DK164880B - PROCEDURE FOR QUANTITATIVE DETERMINATION OF THE CONTENT OF A PRESENTLY DETERMINED VIRAL NUCLEIC ACID WHICH MAY BE CONTAINED IN A NATURAL BIOLOGICAL MEDIUM AND EQUIPMENT FOR USE IN THE PROCEDURE - Google Patents
PROCEDURE FOR QUANTITATIVE DETERMINATION OF THE CONTENT OF A PRESENTLY DETERMINED VIRAL NUCLEIC ACID WHICH MAY BE CONTAINED IN A NATURAL BIOLOGICAL MEDIUM AND EQUIPMENT FOR USE IN THE PROCEDURE Download PDFInfo
- Publication number
- DK164880B DK164880B DK511385A DK511385A DK164880B DK 164880 B DK164880 B DK 164880B DK 511385 A DK511385 A DK 511385A DK 511385 A DK511385 A DK 511385A DK 164880 B DK164880 B DK 164880B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- reagents
- dna
- cloned
- nucleic acid
- probe
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
Abstract
Description
iin
DK 164880 BDK 164880 B
Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde af den i krav 1's indledning angivne art til kvantitativ bestemmelse af indholdet af en på forhånd bestemt viral nucle-insyre, der kan være indeholdt i et naturligt biologisk 5 medium. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del anførte. Opfindelsen angår endvidere et udstyr eller "kit" til kvantitativ bestemmelse af et viralt DNA i et naturligt biologisk medium, der er forligeligt med udviklingen af det tilsvarende 10 virus, i overensstemmelse med den omhandlede fremgangsmåde. Dette udstyr er ejendommeligt ved det i krav 9's kendetegnende del anførte.The present invention relates to a method of the kind set forth in the preamble of claim 1 for quantitatively determining the content of a predetermined viral nucleic acid which may be contained in a natural biological medium. The process according to the invention is characterized by the characterizing part of claim 1. The invention further relates to an equipment or "kit" for the quantitative determination of a viral DNA in a natural biological medium compatible with the development of the corresponding virus, according to the method of the invention. This equipment is peculiar to the characterizing part of claim 9.
For øjeblikket findes der ikke nogen simpel og direkte 15 kvantitativ analysemetode til bestemmelse af inficerende partikler, især til bestemmelse af virion af viralt hepatitis B. DNA-sonder, som indeholder en sekvens, der er karakteristisk for genomet af det virus, som eftersøges, er efterhånden taget i rutinemæssig anvendelse. F.eks.At present, there is no simple and direct quantitative assay for determining infecting particles, especially for determining virion of viral hepatitis B. DNA probes containing a sequence characteristic of the genome of the virus being sought are gradually taken into routine use. Eg.
20 har man allerede foreslået at anvende sonder, der indeholder en DNA-HBV-sekvens eller hele S-genet (eller en del deraf) af hepatitis B-virus. Under de betingelser, som beskrives i den tekniske litteratur, tillader disse sonder en kvalitativ bestemmelse af tilstedeværelsen el-25 ler fraværet af dette virus eller virion i biologiske materialer, hvori de kan være indeholdt. Imidlertid kan disse sonder vanskeligt (under de betingelser, hvorunder de hidtil har været anvendt) benyttes til gennemførelse af kvantitative analyser. Når hybridiseringsforsøget 30 eksempelvis gennemføres på en bærer, såsom en nitrocellulose-bærer, kan sonden være delvis absorberet eller "passere igennem" den pågældende bærer. Dette fænomen griber t ikke ind i bestemmelsens kvalitative karakter. Således forholder det sig imidlertid ikke, når man ønsker at gen-35 nemføre en kvantitativ analyse.20, it has already been proposed to use probes containing a DNA HBV sequence or the entire S gene (or a portion thereof) of hepatitis B virus. Under the conditions described in the technical literature, these probes allow a qualitative determination of the presence or absence of this virus or virion in biological materials in which they may be contained. However, these probes can be difficult (under the conditions under which they have been used so far) to be used to conduct quantitative analyzes. For example, when the hybridization experiment 30 is carried out on a carrier, such as a nitrocellulose carrier, the probe may be partially absorbed or "pass through" that carrier. This phenomenon does not interfere with the qualitative nature of the provision. However, this is not the case when one wants to perform a quantitative analysis.
DK 164880 BDK 164880 B
22
Kvantitative bestemmelser af visse DNA-sekvenser har under bestemte omstændigheder være foretaget under elektronmikroskop. Det er imidlertid klart, at sådanne teknikker ikke kan anvendes rutinemæssigt til kvantitative 5 bestemmelser af virale partikler, især til diagnose. Desuden kan denne metode ikke anvendes, når der er tale om en serie af målinger, der er udstrakt over et vist tidsrum, og som skal følge fremadskriden af den infektion, der skal bestemmes.In certain circumstances, quantitative determinations of certain DNA sequences have been made under electron microscope. However, it is clear that such techniques cannot be routinely used for quantitative determinations of viral particles, especially for diagnosis. Furthermore, this method cannot be used in the case of a series of measurements that are extended over a certain period of time and which must follow the progress of the infection to be determined.
1010
Fra EP offentliggørelsesskrift nr. 62 286 kendes en fremgangsmåde og et udstyr eller "kit'.' til diagnosticering af tilstedeværende hepatitis B virus, hvor man anvender et reagens bestående af en klonet, oprenset og mærket DNA- 15 sekvens. Fremgangsmåden består i, at man afsætter en prøve på et substrat, eliminerer proteinerne og gennemfører en hybridisering med det mærkede reagens.EP-A-62 286 discloses a method and equipment or kit. for the diagnosis of hepatitis B virus present using a reagent consisting of a cloned, purified and labeled DNA sequence, the method consists of depositing a sample on a substrate, eliminating the proteins, and hybridizing with the labeled reagent.
En artikel i Chemical Abstracts bind 100 (1984), nr.An article in Chemical Abstracts Volume 100 (1984), no.
20 99.481, beskriver en fremgangsmåde til detektering af tilstedeværende hepatitis B virus ud fra en prøve uden indhold af proteiner, idet denne detektering gennemføres ved hjælp af et reagens opnået efter oprensning af det virale DNA.20 99,481, discloses a method for detecting hepatitis B virus present from a protein-free sample, this detection being carried out by a reagent obtained after purification of the viral DNA.
2525
Scotto et al., Hepatology 3 (3), 279-284 (1983) beskriver en simplificeret spottest til bestemmelse af hepatitis B virus DNA i blodserum ved hybridisering mellem en sonde og en prøve indeholdende hepatitis B virus DNA. Ved sen- 30 sibilitetsforsøg sammenlignes den beskrevne metode med rækkefortyndinger af positive serumprøver. Scotto et al. viser, at selv når man går ud fra et meget infektiøst serum, får man et positivt hybridiseringssignal med en passende sonde, når forsøget gentages med 50 μΐ af det samme _5 35 serum fortyndet til 6 x 10Scotto et al., Hepatology 3 (3), 279-284 (1983) disclose a simplified spotting test for the determination of hepatitis B virus DNA in blood serum by hybridization between a probe and a sample containing hepatitis B virus DNA. In sensitivity tests, the described method is compared with series dilutions of positive serum samples. Scotto et al. shows that even when starting from a highly infectious serum, a positive hybridization signal with an appropriate probe is obtained when the experiment is repeated with 50 μΐ of the same _5 serum diluted to 6 x 10
DK 164880 BDK 164880 B
33
Desuden beskriver Scotto et al erfaringerne med detektering af en hepatitis B virus DNA-klon, som har været sat til et negativt serum, ligeledes for at teste metodens følsomhed.In addition, Scotto et al describe the experience of detecting a hepatitis B virus DNA clone that has been added to a negative serum as well to test the sensitivity of the method.
55
Disse litteraturreferencer nævner imidlertid ikke de komparative foranstaltninger, som tages i anvendelse ifølge opfindelsen ud over hybridiseringen af den anvendte sonde med viralt DNA i selve prøven, som består af det naturli-10 ge biologiske medium indeholdende DNA'et. Nærmere bestemt hybridiseres den samme sonde med et klonet reference-DNA blandet med proteiner, som ligner - eller som er identiske med - proteinerne indeholdt i den biologiske prøve.However, these literature references do not mention the comparative measures employed in accordance with the invention in addition to the hybridization of the viral DNA probe used in the sample itself, which consists of the natural biological medium containing the DNA. More specifically, the same probe is hybridized with a cloned reference DNA mixed with proteins similar to - or identical to - the proteins contained in the biological sample.
Hermed tilvejebringes en simpel og direkte metode til 15 kvantitativ bestemmelse af infektiøse specier, som ikke kan udledes af den kendte teknik.This provides a simple and direct method for quantitative determination of infectious species which cannot be deduced from the prior art.
Det er således et formål med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe en fremgangsmåde og et udstyr, hvormed 20 man kan gennemføre sådanne kvantitative bestemmelser. Nærmere bestemt er det et formål med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe midler, som sætter laboratorier og klinikere i stand til ikke blot at bestemme en mulig viral infektion, f.eks. B-viral hepatitis, hos bestemte 25 patienter, men også at gøre det muligt hurtigt at vurdere udviklingen af den virale infektion og i konsekvens heraf at kontrollere og justere effektiviteten af passende an-tivirale behandlinger.Thus, it is an object of the present invention to provide a method and equipment by which such quantitative determinations can be made. More specifically, it is an object of the present invention to provide agents which enable laboratories and clinicians not only to determine a possible viral infection, e.g. B-viral hepatitis, in certain 25 patients, but also to enable rapid assessment of the development of the viral infection and, consequently, to control and adjust the effectiveness of appropriate antiviral treatments.
30 Det standardiserede referencereagens til kvantitativ bestemmelse ved sammenligning af et viralt DNA i en prøve af et naturligt biologisk medium, som er forligeligt med udviklingen af det tilsvarende virus, indeholder en på forhånd bestemt koncentration af DNA, der indeholder en 35 DNA-sekvens, som fortrinsvis er klonet, og som kan hybridiseres med det ovennævnte virale DNA, er karakteristisk ved, at det i blanding med det klonede DNA indeholderThe standard reference reagent for quantitative determination by comparing a viral DNA in a sample of a natural biological medium compatible with the development of the corresponding virus contains a predetermined concentration of DNA containing a 35 DNA sequence which is preferably cloned, and which can be hybridized with the aforementioned viral DNA, is characterized in that it contains in admixture with the cloned DNA
DK 164880 BDK 164880 B
4 proteiner.4 proteins.
Fortrinsvis er det klonede DNA til stede i form af en klonet phag, · der indeholder et indført DNA, som kan hy-5 bridiseres med det virale DNA.Preferably, the cloned DNA is present in the form of a cloned phage containing an inserted DNA which can be hybridized with the viral DNA.
Proteinerne hidrører fortrinsvis fra et biologisk medium, som kan sammenlignes med det ovennævnte naturlige biologiske medium. Dette reagens indeholder fortrinsvis de es-10 sentielle ingredienser hørende til det samme naturlige · biologiske medium, og det kan endda bestå af det samme naturlige medium med den undtagelse, at det til at begynde. med ikke indeholder det virale DNA, som skal analyseres kvantitativt. Imidlertid indeholder mediet den oven-15 nævnte phag i den ovenfor angivne, på forhånd fastlagte koncentration.Preferably, the proteins are derived from a biological medium comparable to the aforementioned natural biological medium. This reagent preferably contains the essential ingredients of the same natural biological medium and may even consist of the same natural medium with the exception that it begins. with does not contain the viral DNA to be quantitatively analyzed. However, the medium contains the aforementioned phage at the above predetermined concentration.
Tilknytningen til det klonede DNA, fortrinsvis med en phag, der indeholder en hybridiserbar sekvens af protei-20 ner, gør det muligt at fiksere DNA'et til en bærer af membran- eller filtertype under i det væsentlige reproducerbare betingelser for en på forhånd fastlagt relativ tilstand. Disse observationer udstrækker sig på samme måde til fikseringen af prøver, som skal testes på den 25 samme bærer.The association with the cloned DNA, preferably with a phage containing a hybridizable sequence of proteins, allows the DNA to be fixed to a membrane or filter-type carrier under substantially reproducible conditions for a predetermined relative. condition. These observations extend similarly to the fixation of samples to be tested on the same carrier.
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til kvantitativ bestemmelse af indholdet af en på forhånd bestemt nucleinsyre, der kan være indeholdt i et naturligt biologisk medium, 30 er særegen ved, at man: - bringer flere standardiserede reagenser, som hver især indeholder en klonet nucleinsyre i indbyrdes forskellige koncentrationer, der kan hybridiseres med sonden, og 35 som forinden er bragt i en tilstand, der muliggør hy- bridisering, i kontakt med sonden,The process of the invention for quantitatively determining the content of a predetermined nucleic acid that may be contained in a natural biological medium is peculiar in that: - bringing several standardized reagents, each containing a cloned nucleic acid, at different concentrations which can be hybridized with the probe and previously brought into contact with the probe in a state which allows hybridization,
DK 164880 BDK 164880 B
5 - måler forholdet imellem den måling, der har relation til den mængde af sonden, der er blevet hybridiseret med den virale nucleinsyre, hvis indhold skal bestemmes, og baggrundsstøjen målt under de samme betingelser 5 med en negativ kontrol, - måler de tilsvarende forhold imellem målingerne, der har relation til de mængder af den samme sonde, der er blevet hybridiseret med de klonede nucleinsyrer fra de 10 ovennævnte standardiserede reagenser, og et kontrolrea gens tilsvarende baggrundsstøj under lignende eller identiske betingelser, idet de standardiserede reagenser indeholder de klonede DNA'er i blanding med en proteins ammensætning, der ligner - eller er identisk med -15 proteinsammensætningen af det biologiske medium, og som muliggør fiksering af de klonede DNA'er til en bærer af membran- eller filtertype, og idet de standardiserede reagenser kan skelnes fra kontrolreagenset ved deres indhold af klonet nucleinsyre, der kan hybridiseres med 20 sonden, og skelnes indbyrdes ved de bestemte, men ind byrdes forskellige koncentrationer af den klonede nucleinsyre, og - sammenligner forholdet, som er målt med den virale nu- 25 cleinsyre, hvis indhold skal bestemmes, med de forhold, der er fundet med de klonede nucleinsyrer fra reagenserne hvorved indholdet af den virale nucleinsyre i det undersøgte biologiske medium fremgår af en korrelation med sammenligningsresultaterne.5 - measures the ratio between the measurement related to the amount of the probe that has been hybridized with the viral nucleic acid whose content is to be determined and the background noise measured under the same conditions 5 with a negative control, - measures the corresponding ratio between the measurements related to the amounts of the same probe that have been hybridized with the cloned nucleic acids of the above 10 standardized reagents and a corresponding background noise of a control reagent under similar or identical conditions, the standard reagents containing the cloned DNAs in admixture with a protein composition of amine that is similar to - or identical to - the protein composition of the biological medium, which enables fixation of the cloned DNAs to a membrane or filter-type carrier and the standardized reagents can be distinguished from the control reagent by their content of cloned nucleic acid which can be hybridized with the probe and distinguished - at the determined but different concentrations of the cloned nucleic acid, and - compares the ratio measured with the viral nucleic acid whose content is to be determined with the ratios found with the cloned nucleic acids from the reagents thereby the content of the viral nucleic acid in the biological medium investigated is shown by a correlation with the comparison results.
3030
Det ovenfor angivne referenceforhold kan også fremgå af nomogrammer, som på forhånd er bestemt ud fra forholdene imellem målinger af fastlagte prøvemængder' med på forhånd bestemte forhold, hvor det klonede DNA adskiller sig fra 35 den tilsvarende baggrundsstøj .The above reference ratio may also appear from nomograms predetermined from the ratios of measurements of predetermined sample amounts to predetermined ratios, where the cloned DNA differs from the corresponding background noise.
DK 164880 BDK 164880 B
66
Det fremgår klart af det foregående, at den negative kontrol har en sammensætning, som svarer til (eller er identisk med) sammensætningen af reagenset med den ene undtagelse, at det klonede DNA mangler.It is clear from the foregoing that the negative control has a composition similar to (or identical to) the reagent composition with the one exception that the cloned DNA is missing.
5 Mængderne af de hybridiserede prøver kan korreleres med ethvert måleligt system. F.eks. er den ene partner i hy-bridiseringen bærer af en radioaktiv, enzymatisk, fluorescerende eller lignende markør, hvilket giver anledning 10 til frembringelse af et signal, hvis intensitet kan måles.The quantities of the hybridized samples can be correlated with any measurable system. Eg. is the one partner in the hybridization carrier of a radioactive, enzymatic, fluorescent or similar marker, giving rise to 10 to produce a signal whose intensity can be measured.
Den mulige kvantitative bestemmelse af den nucleinsyre, som anvendes i hybridiseringsreaktionen, er et resultat 15 af den stabilitet, som observeres ved måling af det ovennævnte forhold, når man gentager hybridiseringsoperatio-nen imellem en passende prøve og en på forhånd bestemt mængde af det ifølge opfindelsen anvendte reagens. Dette gælder også for de resultater, som under de samme betin-20 gelser kan måles på en naturlig prøve, der indeholder en tilsvarende dosis af den samme biologiske prøve.The possible quantitative determination of the nucleic acid used in the hybridization reaction results from the stability observed in measuring the above ratio when repeating the hybridization operation between a suitable sample and a predetermined amount of the present invention. reagents used. This also applies to the results that under the same conditions can be measured on a natural sample containing a similar dose of the same biological sample.
Disse forhold er imidlertid variable som en funktion af den mængde klonet DNA, som kan indeholdes i det anvendte 25 reagens, således at det er muligt at konstruere nomogram-mer, som er repræsentative for variationen af det ovennævnte forhold som funktion af koncentrationerne af klonet DNA, især af phag-partikler. Variationerne af det samme forhold, som hidrører fra tilsvarende målinger ud-30 ført på biologiske prøver, kan derefter korreleres med de ovennævnte nomogrammer, således at indholdet af virale partikler, som til at begynde med er ukendt for en bestemt specie, kan udledes gennem en simpel sammenligning af målingerne gennemført med en kurve fra et tilsvarende 35 nomogram.However, these ratios are variable as a function of the amount of cloned DNA which may be contained in the reagent used, so that it is possible to construct nomograms representative of the variation of the above ratio as a function of the cloned DNA concentrations. , especially of phage particles. The variations of the same ratio resulting from similar measurements taken on biological samples can then be correlated with the above nomograms so that the content of viral particles, which is initially unknown to a particular species, can be derived through a simple comparison of the measurements carried out with a curve from a corresponding 35 nomogram.
DK 164880 BDK 164880 B
77
Det fremgår af det foregående, at når den naturlige biologiske specie, som indeholder den virale partikel, der skal afsættes, udgøres af et blodserum, vil det være en fordel at anvende et reagens, som er standardiseret i 5 overensstemmelse med opfindelsen, og hvori det klonede DNA er knyttet til de essentielle bestanddele af dette blodserum. Hvis den specie, der skal testes, er dannet ud fra en celleekstrakt, vil de anvendte reagenser med fordel kunne bestå af en blanding af en ækvivalent cellulo-10 seekstrakt og en på forhånd bestemt mængde klonet DNA.It is apparent from the foregoing that when the natural biological species containing the viral particle to be deposited is a blood serum, it will be advantageous to use a reagent which is standardized in accordance with the invention and wherein cloned DNA is linked to the essential components of this blood serum. If the species to be tested is formed from a cell extract, the reagents used may advantageously consist of a mixture of an equivalent cellulose extract and a predetermined amount of cloned DNA.
Hvad angår selve det klonede DNA, foreligger dette i form af en phag, hvis genetiske arvemasse er blevet modificeret ved indføring af sondesekvensen, f.eks. fuldstændigt 15 DNA-HBV eller en del deraf. Denne sekvens bliver derefter "indpakket" i en separat phag, som der er givet talrige eksempler på i litteraturen. Der kan f.eks. være tale om lambda-phag eller M-13-phag eller derivater eller analoge af disse phager. Den anvendte phag bliver undertiden ud-20 valgt som en funktion af den tilsvarende DNA-sonde-sekvens af de virale partikler, som skal analyseres, idet der tages hensyn til størrelsen af den DNA-indføring, som kan "indpakkes".As for the cloned DNA itself, this is in the form of a phage whose genetic inheritance has been modified by insertion of the probe sequence, e.g. completely 15 DNA HBV or part thereof. This sequence is then "wrapped" in a separate phage, of which numerous examples are given in the literature. For example, be it lambda phag or M-13 phag or derivatives or analogs of these phages. The phage used is sometimes selected as a function of the corresponding DNA probe sequence of the viral particles to be analyzed, taking into account the size of the "insertable" DNA insert.
25 Fordelen ved at anvende et klonet DNA i en phag ligger i ligheden imellem det klonede element og den naturlige partikel, således at der ved tilgrænsende koncentrationer af virale partikler kan observeres en adfærd, som svarer til adfærden af reagenset og den analyserede prøve med 30 hensyn til en på forhånd bestemt DNA-sonde, når hybridi-seringsoperationerne gennemføres under tilsvarende betingelser. Eftersom dette er tilfældet, bør det bemærkes, at det klonede DNA i visse tilfælde kan udgøres af et plasmid, der indeholder den hybridiserbare sekvens med en del 35 af genomet af den virale partikel, som skal analyseres.The advantage of using a cloned DNA in a phage lies in the similarity between the cloned element and the natural particle, so that at adjacent concentrations of viral particles a behavior corresponding to the behavior of the reagent and the assay analyzed with respect to 30 can be observed. to a predetermined DNA probe when the hybridization operations are performed under similar conditions. Since this is the case, it should be noted that in some cases the cloned DNA may be a plasmid containing the hybridizable sequence with a portion of the genome of the viral particle to be assayed.
DK 164880 BDK 164880 B
88
Med hensyn til selve sonden, som både skal hybridiseres med det klonede DNA og den virale nucleinsyre hørende til den afprøvede specie, er det muligt at anvende enhver sonde, om hvilken det vides, at den kan hybridiseres med 5 klonet DNA og med genomet af den eftersøgte viruspartikel. I det foretrukne tilfælde, hvor viruspartiklerne, der skal analyseres, udgøres af hepatitis B virus, kan sonden bestå af en hvilken som helst partiel eller fuldstændig sekvens af DNA-HBV.With respect to the probe itself, which must be hybridized with both the cloned DNA and the viral nucleic acid of the species tested, it is possible to use any probe known to be capable of hybridizing with the cloned DNA and the genome thereof. desired virus particle. In the preferred case where the virus particles to be analyzed are hepatitis B virus, the probe may consist of any partial or complete sequence of DNA HBV.
1010
Det er indlysende, at sonden endvidere kan være sammensat på samme måde som de ovennævnte reagenser, når deres indbyrdes kontakt kan føre til en detekterbar og målelig hy-bridisering under de beskrevne betingelser.It is obvious that the probe may further be composed in the same way as the above reagents, when their mutual contact can lead to a detectable and measurable hybridization under the conditions described.
1515
Generelt markeres sonden, enten ved hjælp af en radioaktiv markør eller ved hjælp af en vilkårlig anden markering, eksempelvis fluoroscerende eller enzymatisk. Når der er tale om en enzymatisk markering, kan mængden af 20 markeret DNA, som anvendes ved hybridiseringen, bedømmes ud fra enzymets virkningsniveau på det tilsvarende substrat, når en modifikation af substratet kan bedømmes kvantitativt på passende måde, især ved colorimetri eller spektrofotometri.Generally, the probe is marked, either by means of a radioactive marker or by any other marker, for example, fluorescent or enzymatic. In the case of an enzymatic label, the amount of 20 labeled DNA used in the hybridization can be judged from the level of action of the enzyme on the corresponding substrate, when a modification of the substrate can be quantitatively appropriately assessed, especially by colorimetry or spectrophotometry.
2525
Naturligvis kan man anvende en hvilken som helst konventionel teknik til frembringelse af en binding imellem hybrid-prøven og den anvendte markør. Man kan.således præ-inkorporere markøren i prøven, hvilket kan være tilfæl-30 det, når markeringen gennemføres ved hjælp af et radioelement. Denne binding kan være direkte eller indirekte, når der er tale om ikke-radioaktive markører. Nærmere bestemt kan prøven modificeres, således at den bærer et antigen-sted, som kan gedkendes af de første antistoffer, 35 som atter genkendes af andre antistoffer, der bærer enzymet eller den fluoroscerende markering, som anvendes ved den ovenfor beskrevne analyse.Of course, any conventional technique can be used to create a bond between the hybrid sample and the marker used. Thus, the marker can be pre-incorporated into the sample, which may be the case when the selection is carried out by means of a radio element. This binding may be direct or indirect in the case of non-radioactive markers. Specifically, the sample can be modified to carry an antigen site recognizable by the first antibodies, which is again recognized by other antibodies bearing the enzyme or the fluorescent label used in the assay described above.
DK 164880 BDK 164880 B
9 I denne sammenhæng kan der f.eks. henvises til den teknik, der er beskrevet i FR patentansøgning nr. 78 10 975, i US patentskrift nr. 4 358 535 og i EP patentskrift nr.9 In this context, e.g. Reference is made to the technique described in FR Patent Application No. 7810975, in U.S. Patent No. 4,358,535 and in European Patent Application No.
63 879.63 879.
55
Den pågældende hybridiseringsreaktion kan frembringes under passende kendte betingelser. Det er således muligt at anvende en biologisk sammensætning, der eventuelt på forhånd er beriget med DNA, og som er opnået ud fra den spe-10 cie, som skal studeres. Hvis man går frem på denne måde, vil det være en fordel at anvende standardiserede reagenser af den ovenfor definerede type, som med fordel kan have undergået den samme type af præ-berigelse. Generelt er det ikke nødvendigt at foretage en sådan indledende 15 rensning. Den indledende behandling af specien kan begrænses til opnåelse af resultater, som opnås ved solubi-lisering af de virale partikler, som skal bestemmes og analyseres, og ved denaturering af DNA'et eller det virale RNA.The hybridization reaction in question can be produced under suitably known conditions. Thus, it is possible to use a biological composition, possibly pre-enriched with DNA, obtained from the species to be studied. Proceeding in this way, it will be advantageous to use standardized reagents of the type defined above which may advantageously have undergone the same type of pre-enrichment. Generally, it is not necessary to perform such initial cleaning. The initial treatment of the species may be limited to obtaining results obtained by solubilizing the viral particles to be determined and analyzed and by denaturing the DNA or viral RNA.
2020
Hybridiseringsreaktionen kan gennemføres i væskefase eller fortrinsvis på en fast bærer.The hybridization reaction may be carried out in liquid phase or preferably on a solid support.
Det er en fordel, at man på den ene side fremkalder en 25 afsætning af den specie, der skal analyseres, og på den anden side afsætter det reagens, som indeholder det klonede DNA, på bærere, som egner sig til den efterfølgende hybridisering, f.eks. på et nitrocellulosefilter eller på en polyamid-bærer, som kendes under betegnelsen nylon.It is advantageous, on the one hand, to induce a deposition of the species to be assayed, and on the other hand, the reagent containing the cloned DNA is deposited on carriers suitable for subsequent hybridization. .g. on a nitrocellulose filter or on a polyamide carrier known as nylon.
30 Denne afsætning foretages under ligeledes kendte betingelser, således at de DNA-sekvenser, som både indeholdes i specien og i reagenset, kan fastgøres til bæreren. Ved en sådan fastgørelse forstås enhver form for retention, som svarer til en egentlig fiksering, f.eks. ved hjælp af 35 covalente bindinger eller ved simpel kompleksdannelse eller ved adsorption. Disse metoder fører til et slutresultat, som er ækvivalent med en fiksering. Under i sig selvThis assay is also made under known conditions, so that the DNA sequences contained in both the species and the reagent can be attached to the carrier. Such attachment means any retention which corresponds to an actual fixation, e.g. by means of 35 covalent bonds or by simple complexation or by adsorption. These methods lead to an end result which is equivalent to a fixation. Beneath itself
DK 164880 BDK 164880 B
10 kendte betingelser bringes specien og reagenset derefter i kontakt med en fælles sonde. Analysen gennemføres efter en passende vask af bæreren med henblik på at fjerne et eventuelt overskud af sonden.In known conditions, the species and the reagent are then contacted with a common probe. The assay is performed after appropriate washing of the support to remove any excess of the probe.
55
Det er også muligt at anvende teknikker, som gør brug af konkurrerende reaktioner. Ved en sådan teknik udnytter man en konkurrence med hensyn til et passende substrat i en på forhånd bestemt mængde, som reagerer med en ukendt 10 mængde af en første konstituent, som er beregnet til at reagere med substratet, og en kendt mængde af en anden konstituent, som generelt er enten identisk eller analog med den første. Begyndelseskoncentrationen af den første konstituent udledes derefter af den mængde eller den kon-15 centration af den anden konstituent, som indgår i reaktionen med substratet.It is also possible to use techniques that make use of competing reactions. Such a technique utilizes a competition for a suitable substrate in a predetermined amount which reacts with an unknown amount of a first constituent intended to react with the substrate and a known amount of a second constituent. , which is generally either identical or analogous to the first. The initial concentration of the first excipient is then derived from the amount or concentration of the second excipient involved in the reaction with the substrate.
I en udførelsesform for opfindelsen består substratet af sonden, og den første konstituent udgøres af specien, der 20 skal analyseres, mens den anden konstituent udgøres af et reagens anvendt ifølge opfindelsen.In one embodiment of the invention, the substrate consists of the probe and the first constituent is constituted by the species to be analyzed, while the second constituent is a reagent used according to the invention.
Det er klart, at der med denne teknik også tilvejebringes nomogrammer, der gør det muligt at foretage en bestemmel-25 se ved at sammenligne indholdet af den eftersøgte virale partikel med den biologiske specie, som underkastes eksperimentet .Obviously, this technique also provides nomograms that allow a determination to be made by comparing the content of the viral particle sought with the biological species undergoing the experiment.
Med henblik på at gennemføre de kvantitative analyser så 30 nøjagtigt som muligt vil det ofte være en fordel at råde over et "udstyr", som omfatter et større antal sådanne reagenser, der kan skelnes fra hinanden ud fra forskellene i koncentration af klonet DNA. Faktisk kan det være en fordel at tilvejebringe en tilstrækkelig mængde reagenser 35 i det samme udstyr, således at man altid er i stand til at bringe mindst ét reagens, hvis indhold af klonet DNA ikke ligger for langt fra den ukendte mængde, i kontaktIn order to carry out the quantitative assays as accurately as possible, it will often be advantageous to have an "equipment" comprising a greater number of such reagents which can be distinguished from the differences in cloned DNA concentration. In fact, it may be advantageous to provide a sufficient amount of reagents 35 in the same equipment so as to always be able to contact at least one reagent whose cloned DNA content is not too far from the unknown amount
DK 164880 BDK 164880 B
11 med den specie, der skal analyseres, således at resultaterne bliver så signifikante som muligt.11 with the specie to be analyzed so that the results are as significant as possible.
Opfindelsen angår således et udstyr eller "kit", som er 5 ejendommeligt ved, at det består af: - en sonde, der kan hybridiseres med den virale nuclein-syre, som skal bestemmes kvantitativt, 10 - et kontrolreagens dannet af en sammensætning af protei ner, der ligner (eller er identiske med) proteinerne i det biologiske medium, og som muliggør fiksering af nucleinsyren til en bærer af membran- eller filtertype, idet kontrolreagenset dog ikke indeholder det klonede 15 DNA, og - et antal standardiserede referencereagenser, som indeholder kontrolreagensets proteinsammensætning og som indeholder forskellige koncentrationer af en klonet nu- 20 cleinsyre, der kan hybridiseres med sonden.The invention thus relates to an equipment or "kit" which is characterized in that it consists of: - a probe which can be hybridized with the viral nucleic acid to be quantitatively determined, 10 - a control reagent formed from a composition of protein - which are similar to (or identical to) the proteins in the biological medium and which allow fixation of the nucleic acid to a membrane or filter type carrier, however, the control reagent does not contain the cloned DNA, and - a number of standardized reference reagents containing protein composition of the control reagent and containing various concentrations of a cloned nucleic acid which can be hybridized with the probe.
Udstyret ifølge opfindelsen omfatter med fordel også mindst et nomogram, som er repræsentativt for de variationer, der kan observeres med hensyn til forholdet imel-25 lem de målte intensiteter af et signal, der tilvejebringes af en markør, efter hybridisering med sonder med forskellige koncentrationer af et reagens anvendt ifølge opfindelsen, idet disse identiteter sammenholdes med den baggrundsstøj, som måltes under tilsvarende betingelser 30 ved at bringe kontrolreagenset i kontakt med den samme sonde under identiske hybridiseringsbetingelser. Måleresultatet er en funktion af de mængder af reagenserne, som anvendes ved disse hybridiseringsforsøg, idet det skal forstås, at markøren bæres af en eller flere af de reak-35 tanter, der anvendes ved hybrid!seringen, fortrinsvis af sonden.Advantageously, the equipment of the invention also comprises at least one nomogram representative of the variations observable with respect to the ratio of the measured intensities of a signal provided by a marker after hybridization with probes having different concentrations of a reagent used according to the invention, comparing these identities with the background noise measured under similar conditions 30 by contacting the control reagent with the same probe under identical hybridization conditions. The measurement result is a function of the amounts of the reagents used in these hybridization experiments, it being understood that the marker is carried by one or more of the reactants used in the hybridization, preferably by the probe.
DK 164880 BDK 164880 B
1212
Desuden omfatter udstyret fortrinsvis en eller flere bærere, som egner sig til afsætning og fiksering af de forskellige ingredienser, som indgår i reagenserne anvendt ifølge opfindelsen, på en bærer sammen med kontrolreagen-5 set, og prøven som skal testes, under sådanne betingelser, som muliggør en efterfølgende hybridisering med en DNA-sonde, som også indeholder en hybridiserbar sekvens.In addition, the equipment preferably comprises one or more carriers suitable for depositing and fixing the various ingredients included in the reagents used in the invention on a carrier together with the control reagent and the sample to be tested under such conditions as allows for subsequent hybridization with a DNA probe which also contains a hybridizable sequence.
Andre karakteristika ved den foreliggende opfindelse vil 10 fremgå af den efterfølgende beskrivelse, som illustrerer foretrukne metoder til fremstilling af de standardiserede reagenser såvel som anvendelsen af disse, og som illustrerer frembringelsen af et nomogram, som kan benyttes som reference til efterfølgende kvantitative bestemmelser 15 ved anvendelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen.Other features of the present invention will become apparent from the following description which illustrates preferred methods for preparing the standardized reagents as well as their use, and illustrates the generation of a nomogram which may be used as a reference for subsequent quantitative determinations 15 in use. of the process of the invention.
Tegningen viser monogram som beskrevet ovenfor.The drawing shows the monogram as described above.
1. Fremstilling af prøver 201. Preparation of Samples 20
Prøver af blodserum, som formodes at være inficeret med virus af hepatitis B, fikseres til en membran af nylonpolyamid (Biodine A, Pall Co. ) eller til en anden bærer af nylon eller nitrocellulose, som kan anvendes til hy-25 bridiseringsforsøg. Afsætningerne gennemføres i "Dot- blots"-pletter. Disse afsætninger kan enten frembringes ved direkte afsætning af de koncentrerede prøver eller ved filtrering af de på forhånd fortyndede prøver igennem lokaliserede zoner af bæreren og sugning igennem disse 30 zoner. Prøverne behandles derefter med en 0,15 M opløsning af natriumcarbonat og 1 M NaCl (endelige koncentrationer) for at solubilisere viruspartiklerne på stedet og for at denaturere DNA'erne og gøre dem tilgængelige for en prøve, som kan hybridiseres med genomet af hepatitis B 35 virus.Blood serum samples suspected of being infected with hepatitis B virus are fixed to a nylon polyamide membrane (Biodine A, Pall Co.) or to another nylon or nitrocellulose carrier which can be used for hybridization experiments. The deposits are carried out in "Dotblots" spots. These deposits can either be generated by direct deposition of the concentrated samples or by filtration of the pre-diluted samples through localized zones of the carrier and suction through these 30 zones. The samples are then treated with a 0.15 M solution of sodium carbonate and 1 M NaCl (final concentrations) to solubilize the virus particles on site and to denature the DNAs and make them available for a sample which can be hybridized with the genome of hepatitis B 35 virus.
DK 164880BDK 164880B
1313
Derefter neutraliseres med en Tris/NaCl-puffer. Den faste fase opvarmes til 80 °C, og opvarmningen opretholdes i en periode på 1-2 timer i afhængighed af arten af den anvendte bærer, idet opvarmningen har til formål at sikre 5 fikseringen af DNA'erne fra prøven til bæreren.Then neutralize with a Tris / NaCl buffer. The solid phase is heated to 80 ° C and the heating is maintained for a period of 1-2 hours depending on the nature of the carrier used, the heating being intended to ensure the fixation of the DNAs from the sample to the carrier.
Prøverne er derefter parate til, at man kan gennemføre de efterfølgende hybridiseringsoperationer med standardiserede reagenser i overensstemmelse med opfindelsen.The samples are then ready to perform the subsequent hybridization operations with standardized reagents in accordance with the invention.
10 2. Fremstilling af standardiserede reagenser10 2. Preparation of Standardized Reagents
De klonede DNA'er som anvendes i disse reagenser, udgøres af phager såsom lambda- eller M-13-phager, hvis genomer 15 er blevet modificeret i en ikke-essentiel region med henblik på replikation af disse phager ved indføring af et DNA, som har en sekvens fælles med genomet af de viruspartikler, som skal bestemmes, f.eks. en partiel eller fuldstændig sekvens af DNA-HBV, hvilken sekvens derefter 20 "indpakkes" i de pågældende phager.The cloned DNAs used in these reagents are constituted by phages such as lambda or M-13 phages, whose genomes have been modified in a non-essential region for replication of these phages by insertion of a DNA which has a sequence in common with the genome of the virus particles to be determined, e.g. a partial or complete sequence of DNA-HBV, which sequence is then "wrapped" in the relevant phages.
Et eller flere reagenser til anvendelse ifølge opfindelsen fremstilles ved at blande disse modificerede phager i på forhånd bestemte koncentrationer (idet koncentratio-25 nerne eksempelvis bestemmes ved måling af optiske densiteter eller ved lysering af plader af cellekulturer) med sundt blodserum. Det er en fordel at fremstille reagenser af denne type, som gør det muligt at anvende enhedsdoser 2 10 af partikler, der strækker sig fra 10 til 10 phag-par-30 tikler.One or more reagents for use according to the invention are prepared by mixing these modified phages at predetermined concentrations (the concentrations being determined, for example, by measuring optical densities or by lysing plates of cell cultures) with healthy blood serum. It is advantageous to prepare reagents of this type which allow unit doses of 2 10 to be used for particles ranging from 10 to 10 phage-30 particles.
Disse reagenser afsættes derefter ensartet på et filter og behandles under de samme betingelser som de prøver, der skal analyseres. Membranerne, som omfatter de endeli-35 ge afsætninger af DNA'er i kendte mængder (pletter dannet af reagenserne) og i ukendte mængder (pletter opnået fra de prøver, der skal analyseres), er herefter parate tilThese reagents are then uniformly deposited on a filter and treated under the same conditions as the samples to be analyzed. The membranes, which comprise the final deposits of DNAs in known amounts (spots formed from the reagents) and in unknown quantities (spots obtained from the samples to be analyzed), are then prepared for
DK 164880 BDK 164880 B
14 hybridisering under konventionelle betingelser, f.eks. med en DNA-HBV-prøve mærket med et radioaktivt element, f.eks. 32P.Hybridization under conventional conditions, e.g. with a DNA HBV sample labeled with a radioactive element, e.g. 32P.
5 Man anvender konventionelle hybridiseringsteknikker, hvorefter bærerne vaskes for at fjerne de ikke-fikserede prøver. Derefter foretages analyserne direkte på filteret (autoradiogrammer) eller eksempelvis ved scintillografi i mediet, efter at man har udskåret pletterne og anbragt 10 disse i måleglas, der indeholder en passende scintilla-tionsvæske.Conventional hybridization techniques are used, after which the carriers are washed to remove the non-fixed samples. Thereafter, the assays are performed directly on the filter (autoradiograms) or, for example, by scintillography in the medium, after cutting the spots and placing them in measuring jars containing an appropriate scintillation liquid.
3. Fremstilling af et karakteristisk nomogram 15 Et membran-filter af nitrocellulose anbringes på overfladen af en plade, som er forsynet med et antal huller, hvilken plade er anbragt på en beholder, der er forbundet til en sugepumpe. Denne gør det muligt at etablere et let reduceret tryk, som udøves på membranen i niveau med pla-20 dens huller (diameter 12 mm). Membranen befugtes med en SSC-puffer, og i de fordybninger med begrænset dybde, som dannes af de dele af membranen, som ligger i overfladens huller, anbringes (under de ovenfor angivne betingelser) stigende doser af det ifølge opfindelsen anvendte rea-25 gens, som indeholder partikler, f.eks. DNA-HBV "indpakket" i en lambda-phag i suspensionen i blodserum, hvorved man opnår et antal afsætninger, der indeholder mængder af 2 10 partikler på mellem 10 og 10 viruspartikler pr. fordybning. Man frembringer kontakt under betingelser, som 30 tillader en hybridisering med en mærket prøve, f.eks. med 32 P som tidligere angivet. Efter at man har gennemført præ-hybridiseringen og selve hybridiseringen under konventionelle betingelser, måler man for hver fordybning det tilbageholdte radioaktivitetsniveau og forholdet mel-35 lem den målte radioaktivitet og baggrundsstøjen (bestemt med en kontrolprøve, som er behandlet under samme betingelser, som er fri for viruspartikler underkastet de sam- 153. Preparation of a Characteristic Nomogram 15 A membrane filter of nitrocellulose is applied to the surface of a plate provided with a plurality of holes which plate is placed on a container connected to a suction pump. This makes it possible to establish a slight reduced pressure exerted on the diaphragm at the level of the plate holes (diameter 12 mm). The membrane is wetted with an SSC buffer and, in the limited depths formed by the parts of the membrane lying in the holes of the surface, increasing (under the above conditions) increasing doses of the reagent used according to the invention are applied. which contains particles, e.g. DNA HBV "wrapped" in a lambda phage in the suspension in blood serum, thereby obtaining a number of deposits containing amounts of 2 10 particles of between 10 and 10 virus particles per recess. Contact is made under conditions which allow hybridization with a labeled sample, e.g. with 32 P as previously stated. After performing the pre-hybridization and the hybridization itself under conventional conditions, for each well, the retained radioactivity level and the ratio of the measured radioactivity and background noise (determined by a control sample treated under the same conditions which are free) are measured. for virus particles subjected to the same
DK 164880 BDK 164880 B
me analyseoperationer), og kurven spores svarende til variationen i forholdene imellem den målte radioaktivitet og baggrundsstøjen som en funktion af det antal viruspartikler, der er indeholdt i de reagenser, som på forhånd 5 er anbragt i fordybningerne.and the curve is traced corresponding to the variation in the ratios of the measured radioactivity and the background noise as a function of the number of virus particles contained in the reagents pre-placed in the wells.
Derefter frembringes den kurve, som repræsenterer variationer i dette forhold (S/B: forkortelse for "signal/bag-grundsstøj") som en funktion af den pågældende koncentra-10 tion. Et sådant nomogram ses eksempelvis på tegningen.Then, the curve representing variations in this ratio (S / B: abbreviation for "signal / background noise") is produced as a function of the concentration in question. Such a nomogram can be seen, for example, in the drawing.
Denne illustrerer den variation, som observeres for S/B-forholdet (på ordinataksen), som funktion af de oprindelige mængder af phag-partikler, som er afsat i hver fordybning (N er antallet af partikler pr. fordybning afsat 15 på abscisseaksen). Målingerne er foretaget direkte på filteret ved hjælp af et autoradiogram.This illustrates the variation observed for the S / B ratio (on the ordinate axis) as a function of the initial amounts of phage particles deposited in each recess (N is the number of particles per recess deposited on the abscissa axis). The measurements were made directly on the filter by means of an autoradiogram.
Eftersom det herefter er et spørgsmål om at bestemme indholdet af viruspartikler i den prøve, som studeres, måles 20 S/B-forholdet under de samme betingelser som tidligere beskrevet. Bestemmelsen af det ukendte indhold af viruspartikler fremgår derefter ved sammenligning af S/B-for-hold, som opnås, med nomogrammet, idet man om nødvendigt medtager en korrektionsfaktor, som også kan bestemmes på 25 forhånd, og som sandsynligvis skyldes den mulige forskel imellem sammensætningen af de anvendte reagenser og sammensætningen af de prøver, som skal testes.Since it is then a matter of determining the content of virus particles in the sample being studied, the 20 S / B ratio is measured under the same conditions as previously described. Determination of the unknown content of virus particles is then made by comparing the S / B ratios obtained with the nomogram, including, if necessary, a correction factor which can also be determined in advance and probably due to the possible difference between the composition of the reagents used and the composition of the samples to be tested.
Det er muligt at frembringe nomogrammer af samme type for 30 alle andre typer af reagenser, der indeholder koncentrationer af særskilt "pakkede" klonede DNA'er.It is possible to generate nomograms of the same type for all other types of reagents containing concentrations of separately "packaged" cloned DNAs.
Til kvantitative målinger kan de værdier, der svarer til S/B-forholdet på over 2, bekvemt regnes som pålidelige.For quantitative measurements, the values corresponding to the S / B ratio of more than 2 can conveniently be considered reliable.
En kvantitativ analysemetode, som kan benyttes som modifikation, involverer HBV-DNA-sekvenser, som er mærket ra- 35A quantitative assay that can be used as a modification involves HBV DNA sequences which are labeled as
DK 164880 BDK 164880 B
16 dioaktivt, som har en kendt specifik aktivitet, og som er immobiliseret på en fast bærer. Disse immobiliserede standardreagenser behandles derefter som angivet ovenfor.16, which have a known specific activity and which are immobilized on a solid support. These standardized immobilized reagents are then treated as indicated above.
Der frembringes en hybridisering imellem disse immobili-5 serede sekvenser og et system af radioaktivt mærkede reagenser med kendte koncentrationer af phag-partikler på den ene side og på den anden side et andet system bestående af på forhånd bestemte doser af en prøve, der skal analyseres, og hvis indhold af naturlige viruspartikler 10 er ukendt.Hybridization is produced between these immobilized sequences and a system of radiolabeled reagents with known phage particle concentrations, on the one hand, and on the other, another system consisting of predetermined doses of a sample to be analyzed. , and whose content of natural virus particles 10 is unknown.
Den endelige mængde DNA, som tilbageholdes på den faste bærer, kan derefter beregnes, og det er muligt både at bestemme hybridiseringseffektiviteten og den kvantitative 15 dosering af hybridiserede partikler, der hidrører fra de prøver, som skal analyseres.The final amount of DNA retained on the solid support can then be calculated and it is possible to determine both the hybridization efficiency and the quantitative dosage of hybridized particles resulting from the samples to be analyzed.
Generelt kan den omhandlede fremgangsmåde, på hvis praktiske gennemførelse der er givet et eksempel ovenfor, 20 tilpasses til enhver anden type af virale partikler og tilpasses til enhver tilsvarende prøvesubstans, som gør brug af andre markeringer, f.eks. enzymatiske eller fluorescerende markeringer. Fremgangsmåden kan benyttes til bestemmelse af relative koncentrationer af enhver 25 form for DNA eller især RNA af viral oprindelse i biologiske væsker, væv eller celler. Reagenserne, som benyttes ifølge opfindelsen, kan også anvendes til fremstilling af internationale standarder, både hvad angår reagenserne og hvad angår de prøver, der indeholder tilsvarende naturli-30 ge virale partikler.In general, the method of the invention, the practical example of which is given above, can be adapted to any other type of viral particle and adapted to any similar test substance using other markings, e.g. enzymatic or fluorescent markers. The method can be used to determine relative concentrations of any kind of DNA or especially viral origin RNA in biological fluids, tissues or cells. The reagents used according to the invention can also be used to prepare international standards, both in respect of the reagents and in the samples containing similar natural viral particles.
Med fremgangsmåden ifølge opfindelsen tilvejebringes således en direkte kvantitativ analysemetode til bestemmelse af partikler, f.eks. HBV-partikler, og anvendelsen af 35 denne analysemetode er særdeles simpel. Den er særligt nyttig, når der er tale om at bestemme graden af en infektion, som en patient lider af, med henblik på at be- 17Thus, with the method of the invention, a direct quantitative assay method for determining particles, e.g. HBV particles, and the application of this assay method is extremely simple. It is particularly useful in determining the degree of infection that a patient suffers in order to
DK 164880 BDK 164880 B
dømme infektionens udvikling og bestemme effektiviteten af en anti-viral behandling.judge the development of the infection and determine the effectiveness of an anti-viral treatment.
5 10 15 20 25 30 355 10 15 20 25 30 35
Claims (12)
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8403566A FR2560995B1 (en) | 1984-03-07 | 1984-03-07 | REAGENTS AND KITS FOR THE QUANTITATIVE DETERMINATION OF A VIRAL NUCLEIC ACID IN A BIOLOGICAL MEDIUM AND METHOD FOR DETERMINING SUCH A VIRAL NUCLEIC ACID |
| FR8403566 | 1984-03-07 | ||
| FR8500045 | 1985-03-07 | ||
| PCT/FR1985/000045 WO1985003951A1 (en) | 1984-03-07 | 1985-03-07 | Reagents and kits for the quantitative dosing of a viral nucleic acid in a biological medium and method for dosing said viral nucleic acid |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK511385A DK511385A (en) | 1985-11-06 |
| DK511385D0 DK511385D0 (en) | 1985-11-06 |
| DK164880B true DK164880B (en) | 1992-08-31 |
| DK164880C DK164880C (en) | 1993-01-18 |
Family
ID=9301809
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK511385A DK164880C (en) | 1984-03-07 | 1985-11-06 | PROCEDURE FOR QUANTITATIVE DETERMINATION OF THE CONTENT OF A PRESENTLY DETERMINED VIRAL NUCLEIC ACID WHICH MAY BE CONTAINED IN A NATURAL BIOLOGICAL MEDIUM AND EQUIPMENT FOR USE IN THE PROCEDURE |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0159223B1 (en) |
| JP (1) | JPH062080B2 (en) |
| AT (1) | ATE43642T1 (en) |
| CA (1) | CA1273862A (en) |
| DE (1) | DE3570698D1 (en) |
| DK (1) | DK164880C (en) |
| FR (1) | FR2560995B1 (en) |
| GR (1) | GR850578B (en) |
| WO (1) | WO1985003951A1 (en) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1988004326A1 (en) * | 1986-12-01 | 1988-06-16 | Mcdonnell Douglas Corporation | Method of identifying unknown organisms |
| US5780219A (en) * | 1989-07-11 | 1998-07-14 | Gen-Probe Incorporated | Nucleic acid amplification oligonucleotides and probes to human hepatitis B virus |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2444713A1 (en) * | 1978-12-18 | 1980-07-18 | Pasteur Institut | PROCESS FOR PRODUCING DNA COMPRISING THE GENOME OF HEPATITIS B VIRUS AND VECTOR COMPRISING SAME |
| FR2492985A1 (en) * | 1980-10-24 | 1982-04-30 | Pasteur Institut | Detection of messenger RNA transcription - by contacting nucleic-acid-free cell extract with exogenous DNA |
| US4358535A (en) * | 1980-12-08 | 1982-11-09 | Board Of Regents Of The University Of Washington | Specific DNA probes in diagnostic microbiology |
| US4446237A (en) * | 1981-03-27 | 1984-05-01 | Life Technologies, Inc. | Method for detection of a suspect viral deoxyribonucleic acid in an acellular biological fluid |
| EP0062286A1 (en) * | 1981-03-31 | 1982-10-13 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University | Diagnostic test for hepatitis B virus |
| JPS58170496A (en) * | 1982-03-31 | 1983-10-07 | アルバ−ト・アインシユタイン・カレツジ・オブ・メデイスン・オブ・イエシ−バ・ユニバ−シテイ− | Diagnostic test method, diagnostic reagent and diagnostic kit of b type hepatisis virus |
| WO1984001174A1 (en) * | 1982-09-20 | 1984-03-29 | Harvard College | Identification of microorganisms |
-
1984
- 1984-03-07 FR FR8403566A patent/FR2560995B1/en not_active Expired
-
1985
- 1985-03-07 DE DE8585400445T patent/DE3570698D1/en not_active Expired
- 1985-03-07 JP JP60501079A patent/JPH062080B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-03-07 CA CA000475889A patent/CA1273862A/en not_active Expired - Fee Related
- 1985-03-07 WO PCT/FR1985/000045 patent/WO1985003951A1/en unknown
- 1985-03-07 EP EP85400445A patent/EP0159223B1/en not_active Expired
- 1985-03-07 AT AT85400445T patent/ATE43642T1/en not_active IP Right Cessation
- 1985-03-07 GR GR850578A patent/GR850578B/el unknown
- 1985-11-06 DK DK511385A patent/DK164880C/en active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2560995B1 (en) | 1988-02-19 |
| ATE43642T1 (en) | 1989-06-15 |
| CA1273862A (en) | 1990-09-11 |
| DK511385A (en) | 1985-11-06 |
| EP0159223A1 (en) | 1985-10-23 |
| DK511385D0 (en) | 1985-11-06 |
| WO1985003951A1 (en) | 1985-09-12 |
| DE3570698D1 (en) | 1989-07-06 |
| DK164880C (en) | 1993-01-18 |
| GR850578B (en) | 1985-11-25 |
| JPS61501306A (en) | 1986-07-03 |
| FR2560995A1 (en) | 1985-09-13 |
| JPH062080B2 (en) | 1994-01-12 |
| EP0159223B1 (en) | 1989-05-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| WO2021242834A1 (en) | Method for resetting an array | |
| CN105441595B (en) | It is a kind of for detecting the digital pcr absolute quantitation parting detecting reagent of HBV-B/C | |
| FI77689C (en) | SENSITIVE TESTER BASERADE PAO CONSTATERAND AV DNA FOER PAOVISANDE AV MALIGNITET. | |
| JPH03504199A (en) | Rapid nucleic acid detection method | |
| Leis et al. | Characteristics and regulation of interaction of avian retrovirus pp12 protein with viral RNA | |
| Wagter et al. | PCR detection of lentiviral GAG segment DNA in the white blood cells of sheep and goats | |
| CN109457050A (en) | Detect primer, probe, kit and the detection method of hbv nucleic acid | |
| CA2229986A1 (en) | Process and device for determining the activity of enzymes in liquids, or the concentration and/or activity of inhibitors in liquids | |
| CN111323581A (en) | Influenza hemagglutination inhibition test detection method | |
| CN111719018B (en) | Novel coronary virus loop-mediated isothermal amplification detection chip and preparation and use methods thereof | |
| DK164880B (en) | PROCEDURE FOR QUANTITATIVE DETERMINATION OF THE CONTENT OF A PRESENTLY DETERMINED VIRAL NUCLEIC ACID WHICH MAY BE CONTAINED IN A NATURAL BIOLOGICAL MEDIUM AND EQUIPMENT FOR USE IN THE PROCEDURE | |
| Richman | Principles of HIV resistance testing and overview of assay performance characteristics | |
| Erhardt et al. | Quantitative assay of PCR-amplified hepatitis B virus DNA using a peroxidase-labelled DNA probe and enhanced chemiluminescence | |
| CA2212043C (en) | Method for assay of analyte by adjustment of chemiluminescence | |
| CN109457052A (en) | Detect primer, probe, kit and the detection method of human immunodeficiency virus nucleic acid | |
| CN114460287A (en) | Detection method and kit for neutralizing antibody | |
| CN113249526A (en) | PCR reaction sequence combination for detecting hepatitis B virus and kit thereof | |
| CN110669869A (en) | Method for detecting plasma EB virus DNA by magnetic bead method nucleic acid extraction combined with fluorescence PCR | |
| CN109457051A (en) | Detect primer, probe, kit and the detection method of hepatitis C virus nucleic acid | |
| JP3540675B2 (en) | Specific binding assay using methyl orange | |
| CN114606345B (en) | Preparation method, detection method and kit of protein thermal stability detection chip | |
| US7875422B2 (en) | Viral drug susceptibility testing | |
| RU2142134C1 (en) | Test system for detecting antibodies to nuclear protein of hepatitis c of igm class | |
| JPH06113896A (en) | Method for measuring nucleic acid | |
| CN116296702A (en) | Dead-living dye capable of customizing detection channel based on mass spectrometry detection technology and preparation method and application thereof |