom omfatte D-forbi ndel ser, L-forbi ndel ser og racemi ske blandinger.

En forbindelse ifølge den foreliggende opfindelse, hvori Y betegner 0

30 ^Q^-CHgOC-A

hvor A har den ovenfor anførte betydning, kan fremstilles ved en 35 fremgangsmåde, der er ejendommelig ved, at et N-benzyl-oxycarbonylaminosyrederivat med formlen: 5 4

DK 166354 B

O

(py CH2OC - a - oh (III) hvor A har den ovenfor anførte betydning, omsættes med et neuramin-syrederivat med formlen: HO H OCH- 10 «I I 3 /V (Π)

Hb/H ° / C00CH3

"2 I ώ'"'-/H

Η H

15

Af fremgangsmåder til udførelse af koblingsreaktionen mellem ovennævnte neuraminsyre med formlen (II) og N-benzyloxycarbonyl-aminosyrederivatet med formlen (III) findes der sådanne, ved hvilke 2Q forbindelserne forinden gøres til aktive derivater af disse, hvorpå koblingsreaktionen udføres. Det vil sige, der findes fremgangsmåder til N-terminal aktivering og til C-termi nal akti vering (ved en fremgangsmåde anvendes syrechlorid, ved en anden anvendes azid, ved en tredie anvendes blandede syreanhydrider og ved en fjerde anvendes 25 aktiv ester).

Som et konkret eksempel på aktivering, findes der en fremgangsmåde, ved hvilken dicyclohexylcarbodiimid (i det følgende omtalt som DCC) tilsættes en blanding af forbindelserne (II) og (III). Solventer som methylenchlorid, acetonitril, dimethyl formamid 3Q (i det foreliggende omtalt som DMF), pyridin og tetrahydrofuran kan anvendes. Som opløsningsmiddel ved den reaktion, hvori ovennævnte DCC benyttes, anvendes fortrinsvis vandfri pyridin og DMF.

Som en generel metode til begrænsning af dannelsen af racemiske forbindelser ved koblingsreaktionen, findes der en metode, der er 3g kendt som Eintopf-metoden, ved hvilken DCC og en N-hydroxyforbindel se tilsættes som reagens til aktivering af carboxylgruppen. Eksempler på N-hydroxy-forbindel ser omfatter N-hydroxysuccininimid (i det følgende som HOSu), 1-hydroxybenzotriazol (i det følgende omtalt som HOBt), 3-hydroxy-4-oxo-3,4-dihydro-l,2,3-benzotriazin (i 5

DK 166354 B

det følgende omtalt som HOOBt) og N-hydroxy-5-norbornen-2,3-di-carboximid (i det følgende omtalt som HONB). Tetrahydrofuran eller dimethyl formamid kan anvendes som opløsningsmiddel ved reaktionen.

Som kombination af ovennævnte N-hydroxy-forbindelse og solvent 5 anvendes HONB og dimethyl formamid fortrinsvis sammen.

En fremgangsmåde til fremstilling af hydrochloridadditionssaltet af forbindelsen (II) er beskrevet i J.A.C.S., 99, 8273 (1977).

Opfindelsen angår’ endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af en forbindelse ifølge opfindelsen, hvor Y betegner ^N-CHCO, hvor 10 !4

Ir R^ har den ovenfor anførte betydning, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at en forbindelse udvalgt fra gruppen bestående af N-substituerede neuraminsyrederivater med formlen: 15 r1° a L 0CH3 20 /7Λ ° 'Vx / “”"3 \0/~ CH20C - a - NH /

Η I

H

25 n hvor R og A har den ovenfor anførte betydning, underkastes katalytisk reduktion.

Den katalytiske reduktion kan fortrinsvis udføres ved dekomponer i ng ved hydrogenering under anvendelse af Pd/c og methanol som opløsningsmiddel. Forbindelsen kan endvidere let opnås som hydro-chloridsaltet af denne ved tilsætning af ammoniumchlorid til reaktionsblandingen.

Opfindelsen angår desuden et præparat til regulering af immunsystemets forsvar, hvilket præparat er ejendommeligt ved, at det omfatter et N-substitueret neuraminsyrederivat ifølge opfindelsen.

Ifølge den foreliggende opfindelse har forbindelserne med formlen (I) en fortrinlig aktivitet, der er i stand til at regulere styrken af immunsystemet. Aktivitet, der er i stand til at regulere styrken af immunsystemet, kan konstateres ved følgende metode.

DK 166354B

6

Modvirkning af aktivering af miltlvmfocvter fra mus med Con A:

Da en T-celle aktiveres ikke-specifikt af Con A, blev der tilsat én af de N-substituerede neurarainsyrederivater ifølge den foreliggende opfindelse til reaktionsblandingen, hvorpå virkningen 5 heraf blev undersøgt. Det vil sige Con A og en forbindelse med formlen (I), f.eks. en forbindelse fremstillet ifølge et af de nedenfor anførte eksempler, blev respektivt tilsat miltlymfocyterne (SPC), som var udtaget fra BALB/C mus, og blandingen blev dyrket i ca. 20 timer på mi kroplade med 5% CO2 tilsat blandingen ved 37°C.

1q Thymidin mærket med tritium og SPC blev opsamlet efter yderligere dyrkning af blandingen i ca. 10 timer; Mængden af 3H-thymidin optaget i SPC blev bestemt ved anvendelse af en scintillationstæl-ler.

3

Fremskyndelsen og forøgelsen af H-thymidinoptagelsen blev observeret i relation til forbindelser med formlen (I), og en forbedring af modvirkningen af aktiveringen af T-celler med Con A blev også observeret.

Nedenfor er anført forsøgsresultater:

,OH

20 / y OH

OCH3

O * H0W^0^C00CH

V CH2OCN-CHCONH 3

H R2 OH

25 3 H-thymidinoptagelsesforhold i forhold til kontrol (%) R2 ΙΟ"4 ΙΟ"5 10"6 (M) 30 -CH3 (L) 90 103 77 -CH3 (D) 95 91 79 -CH2CH(CH3)2 87 100 66 -CH2C6H5 74 92 83 35 -CH20H 79 94 107 -CH(CH3)2 84 108 73 -CH2CH2SCH3 84 87 84

Kontrol a) 3 5 21

DK 166354B

7 a) Mitomycin C blev benyttet som kontrol.

Ud fra ovennævnte resultater observeredes der en forøgelse og 3 forbedring af H-thymidinoptagelse og en forbedring af modvirkningen 5 af aktivering af T-celler med ConA.

OB

mjt jp 10 h2n - C00CH3

R4 OH

3 H-thymidinoptagelsesforhold i forhold til kontrol (%) 15 R4 ΙΟ-4 ΙΟ"5 10"6 (M) -H 70 116 65 -CH3 68 110 59 2Q -CH2CH(CH3)2 73 102 52 -CH2C6H5 62 93 53 -CH20H 65 106 79 -CH(CH3)2 77 126 49 -CH2CH2SCH3 80 97 76

Kontrol a) 3 3 19 a) Mitomycin C blev benyttet som kontrol.

Ud fra ovennævnte resultater observeredes der en forøgelse og 3 20 forbedring af H-thymidinoptagelse og en forbedring af modvirkningen af aktivering af T-celler med ConA.

Modvirkning af muse-mi 1 tivmfocvtters produktion af immunoglobulin:

Som i det foregående eksperiment vedrørende aktiveringen af T-celler blev endvidere den af de N-substituerede neuraminsyre-derivater ifølge den foreliggede opfindelse frembragte modvirkning af produktionen af immunoglobulin undersøgt ved måling af antallet af plaque-dannende celler (PFC).

Først blev røde blodlegemer fra får og én af forbindelserne med

DK 166354B

8 formlerne (I), f.eks. en forbindelse fremstillet ifølge et af de nedenfor anførte eksempler, sat til SPC, og blandingen blev dyrket ved 37°C i 5 dage. SRBC og komplement blev tilsat igen til de således opnåede, sensibiliserede SPC. Antallet af PFC blev talt, 5 efter at blandingen var blevet dyrket i et Cunninghamkammer ved 37°C i mellem 3 og 12 timer.

Eftersom der blev iagttaget et fald i antallet af PFC, og cellelevedygtigheden var den samme som i en kontrol, blev det fastslået, at undertrykkelsen af produktionen af immunoglobulin var jO blevet forstærket.

Forbindelserne ifølge den foreliggende opfindelse udviste en fortrinlig aktivitet ved de to typer undersøgelser, der er beskrevet ovenfor. I overensstemmelse med dette faktum, blev det antaget, at produktionen af immunoglobulin blev hæmmet ved aktivering af sup-j5 pressions-T:celler.

Indtil nu er nedsættelse af funktionen af suppressor-T-celler blevet observeret ved autoimmunsygdomme, såsom collagene lidelser.

De N-substituerede neuraminsyrederivater ifølge den foreliggende opfindelse med aktiveringsvirkning på suppressor-T-celler forventes 20 følgelig at være effektive ved kliniske anvendelser, som et middel til at regulere immunsystemets styrke.

Opfindelsen vil nu blive illustreret med følgende eksempler.

Eksempel 1 25 Fremstilling af methvl-fmethvl-5-fN-benzvloxocarbonvlolvcvl aminol-3.5-dedeoxv-fl-D-alvcero-D-aalacto-2-nonuloDvranosidlonat.

3,0 g (0,01 mol) Methyl-(methyl-5-amino-3,5-dideoxy-jS-D-glyce-ro-D-galacto-2-nonulopyranosid)onat (forbindelse (II)), 2,13 g (0,01 mol) N-CBZ-glycin (forbindelse (III)) og 3,1 g (0,015 mol) DCC blev 30 opløst i 350 ml vandfri pyridin, hvorpå blandingen blev omrørt i 48 timer ved stuetemperatur. Den resulterende suspension blev filtreret, og solventen blev afdestilieret til tørhed. Derefter blev den underkastet silicagel-søjlekromatografi og elueret med chloroform/ methanol (5:1), hvorved der blev opnået 3,92 g af et farveløst, oc amorft stof (udbytte: 80%).

<5 u

Fysiske egenskaber af det farveløse, amorfe stof:

Dekomponer!ngspunkt 190 - 193°C

13

El ementaranal y se C2 jH^NgO11 * ioH2° M.V. = 509,89

DK 166354 B

g

Beregnet C: 49,47 H: 6,44 N: 5,49

Fundet C: 49,48 H:6,63 N: 5,37 IR 7 max cml 3,350 ('0H’ 'NH)j 1)740 (-COOMe), 5 1,700 (-NH C-0-), 1,655 (-C-C-NH-)

" II

o o 10 1h-NMR90HHz c*®0 - d6 + ¥' THS> 1,58 (IH, dd, J = 12,2Hz, J = 10,8Hz, 3-Hax) 2,27 (IH, dd, J = 12,2Hz, J = 4,5Hz, 3-Heq) 3,19 (3H, S, 2-OMe) 15 3,77 (3H, S, -COOMe)

5,08 (2H, S, FORMEL

7,39 (5H, S, phenyl-H) 20 20"C o [a]jj L - 29,6° (Ol, MeOH)

Eksempel 2

Fremstilling af methvl-fmethvl-5-(N-benzvloxvcarbonvlalvcvl oc aminol-3.5-dideoxv-8-D-alvcero-D-aalacto-2-nonulopvranosidlonat.

uv

Eksempel 2 blev udført ved samme procedure som den i eksempel 1 angivne, bortset fra, at der blev opløst 1,15 g (3,9 mmol) af forbindelse (II), 0,82 g (3,9 mmol) N-CBZ-glycin og 1,21 g (5,85 mmol) DCC i 35 ml vandfri DMF, hvorved der blev opnået 1,32 g af produktet (udbytte: 70%).

O v

Fysiske egenskaber af produktet:

Dekomponeringspunkt: 190-193°C.

IRY CKT1 3,350 (**OH,-NH) , 1,740 (-COOMe), 35 o

II

1,700 (-NH-C-0—), 1,655 (-C-C-NH-)

II

O

10

DK 166354 B

1h-NMR60MHz (DMS0 “ d6 + CDCe.3 + d2o, TMS) 1,59 (IH, ra, 3-Hax) g 2,34 (IH, m, 3-Heq) 3,24 (3H, S, 2-OMe) 3*77 (3H, S, -COOMe} 5,08 (2H, S, (C^>-Cii?-0) 7,35 (5H, S, phenyl-H) 10

Eksempel 3

Fremstilling af methvl-(methyl-5-(N-benzv1oxvcarbonvlalvcvl aminol;3.5-dideoxv-8-D-qlvcero-D-qalacto-2-nonulopvranosidlonat.

1,0 g (3,39 mmol) Af forbindelse (II) og 0,71 g (3,39 mmol) af 15 forbindelse (III) blev opløst i 30 ml DMF-anhydrid, hvorpå 0,31 ml N-ethylmorpholin og 0,79 g (4,41 mmol) Η0ΝΒ (N-hydroxy-5-norbo-nen-2,3-dicarboximid) blev tilsat. Derefter blev 0,91 g (4,41 mmol) DCC tilsat, og den således opnåede blanding blev omrørt i 48 timer ved stuetemperatur og efter afkøling til en temperatur på 0°C omrørt 20 i 3 timer. Den resulterende suspension blev filtreret, og solventen blev afdestilieret til tørhed. Derefter blev den underkastet sil i -cagel-søjlekromatografi og elueret med chloroform/methanol (5:1), hvorved der blev opnået 1,35 g af et farveløst, amorft stof (udbytte: 82%).

25

Fysiske egenskaber af stoffet:

Dekomponeringspunkt: 190-193°C

Elementaranalyse: C21^30N2°11 Μ·ν· = 486>47

Beregnet: C: 51,85H: 6,22 N: 5,76 30 Fundet: C: 51,80H: 6,21 N: 5,64 KR Γ * IRy max cm-1 3-350 1-740 (-COOMe), 0 1.700 (-NH-C-0-), 1.655 (-C-C-NH-) 35 0 1h-NMrPP^Hz (DMSO - d6, TMS) 1,52 (IH, dd, J = 12,2Hz, J = 10.8Hz, 3-Hax) 2,19 (IH, dd, J = 12,2Hz, J = 4,5Hz, 3-Heq) 3,18 (3H, S, 2-OMe) 5

DK 166354B

11 3,71 {3H, S, -COOMe) 5,04 (2H, S, (C^-CH2-°-) 7,35 (SH, S, phenyl-H)

Eksempel 4

Fremstilling af methvl-fmethvl-5-fN-benzvloxvcarbonvl-L-ala nvlamino)-3.5-dideoxv-fl-D-gvcero-D-aalacto-2-nonulopvranosidlonat.

10 Eksempel 4 blev udført ved samme procedure som den i eksempel 1 angivne, bortset fra, at der blev opløst 1,0 g (3,39 mmol) af forbindelse II, 0,76 g (3,9 mmol) N-CBZ-L-alanin og 0,84 g DCC i 100 ml vandfri pyridin, hvorved der blev opnået 1,18 g af et farveløst, amorft stof (udbytte: 70%).

15

Fysiske egenskaber af stoffet:

Smeltepunkt: 74-77°C Dekomponeringspunkt: 193-195°C

Elementaranalyse: *72^32**2®11 M.V.· 500,51

Beregnet: C: 52,79 H: 6,44 N: 5,60 20 Fundet: C: 52,77 H: 6,42 N: 5,58 IR Y max cra 1 3 -350 (-OH,-NH), 1-740 (-COOMe), 1-700 (-NHC-0-), 1.660 (-C-C-NH-)

I II

o o 25 1h“NMR9omh2 (dmso “ dg + CDC£3 + D20, TMS) 1,40 (3H, d, J = 7,07 Hz _ ch3) 30 1,68 (IH, dd, J = 13,5 Hzf J = 10,8 Hz, 3-Hax) 2,38 (IH, dd, J = 13,5 Hz, J « 4,9 Hz, 3-Heq) 3,26 (3H, S, 2-OCH3) 35 3,73 (3H, S, -COOCH3) 5.05 (2H, S, 7.29 (5H, S, phenyl-H) «il™ - 29.9° (C - if HeOH) 12

DK 166354 B

Eksempel 5

Fremstilling af methvl-(methvl-5-(N-benzvloxvcarbonvl-L-alanvl amino)-3.5-dideoxv-fl-D-qlvcero-D-qal acto-2-nonulopvranosidlonat.

Eksempel 5 blev udført ved samme procedure som den i eksempel 3 5 angivne, bortset fra, at der blev anvendt 0,76 g (3,39 mmol) N-CBZ-L-alanin i stedet for N-CBZ-glycin, hvorved der blev opnået 1,40 g produkt (udbytte:83%).

Fysiske egenskaber af produktet:

1Q Dekomponeringspunkt: 198-201°C

Eksempel 6

Fremstilling af methvl-(methvl-5-fN-benzvloxvcarbonvl-L-leu cvlaminol-3.5-dideoxv-6-D-qlvcero-D-qalacto-2-nonulopvranosidlonat.

15 Eksempel 6 blev udført med samme procedure som den i eksempel 4 angivne, bortset fra, at der blev anvendt 0,9 g (3,39 mmol) N-CBZ-L-leucin i stedet for N-CBZ-L-alanin, og at chloroform/ methanol (10:1) blev anvendt som solvent ved elueringen, hvorved der blev opnået 1,38 g produkt (udbytte: 75%).

20

Fysiske egenskaber af produktet:

Smeltepunkt: 76-81°C Dekomponeringspunkt: 156-158°C

Elementaranalyse: C25H38N2°H*5H20 M*V* = 546’20

Beregnet: C: 54,98 H: 7,09 N: 5,13 25 Fundet: . C: 54,97 H: 6,95 N: 5,05 IR γ cnf-1 3,375 (-OH,—NH—) , 1.740 (-COOMe) ,

1 luaX

0 1.700 (-NH-O0-) , 1.655 (-C-C-NH)

30 O

Ϊ-H-NMrIP^ (DMSO - dg + CDC23 +D20 TMS) 35 ch3 0,94 (6H, d, J = 4,9Hz/ -CH ) ch3

DK 166354B

13 2,37 (IH, dd, J = 13,5Hz, J = 5,4Hz, 3-Heq) 3,27 (3H, S, 2-OMe) 5 3,78 (3H, S, -COOCH3) 5,09 (2H, S, {5)-222-0-) 7,34 (5H, S, phenyl-H) 10 C 3 2°°c _29i3o (Ol, MeOH) jg Ved en yderligere fremgangsmåde blev den samme forbindelse, som er angivet i eksempel 6, fremstillet ved samme procedure, som den i eksempel 5 beskrevne, bortset fra, at 5,39 g N-CBZ-L-leucin blev anvendt i stedet for N-CBZ-L-alanin, og at der blev anvendt 6,0 g af forbindelsen II, 1,86 ml N-ethylmorpholin og 4,74 g HONB. Der blev 2Q herved opnået 7,7 g produkt (udbytte 70%), og de fysiske egenskaber af dette produkt var de samme som de ovenfor anførte.

Eksempel 7

Fremstilling af methv1-(methvl-5-N-(benzv1oxvcarbonvl-L-Dhenvl-25 alanvlami nol-3.5-dideoxv-fl-D-alvcero-D-aalacto-2-nonulopvranosidl- onat.

Eksempel 7 blev udført med samme procedure som den i eksempel 4 beskrevne, bortset fra, at der blev anvendt 1,015 g (3,39 mmol) N-CBZ-L-phenylalanin i stedet for N-CBZ-L-alanin, hvorved der blev 20 opnået 1,52 g produkt (udbytte: 78%).

Fysiske egenskaber af produktet:

Smeltepunkt: 75-80°C Dekomponeringspunkt: 168-170°C

Elementaranalyse: C28H36N2°11M,V· = 576,60 35 Beregnet: C: 58,33 H: 6,29 N: 4,86

Fundet: C: 58,32 H: 6,17 N: 4,83 .

DK 166354B

14 KBr ! 3.375 (-OH.-NH-) , 1-735 (-COOMe) , max 1.700 (-NH-C-0-), 1,655 (-C-C-NB) i 1' o 0 5 1h"NMR90MH2 <DMS0 - d6 + D20, TMS) 1,55 (IH, dd, J = 12,6Hz, J - 10,8Hz, 3-Hax) 2,22 (IH, dd, J - 12,6Hz, J = 4,05Hz, 3-Heq) 1Q 3,21 (3H, S, 2-OCH3) 3,74 (3Hr S, -COOCH3) 4,96 (2H, S, /0VCH7-O-) O 1 £°°C -22r8° (C=l, MeOH)

Ved en yderligere fremgangsmåde blev den samme forbindelse, som den i eksempel 7 angivne, fremstillet ved samme procedure som den i eksempel 5 beskrevne bortset fra, at 6,08 g N-CBZ-L-phenylalanin blev anvendt i stedet for N-CBZ-L-alanin, og at der blev anvendt 6,0 20 g af forbindelsen II,* 1,86 ml N-ethylmorpholin og 4,74 g HONB. Der blev herved opnået 8,4 g produkt (udbytte: 72%), og de fysiske egenskaber af produktet var de samme som de ovenfor anførte.

Eksempel 8 25 Fremstilling af methvl-fmethvl-5-fN-benzvloxvcarbonvl-servl amino)-3.5-dideoxv-fl-D-g1vcero-D-qalacto-2-nonuloDvranosidlonat.

Eksempel 8 blev udført med samme procedure som den i eksempel 4 beskrevne, bortset fra at 0,81 g (3,39 mmol) N-CBZ-L-serin blev anvendt i stedet for N-CBZ-L-alanin, og der blev herved opnået 1,33 g produkt (udbytte: 76%).

Fysiske egenskaber af produktet:

Smeltepunkt: 71-76°C Dekomponeringspunkt: 147-151°C

Elementaranalyse: 622^32^2^12^* = 516,51 35 Beregnet: C: 51,16 H: 6,24 N: 5,42

Fundet: C: 51,13 H: 6,17 N: 5,46 15

DK 166354 B

KB ir IRY max cm-l 3.375 (-0H, -NH) , 1.740 (-COOMe), 1.700 C-NH-C-O—), 1.655 (-C-C-NH-) 8 li

O O

5 iH-NMRPP^ (DMSO - d6 + D20, TMS) 1,51 (IH, dd, J = 12,6Hz, J = 11,25Hz, 3-Hax) 2,21 (IH, dd, J = 12,6Hz, J = 5,0Hz, 3-Heq) 3,17 (3H, S, 2-OCH3) 3,72 (3H, S, -COOCH3) 5t04 (2H, S, (5)-222-0-) 7,37 (5H, S, phenyl-H) C -22,63° (C=l, MeOH) 2Q Ved en yderligere fremgangsmåde blev den samme forbindelse, som den i eksempel 8 angivne fremstillet ved samme procedure, som den i eksempel 5 beskrevne, bortset fra, at 4,86 g N-CBZ-L-serin blev anvendt i stedet for N-CBZ-L-alanin, og at der blev anvendt 6,0 g af forbindelse II, 2,42 ml N-ethylmorpholin og 4,73 g HONB. Der blev 25 herved opnået 7,4 g produkt (udbytte: 70%), og de fysiske egenskaber af produktet var de samme som de ovenfor anførte.

Eksempel 9

Fremstilling af methvl-(methv1-5-(N-benzvloxvcarbonv1-L-valvl gø aminol-3.5-dideoxv-g-D-q1vcero-D-ga1acto-2-nonulopvranosidl onat.

Eksempel 9 blev udført 'med samme procedure som den i eksempel 4 beskrevne, bortset fra, at der blev anvendt 0,85 g (3,39 mmol) N-CBZ-L-valin i stedet for N-CBZ-L-alanin, og at chloroform/ methanol (10:1) blev anvendt som solvent til elueringen; der blev herved __ opnået 1,43 g produkt (udbytte: 80%).

OD

Fysiske egenskaber af produktet:

Smeltepunkt: 78-83°C Dekomponeringspunkt: 153-154°C

Elementaranalyse: C24H36N20H*5H20 M,V* = 535»77

DK 166354B

16

Beregnet: C: 53,80 H: 6,92 N: 5,23

Fundet: C: 53,83 H: 6,81 N: 5,18 IRY cnf-1 3-375 (-OH,-NH), 1.730 (-COOCH3) ,

g lu 3.X

0 1-700 (-NH-C-0-), 1.650 (-OC-NH}

O

10 1h-nmr|PJH2 (DMSO - d6 + d20, TMS) CS3 0,87; 0,90 (6H, d, J = 6,6Hz, -CH^ ) 15 \ CH3 1,55 (IH, dd, J = 12,7Hz, J = 10,9Hz, 3-Hax) CHo / 1,73 - 2.10 (IH, m, -CH ^ ) 20 7 — \ ch3 2,23 (IH, dd, J = 12,7Hz, J « 4,4Hz, 3-Heq) 3.19 (3H, S, 2-OCH3) 25 3,74 (3H, S, -COOCH3) CH3 3.19 - 3,91 (8H, m, sialy-H,^CH-CH^ )

Xch3 30 5,05 (2H, S, C6H5CH2O-) 7,37 (5H, S, C6H5-)

_ 20°C

C^1D -26,2° (C=l, MeOH) 35

Ved en yderligere fremgangsmåde blev den samme forbindelse som den i eksempel 9 angivne, fremstillet ved samme procedure som den i eksempel 5 beskrevne, bortset fra at 5,62 g N-CBZ-L-valin blev anvendt i stedet for N-CBZ-L-alanin, og at der blev anvendt 6,0 g af 17

DK 166354 B

forbindelsen II, 2,35 ml N-ethylmorpholin og 4,73 g HONB. Der blev herved opnået 7,84 g produkt (udbytte: 73%), og de fysiske egenskaber af produktet var de samme som de ovenfor anførte.

5 Eksempel 10

Fremstilling af methv1-(methvl-5-(N-benzvloxvcarbonvl-L-me-thionvlamino)-3.5-dideoxv-fl-D-q1vcero-D-ga1 acto-2-nonuloDvrano-sidlonat.

Eksempel 10 blev udført med samme procedure som den i eksempel jq 4 angivne, bortset fra, at der blev anvendt 0,96 g (3,39 mmol) N-CBZ-L-methionin i stedet for N-CBZ-L-alanin, og at chloroform/me-thanol (10:1) blev anvendt til elueringen; der blev herved opnået 1,48 g produkt (udbytte: 78%).

Fysiske egenskaber af produktet:

Smeltepunkt: 67-72°C Dekomponeringspunkt: 170-177°C

Elementaranalyse: ^24^36^11S = ®60,63

Beregnet: C: 51,42 H: 6,47 N: 5,00

Fundet: C: 51,28 H: 6,37 N: 4,97 20 IR cm“l 3.350 (-ΟΗ,-ΝΗ) , 1.730 (-COOCH3), 0 1.700 (-NH-C-0-), 1.650 (-C-C-NH) « 1h~NMR90MHz (DMS0 “ d6 + D20, TMS) 0 25 .

1,56 (IH, dd, J = 12,7Hz, J = 11,0Hz, 3-Hax) 1,71 - 2.00 (2H, m, CHqSCH?CH?-) 2,04 (3H, S, CH3-s-) 30 2'25 dH' dd* J * 12,7Hz, J = 4;0Hz, 3-Heq) 2,35 - 2.62 (2H, m, CH3SCH2CH2~) 3,19 (3H, S, 2-OCH3) 3,75 (3H, S, -COOCH3) 35 3/19 - 3.85 (8H, m, sialyl-H, CH3SCH2CH2CH\ ) 5,05 (2H, S, CgHqCH2Q-i 7,37 (SH, S, C6H5-)

20°C

C^]D -27,5° (C=l, MeOH)

DK 166354B

18

Ved en yderligere fremgangsmåde blev den samme forbindelse, som den i eksempel 10 angivne, fremstillet ved samme procedure, som den i eksempel 5 beskrevne, bortset fra, at 5,76 g N-CBZ-L-methionin blev anvendt i stedet for N-CBZ-L-alanin, og at der blev anvendt 6,0 5 g af forbindelsen II, 2,35 ml N-ethylmorpholin og 4,73 g HONB. Der blev herved opnået 8,1 g produkt (udbytte: 71%), og de fysiske egenskaber af produktet var de samme som de ovenfor anførte.

Eksempel 11 1q Fremstilling af methvl-(methvl-5-(qlvcvlaminol-3.5-dideoxv-g- D-qlvcero-D-galacto-2-nonuloDvranosidlonat.

300 mg (1,34 mmol) Methyl-(methyl-5-(N-benzyloxycarbonylgly-cylamino)-3,5-dideoxy-/J-D-glycero-D-gal acto-2-nonulopyranosid)onat blev opløst i vandfri methanol, hvorefter der blev tilsat 301 mg 15 (0,62 mmol) Pd/c (10%). Blandingen blev derpå omrørt under hydrogen gas ved stuetemperatur i 16 timer. Den resulterende reaktionssuspension blev filtreret, og solventen blev afdestilleret til tørhed. Der blev opnået 210 mg af et farveløst, amorft stof (udbytte: 97%).

2Q Fysiske egenskaber af stoffet:

Dekomponeringspunkt: 126-130°C.

IR Ύ max cm_1 1,740 (-COOCH3) 25 lH~NMR60MHZ (CD30D, TMS) lf61 (IH. m. 3-Hax) 2,40 (IH. m. 3-Heq) 30 3,27 (3H. S. 2-OCH3) 3,81 (3H. S. -COOCH3) 3;41 - 4,36 (9H, m, sialyl-H, NH9CH9CO-)

Eksempel 12 35

Fremstilling af hvdrochloridsaltet af methv1-(methvl-5"(qlvcyl-aminol-3.5-dideoxv-8-D-qlvcero-D-galacto-2-nonulopvranosidlonat.

500 mg (10,28 mmol) Methyl-(methyl-5-(N-benzyloxycarbonylgly-cylamino)-3,5-dideoxy-/}-D-glycero-D-galacto-2-nonulopyranosid)onat

DK 166354B

19 blev opløst i vandfri methanol, og der blev derefter tilsat 428 mg (0,4 mmol) Pd/c (10%) og 200 mg (3,67 mmol) ammoniumchlorid. Blandingen blev derpå omrørt under hydrogengas ved stuetemperatur i 20 timer. Den resulterende reaktionssuspension blev filtreret, og 5 solventen blev afdestilleret til tørhed; 380 mg farveløst, amorft stof blev opnået (udbytte: 95%).

Fysiske egenskaber af stoffet:

Dekomponeringspunkt: 145-150°C.

10 IR v KBr cm“l 1.740 (-COOCHo),

1 max J

15 1h_NMR60MH2 <cd30d* TMS) lr62 (IH, m, 3-Hax) 2,36 (IH, m, 3-Heq) 20 3,27 (3H, S, 2-OCH3) 3,83 (3H, S, -COOCH3) 3/40 - 4,20 (9H, m, sialyl-H, NH?CH?CO-) 25

Eksempel 13

Fremstilling af methvl-fmethvl-5-fN-benzvloxvcarbonvlalvcvl aminol-3.5-dideoxv-4,7,8,9-tetra-0-acetvl-g-D-g1vcero-D-qalacto- 2-nonuloDvranosidlonat.

2Q 0,15 g (0,31 mmol) Methyl -(methyl-5-(N-benzyloxycarbonyl- glycylamino)-3,5-dideoxy-Ø-D-glycero-D-galacto-2-nonulopyranosid)-onat blev opløst i 3 ml vandfri pyridin, og der blev derefter tilsat 3 ml eddikesyreanhydrid. Blandingen blev derpå omrørt ved stuetemperatur i 2 timer. Den resulterende reaktionsblanding blev filtreret, og solventen blev afdestilleret til tørhed. Derefter blev 35 den underkastet sil icagel-kromatografi og elueret med chloroform/-methanol (30:1); der blev opnået 0,17 g farveløst, amorft stof (udbytte: 85%).

5 20

DK 166354 B

Fysiske egenskaber af stoffet:

Smeltepunkt: 70-74°C Dekomponeringspunkt: 130-160°c.

IR γ KBr cm-1 3,370 (-NH), 1.740 (-COOCH3), max 1h-NMrPP”Hz (CD« 3, TMS) 1,57 - 2,14 (13H, mf CH3CO-, 3-Hax) 10 2f47 (IH, dd, J = 13,0Hz, J = 5,27Hz, 3-Heq) 3,23 (3H, S, 2-OCH3) 3,80 (3H, S, -COOCH3) 15 5,14 (2H, S, <0>-^2-0-> 3,61 - 5f50 (9H, m, -NHCH2_C0-r sialyl-H) 5,62-6,62 (2H, broad S, -NH-) 7,35 (5H, S, phenyl-H) 20

Eksempel 14

Fremstilling af methvl-(methvl-5-(N-benzvloxvcarbonv1-D-ala nv1aminol-3.5-dideoxv-B-D-alvcero-D-galacto-2-nonu1oDvranosidlonat. Eksempel 14 blev udført med samme procedure som den i eksempel 25 5 angivne, bortset fra at 0,76 g N-CBZ-D-alanin blev anvendt i stedet for N-CBZ-L-alanin, og at der blev anvendt 1 g af forbindelsen (II), 0,36 ml N-ethylmorpholin og 0,79 g Η0ΝΒ. Der blev herved opnået 1,2 g produkt (udbytte: 70%).

2Q Fysiske egenskaber af produktet:

Dekomponeringspunkt: 209-213°C.

Elementaranalyse: C12H32^2°1I M.V. = ®00,51

Beregnet: C: 52,79H: 6,44 N: 5,60

Fundet: C: 52,97H: 6,40 N: 5,73 35 5 21

DK 166354 B

IRY max cm-1 3.400 (-°H/-NH)' 1-740 (-COO CH3), 1.700 (-NH C-0-),

II

O

10 1H-NMRPP^J2 (DMSO-dg + D20, TMS) 1,26 (3H, d, J=7,07 Hz, >CH-CH3) 1,52 (IH, dd, J=13.0 Hz, J=10,8 Hz, 3-Hax) 15 2,21 (IH, dd, J=13,0 Hz, J=4.5 Hz, 3-Heq), 3,18 (3H, S, 2-OCH3) 3,74 (3H, S, -COOCH3) 5,04 (2H, S, ^-CH2-0-) 20 7,37 (5H, S, phenyl-H)

2? S°C

03 £ 1 - 12,91° (C=l, MeOH) 25

Eksempel 15

Fremstilling af methvl-(methvl-5-(N-ben2vloxvcarbonvl-DL-ala nviaminol-3.5-dideoxv-8-D-qlvcero-D-galacto-2-nonulopvranosid)onat.

Eksempel 15 blev udført med samme procedure som den i eksempel 5 beskrevne, bortset fra, at 0,76 g N-CBZ-DL-alanin blev anvendt i stedet for N-CBZ-L-alanin, og at der blev anvendt 1,0 g af forbindelsen (II), 0,36 ml N-ethylmorpholin og 0,79 g Η0ΝΒ, Der blev 3 5 herved opnået 1,25 g produkt (udbytte: 74%).

Fysiske egenskaber af produktet:

Dekompositionspunkt: 192-195°C

5 22

DK 166354 B

Elementaranalyse: C12H32N2°11 M*V' = 500>51

Beregnet: C: 52,79H: 6,44 N: 5,60

Fundet: C: 52,88H: 6,30 N: 5,65 1H-NMRPPJMH2(DMSO-d6 + D20, TMS) 1,218; 1,223 (6Hf d, J = 7,10 Hz, > CH-CH3) 2g lf503 {IH, m, 3-Hax) 2,161 (IH, m, 3-Heq) 3,168; 3.176 (3H, S, 2-OCH3) 4,045; 4.142 (IH, m, >CH-CH3) 15 KB r IR Ύ max 0111-1 3.400 (-OH,-NH) , 1,740 (-COOCH3) , 1.700 (-NHC-0-), 1.660 (-C-C-NH-) I li

O O

20

Eksempel 16

Fremstilling af methvl (methvl-5-(N-benzvloxvcarbonvl-D-valvl-amino)-3.5-dideoxv-g-D-qlvcero-D-qalacto-2-nonulQDvranosid)onat.

Eksempel 16 blev udført med samme procedure som den i eksempel 5 beskrevne, bortset fra at 0,43 g N-CBZ-D-valin blev anvendt i stedet for N-CBZ-L-alanin, og at der blev anvendt 0,5 g af forbindelsen II, 0,18 ml N-ethylmorpholin og 0,40 g Η0ΝΒ. Der blev herved opnået 627 mg produkt (udbytte: 70%).

Fysiske egenskaber af produktet:

Dekomponeringspunkt: 229-231°C

Elementaranalyse: C24H36N2°11 M*V* = ^8’56

Beregnet: C: 54,54H: 6,87 N: 5,30

Fundet: C: 54,61H: 6,72 N: 5,44 35 23

DK 166354 B

KBr IR Y max cm-1 3.400 (-OH,-NH), 1,740 (-COOCH3), 1,700 (-NH-C-0-),

(I

O

0]2p»6°C -33, 8° (C=l, DMF)

Eksempel 17

Fremstilling af methyl-(methyl-5-L-alanvlamino-3.5-dideoxv-b-D-qlvcero-D-qalacto-2-nonulopvranosidlonat. jq Eksempel 17 blev udført med samme procedure som den i eksempel 11 beskrevne, bortset fra, at 1,5 g af det i eksempel 4 fremstillede farveløse, amorfe stof blev anvendt som udgangsstof. Der blev herved opnået 0,77 g produkt (udbytte: 70%).

25 Fysiske egenskaber af det opnåede produkt:

Dekomponeringspunkt: 164-170°C

KB Γ IR γ max cm”I 3.300 (-NH2,-OH), 1.740 (-COOCH3) 20 lH-NMRPP^z(DHSO-d6 + D20, TMS) 1,19 (3H, d, J = 6,8 Hz, -CH3) 3;17 (3H, S, 2-OCH3) 25 3,73 (3H, S, -COOCH3)

Eksempel 18

Fremstilling af methyl-(methvl-5-L-leucvlamino-3.5-dideoxy-/?-D-30 glvcero-D-qalacto-2-nonvlopvranosidlonat.

Eksempel 18 blev udført med samme procedure som den i eksempel 11 beskrevne, bortset fra at 1,5 g af det i eksempel 6 fremstillede produkt blev anvendt som udgangsstof. Der blev herved opnået 0,93 g produkt (udbytte: 82%).

Fysiske egenskaber af det opnåede produkt:

Dekomponeringspunkt: 196-199°C

35 24

DK 166354 B

IR Ύ 5BC cm-1 3.400 - 3.200 (-NH2, -OH), 1,740 (-COOCH3)

uldX

1h-nmrPP”„ (dms°-<J6. TMS) c 90MHz CH3~- 0.89 (6H, d, J = 6,18 Hz, >CH-)

CT3 X

3,18 (3H, S, 2-OCH3) 3,71 (3H, S, -COOCH3) 10 Eksempel 19

Fremstilling af methvl-(methvl-5-L-phenyl-alanvlamino-3.5-dide οχν-β-D-qlvcero-D-qalacto-2-nonulopvranosicnonat.

Eksempel 19 blev udført med samme procedure som den i eksempel 11 beskrevne, bortset fra, at 1,5 g af det i eksempel 7 fremstillede 15 produkt blev anvendt som udgangsstof. Der blev herved opnået 0,91 g produkt (udbytte: 79%).

Fysiske egenskaber af det opnåede produkt:

Dekomponeringspunkt: 181-187°C

20

Tnv KB r maxcm 3,350 (-OH,-NH2), 1.740 (-COOCH3) lH-NME&2(DMS°-d6. TMS) 25 3,18 (3H, S, 2-OCH3) 3,71 (3H, S, -COOCH3) 2q Eksempel 20

Fremstilling af methvl-(methvl-5-L-servlamino-3.5-dideoxv-fl-D-qlvcero-D-qalacto-2-nonulopvranosidlonat.

Eksempel 20 blev udført med samme procedure som den i eksempel 11 beskrevne, bortset fra, at 1,5 g af det i eksempel 8 fremstillede produkt blev anvendt som udgangsstof. Der blev herved opnået 0,91 g produkt (udbytte: 82%).

Fysiske egenskaber af det opnåede produkt:

Dekomponeringspunkt: 118-124°C

25

DK 166354 B

IR γ mi cm-1 3.350 (-OHf-NH2) , 1.740 (-COOCH3) max 5 1H-N«R|oMH2(DMSO'd6 + D2°- TMS> 3,17 (3H, S, 2-OCH3) 10 3,73 (3Hf S, -COOCH3)

Eksempel 21

Fremstilling af methvl-(methvl-5-L-varvlamino-3.5-dideoxv-g-D-15 alycero-D-qalacto-2-nonuloDvranosicOonat.

Eksempel 21 blev udført med samme procedure som den i eksempel 11 beskrevne, bortset fra at 1,5 g af det eksempel 9 fremstillede produkt blev anvendt som udgangsstof. Der blev herved opnået 0,93 g produkt (udbytte: 83%).

20

Fysiske egenskaber af det opnåede produkt:

Dekomponeringspunkt: 112-118°C

25 tr v KBr -i Y max cra 3.300 - 3.400 (-OH,-NH2), 1.740 (-COOCH3) 30 1H-NMR^Mh2 (DMSO-dg, TMS) 0,897 (6H, d, J=6;2 Hz, ^3 ^>CH-) 3,180 (3H, S, 2-OCH3) 35 3,710 (3H, S, -COOCH3)

Claims

1. N-substituerede neuraminsyrederi vater, kendetegnet ved, at de har formlen: 5 HO J1 JL 0CH3 T/ o — COOCH- boA / (I)

10. OH H il H O r—K li hvor Y betegner ( O ch2oc — A ,hvor A er en aminosyrerest med følgende formel: * - NH - CHCO-

20 L o hvor R er udvalgt blandt 25 -ch3/ -chch3, -ch2chch3, I I ch3 ch3

30 -CH2CH2SCH3, -CH2c6h5 / -CHjOH, -CHCH3, -CH2SH, OH eller Y betegner A', hvor A' er en aminosyrerest med følgende formel 35 DK 166354 B * H2N - CHCO- V 4 hvor R er udvalgt blandt -H, -ch3, -chch3/ -ch2chch3, I I ch3 ch3

10 -CH2CH2SCH3, -CH2CgH5, “CH2OH, -chch3/ -ch2sh. OH 15

2. Fremgangsmåde til fremstilling af en forbindelse ifølge krav 1, hvori Y betegner 20 <Q>-CH20C-A . hvor A har den ovenfor anførte betydning, kendetegnet ved, at et N-benzyloxycarbonylaminosyrederivat med formlen: 25 ° ^0)-CH20C “ a - oh (III) hvor A har den ovenfor anførte betydning, omsættes med et neuramin-syrederivat med formlen: HO H och3 H0 t

0. C00CH3 (II)

35 H2 i H Η H

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at omsætningen udføres i et solvent, der er udvalgt fra gruppen DK 166354 B bestående af vandfri pyridin og dimethyl formamid, i nærværelse af di cyclohexylcarbodi imi d.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at en 5 aktivator i form af en N-hydroxyforbindelse udvalgt blandt N-hy-droxysuccinimid, 1-hydroxybenzotriazol, 3-hydroxy-4-oxo-3,4-dihy-dro-1,2,3-benzotri azi n og N-hydroxy-5-norbornen-2,3-di carboximid sættes til dimethyl formamid i nærværelse af di cyclohexylcarbodiimid. 2Q

5. Fremgangsmåde til fremstilling af en forbindelse ifølge krav 1, hvori Y betegner HgN-CHCO, hvor R^ har den ovenfor anførte R4 betydning, kendetegnet ved, at en forbindelse udvalgt fra 25 gruppen bestående af N-substituerede neuraminsyrederivater med formlen: i· r1° h °CH 20 rxG r l . 3 O T ;/ H O ^/^COOCH^ /~\ t RO/ ! / 3 (Or ch2oc - a - NH / '-' * OR1 H H ‘

25 H hvor R1 og A har den ovenfor anførte betydning, underkastes katalytisk reduktion. 30

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at den katalytiske reduktion udføres med hydrogen i nærværelse af en pal1 adi um/carbon-katalysator.

7. Præparat til regulering af immunsystemets forsvar, kende-35 tegnet ved, at det omfatter et N-substitueret neuraminsyrederi vat ifølge krav 1.