DK164880B - Fremgangsmaade til kvantitativ bestemmelse af indholdet af en paa forhaand bestemt viral nucleinsyre, der kan vaere indeholdt i et naturligt biologisk medium, og udstyr til brug ved fremgangsmaaden - Google Patents

Description

i

DK 164880 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde af den i krav 1's indledning angivne art til kvantitativ bestemmelse af indholdet af en på forhånd bestemt viral nucle-insyre, der kan være indeholdt i et naturligt biologisk 5 medium. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del anførte. Opfindelsen angår endvidere et udstyr eller "kit" til kvantitativ bestemmelse af et viralt DNA i et naturligt biologisk medium, der er forligeligt med udviklingen af det tilsvarende 10 virus, i overensstemmelse med den omhandlede fremgangsmåde. Dette udstyr er ejendommeligt ved det i krav 9's kendetegnende del anførte.

For øjeblikket findes der ikke nogen simpel og direkte 15 kvantitativ analysemetode til bestemmelse af inficerende partikler, især til bestemmelse af virion af viralt hepatitis B. DNA-sonder, som indeholder en sekvens, der er karakteristisk for genomet af det virus, som eftersøges, er efterhånden taget i rutinemæssig anvendelse. F.eks.

20 har man allerede foreslået at anvende sonder, der indeholder en DNA-HBV-sekvens eller hele S-genet (eller en del deraf) af hepatitis B-virus. Under de betingelser, som beskrives i den tekniske litteratur, tillader disse sonder en kvalitativ bestemmelse af tilstedeværelsen el-25 ler fraværet af dette virus eller virion i biologiske materialer, hvori de kan være indeholdt. Imidlertid kan disse sonder vanskeligt (under de betingelser, hvorunder de hidtil har været anvendt) benyttes til gennemførelse af kvantitative analyser. Når hybridiseringsforsøget 30 eksempelvis gennemføres på en bærer, såsom en nitrocellulose-bærer, kan sonden være delvis absorberet eller "passere igennem" den pågældende bærer. Dette fænomen griber t ikke ind i bestemmelsens kvalitative karakter. Således forholder det sig imidlertid ikke, når man ønsker at gen-35 nemføre en kvantitativ analyse.

DK 164880 B

2

Kvantitative bestemmelser af visse DNA-sekvenser har under bestemte omstændigheder være foretaget under elektronmikroskop. Det er imidlertid klart, at sådanne teknikker ikke kan anvendes rutinemæssigt til kvantitative 5 bestemmelser af virale partikler, især til diagnose. Desuden kan denne metode ikke anvendes, når der er tale om en serie af målinger, der er udstrakt over et vist tidsrum, og som skal følge fremadskriden af den infektion, der skal bestemmes.

10

Fra EP offentliggørelsesskrift nr. 62 286 kendes en fremgangsmåde og et udstyr eller "kit'.' til diagnosticering af tilstedeværende hepatitis B virus, hvor man anvender et reagens bestående af en klonet, oprenset og mærket DNA- 15 sekvens. Fremgangsmåden består i, at man afsætter en prøve på et substrat, eliminerer proteinerne og gennemfører en hybridisering med det mærkede reagens.

En artikel i Chemical Abstracts bind 100 (1984), nr.

20 99.481, beskriver en fremgangsmåde til detektering af tilstedeværende hepatitis B virus ud fra en prøve uden indhold af proteiner, idet denne detektering gennemføres ved hjælp af et reagens opnået efter oprensning af det virale DNA.

25

Scotto et al., Hepatology 3 (3), 279-284 (1983) beskriver en simplificeret spottest til bestemmelse af hepatitis B virus DNA i blodserum ved hybridisering mellem en sonde og en prøve indeholdende hepatitis B virus DNA. Ved sen- 30 sibilitetsforsøg sammenlignes den beskrevne metode med rækkefortyndinger af positive serumprøver. Scotto et al. viser, at selv når man går ud fra et meget infektiøst serum, får man et positivt hybridiseringssignal med en passende sonde, når forsøget gentages med 50 μΐ af det samme _5 35 serum fortyndet til 6 x 10

DK 164880 B

3

Desuden beskriver Scotto et al erfaringerne med detektering af en hepatitis B virus DNA-klon, som har været sat til et negativt serum, ligeledes for at teste metodens følsomhed.

5

Disse litteraturreferencer nævner imidlertid ikke de komparative foranstaltninger, som tages i anvendelse ifølge opfindelsen ud over hybridiseringen af den anvendte sonde med viralt DNA i selve prøven, som består af det naturli-10 ge biologiske medium indeholdende DNA'et. Nærmere bestemt hybridiseres den samme sonde med et klonet reference-DNA blandet med proteiner, som ligner - eller som er identiske med - proteinerne indeholdt i den biologiske prøve.

Hermed tilvejebringes en simpel og direkte metode til 15 kvantitativ bestemmelse af infektiøse specier, som ikke kan udledes af den kendte teknik.

Det er således et formål med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe en fremgangsmåde og et udstyr, hvormed 20 man kan gennemføre sådanne kvantitative bestemmelser. Nærmere bestemt er det et formål med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe midler, som sætter laboratorier og klinikere i stand til ikke blot at bestemme en mulig viral infektion, f.eks. B-viral hepatitis, hos bestemte 25 patienter, men også at gøre det muligt hurtigt at vurdere udviklingen af den virale infektion og i konsekvens heraf at kontrollere og justere effektiviteten af passende an-tivirale behandlinger.

30 Det standardiserede referencereagens til kvantitativ bestemmelse ved sammenligning af et viralt DNA i en prøve af et naturligt biologisk medium, som er forligeligt med udviklingen af det tilsvarende virus, indeholder en på forhånd bestemt koncentration af DNA, der indeholder en 35 DNA-sekvens, som fortrinsvis er klonet, og som kan hybridiseres med det ovennævnte virale DNA, er karakteristisk ved, at det i blanding med det klonede DNA indeholder

DK 164880 B

4 proteiner.

Fortrinsvis er det klonede DNA til stede i form af en klonet phag, · der indeholder et indført DNA, som kan hy-5 bridiseres med det virale DNA.

Proteinerne hidrører fortrinsvis fra et biologisk medium, som kan sammenlignes med det ovennævnte naturlige biologiske medium. Dette reagens indeholder fortrinsvis de es-10 sentielle ingredienser hørende til det samme naturlige · biologiske medium, og det kan endda bestå af det samme naturlige medium med den undtagelse, at det til at begynde. med ikke indeholder det virale DNA, som skal analyseres kvantitativt. Imidlertid indeholder mediet den oven-15 nævnte phag i den ovenfor angivne, på forhånd fastlagte koncentration.

Tilknytningen til det klonede DNA, fortrinsvis med en phag, der indeholder en hybridiserbar sekvens af protei-20 ner, gør det muligt at fiksere DNA'et til en bærer af membran- eller filtertype under i det væsentlige reproducerbare betingelser for en på forhånd fastlagt relativ tilstand. Disse observationer udstrækker sig på samme måde til fikseringen af prøver, som skal testes på den 25 samme bærer.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til kvantitativ bestemmelse af indholdet af en på forhånd bestemt nucleinsyre, der kan være indeholdt i et naturligt biologisk medium, 30 er særegen ved, at man: - bringer flere standardiserede reagenser, som hver især indeholder en klonet nucleinsyre i indbyrdes forskellige koncentrationer, der kan hybridiseres med sonden, og 35 som forinden er bragt i en tilstand, der muliggør hy- bridisering, i kontakt med sonden,

DK 164880 B

5 - måler forholdet imellem den måling, der har relation til den mængde af sonden, der er blevet hybridiseret med den virale nucleinsyre, hvis indhold skal bestemmes, og baggrundsstøjen målt under de samme betingelser 5 med en negativ kontrol, - måler de tilsvarende forhold imellem målingerne, der har relation til de mængder af den samme sonde, der er blevet hybridiseret med de klonede nucleinsyrer fra de 10 ovennævnte standardiserede reagenser, og et kontrolrea gens tilsvarende baggrundsstøj under lignende eller identiske betingelser, idet de standardiserede reagenser indeholder de klonede DNA'er i blanding med en proteins ammensætning, der ligner - eller er identisk med -15 proteinsammensætningen af det biologiske medium, og som muliggør fiksering af de klonede DNA'er til en bærer af membran- eller filtertype, og idet de standardiserede reagenser kan skelnes fra kontrolreagenset ved deres indhold af klonet nucleinsyre, der kan hybridiseres med 20 sonden, og skelnes indbyrdes ved de bestemte, men ind byrdes forskellige koncentrationer af den klonede nucleinsyre, og - sammenligner forholdet, som er målt med den virale nu- 25 cleinsyre, hvis indhold skal bestemmes, med de forhold, der er fundet med de klonede nucleinsyrer fra reagenserne hvorved indholdet af den virale nucleinsyre i det undersøgte biologiske medium fremgår af en korrelation med sammenligningsresultaterne.

30

Det ovenfor angivne referenceforhold kan også fremgå af nomogrammer, som på forhånd er bestemt ud fra forholdene imellem målinger af fastlagte prøvemængder' med på forhånd bestemte forhold, hvor det klonede DNA adskiller sig fra 35 den tilsvarende baggrundsstøj .

DK 164880 B

6

Det fremgår klart af det foregående, at den negative kontrol har en sammensætning, som svarer til (eller er identisk med) sammensætningen af reagenset med den ene undtagelse, at det klonede DNA mangler.

5 Mængderne af de hybridiserede prøver kan korreleres med ethvert måleligt system. F.eks. er den ene partner i hy-bridiseringen bærer af en radioaktiv, enzymatisk, fluorescerende eller lignende markør, hvilket giver anledning 10 til frembringelse af et signal, hvis intensitet kan måles.

Den mulige kvantitative bestemmelse af den nucleinsyre, som anvendes i hybridiseringsreaktionen, er et resultat 15 af den stabilitet, som observeres ved måling af det ovennævnte forhold, når man gentager hybridiseringsoperatio-nen imellem en passende prøve og en på forhånd bestemt mængde af det ifølge opfindelsen anvendte reagens. Dette gælder også for de resultater, som under de samme betin-20 gelser kan måles på en naturlig prøve, der indeholder en tilsvarende dosis af den samme biologiske prøve.

Disse forhold er imidlertid variable som en funktion af den mængde klonet DNA, som kan indeholdes i det anvendte 25 reagens, således at det er muligt at konstruere nomogram-mer, som er repræsentative for variationen af det ovennævnte forhold som funktion af koncentrationerne af klonet DNA, især af phag-partikler. Variationerne af det samme forhold, som hidrører fra tilsvarende målinger ud-30 ført på biologiske prøver, kan derefter korreleres med de ovennævnte nomogrammer, således at indholdet af virale partikler, som til at begynde med er ukendt for en bestemt specie, kan udledes gennem en simpel sammenligning af målingerne gennemført med en kurve fra et tilsvarende 35 nomogram.

DK 164880 B

7

Det fremgår af det foregående, at når den naturlige biologiske specie, som indeholder den virale partikel, der skal afsættes, udgøres af et blodserum, vil det være en fordel at anvende et reagens, som er standardiseret i 5 overensstemmelse med opfindelsen, og hvori det klonede DNA er knyttet til de essentielle bestanddele af dette blodserum. Hvis den specie, der skal testes, er dannet ud fra en celleekstrakt, vil de anvendte reagenser med fordel kunne bestå af en blanding af en ækvivalent cellulo-10 seekstrakt og en på forhånd bestemt mængde klonet DNA.

Hvad angår selve det klonede DNA, foreligger dette i form af en phag, hvis genetiske arvemasse er blevet modificeret ved indføring af sondesekvensen, f.eks. fuldstændigt 15 DNA-HBV eller en del deraf. Denne sekvens bliver derefter "indpakket" i en separat phag, som der er givet talrige eksempler på i litteraturen. Der kan f.eks. være tale om lambda-phag eller M-13-phag eller derivater eller analoge af disse phager. Den anvendte phag bliver undertiden ud-20 valgt som en funktion af den tilsvarende DNA-sonde-sekvens af de virale partikler, som skal analyseres, idet der tages hensyn til størrelsen af den DNA-indføring, som kan "indpakkes".

25 Fordelen ved at anvende et klonet DNA i en phag ligger i ligheden imellem det klonede element og den naturlige partikel, således at der ved tilgrænsende koncentrationer af virale partikler kan observeres en adfærd, som svarer til adfærden af reagenset og den analyserede prøve med 30 hensyn til en på forhånd bestemt DNA-sonde, når hybridi-seringsoperationerne gennemføres under tilsvarende betingelser. Eftersom dette er tilfældet, bør det bemærkes, at det klonede DNA i visse tilfælde kan udgøres af et plasmid, der indeholder den hybridiserbare sekvens med en del 35 af genomet af den virale partikel, som skal analyseres.

DK 164880 B

8

Med hensyn til selve sonden, som både skal hybridiseres med det klonede DNA og den virale nucleinsyre hørende til den afprøvede specie, er det muligt at anvende enhver sonde, om hvilken det vides, at den kan hybridiseres med 5 klonet DNA og med genomet af den eftersøgte viruspartikel. I det foretrukne tilfælde, hvor viruspartiklerne, der skal analyseres, udgøres af hepatitis B virus, kan sonden bestå af en hvilken som helst partiel eller fuldstændig sekvens af DNA-HBV.

10

Det er indlysende, at sonden endvidere kan være sammensat på samme måde som de ovennævnte reagenser, når deres indbyrdes kontakt kan føre til en detekterbar og målelig hy-bridisering under de beskrevne betingelser.

15

Generelt markeres sonden, enten ved hjælp af en radioaktiv markør eller ved hjælp af en vilkårlig anden markering, eksempelvis fluoroscerende eller enzymatisk. Når der er tale om en enzymatisk markering, kan mængden af 20 markeret DNA, som anvendes ved hybridiseringen, bedømmes ud fra enzymets virkningsniveau på det tilsvarende substrat, når en modifikation af substratet kan bedømmes kvantitativt på passende måde, især ved colorimetri eller spektrofotometri.

25

Naturligvis kan man anvende en hvilken som helst konventionel teknik til frembringelse af en binding imellem hybrid-prøven og den anvendte markør. Man kan.således præ-inkorporere markøren i prøven, hvilket kan være tilfæl-30 det, når markeringen gennemføres ved hjælp af et radioelement. Denne binding kan være direkte eller indirekte, når der er tale om ikke-radioaktive markører. Nærmere bestemt kan prøven modificeres, således at den bærer et antigen-sted, som kan gedkendes af de første antistoffer, 35 som atter genkendes af andre antistoffer, der bærer enzymet eller den fluoroscerende markering, som anvendes ved den ovenfor beskrevne analyse.

DK 164880 B

9 I denne sammenhæng kan der f.eks. henvises til den teknik, der er beskrevet i FR patentansøgning nr. 78 10 975, i US patentskrift nr. 4 358 535 og i EP patentskrift nr.

63 879.

5

Den pågældende hybridiseringsreaktion kan frembringes under passende kendte betingelser. Det er således muligt at anvende en biologisk sammensætning, der eventuelt på forhånd er beriget med DNA, og som er opnået ud fra den spe-10 cie, som skal studeres. Hvis man går frem på denne måde, vil det være en fordel at anvende standardiserede reagenser af den ovenfor definerede type, som med fordel kan have undergået den samme type af præ-berigelse. Generelt er det ikke nødvendigt at foretage en sådan indledende 15 rensning. Den indledende behandling af specien kan begrænses til opnåelse af resultater, som opnås ved solubi-lisering af de virale partikler, som skal bestemmes og analyseres, og ved denaturering af DNA'et eller det virale RNA.

20

Hybridiseringsreaktionen kan gennemføres i væskefase eller fortrinsvis på en fast bærer.

Det er en fordel, at man på den ene side fremkalder en 25 afsætning af den specie, der skal analyseres, og på den anden side afsætter det reagens, som indeholder det klonede DNA, på bærere, som egner sig til den efterfølgende hybridisering, f.eks. på et nitrocellulosefilter eller på en polyamid-bærer, som kendes under betegnelsen nylon.

30 Denne afsætning foretages under ligeledes kendte betingelser, således at de DNA-sekvenser, som både indeholdes i specien og i reagenset, kan fastgøres til bæreren. Ved en sådan fastgørelse forstås enhver form for retention, som svarer til en egentlig fiksering, f.eks. ved hjælp af 35 covalente bindinger eller ved simpel kompleksdannelse eller ved adsorption. Disse metoder fører til et slutresultat, som er ækvivalent med en fiksering. Under i sig selv

DK 164880 B

10 kendte betingelser bringes specien og reagenset derefter i kontakt med en fælles sonde. Analysen gennemføres efter en passende vask af bæreren med henblik på at fjerne et eventuelt overskud af sonden.

5

Det er også muligt at anvende teknikker, som gør brug af konkurrerende reaktioner. Ved en sådan teknik udnytter man en konkurrence med hensyn til et passende substrat i en på forhånd bestemt mængde, som reagerer med en ukendt 10 mængde af en første konstituent, som er beregnet til at reagere med substratet, og en kendt mængde af en anden konstituent, som generelt er enten identisk eller analog med den første. Begyndelseskoncentrationen af den første konstituent udledes derefter af den mængde eller den kon-15 centration af den anden konstituent, som indgår i reaktionen med substratet.

I en udførelsesform for opfindelsen består substratet af sonden, og den første konstituent udgøres af specien, der 20 skal analyseres, mens den anden konstituent udgøres af et reagens anvendt ifølge opfindelsen.

Det er klart, at der med denne teknik også tilvejebringes nomogrammer, der gør det muligt at foretage en bestemmel-25 se ved at sammenligne indholdet af den eftersøgte virale partikel med den biologiske specie, som underkastes eksperimentet .

Med henblik på at gennemføre de kvantitative analyser så 30 nøjagtigt som muligt vil det ofte være en fordel at råde over et "udstyr", som omfatter et større antal sådanne reagenser, der kan skelnes fra hinanden ud fra forskellene i koncentration af klonet DNA. Faktisk kan det være en fordel at tilvejebringe en tilstrækkelig mængde reagenser 35 i det samme udstyr, således at man altid er i stand til at bringe mindst ét reagens, hvis indhold af klonet DNA ikke ligger for langt fra den ukendte mængde, i kontakt

DK 164880 B

11 med den specie, der skal analyseres, således at resultaterne bliver så signifikante som muligt.

Opfindelsen angår således et udstyr eller "kit", som er 5 ejendommeligt ved, at det består af: - en sonde, der kan hybridiseres med den virale nuclein-syre, som skal bestemmes kvantitativt, 10 - et kontrolreagens dannet af en sammensætning af protei ner, der ligner (eller er identiske med) proteinerne i det biologiske medium, og som muliggør fiksering af nucleinsyren til en bærer af membran- eller filtertype, idet kontrolreagenset dog ikke indeholder det klonede 15 DNA, og - et antal standardiserede referencereagenser, som indeholder kontrolreagensets proteinsammensætning og som indeholder forskellige koncentrationer af en klonet nu- 20 cleinsyre, der kan hybridiseres med sonden.

Udstyret ifølge opfindelsen omfatter med fordel også mindst et nomogram, som er repræsentativt for de variationer, der kan observeres med hensyn til forholdet imel-25 lem de målte intensiteter af et signal, der tilvejebringes af en markør, efter hybridisering med sonder med forskellige koncentrationer af et reagens anvendt ifølge opfindelsen, idet disse identiteter sammenholdes med den baggrundsstøj, som måltes under tilsvarende betingelser 30 ved at bringe kontrolreagenset i kontakt med den samme sonde under identiske hybridiseringsbetingelser. Måleresultatet er en funktion af de mængder af reagenserne, som anvendes ved disse hybridiseringsforsøg, idet det skal forstås, at markøren bæres af en eller flere af de reak-35 tanter, der anvendes ved hybrid!seringen, fortrinsvis af sonden.

DK 164880 B

12

Desuden omfatter udstyret fortrinsvis en eller flere bærere, som egner sig til afsætning og fiksering af de forskellige ingredienser, som indgår i reagenserne anvendt ifølge opfindelsen, på en bærer sammen med kontrolreagen-5 set, og prøven som skal testes, under sådanne betingelser, som muliggør en efterfølgende hybridisering med en DNA-sonde, som også indeholder en hybridiserbar sekvens.

Andre karakteristika ved den foreliggende opfindelse vil 10 fremgå af den efterfølgende beskrivelse, som illustrerer foretrukne metoder til fremstilling af de standardiserede reagenser såvel som anvendelsen af disse, og som illustrerer frembringelsen af et nomogram, som kan benyttes som reference til efterfølgende kvantitative bestemmelser 15 ved anvendelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Tegningen viser monogram som beskrevet ovenfor.

1. Fremstilling af prøver 20

Prøver af blodserum, som formodes at være inficeret med virus af hepatitis B, fikseres til en membran af nylonpolyamid (Biodine A, Pall Co. ) eller til en anden bærer af nylon eller nitrocellulose, som kan anvendes til hy-25 bridiseringsforsøg. Afsætningerne gennemføres i "Dot- blots"-pletter. Disse afsætninger kan enten frembringes ved direkte afsætning af de koncentrerede prøver eller ved filtrering af de på forhånd fortyndede prøver igennem lokaliserede zoner af bæreren og sugning igennem disse 30 zoner. Prøverne behandles derefter med en 0,15 M opløsning af natriumcarbonat og 1 M NaCl (endelige koncentrationer) for at solubilisere viruspartiklerne på stedet og for at denaturere DNA'erne og gøre dem tilgængelige for en prøve, som kan hybridiseres med genomet af hepatitis B 35 virus.

DK 164880B

13

Derefter neutraliseres med en Tris/NaCl-puffer. Den faste fase opvarmes til 80 °C, og opvarmningen opretholdes i en periode på 1-2 timer i afhængighed af arten af den anvendte bærer, idet opvarmningen har til formål at sikre 5 fikseringen af DNA'erne fra prøven til bæreren.

Prøverne er derefter parate til, at man kan gennemføre de efterfølgende hybridiseringsoperationer med standardiserede reagenser i overensstemmelse med opfindelsen.

10 2. Fremstilling af standardiserede reagenser

De klonede DNA'er som anvendes i disse reagenser, udgøres af phager såsom lambda- eller M-13-phager, hvis genomer 15 er blevet modificeret i en ikke-essentiel region med henblik på replikation af disse phager ved indføring af et DNA, som har en sekvens fælles med genomet af de viruspartikler, som skal bestemmes, f.eks. en partiel eller fuldstændig sekvens af DNA-HBV, hvilken sekvens derefter 20 "indpakkes" i de pågældende phager.

Et eller flere reagenser til anvendelse ifølge opfindelsen fremstilles ved at blande disse modificerede phager i på forhånd bestemte koncentrationer (idet koncentratio-25 nerne eksempelvis bestemmes ved måling af optiske densiteter eller ved lysering af plader af cellekulturer) med sundt blodserum. Det er en fordel at fremstille reagenser af denne type, som gør det muligt at anvende enhedsdoser 2 10 af partikler, der strækker sig fra 10 til 10 phag-par-30 tikler.

Disse reagenser afsættes derefter ensartet på et filter og behandles under de samme betingelser som de prøver, der skal analyseres. Membranerne, som omfatter de endeli-35 ge afsætninger af DNA'er i kendte mængder (pletter dannet af reagenserne) og i ukendte mængder (pletter opnået fra de prøver, der skal analyseres), er herefter parate til

DK 164880 B

14 hybridisering under konventionelle betingelser, f.eks. med en DNA-HBV-prøve mærket med et radioaktivt element, f.eks. 32P.

5 Man anvender konventionelle hybridiseringsteknikker, hvorefter bærerne vaskes for at fjerne de ikke-fikserede prøver. Derefter foretages analyserne direkte på filteret (autoradiogrammer) eller eksempelvis ved scintillografi i mediet, efter at man har udskåret pletterne og anbragt 10 disse i måleglas, der indeholder en passende scintilla-tionsvæske.

3. Fremstilling af et karakteristisk nomogram 15 Et membran-filter af nitrocellulose anbringes på overfladen af en plade, som er forsynet med et antal huller, hvilken plade er anbragt på en beholder, der er forbundet til en sugepumpe. Denne gør det muligt at etablere et let reduceret tryk, som udøves på membranen i niveau med pla-20 dens huller (diameter 12 mm). Membranen befugtes med en SSC-puffer, og i de fordybninger med begrænset dybde, som dannes af de dele af membranen, som ligger i overfladens huller, anbringes (under de ovenfor angivne betingelser) stigende doser af det ifølge opfindelsen anvendte rea-25 gens, som indeholder partikler, f.eks. DNA-HBV "indpakket" i en lambda-phag i suspensionen i blodserum, hvorved man opnår et antal afsætninger, der indeholder mængder af 2 10 partikler på mellem 10 og 10 viruspartikler pr. fordybning. Man frembringer kontakt under betingelser, som 30 tillader en hybridisering med en mærket prøve, f.eks. med 32 P som tidligere angivet. Efter at man har gennemført præ-hybridiseringen og selve hybridiseringen under konventionelle betingelser, måler man for hver fordybning det tilbageholdte radioaktivitetsniveau og forholdet mel-35 lem den målte radioaktivitet og baggrundsstøjen (bestemt med en kontrolprøve, som er behandlet under samme betingelser, som er fri for viruspartikler underkastet de sam- 15

DK 164880 B

me analyseoperationer), og kurven spores svarende til variationen i forholdene imellem den målte radioaktivitet og baggrundsstøjen som en funktion af det antal viruspartikler, der er indeholdt i de reagenser, som på forhånd 5 er anbragt i fordybningerne.

Derefter frembringes den kurve, som repræsenterer variationer i dette forhold (S/B: forkortelse for "signal/bag-grundsstøj") som en funktion af den pågældende koncentra-10 tion. Et sådant nomogram ses eksempelvis på tegningen.

Denne illustrerer den variation, som observeres for S/B-forholdet (på ordinataksen), som funktion af de oprindelige mængder af phag-partikler, som er afsat i hver fordybning (N er antallet af partikler pr. fordybning afsat 15 på abscisseaksen). Målingerne er foretaget direkte på filteret ved hjælp af et autoradiogram.

Eftersom det herefter er et spørgsmål om at bestemme indholdet af viruspartikler i den prøve, som studeres, måles 20 S/B-forholdet under de samme betingelser som tidligere beskrevet. Bestemmelsen af det ukendte indhold af viruspartikler fremgår derefter ved sammenligning af S/B-for-hold, som opnås, med nomogrammet, idet man om nødvendigt medtager en korrektionsfaktor, som også kan bestemmes på 25 forhånd, og som sandsynligvis skyldes den mulige forskel imellem sammensætningen af de anvendte reagenser og sammensætningen af de prøver, som skal testes.

Det er muligt at frembringe nomogrammer af samme type for 30 alle andre typer af reagenser, der indeholder koncentrationer af særskilt "pakkede" klonede DNA'er.

Til kvantitative målinger kan de værdier, der svarer til S/B-forholdet på over 2, bekvemt regnes som pålidelige.

En kvantitativ analysemetode, som kan benyttes som modifikation, involverer HBV-DNA-sekvenser, som er mærket ra- 35

DK 164880 B

16 dioaktivt, som har en kendt specifik aktivitet, og som er immobiliseret på en fast bærer. Disse immobiliserede standardreagenser behandles derefter som angivet ovenfor.

Der frembringes en hybridisering imellem disse immobili-5 serede sekvenser og et system af radioaktivt mærkede reagenser med kendte koncentrationer af phag-partikler på den ene side og på den anden side et andet system bestående af på forhånd bestemte doser af en prøve, der skal analyseres, og hvis indhold af naturlige viruspartikler 10 er ukendt.

Den endelige mængde DNA, som tilbageholdes på den faste bærer, kan derefter beregnes, og det er muligt både at bestemme hybridiseringseffektiviteten og den kvantitative 15 dosering af hybridiserede partikler, der hidrører fra de prøver, som skal analyseres.

Generelt kan den omhandlede fremgangsmåde, på hvis praktiske gennemførelse der er givet et eksempel ovenfor, 20 tilpasses til enhver anden type af virale partikler og tilpasses til enhver tilsvarende prøvesubstans, som gør brug af andre markeringer, f.eks. enzymatiske eller fluorescerende markeringer. Fremgangsmåden kan benyttes til bestemmelse af relative koncentrationer af enhver 25 form for DNA eller især RNA af viral oprindelse i biologiske væsker, væv eller celler. Reagenserne, som benyttes ifølge opfindelsen, kan også anvendes til fremstilling af internationale standarder, både hvad angår reagenserne og hvad angår de prøver, der indeholder tilsvarende naturli-30 ge virale partikler.

Med fremgangsmåden ifølge opfindelsen tilvejebringes således en direkte kvantitativ analysemetode til bestemmelse af partikler, f.eks. HBV-partikler, og anvendelsen af 35 denne analysemetode er særdeles simpel. Den er særligt nyttig, når der er tale om at bestemme graden af en infektion, som en patient lider af, med henblik på at be- 17

DK 164880 B

dømme infektionens udvikling og bestemme effektiviteten af en anti-viral behandling.

5 10 15 20 25 30 35

Claims (12)

1. Fremgangsmåde til kvantitativ bestemmelse af indholdet 5 af en på forhånd bestemt viral nucleinsyre, der kan være indeholdt i et naturligt biologisk medium, hvorved dette medium bringes i kontakt med en DNA-sonde, idet mediet forinden er bragt i en tilstand, der muliggør hybridise-ring, kendetegnet ved, at man: 10 - bringer flere standardiserede reagenser, som hver især indeholder en klonet nucleinsyre i indbyrdes forskellige koncentrationer, der kan hybridiseres med sonden, og som forinden er bragt i en tilstand, der muliggør hy- 15 bridisering, i kontakt med sonden, - måler forholdet imellem den måling, der har relation til den mængde af sonden, der er blevet hybridiseret med den virale nucleinsyre, hvis indhold skal bestem- 20 mes, og baggrundsstøjen målt under de samme betingelser med en negativ kontrol, - måler de tilsvarende forhold imellem målingerne, der har relation til de mængder af den samme sonde, der er 25 blevet hybridiseret med de klonede nucleinsyrer fra de ovennævnte standardiserede reagenser, og et kontrolreagens tilsvarende baggrundsstøj under lignende eller identiske betingelser, idet de standardiserede reagenser indeholder de klonede DNA'er i blanding med en pro- 30 teinsammensætning, der ligner - eller er identisk med - proteinsammensætningen af det biologiske medium, og som muliggør fiksering af de klonede DNA'er til en bærer af membran- eller filtertype, og idet de standardiserede reagenser kan skelnes fra kontrolreagenset ved deres 35 indhold af klonet nucleinsyre, der kan hybridiseres med sonden, og skelnes indbyrdes ved de bestemte, men indbyrdes forskellige koncentrationer af den klonede DK 164880B nucleinsyre, og - sammenligner forholdet, som er målt med den virale nucleinsyre, hvis indhold skal bestemmes, med de forhold, 5 der er fundet med de klonede nucleinsyrer fra reagen serne hvorved indholdet af den virale nucleinsyre i det undersøgte biologiske medium fremgår af en korrelation med sammenligningsresultaterne.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at de standardiserede reagenser indeholder de essentielle bestanddele af det naturlige biologiske medium eller består af det samme naturlige biologiske medium som det, der indeholder den virale nucleinsyre, der skal be-15 stemmes kvantitativt, med den undtagelse, at mediet til at begynde med ikke indeholder det virale DNA, der skal bestemmes kvantitativt, idet disse reagenser imidlertid tillige indeholder det ovennævnte klonede DNA i fastlagte, indbyrdes forskellige koncentrationer. 20

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at reagenserne består af et sundt blodserum med tilsætning af det klonede DNA i indbyrdes forskellige koncentrationer . 25

4. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-3, kendetegnet ved, at den på forhånd udvalgte virale nucleinsyre, der skal bestemmes kvantitativt, består af et DNA fra hepatitis B-virus, og at det klonede DNA i 30 hvert af reagenserne indeholder en DNA-sekvens, som kan hybridiseres med genomet af hepatitis B-virus, såsom DNA-HBV eller S-genet fra genomet af hepatitis B-virus.

5. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-4, k e n -35 detegnet ved, at det klonede DNA i hvert af de standardiserede reagenser består af en klonet phag, hvori der er indført en DNA-sekvens, der kan hybridiseres med DK 164880B den ovennævnte sonde.

6. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-5, kendetegnet ved, at det klonede DNA i hvert af de 5 standardiserede reagenser omfatter en markør.

7. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-6, kendetegnet ved, at hvert af de standardiserede reagenser er fikseret til en bærer under betingelser, der 10 muliggør efterfølgende hybridisering af reagensets klonede DNA med DNA-sonden, og som også kan hybridiseres med den virale nucleinsyre, der skal bestemmes.

8. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-7, k e n -15 detegnet ved, at referenceforholdene i relation til de standardiserede reagenser er opnået ud fra et nomogram, der er etableret på forhånd på basis af hybri-diseringsforsøg med disse reagenser og sonden, hvilket nomogram er repræsentativt for variationen af disse for-20 hold som funktion af koncentrationerne af de hybridisere-de nucleinsyrer indeholdt i reagenserne, og at man sammenligner det målte forhold for den virale nucleinsyre, som skal bestemmes kvantitativt i mediet, med de referenceforhold, der kan aflæses af nomogrammet. 25

9. Udstyr eller "kit" til kvantitativ bestemmelse af et viralt DNA i et naturligt biologisk medium, der er forligeligt med udviklingen af det tilsvarende virus, i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge ethvert af kravene 30 1-8, kendetegnet ved, at det består af: - en sonde, der kan hybridiseres med den virale nucleinsyre, der skal bestemmes kvantitativt, 35. et kontrolreagens dannet af en sammensætning af protei ner, der ligner (eller er identiske med) proteinerne i det biologiske medium, og som muliggør fiksering af DK 164880 B nucleinsyren til en bærer af membran- eller filtertype, idet kontrolreagenset dog ikke indeholder det klonede DNA, og 5. et antal standardiserede referencereagenser, som inde holder kontrolreagensets proteinsammensætning og som indeholder forskellige koncentrationer af en klonet nucleinsyre, der kan hybridiseres med sonden.

10. Udstyr ifølge krav 9, kendetegnet ved, at det både omfatter de ovennævnte reagenser fikseret til en bærer og de ovennævnte reagenser, der ikke er fikseret til en bærer, idet de sidstnævnte reagenser bærer en markør, hvilket ikke er tilfældet for de førstnævnte reagen-15 ser.

11. Udstyr ifølge krav 9 eller 10, kendetegnet ved, at det yderligere omfatter mindst et nomogram, som er repræsentativt for variationerne i forholdet mellem de 20 målte intensiteter af et signal, der er frembragt af en markør efter hybridisering mellem sonden og de klonede DNA'er fra de forskellige reagenser, og baggrundsstøjen målt under tilsvarende betingelser ved at bringe kontrolreagenset i kontakt med den samme sonde under identiske 25 hybridiseringsbetingelser, idet disse variationer er en funktion af mængderne af klonet DNA indeholdt i de anvendte reagenser, og idet markøren bæres af én af komponenterne i hybridiseringsproceduren, fortrinsvis sonden.

12. Udstyr ifølge ethvert af kravene 9-11, kende tegnet ved, at referencereagensernes klonede DNA'er indeholder en sekvens, der er hybridiserbar med genomet af hepatitis B-virus, især DNA-HBV eller S-genet fra genomet af hepatitis B-virus. 35