FR2492985A1 - Procede d'etude et de detection d'un gene susceptible d'etre transcrit en un arn messager determine et de la capacite des cellules ou d'une fraction cellulaire d'en assurer la transcription et application au diagnostic in vitro de maladies dues a des anomalies genetiques ou a des adn etrangers - Google Patents

Procede d'etude et de detection d'un gene susceptible d'etre transcrit en un arn messager determine et de la capacite des cellules ou d'une fraction cellulaire d'en assurer la transcription et application au diagnostic in vitro de maladies dues a des anomalies genetiques ou a des adn etrangers Download PDF

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Abstract

PROCEDE DE DETECTION, NOTAMMENT EN VUE D'UN DIAGNOSTIC IN VITRO, D'UN GENE SUSCEPTIBLE D'ETRE EXPRIME SOUS LA FORME D'UNE PROTEINE DETERMINEE. LE PROCEDE CONSISTE A METTRE EN CONTACT UN EXTRAIT ESSENTIELLEMENT DEPOURVU D'ACIDE NUCLEIQUE DES CELLULES SUPPOSEES NORMALEMENT CONTENIR LE GENE EN QUESTION, AVEC UNE SEQUENCE DE L'ADN EXOGENE COMPLETE CONTENANT LEDIT GENE EN PRESENCE DE PRECURSEUR NECESSAIRE A LA SYNTHESE DE L'ARN MESSAGER ET A DETECTER LA PRODUCTION EFFECTIVE EVENTUELLE DE CE DERNIER.

Description

Procédé d'étude et de détectation d'un gène suceptible d'être transcrit en un ARN messager déterminé et de la capacité des cellules ou d'une fraction cellulaire d'en assurer la transcription et application au diagnostic in vitro de maladies dues à des anomalies génétiques ou à des AD; étrangers.
L'invention concerne un procédé d'étude et de détection de séquences d'ADN contenant un gène susceptible d'etre transcrit en un ARN messager déterminé ou de la capacité des cellules, notamment eucaryotes, d'en assurer la transcription. Elle concerne également plus particulièrement l'application de ce procédé à des diagnostics in vitro de maladies - ou de potentialités de maladies - dues à des anomalies génétiques de causes diverses ou encore à la contamination de l'organisme par des ADN étrangers, notamment ceux aptes a coder pour des protéines à caractère antigénique, notamment des protéines virales.
I1 est bien connu que des méthodes de diagnostic de certaines maladies reposent sur la détection analytique de la présence ou selon le cas de l'absence dans les milieux ou tissus biologiques appropriés, d'une protéine déterminée. A titre d'exemples de ces maladies on citera certaines anémies et leucémies caractérisables entre autres par la présence anormale dans la circulation sanguine de précurseurs des he'maties, notamment de proérythroblastes et d'érythroblastes ainsi que de l'ARN messager synthétisé par ces précurseurs, parmi lesquels 1'AX ss-globine. On peut également observer des accumulations d'érithroblastes dans des tissus érythrémiques, tels que la rate.Il est bien connu que ces précurseurs des hématies qui se forment normalement dans la moelle osseuse ne passent pas dans la circulation sanguine chez des sujets sains.
Un mode de diagnostic des anémies ou leucémies de ce type consiste donc dans la détection in vitro de la présence d'erythroblastes dans le sang ou dans certains tissus érythrémiques, notamment la rate,
A l'inverse, c'est l'absence de certaines protéines ou tout au moins des quantités insuffisantes de certaines protéines qui peuvent etre mises en oeuvre pour dépister in vitro certaines maladies ou anomalies.
I1 peut en etre ainsi par exemple dans le cas des < - ou 3-thalassémies qui peuvent etre caractérisées par une capacité insuffisante des cellules de l'hote de synthétiser de l'hémoglobine.
On peut aussi dans certains cas déterminer si un sujet est atteint ou a été atteint d'une maladie induite par un ADN étranger, notamment un virus, par la détection dans le milieu pathologique approprié de produits rsi-uels de traduction de ces ADN étrangers. A titre d'exemple on mentionnera la détection au niveau du sérum sanguin ou du tissu hépatique d'antigène HBs chez des patients qui ont été exposés au virus de l'hépatite virale
B.
L'un des buts de l'invention est de fournir des procédés de diagnostic in vitro de maladies ou anomalies du genre en question, notamment susceptiblesd'être adaptés à détecter ces maladies ou anomalies à un stade extremement précoce de leur développement, voire meme avant que celui-ci n'ait réellement été déclenché dans l'organisme. L'on conçoit l'intéret fondamental que peut présenter une détection précoce de ces maladies souvent extremement graves, à l'égard desquelles un traitement thérapeutique a d'autant plus de chances d'etre efficace que la maladie n'est pas encore développée.
L'invention s'appuie sur l'idée de la détection précoce de la synthèse de l'ARN messager spécifique cor respondant à la protéine déterminée qui est susceptible d'etre en corrélation avec la maladie éventuelle recherchée. L'on sait en effet que la synthèse d'une telle protéine est la traduction finale d'une séquence d"évene- ments au niveau cellulaire résultant de l'expression du gène correspondant appartenant au patrimoine génétique des cellules en question. L'invention se propose par conséquent de permettre la détection aisée de l'un des évènements antérieurs et ce au niveau de l'immédiate transcription du gène correspondant en 1'ARN messager spécifique.
Pour obvier à la difficulté apparemment insurmontable que représente la détection d'un ARN messager spécifique parmi la multitude des ARN messagers résultant de la transcription de ltensemble des gènes des cellules en cause, l'invention met a profit la capacite d'un gène purifié à reproduire in vitro la synthèse d'ARN messager observée in vivo, lorsque cette opération est réalisée au sein d'un milieu contenant tous les éléments nécessaires à cette synthèse.Plus particulièrement le procédé de détection selon l'invention est caractérisé par la mise en contact in vitro d'une séquence exogène d'ADN contenant un gène purifié , codant pour L'ART messager recherché, avec un milieu contenant & la fois, d'une part, un extrait de cellules dans lequel 1'ARN messager recherché est éventuellement susceptible d'être synthétisé, ce milieu ayant cependant au préalable été débarrassé de ses acides nucléiques, et, d'autre part, des précurseurs, notammént les nucléotides nécessaires à l'éventuelle synthèse in vitro de 1'ARN messager correspondant.
L'invention consiste donc, outre la tentative de transcription d'un ADN in vitro, plutôt qu'in vivo, en la substitution, au contact du milieu cellulaire contenant les éventuels facteurs de régulation non nucléique de la synthèse de 1'ARN messager recherché, d'une séquence (ou d'un nombre réduit de séquences) d'ADN au patrimoine génétique excessivement complexe de la cellule. Cette séquence purifiée d'ADN résulte par exemple de la purification par clonage dans une bactérie du gène précédemment identifié et isolé qui
est susceptible d'être transcrit en l'ARN messager étudié. Avantageusement cette séquence (ou ces séquences) ne comporte que ce seul gène ou un groupe de gènes parmi lesquels le gène étudié, dans le cas de gènes dont la régulation est coordonnée, à partir de facteurs internes d'initiation et de régulation communs au niveau de 1'ADN.
La mise en contact de la susdite séquence exogène d' ADN avec le milieu tel que ci-dessus défini ne conduira donc à la séquence d'ARN messager en cause que pour autantQU'existaient antérieurement dans les cellules dont provenait l'extrait cellulaire, à la fois un gène endogène sensiblement identique au gène de la séquence d'ADN exogène ainsi que les facteurs de régulation enzymatique nécessaires à la régulation de la transcription de ce gène en ARN messager, étape évidemment nécessaire au développement des séquences aboutissant à la traduction finale de ce gène en protéines.
Dans le cas contraire où les cellules,dont l'extrait utilisé était originaire,ne possédaient pas dans leur patrimoine génétique les facteurs de régulation enzymatique nécessaires à l'initiation et à la régulation de la transcription, on n'observera aucune synthèse in vitro de 1'ARN messager recherché.
C'est ainsi que dans l'une des applications préférées de l'invention consistant dans le diagnostic de la présence, voire même seulement de la potentialité de présence dans un échantillon sanguin ou dans un tissu érythrémique de 0globine, le procédé selon l'invention comprend la mise en contact d'un extrait cellulaire obtenu à partir des cellules susceptibles de la contenir, par exemple de sang, cependant dépourvu de leurs acides nucléiques, avec une séquence d'ADN exogène contenant le gène purifié de la globine, par exemple obtenu par clonage dans une bactérie, au sein d'un milieu contenant les précurseurs nécessaires, notamment les nucléotides ATP, GTP,
CTP et UTP, et de façon en soi connue pour ce qui est des synthèses d'ARN in vitro, des autres constituants, notamment
sels de magnésium, nécessaires à la synthèse de l'éventuel ARN messager correspondant à la Globine et la détection de la pro- duction éventuelle de cet ARN messager spécifique. Selon que les cellules du patient contenaient ou non des facteurs néÔa'a.eurs susoeptibles de permettre ltexpression de la -g1obine, lton détectera ------------------------- la synthèse ou l'absence de synthèse de l'ARN messager correspondant in vitro. Ce test in vitre permet donc une détection extremement précoce de maladies corrélables à une teneur anormale en érythroblastes de tissu sanguin ou d'autres cellules réputées comme pouvant en contenir.
L'invention s'applique dans des conditions tout à fait analogues lorsqu'il s'agit de détecter de façon précoce l'incapacité ou l'insuffisante capacité des "cellules compétentes" (étant entendu que l'on désignera par la suite et sous cette expression les cellules qui, d'une façon générale, sont le cas échéant susceptibles d'héberger le gène recherché en rapport avec une application donnée) du sujet dont elles sont originaires de normalement synthétiser in vivo une autre protéine détermi- née, dès lors que le gène responsable a été identifié.
Ainsi l'invention s'applique dans des conditions semblables au diagnostic de l'insuffisante synthèse ou absence de synthèse par l'organisme de protéines telles que lthmoglobine,
( rlet $thalassémies)1 l'hormone de croissance, insuffisances enzymatiques-(galactosémies).
étant entendu que l'on aura dans chaque cas recours à une séquence d'ADN spécifique contenant le gène correspondant, obtenu par clonage.
D'une façon générale l'invention peut etre mise en oeuvre avec tout gène purifié par clonage et contenant le site d'initiation de la transcription. Il peut permettre de détecter précocement des anomalies liées au fonctionnement d'un gène, ou d'un ensemble de gènes régulés de façon coordonnée. On citera encore la détection ainsi possible de l'apparition de certaines formes blastiques, dans les tissus lymphoides,par mise en contact d'un extrait de ces tissus préalablement débarrassés de leur teneur en acides nucléiques avec des gènes immunoglobulines purifiés par clonage. On citera encore, à titre d'exemple supplémentaire, la détection précoce grâce au procédé de l'invention de certaines maladies génétiques (maladies autoimmunes, déficiences enzymatiques, certaines hémoglobinopathies) liées au mauvais fonctionnement d'un ou de plusieurs gènes.
L'invention peut encore s'appliquer de la meme façon aux détections ou dépistages de certaines maladies virales ou, dans certains cas, du fait que le sujet dont les cellules sont examinées y a été exposé. C'est le cas par exemple des sujets qui ont été affectés par une hépatite virale B, cas dans lequel le test sera avantageusement mis en oeuvre sur des extraits cellulaires obtenus à partir de cellules hépatiques préalablement débarrassées de leurs acides nucléiques et mises en contact dans les conditions sus-indiquées avec l'ADN du virus de l'hépatite virale B purifié par clonage ou avec une séquence particulière de cet ADN, notamment celle codant pour des déterminants antigéniques principaux de ce virus, en l'occurence le "gène S" de cet ADN, qui code pour des déterminants antigéniques caractéristiques de l'antigène de surface HBs.
L'invention peut donc au niveau de l'application au diagnostic être définie de façon générale comme consistant en le diagnostic in vitro d'une maladie impliquant selon le cas l'incapacité ou au contraire la capacité, éventuellement elle-même insuffisante ou excessive, de cellules compétentes de synthétiser une protéine déterminée ce procédé étant caractérisé par la mise en contact d'un extrait essentiellement dépourvu des acides nucléiques des cellules compétentes correspondantes avec une séquence d'ADN exogène naturellement complète en ce qu'elle comporte
en sus du gène requis les éléments d'initiation et de régularisation interne à l'ADN correspondant, et ce en présence desdits précurseurs, parmi lesquels les nucléotides de base dont l'un au moins est marqué, le diagnostic étant alors corrélatif à la non détection ou à la détection éventuellement elle-meme insuffisante ou excessive d'ARN messager spécifique corres pondant synthétisé in vitro.
La production des extraits cellulaires dépourvus d'ADN à partir des cellules à étudier peut etre réalisée en mettant en oeuvre tout procédé connu de séparation des acides nucléiques tel que celui dont un exemple sera indiqué plus loin à titre d'exemple aux seules fins d'illustrer plus complètement l'invention.
La détection de 1'ARN messager éventuellement produit sur les séquences d'ADN exogène peut également etre réalisée de toute façon connue en soi. Avantageusement l'on a recours au marquage de l'un des nucléotides à partir desquelles est effectuée la synthèse de l'ARN messager, lorsque celle-ci est possible, dans les conditions qui ont été indiquées plus haut,d'où la possibilité de distinguer le complexe ADN-ARN naissant,éventuellement formé d'un ADN non modifié témoin,du fait de la plus grande radioactivité du premier alors beaucoup plus importante que celle du second. Le marquage peut être réalisé en ayant recours à des méthodes de marquage radio-actif ou enzymatique connues.
De préférence la séquence d,'ADN exogène, mise en contact avec l'extrait cellulaire dans les conditions qui ont été indiquées plus haut est elle-meme à l'état de mélange avec au moins une autre séquence d'ADN, de préférence hétérologue, utilisée à titre de référence interne, non susceptible d'etre transcrite en présence dudit extrait ou de ladite fraction et dans une proportion initialement déterminée vis à vis de la susdite séquence d'ADN exogène,et l'on détecte les différences relatives d'adsorption du marqueur observées au niveau tant de la susdite séquence d'ADN exogène que de la référence interne, après la susdite mise en contact dans des conditions propres à éventuellement permettre une synthèse d'ARN messager.
La séparation ultérieure, notamment sur gel d'agarose ou analogue, de la séquence d'ADN exogène contenant le complexe ADN-ARN formé et des références internes rend alors possible une visualisation, notamment par autoradiographie,des différences relatives d'adsorption du marqueur au niveau respectivement de la susdite séquence d,' ADìi exogène contenant le gène transcrit et des références internes.
Bien que le procédé selon l'invention trouve son application préférée dans les techniques de diagnostic in vitro qui ont été évoquées ci-dessus, il apparaitra immédiatement qu'il est applicable également à des études, soit de séquences d'ADN renfermant un gène caractéristique susceptible d'etre transcrit en un ARN messager1 soit à des fractions de purification plus ou moins poussée d'extraits cellulaires en vue du repérage de celles des fractions qui contiennent les facteurs de régulation né ces- saires à ltexpression du gène in vivo.
D'une façon générale le procédé selon l'invention peut donc etre défini comme un procédé de détermination des capacités réciproques que possèdent soit des cellules normalement susceptibles d'etre le siège de la production d'un ARN messager spécifique correspondant à une protéine déterminée ou une fraction originaire de telles cellules1 soit une séquence d'ADN exogène également déterminée comportant éventuellement un gène spécifique correspondant codant pour la même protéine détenanée, de permettre la transcription effective de cet ARN messager, ce procédé étant caractérisé par la mise en contact d'un extrait de cette fraction ou de ces cellules, essentiellement dépourvu des acides nucléiques que ces cellules contenaient initialement, avec ladite séquence exogène d'ADN, en présence des précurseurs parmi lesquels les nucléotides nécessaires et dans des conditions propres à permettre l'éventuelle synthèse in vitro d'ARN messager et en ce que l'on détecte l'ARN messaaer déterminé éventuellement synthétisé.Dans un cas d'application préféré supplémentaire de l'invention on a recours à un extrait cellulaire ou fraction qui comprend les facteurs de régulation cellulaire normalemnet requis pour la transcription dudit gène specifique, en particulier lorsque le procédé vise à la détermination de la présence ou non dans la séquence d'ADN exogène, soit du gène à partir duquel cette transcription est susceptible d'être effectuée, soit de la présence d'autres éléments endogènes, notamment d'initiation et de régulation de la transcription.Par exemple le procédé selon l'invention est applicable à la localisation au moins approximative du site d'initiation de la transcription du gène qui lui est associé dès lors que la séquence d'ADN initialement complète peut etre fragmentée en fragments plus petits, notamment au moyen d'enzymes de restriction différentes, la localisation résultant de la comparaison des différents fragments selon qu'ils réagissent positivement ou non dans les essais de transcription en hRlT messager des gènes qu'ils contiennent.
Dans un autre type d'application de l'invention le procédé visera à la détermination de la présence ou non des éléments régulateurs cellulaires dans un extrait cellulaire, ladite séquence d'ADN exogène étant alors complète en ce qu'elle comprend les séquences d'acide nucléi q' regulatrices de la transcription de llARlmessager susdit.
Des caractéristiques complémentaires de l'invention apparaitront encore à la lumière de la description détaillée d'un exemple de mise en oeuvre du procédé selon l'inventlon, exemple qui n'est fourni qu'à des fins d'il- lustration et non de limitation de l'invention. Référence sera faite au dessin dans lequel les figures 1 à 3 sont des schémas de principe ayant pour but de faciliter la eorapréhension de la façon dont lés observations sont faites et exploites en vue de conclure à la synthèse - ou non synthèse - d'ARN messager spécifique dans les conditions développées ci-dessus.
a) Préparation des fragments d'ADN exogènes.
L'ADN recombinant, contenant ie gene B globine murin ou humain est préparé à partir du bactériophage Agt 3 ss G2 amplifié dans la bactérie Escherichia celui. L'ADN est extrait à l'aide d'un volume de phénol saturé d'eau puis dialysé contre une solution contenant Tris HCl pH 7,2, 20 .- NaCl 50mM, MgCl2 10 mM dithiothréitol 0,5 mM. Le Di'47A recombinant peut etre coupé en trois fragments par l'enzyme de restriction EcoRi (0,5 unités par ug d'ADN pendant 2 heures à 370 C).Le premier comporte l'insertion ss globine (7 kilobases) et le site d'initiation de l'ARN messager correspondant et les deux autres, l'un de 12 kilobases et l'autre de 22 kilobases, sont porteurs de gènes de bactériophage X mais dépourvus de sites d' initiation in vitro.
b) Préparation des extraits cellulaires.
Environ 105 cellules correspondant à 0,5 rnl de sang de souris sont lavées 3 fois dans une solution tamponnée contenant du phosphate monosodique pH 7,4 20 mM,
NaCl 0,14 M. Après élimination du sérum et de la majorité des globules blancs, les cellules sont reprises dans 0,5 à 1 ml d'une solution à basse force ionique (Tris pH 7,8 10 mM MgCl2 3 mise CaCl2 2 mise dithiothreitol 0,5 t:,
EDTA 0,1 mM).Après homogénéisation rapide et à froid avec un homogéniseur Potter, du sucrose 2 N (pour protéger les noyaux de façon à éviter la libération d'ADN et d'histones, protéines susceptibles de perturber les réactions ultérieures) est ajouté pour obtenir une concentration finale de 0,3 M. L'homogénat est centrifugé pendant 30 minutes à 10.000 rpm dans un rotor HBA SORVALL. Le surnageant est récolté en éliminant la partie supérieure (matières grasses) et la partie inférieure (contenant éventuellement un certain nombre de noyaux) du tube (hauteur du tube : 10 cm; diamètre du tube : 1,5 cm
Réparti en aliquot, de 50 à 100 ul, cet extrait peut etre conservé au moins deux mois par congélation rapide dans l'azote liquide.
c) Préparation et analyse des complexes de transcription.
Les complexes de transcription sont formés sur les trois fragments D'ADN précités en présence d'une quantité optimale d'extrait cellulaire contenant l'ARN polymérase II et les précurseurs nécessaires à la synthèse d'ARN.
Dans un volume final de 30 1, les éléments suivants sont ajoutés successivement : Tris HCl pH 7,9, 50 iw1 ; MgCl2, 10 mM ; dithiothréitol 0,5 mM, EDTA 0,1 mM,
ATP, GTP 600 uN ; CTP 60 vM et UTP (aP32) Amersham, (acti- vité spécifique 500 Ci/mM) 6 pM. 1 ug des fragments d'ADN exogène préparés comme indiqué précédemment, 0,5 à 1 ug d'extrait cellulaire.
La synthèse d'ARN messager par l'ARNpolynérase II endogène est réalisée à 300C pendant 5 minutes. L'incubation est arrêtée par addition de 10 ul d'une solution contenant EDTA, 20 mM ; héparine 100 pg/ml. Pour déterminer la synthèse d'ARN total, un échantillon de 1 ul est précipité avec 5 % d'acide trichloroacétique ; le précipité est retenu sur un filtre de verre (GFC84 de la société SCHLINCHER & SCi!ULZ) et compté dans un compteur à scintillation.
Pour visualiser la synthèse d'ARN messager spécifique (ss globine), les complexes ADN, ARN naissants marqués au P32 sont séparés sur un gel d'agarose 0,8 %. La migration se fait à la chambre froide pendant environ 4 heures avec une tension de 120 V. Le gel est ensuite incubé pendant 20 minutes dans une solution à 200 pg de bromure d'éthidium. L'observation des fragments d'ADN se fait par fluorescence sous une lampe à rayons ultraviolets. Après l'avoir photographié, le gel est lavé dans l'eau et séché sous vide à froid pendant 2 heures. Une autoradiographie de 1 à 4 jours peut être réalisée à l'aide d'écrans renforcateurs du rayonnement (par exemple ceux commercialisés sous la marque CRONEX HUI PLUS (DUPONT
DE .4EMOURS).
L'intensité du rayonnement au niveau des fragments ss globine et du bactériophage X permet de mesurer la synthèse spécifique d'ARN ss globine par comparaison avec celle non spécifique sur les fragments hétérologueso Ainsi, l'extrait préparé à partir du sang des souris normales ne donne pas de test positif alors que celui du sang de souris anémiées contenant les érythroblastes permet la transcription spécifique du gène ss globine.
Les fig. 1, 2 et 3 du dessin ci-joint, visent à illustrer de façon tout à fait schématique la nature des observations qui peuvent être faites comme suite à la mise en oeuvre du procédé selon l'invention.
La fig. 1 et la fig. 3 illustrent ce qui peut être observé au niveau des autoradiographies de plaques de gel après l'opération de séparation par électrophorèse de plusieurs séquences d'ADN, dont dans certains cas des complexes de transcription ADN-ARN messagers.
La fig. 2 est représentative de façon non moins schématique de deux des cas susceptibles d'être observés.
A représente un ADN recombinant formé de trois fragments
B, C et D, séparables les uns des autres au moyen d'une endonucléase de restriction spécifique.
La mise en oeuvre du procédé selon l'invention au moyen de précurseurs,parmi lesquels l'UTP32 marqué, conduit à la formation de complexes de transcription ADI4- ARN soit sur le recombinant A lui-même, si la séparation en ses fragments n'a pas été totale au niveau du traitement par ltendonucléase, soit sur le seul fragment D (dans l'hypothèse où c'est le fragment D qui contient 1'ADN à transcrire), dans le cas où la séparation préalable du recombinant A a été totale (cas 1) ou à la fois sur le recombinant
A et sur le fragment D, dans le cas où la séparation préalable n'a été que partielle (cas 2) . Les fragments B et C jouent le rôle de référence interne, comme il est illustré dans les fig. 1 à 3.
Les bandes a, b, c et d des plaques de diffusion sur agarose de la fig. 1 sont supposées respectivement correspondantes au recombinant A et au fragment B, C et D.
Les plaques 1 et 2 sont représentatives de cas où aucun ART messager de transcription ne s'est formé. Les bandes a, b, c et d présentent dans les deux cas des intensités semblables reflétant soit l'absence d'incorporation de l'UTP32 , soit les incorpérations equivalentes parasites. La plaque 3 est représentative des phénomènes observés comme suite à la formation du complexe de transcription du frag ment d'ADN D avec Da:ec l'AR'Imessagercorrespondant (cas 1 évoqué ci-dessus). La présence d'ARN messager découle de la comparaison des intensités radio graphiques de la bande d et des bandes b et c correspondant aux références internes.
Enfin, la plaque 4 est représentative des phénomènes radioactifs observés dans le cas 2 ci-dessus, c'est-à-dire celui où l'ADN n'a pas été initialement totalement fragmenté.
L'ARN messager s'est alors fixé à la fois sur l'ADN non fragmenté (bande a) et sur le fragment B plus spécifique.
Là encore, la formation de L'ARN messager correspondant découle de la comparaison des intensités radiographiques des bandes observées.
La fig. 3 est également représentative de plaques autoradiographiques, permettant d'apprécier la capacité du procédé de l'invention de distinguer ceux des gènes qui parmi un ensemble de gènes régulés de façon coor donc, sont susceptibles d'être affectées par une anomalie.
A. supposer par exemple que la bande e corresponde à l'ADN recombinant initial, que les bandes f et g correspondent à des fragments hétérologues ou révérences internes et les bandes h, i, j et k à quatre gènes régulés de façon coordonnée, on constate que la plaque 5 témoigne d'une totale absence de formation d'ARN messager au cours de la mise en oeuvre ultérieure du procédé selon l'inventicn. La plaque 6 témoigne de la formation de l'ARN messa- ger au niveau du gène i, alors que dans la plaque 7 cette formation a1 ARN messager s'est formée au niveau des gènes j et k.
L' invention concerne finalement également un nécessaire contenant les éléw,ents nécessaires à la rîse en oeuvre du procédé selon l'inventon. En particulier un tel nécessaire comprend, lorsqu'il est destiné à des essais de détection de la capacité des cellules étudiées de promouvoir la synthèse d'un ARN messager donné - une séquence d'ADN exogène contenant le gène correspon
dant et, le cas échéant, au moins l'une des susdites
références internes, - les susdits précurseurs, - le cas échéant, au moins un extrait cellulaire sain ou
un extrait cellulaire pathologique ou les deux à ia fois,
utilisables en tant que témoins.
Avantageusement, le nécessaire comprend au moins soit les susdites références internes, soit un extrait cellulaire sain,soit un extrait cellulaire pathologique en vue de permettre dans tous les cas des essais comparatifs reposant, dans ie cas où le nécessaire comprend des références internes, sur la comparaison des niveaux d'incorporation relatifs du nucléotide marqué respectivement sur la séquence comprenant le gène déterminé et sur les références internes et, dans le cas où l'on a recours à des extraits cellulaires témoins, sur la comparaison des -n-iorporations du nucléotide marqué respectivement sur la séquence d'ADN exogène mise en oeuvre en présence de l'extrait cellulaire à étudier et sur une séquence d'AD!J exogène équivalente mise en présence de l'extrait cellulaire témoin.
I1 peut naturellement être avantageux pour confirmer la sécurité du diagnostic d'avoir recours aux deux types.de témoins à la fois.
- Corne il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de > e qui précède, l'inventIon ne se limite nullement à ceux de ses odes d'application et de réalisation qui ont été plus spécialement envisagés ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes ;Far exemple, l'invention s'ap- plique encore à l'étude de ia possibilité de séquences d'ADN contenant des gènes déterminés, d'être exprimées dans un environnement cellulaire différent ; par exemple l'in ention s'appliquerait à des essais visant à déterminer la capacité d'expression du gène de fixation de l'azote d'une plante, le procédé comprenant alors la mise en contact de ce gène avec un extrait bactérien obtenu, après séparation des acides nucléiques des bactéries étudiées.
A l'inverse, l'invention permet également, lorsqu'est connue la capacité de certains organismes de permettre l'expression d'un gène déterminé, de rechercher grace au milieu cellulaire obtenu à partir de cet organisme, après séparation de l'ADN, si des séquences d'ADN hétérologues, d'origines différentes, sont aptes à synthétiser elles-mê.mes 1'ARN messager correspondant à un tel gène, après mise en contact avec ce milieu en présence des précurseurs, dans les conditions qui ont été définies plus haut.

Claims (11)

  1. REVENDICATIONS
    ARN messager caractérisé par la mise en contact d'un extrait de cette fraction ou de ces cellules, essentiellement dépourvu des acides nucléiques que ces cellules contenaient initialement, avec ladite séquence exogène d'ADN, en présence des précurseurs parmi lesquels les nucléotides nécessaires et dans des conditions propres à permettre l'éven- tuelle synthèse in vitro d'ARN messager et en ce que l'on détecte 1'ARN messager déterminé éventuellement synthétisé.
    l - Procédé de détermination des capacités réciproques que possèdent soit des cellules normalement susceptibles d'être le siège de la production d'un ARN messager spécifique correspondant à une protéine déterminée ou une fraction originaire de telles cellules, soit une séquence d 'ADN exogène é,calement déterminée coepcrtant éventelietner't un gène spécifique correspondant codant pour la meme protéine déterminée, de permettre la transcription effective de cet
  2. 2 - Procédé selon la revendication 1 caractérise en ce que ledit extrait cellulaire ou fraction comprend les facteurs de régulation cellulaire normalement requis pour la transcription dudit gène spécifique et que le pro cedé vise à la détermination de la présence ou non dans la séquence d'ADN exogène, soit du gène à partir duquel cette transcription est susceptible d'être effectuée, soit d'autres éléments endogènes, notamment d'initiation et de régulation de la transcription.
  3. 3 - Procédé selon la revendication 1, carac térisé en ce que ladite séquence d'ADN exogène est complète en ce qu'elle comprend les éléments régulateurs nucléiques de la transcription de 1'ARN messager susdit et que le procédé vise à la détermination de la présence ou non des éléments régulateurs cellulaires dans ledit extrait cellulaire.
  4. 4 - Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que l'extrait cellulaire est un extrait cytosolique.
  5. 5 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que l'un au moins des susdits nucléotides comporte un marqueur.
  6. 6 - Procédé selon la revendication 5 caractérisé en ce que ledit extrait cellulaire ou ladite fraction cellulaire sont mis en contact avec la susdite séquence d'ADN exogène elle-meme à l'état de mélange avec au moins une autre séquence d'ADN, utilisée à titre de référence interne, de préférence hétérologue, non -susceptible d'être transcrite en présence dudit extrait ou de ladite fraction et dans une proportion initialement déterminée vis à vis de la susdite séquence d'ADN exogène, en ce crue, après le susdit contact l'on produit la séparation, et en ce que l'on détecte les diffé rends relatives dXadsorption du marqueur observées au niveau tant de la susdite séquence d'ADN exogène que de la référence interne après la susdite mise en contact dans des conditions propres à éventuellement permettre une synthèse d'ARN messager.
  7. 7 - Procédé selon la revendication 6 caractérisé en ce que la susdite séquence d'ADN exogène est d'origine eucaryote et ladite ou lesdites références internes sont d'origine procaryote, notamment bactérienne ou virale, ladite séquence d'ADN exogène et la ou lesdites références internes résultant de préférence du traitement d'un ADNrecombinant dans lequel était auparavant insérée ladite séquence d'ADN exogène par au moins une endonucléase, notamment de restriction appropriée.
  8. 8 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 7 caractérisé en ce que 1'ADN exogène code pour la ss -globine.
  9. 9 - Procédé selon les revendications 2 à 7 caractérisé en ce que 1'ADN exogène contient 1'ADN du virus de l'hépatite B ou une séquence antigènique spécifique de celui-ci, tel que le "gène S" codant pour l'antigène HBs de l'hépatite virale.
  10. 10 - Application du procédé selon la revendication 3, seule ou en combinaison avec l'une quelconque des revendications 4 à 9, au diagnostic in vitro d'une maladie impliquant selon le cas, l'incapacité ou au contraire la capacité, éventuellement elle-meme insuffisante ou excessive, de cellules compétentes de l'rate de synthéti ser un ARN messager déterminé, caractérisé par la mise en contact d'un extrait essentiellement dépourvu d'acides nucléiques desdites cellules compétentes avec la séquence d'ADN exogène complète correspondante en présence desdits précurseurs, le diagnostic étant alors corrélatif à la non-détection ou à une détection éventuellement en quantité insuffisante ou excessive, de 1gNEN messager spécifique synthétisé in vitro.
    au moins l'une des susdites références internes.
    - la susdite séquence d'ADN exogène et, le cas échéant,
  11. 11 - nécessaire pour la nlse en oeuvre de 1'ap- libation sus-indiquée comportant
    la fois, utilisables en tant que témoins.
    ou un extrait cellulaire pathologique ou les deux à
    - le cas échéant au moins un extrait cellulaire sain
    - les susdits précurseurs,
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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EP0117727A2 (fr) * 1983-02-25 1984-09-05 The President And Fellows Of Harvard College Détection de l'ADN réarrangé
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EP0159223A1 (fr) * 1984-03-07 1985-10-23 Institut Pasteur Réactifs et nécessaires pour le dosage quantitatif d'un acide nucléique viral dans un milieu biologique et procédé de dosage de cet acide nucléique viral

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