JPH062080B2

JPH062080B2 - 生物学的媒体中のウイルス核酸の定量用試薬並びにキツト及び該核酸の定量方法

Info

Publication number: JPH062080B2
Application number: JP60501079A
Authority: JP
Inventors: ブレシヨツト，クリスチヤン; チオレ，ピエール; スコツト，ジヤツク; クーン，マリー
Original assignee: ANSUCHI PASUTSUURU; Abbott Laboratories
Current assignee: ANSUCHI PASUTSUURU; Abbott Laboratories
Priority date: 1984-03-07
Filing date: 1985-03-07
Publication date: 1994-01-12
Anticipated expiration: 2009-01-12
Also published as: DK511385A; ATE43642T1; DK511385D0; FR2560995A1; FR2560995B1; DK164880B; CA1273862A; DE3570698D1; WO1985003951A1; EP0159223A1; GR850578B; JPS61501306A; EP0159223B1; DK164880C

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、生物学的媒体、特に天然媒体中に含まれるウ
ィルス核酸（ＤＮＡあるいはＲＮＡ）の定量用試薬、該
試薬を含むキット及び該天然核酸の定量方法に係る。そ
の好ましい利用の一つにおいては、本発明は例えばヒト
あるいは霊長目の動物の血清中のＢ型肝炎ウィルス、よ
り一般にはこの媒体が含有し得る感染ウィルスあるいは
ヴィリオンからのウィルスＤＮＡの定量に係る。

現在、感染粒子特にＢ型ウィルス肝炎のヴィリオンに対
する簡単で直接的な定量法は殆んど存在しない。対象ウ
ィルスのゲノムに特異的な配列を有するＤＮＡプローブ
が日常的に使用され始めている。例えば、Ｂ型ウィルス
肝炎ウィルスのＤＮＡ−ＨＢＶ配列あるいはＳ遺伝子の
全部あるいは一部を含むプローブの使用が既に提案され
ている。これ等のプローブはその技術文献に記載された
条件下でウィルスあるいはヴィリオンの存在を、それ等
が存在し得る生物学的試料中において定性的に検知し得
る。しかしながらこれ等のプローブは現状で使用される
条件下においては定量を行なうのには役に立たない。例
えば、ニトロセルロース支持体のような支持体上でハイ
ブリデーション試験を行なう様な場合、該プローブは該
支持体に部分的に吸着されたり“移動（traverser）”
したりする。この現象は検知における定性的特徴を阻害
するものではない。しかし、定量的測定を行ないたい場
合にはそうではない。

ある種のＤＮＡ配列の定量的測定は特定の条件下で電子
顕微鏡下に行なわれていた。しかしこのような技術を日
常的なウィルス粒子の定量測定操作、特に診断等に使用
することは考えられないことは明らかである。この方法
は感染の進行を測定できるようにする、経時的な連続的
測定にはとても使用できない。

本発明の目的はそのような定量的測定を可能にする手段
（試薬，試薬キット及び方法）を提供することである。
特に、例えば特定の患者におけるＢ型ウィルス肝炎のよ
うな可能性のあるウィルスの感染を検知することだけで
はなく、ウィルス感染の進行を迅速に測定し、それによ
り最適な抗ウィルス治療を行なえるように確認及び調整
することをも、研究室においてあるいは臨床医が自由に
行えるようにする手段を提供することが本発明の目的で
ある。

当然、この方法を簡単に日常的に利用できる手段を提供
することも本発明の目的である。

対応するウィルスの増殖に適合する天然の生物学的媒体
標本中のウィルスＤＮＡの定量測定用標準試薬は、前記
のウィルスＤＮＡとハイブリデーションし得る、好まし
くはクローン化された既知濃度のＤＮＡ配列とタンパク
質を混合して含むことを特徴とする。

クローン化ＤＮＡはウィルスＤＮＡとハイブリデーショ
ンし得るＤＮＡインサート含有するクローン化ファージ
の形態であることが好ましい。

タンパク質は前記の天然の生物学的媒体と類似の生物学
的媒体に由来するものであることが好ましい。この試薬
は、当初に定量測定しようとするＤＮＡを含んでいない
こと、及び前記の既知濃度で前記のファージを含んでい
ることを除いては、同じ天然生物学的媒体の必須成分を
含有するか、さらには同じ天然生物学的媒体により構成
されていることが好ましい。

クローン化ＤＮＡ、好ましくはハイブリデーションし得
る配列を有するファージとタンパク質の結合により、相
対的測定条件として正確に再現可能な条件下で該ＤＮＡ
をメンブランあるいはフィルター型の支持体に固定する
ことができる。これは同じ支持体への試験標本の固定に
ついても同様である。

天然の生物学的媒体に含有されているある種のウィルス
核酸の含有量を定量測定する本方法は、該ウィルス核酸
を含む媒体を前もってハイブリデーションし得る条件に
してＤＮＡプローブと適当に接触させ、その結果対象ウ
ィルス核酸とハイブリデーションしたプローブの量の同
一の条件で陰性対照に対して測定したバックグラウンド
ノイズに対する比と、同一のプローブと測定ウィルスＤ
ＮＡに対応するクローン化ＤＮＡを含む前記したような
試薬とのハイブリデーションにより対応するバックグラ
ウンドノイズに対して同一でないとしても同様の条件下
で得られた結果に対応する対照となる比の少くとも１つ
の比較から成ることを特徴とする。

上記の対照比は、既知のそれぞれ異なる量のクローン化
ＤＮＡと結合したプローブの測定量の対応うるバックグ
ラウンドノイズに対する比から作成しあ計算図からも得
られる。

陰性対照はクローン化ＤＮＡが存在しない以外、試薬と
類似又は同一の組成を有するものであることは前述より
自明である。

ハイブリデーションしたプローブの量はどのような測定
システムとも関連させ得る。例えばハイブリデーション
の相手の１つとしては、放射活性，酵素，螢光のような
その強度を測定し得る信号を発生するものにより標識さ
れた保持物である。

本発明による試薬の既知量と適当なプローブとのハイブ
リデーション操作を繰り返した時、ハイブリデーション
反応中の上記した比の不変性を観察することによりハイ
ブリデーション反応に使用した核酸の量を測定すること
ができる。これは常に類似の生物学的標本を含む天然標
本の同じ量（例えばいくつものアリコート）について同
じ条件下で測定し得る比に関しても同じである。

しかし、これ等の比は使用する試薬に含まれ得るクロー
ン化ＤＮＡの量の関数として変化するものであり、従っ
てクローン化ＤＮＡの濃度の関数としての上記比の変化
を示す計算図を、特にファージ粒子に関し作成すること
ができる。試験した生物学的標本について行った同様の
測定から得られた同じ比の変化は上記の計算図と相関さ
せることができ、従って特定の標本中の当初は未知のウ
ィルス粒子含有量を測定した結果と対応する計算図の曲
線との単純な比較により求めることができる。

前記より、検出所望ウィルス粒子を含む天然生物学的標
本が血液血清から成る時、クローン化ＤＮＡが血液血清
の必須成分と結合するような本発明の標準試薬を使用す
ることが有利である。試薬標本が細胞抽出物である時
は、使用する試薬は同等の細胞抽出物と既知量のクロー
ン化ＤＮＡの混合物から成るものであることが有利であ
る。

クローン化ＤＮＡそのものは、例えばＤＮＡ−ＨＢＶの
全部あるいは一部のようなプローブ配列のインサートに
よりその遺伝形質を改変されたファージの形態である。
従ってこの配列は個々のファージ中に“パッケージ”さ
れるものであり、そのファージについては文献に多数の
例が記載されている。例えばλ−ファージあるいはＭ−
13ファージ、あるいはこれらのファージの誘導物や類似
物である。使用されるファージは、パッケージできるイ
ンサートＤＮＡの大きさを考慮して、定量するウィルス
粒子の対応ＤＮＡプローブ配列の機能を果すものが選択
されることもある。

ファージ中のクローン化ＤＮＡを使用する利点はクロー
ン化要素と天然粒子間の類似性にあり、従ってハイブリ
デーション操作を類似の条件下で行なった場合、ウィル
ス粒子の近い濃度において特定ＤＮＡプローブに関し、
試薬及び測定試料に同様な挙動が見られる。これはひと
つの場合であり、クローン化ＤＮＡは定量対象ウィルス
粒子のゲノムの一部おハイブリデーションし得る配列を
含むプラスミドにより構成されてもよい場合もあること
を指摘しておく。

クローン化ＤＮＡ及び試験標本のウィルス核酸の両方と
ハイブリデーションするプローブについては、クローン
化ＤＮＡ及び対象ウィルス粒子のゲノムとハイブリデー
ションできることが知られているプローブであればどの
ようなものを使用しても良い。好適な場合である定量ウ
ィルス粒子がＢ型肝炎ウィルスから成る場合、プローブ
はＤＮＡ−ＨＢＶの全体あるいはいかなる部分によって
も構成され得る。

前述したような条件下においてプローブと試薬の接触に
より検知及び測定可能なハイブリデーションが生起でき
るならば、プローブは前述の試薬と同様に構成され得る
ことは自明である。

プローブは一般に、放射活性マーカーあるいは螢光，酵
素のようなその他の形のマーカーで標識される。酵素標
識を使用した場合においては、ハイブリデーションにお
いて使用された標識ＤＮＡの量は、対応する基質に対す
る酵素の作用レベルを、基質の改変を何らかの適当な方
法、特に比色法あるいは分光光度法により定量的に測定
することによって評価し、算出することができる。

もちろん、ハイブリッドプローブと使用したマーカー間
の結合を生起できるものであればどのような慣用の技術
も使用することができる。マーカーはプローブと予備結
合されていても良い。これは標識が放射性物質を介して
なされている場合可能である。非放射性標識の場合は、
この結合は直接的なものであっても間接的なものであっ
てもよい。特に、プローブが第１抗体を認識できるよう
な抗原部位を有するように改変され、さらにその第１交
替が今度はそれ自身が第２抗体を認識し、その第２抗原
が上記した定量において使用した酵素あるいは螢光標識
を支持するようにしてもよい。

この点に関しては、この技術の記載を参照するのが有利
であり、例えばフランス特許出願No.78 10975号，アメ
リカ特許4358535号，ヨーロッパ特許00063879号等であ
る。

適切なハイブリデーション反応は適当な公知の条件を生
起することができる。その操作は試験標本から得られ、
ＤＮＡについて予備濃縮された生物学的組成物について
行うことができる。そのような前提においては、前記に
定義したようなタイプの標準試薬を使用し、さらにそれ
に同じタイプの予備濃縮を行なうことが有利である。こ
の予備精製は一般的には不要である。標本の予備処理
は、結果を得るのに検知及び定量所望ウィルス粒子の溶
解及びＤＮＡあるいはウィルスＲＮＡの変性が必要な場
合に限られる。

ハイブリデーション反応は液相中で好ましくは固体支持
体上で行なわれる。

一つの方法として測定対象標本を、また別な場合として
クローン化ＤＮＡを含む試薬を、例えばニトロセルロー
スフィルターあるいはナイロンのブランドで知られるポ
リアミド支持体のような後のハイブリデーションに適し
た支持体上に沈積させるのが有利である。この沈積は標
本及び試薬に含有されたＤＮＡ配列が実際に支持体上に
固定されるような条件下で行なう。固定は真の固定に対
応する保持と解されるべきで、例えば共有結合あるいは
より単純な錯体化によるものである。しかし吸着であっ
ても固定によるものと全体的に同等な結果をもたらす。
その後、それ自身は公知の条件下で標本と試薬のそれぞ
れを共通のプローブと接触させる。適用された過剰なプ
ローブの全てを除去するために適当に洗浄した後、定量
を行なう。

競合反応を使用する技術を利用することも可能である。
このような技術は、基質との反応に使用されるが未知量
の第１成分と第１成分と同一か類似の既知量の第２成分
との既知量の基質についての競合を使用する。第１成分
の当初濃度は基質との反応に使用された第２成分の量あ
るいは濃度から導くことができる。

本発明の範囲においては、基質は特にプローブであり、
第１成分が定量対象標本、第２成分が本発明の試薬であ
る。

本技術においても試験成分学的標本の所望ウィルス粒子
含量の比較による測定を可能にする計算図を作成できる
ことは明らかである。

定量的測定をできる限り正確に行なうために、これ等の
試薬の複数を含む用具一式あるいは“キット”を使用す
ると有利なことが多い。複数の試薬はそれぞれ異なるク
ローン化ＤＮＡの濃度によりお互いに区別される。実
際、少くとも１つの試薬が測定する未知量とさほど違わ
ないクローン化ＤＮＡ濃度を持っているようにして結果
をできるだけ有意なものにするのに充分な試薬を、いつ
でも試験標本と接触できるように同一の用具一式の中に
備えておくことが有利である。

本発明は、 ―少なくとも１つの上記の試薬及び ―クローン化ＤＮＡを含まない以外は同一の組成を有す
る試薬、からなることを特徴とする用具一式あるいは“キット”
にも係る。

該キットはさらに、本発明の試薬の種々の濃度とプロー
ブとのハイブリデーションの後に測定した標識による信
号の強度の、対照試薬を同じプローブと同一のハイブリ
デーション条件下で接触させて同様の条件下で測定した
バックグラウンドノイズに対する比の変化を、これ等の
ハイブリデーション試験に使用した試薬の量の関数とし
て示した少なくとも一つの計算図を含むことが有利であ
る。ここで標識はハイブリデーションで使用した相手の
どれかに保持されるものと解され、好ましくはプローブ
により保持される。

用具一式はさらに、本発明に依る試薬、対照試薬及び試
験標本の種々の成分をその後のハイブリデーション可能
配列を含むＤＮＡプローブとのハイブリデーションを可
能とする条件下で沈積及び固定するための一つあるいは
数種の支持体を含むことが好ましい。

本発明のその他の特徴は、標準試薬の好ましい製造及び
使用方法、その後の定量的測定用ファレンスとなる計算
図の作成方法、及び本発明方法の使用方法を記した以下
の記載の中でも明らかにされるであろう。

1) 標本の調製Ｂ型肝炎ウィルスに感染されていると見られる血液血清
標本をナイロンポリアミド（ビオデインＡ［Ｂodine
Ａ］，パール［Ｐall]社）あるいはその他のハイブリデ
ーションテストに適したナイロンあるいはニトロセルロ
ースのメンブラン上に固定する。沈積は“点汚れ（Ｄot
-blosts）”スポットで行なう。この沈積は、濃縮した
標本の直接の沈積、予め希釈した標本を支持体の限定域
を通る口過、及びその部分を通す吸引のいずれによって
も生成できる。標本を次に0.15Ｍソーダ溶液及び１ＭＮ
ａＣｌ（最適濃度）溶液で処理いてその場でウィルス粒
子を溶解し、ＤＮＡを変性し、それ等をＨＢＶウィルス
のゲノムとハイブリデーションできるプローブに接近し
得るようにする。

その後、トリス：ＮａＣｌバッファーで中和する。次に
固体相を80℃に加熱し、使用した支持体の性質により１
〜２時間加熱を維持する。この加熱により標本のＤＮＡ
の支持体への固定を確保する。

次に標本は、本発明の標準試薬とのハイブリデーション
操作を受ける。

2) 表示試薬の調製これ等に使用されるクローン化ＤＮＡは、検出所望ウィ
ルス粒子のゲノムと共通の配列を有するＤＮＡ、例えば
ＤＮＡ−ＨＢＶの部分的あるいは全体的配列のインサー
トにより、それを使用するファージ中にパッケージして
そのファージの複製に不可欠ではない部分を改変したλ
−ファージあるいはＭ−13ファージのようなファージに
より構成される。

これ等の改変ファージを既知濃度（濃度は、例えば光学
密度の測定、マット中の細胞培養プレートにより測定で
きる）で、健康な血液血清と混合することによって１種
あるいは数種の本発明の試薬を調製することができる。
10²〜10¹⁰の範囲のファージ粒子の単位用量を使用でき
るこのタイプの試薬を生成するのが有利である。

次にこれ等の試薬を同様にフィルター上に沈積し、測定
標本と同じ条件で処理する。既知量（試薬によって形成
されたスポット）及び未知量（測定標本から得たスポッ
ト）のＤＮＡを沈積し終えたメンブランは、例えば³²Ｐ
のような放射活性物質により標識されたＤＮＡ−ＨＢＶ
プローブと慣用の条件下でハイブリデーションの生成を
受ける。

慣用のハイブリデーション技術を使用した後、支持体を
洗浄して固定されていないプローブを除去する。フィル
ター上で直接に（オートラジオグラム）、あるいはスポ
ットを切り取った後あるいは媒体の場合は適当な発光液
体を入れたメジャーカップに入れた後に放射線測定によ
り測定を行なう。

3) 特異的計算図の作成ニトロセルロースのメンブランフィルターを複数の孔を
有するプレート表面上に載置し、該プレートは吸引ポン
プを結合したタンク上に置く。ポンプによりメンブラン
のプレートの孔（直径１２mm）のレベルにおいてわずか
に減圧の状態を生起し得る。メンブランをＳＳＣバッフ
ァーで湿らせ、次にプレートの孔の上にメンブランの一
部によって形成された限定された深さのウェル中に、前
記した条件下で種々の量の本発明の粒子を含む試薬、例
えばＤＮＡ−ＨＢＶをパッケージしたλ−ファージを血
液血清中に懸濁したようなものを入れ、ウェル当りウィ
ルス粒子10²〜10¹⁰の範囲の粒子量をそれぞれ含有する
一連の沈積を得る。触媒は前に示したように例えば³²Ｐ
による標識プローブとハイブリデーションできる条件下
で生起する。予備ハイブリデーション及びハイブリデー
ションステップを慣用の条件下で行なった後、それぞれ
のウェルにつき保持される放射活性レベルを測定し、バ
ックグラウンドノイズ（ウィルス粒子を含まない対照標
本に対して同じ条件下で同じ定量で行ない得たもの）に
対する放射活性の比を測定し、前にウェル中に導入した
試薬中に含まれるウィルス粒子数の関数としての測定放
射活性／バックグラウンドノイズの比の変化に対応する
曲線を描く。

最初に使用した特異的な濃度の関数としてのこの比（Ｓ
／Ｂ：“信号（signal）／ノイズ(noise)”の略記）の
変化を示す曲線が得られる。このような計算図の一つを
図に示す。図においては、当初ウェルに導入したファー
ジ粒子の既知量（横軸上のウェル当りの粒子数Ｎ）の関
数として観察されるＳ／Ｂ比（縦軸上）の変化が示され
ている。測定はオートラジオグラムによりフィルター上
で直接行なった。

そこで次に試験標本中のウィルス粒子含量を測定するの
に重要なことは、前記したような同様の条件下でＳ／Ｂ
比を測定し決定することである。その後、必要ならば使
用した試薬と試験標本の組成の差異によるもののような
修正要因を同様に前もって測定した上で考慮し、得られ
たＳ／Ｂ比と計算図を比較することによって未知のウィ
ルス粒子含量を決定することができる。

パッケージされた特異的なクローン化ＤＮＡを種々の濃
度を含むその他の型の試薬についても全て同じような計
算図を作成することができる。

定量的測定については、Ｓ／Ｂ比が２以上において測定
するのが信頼性があるものと言える。

変形として使用される定量測定法においては、放射活性
で標識され、公知の特異的活性を有し、固体支持体上に
固定されたＨＢＶ−ＤＮＡ配列が使用される。これ等の
固定標準試薬も後は前述した様に処理される。一方でこ
れ等の固定配列と既知濃度のファージ粒子の放射活性標
識試薬のセットとのハイブリデーションを生起させ、そ
して天然ウィルス粒子含量が未知の試験標本の測定量の
セットと行なう。

次に最終的に固体支持体上に保持されたＤＮＡの量を計
算し、ハイブリデーション効率と試験標本に由来するハ
イブリデーションした粒子の用量の両方を決定できる。

一般に、１つの実施例を示した本方法は、他の全てのタ
イプのウィルス粒子、及び例えば酵素あるいは螢光標識
のような異なる標識を使用した全ての対応プローブにつ
いて適用できる。本方法は、生物学的液体、組織あるい
は細胞中のウィルス起源のあらゆるＤＮＡあるいは特定
のＲＮＡの相対的濃度の決定に使用できる。本発明によ
る試薬はまた、試薬及び対応する天然ウィルス粒子標本
の両方に関し、国際標準の作成にも適用できる。

結論として、本発明の方法は例えばＨＢＶ粒子のような
粒子の直接的な定量方法を提供するものであり、その使
用は特に簡単なものである。本方法は、感染の進行を評
価すること及び抗ウィルス治療の効果を評価するため
に、羅患者の感染レベルを測定しなければならない場合
に特に有用である。

自明であり、また既に記載した内容から得られるよう
に、本発明は特に意図した適用及び実施態様に限定され
るものではなく、そればかりかあらゆる変形例も包含す
るものである。

フロントページの続き (72)発明者チオレ，ピエールフランス国、75013・パリ、リユ・ドウ・ラ・グラシエール、16 (72)発明者スコツト，ジヤツクフランス国、75005・パリ、リユ・カトルフアージユ、８ (72)発明者クーン，マリーフランス国、75008・パリ、リユ・ジヤン・グージヨン、10 (56)参考文献欧州特許出願公開 62286（ＥＰ，Ａ)

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】特定のウイルス核酸をそれとハイブリダイ
ズ可能でマーカーを担持しているＤＮＡプローブとメン
ブランまたはフィルター上でハイブリダイズさせること
により、タンパク質を含む生物試料中の特定のウイルス
核酸を定量する方法であって、 (１) （ｉ）前記生物試料、 (ii) 前記生物試料中のタンパク質と類似又は同一のタ
ンパク質を含むが前記ウイルス核酸を含まない負の対照
試薬、 (iii) 前記生物試料中のタンパク質と類似又は同一の
タンパク質及び前記プローブとハイブリダイズ可能なク
ローン化核酸を種々の既知濃度で含むが分析しようとす
るウイルス核酸を含まない一連の標準化試薬を夫々前記プローブとメンブラン又はフィルター上で接
触させ、 (２)前記生物試料中のウイルス核酸とハイブリダイズし
たプローブに担持されているマーカーが与える信号の強
度（Ｓ）と、前記プローブと負の対照試薬の接触の結果をマーカーが
与えるバックグラウンドノイズの強度（Ｂ）と、前記一連の標準化試薬中のクローン化核酸とハイブリダ
イズしたプローブに担持されているマーカーが与える信
号の強度（Ｓｎ）とを夫々測定し、 (３)前記生物試料中のウイルス核酸の含量を比Ｓ／Ｂと
標準化試薬の比Ｓｎ／Ｂとの相関から評価することから成る方法。
【請求項２】標準化試薬が、生物試料と類似または同一
であるが分析しようとするウイルス核酸を含まない培地
と、種々の既知濃度のクローン化核酸とから成ることを
特徴とする請求の範囲１に記載の方法。
【請求項３】標準化試薬が、クローン化核酸を種々の既
知濃度で含む健常な血清から成ることを特徴とする請求
の範囲１に記載の方法。
【請求項４】分析しようとするウイルス核酸がＢ型肝炎
ウイルスのＤＮＡから構成され、ＤＮＡプローブがＢ型
肝炎ウイルスのゲノム、例えばＨＢＶ−ＤＮＡ又はＢ型
肝炎ウイルスゲノムのＳ遺伝子とハイブリダイズし得る
ＤＮＡ配列を含み、クローン化核酸がＤＮＡプローブと
ハイブリダイズ可能な配列を含むことを特徴とする請求
の範囲１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】標準化試薬中のクローン化核酸が、前記プ
ローブとハイブリダイズし得るＤＮＡ配列が挿入された
クローン化ファージからなることを特徴とする請求の範
囲１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】標準化試薬中のクローン化核酸がマーカー
を含んでいることを特徴とする請求の範囲１〜５のいず
れかに記載の方法。
【請求項７】標準化試薬中のクローン化核酸とＤＮＡプ
ローブとの間で後に行なわれるハイブリダイゼーション
を可能にする条件下で各々の標準化試薬がメンブラン又
はフィルターに固定されていることを特徴とする請求の
範囲１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】標準化試薬中のクローン化核酸の濃度の関
数として標準化試薬の比Ｓｎ／Ｂを表すモノグラムを予
め作成し、生物試料中のウイルス核酸の含量を比Ｓ／Ｂ
及び前記モノグラムから決定することを特徴とする請求
の範囲１〜７のいずいれかに記載の方法。
【請求項９】生物試料中のウイルス核酸の定量用キット
であって、（１）分析しようとするウイルス核酸とハイブリダイ
ズし得るＤＮＡプローブと、（２）前記生物試料中のタンパク質と類似又は同一の
タンパク質を含むが該プローブとハイブリダイズし得る
核酸を含まない負の対照試薬と、（３）前記生物試料中のタンパク質と類似又は同一の
タンパク質及び前記プローブとハイブリダイズし得る種
々の既知濃度のクローン化核酸を含むが、該ウイルス核
酸を含まない一連の標準化試薬とから成るキット。
【請求項１０】支持体に固定されていてマーカーを含ま
ない前記試薬と、マーカーを担持していて支持体に固定
されていない前記試薬とを含むことを特徴とする請求の
範囲９に記載のキット。
【請求項１１】標準化試薬中のクローン化核酸の濃度の
関数としての、プローブとクローン化核酸との間のハイ
ブリダイゼーションの後にマーカーにより与えられる信
号の強度と、前記プローブと負の対照試薬との接触の結
果マーカーにより与えられるバックグラウンドノイズの
強度との比を示す少なくとも１つのモノグラムをさらに
含み、前記マーカーはハイブリダイゼーションに関与し
た対合相手のいずれかの一方、好ましくはプローブが担
持していることを特徴とする請求の範囲９または１０に
記載のキット。
【請求項１２】標準化試薬中のクローン化核酸が、Ｂ型
肝炎ウイルスのゲノム、特にＨＢＶ−ＤＮＡ又はＢ型肝
炎ウイルスゲノムのＳ遺伝子とハイブリダイズし得るプ
ローブとハイブリダイズし得る配列を含有していること
を特徴とする請求の範囲９〜１１のいずれかに記載のキ
ット。
【請求項１３】好ましくはクローン化されていて、前記
ウイルス核酸とハイブリダイズ可能なＤＮＡ配列を含む
既知の濃度の核酸及び前記生物試料中のタンパク質と類
似又は同一のタンパク質を含むことを特徴とする生物試
料中のウイルス核酸の定量用の標準化試薬。
【請求項１４】クローン化核酸が、前記ＤＮＡ配列が挿
入されたクローン化ファージにより構成されていること
を特徴とする請求の範囲１３に記載の試薬。
【請求項１５】タンパク質が、分析しようとするウイル
ス核酸を含有する生物試料に類似の生物培地に由来する
ものであることを特徴とする請求の範囲１３又は１４に
記載の試薬。
【請求項１６】クローン化核酸が、生物試料と同一であ
るが分析しようとするウイルス核酸を含まない天然生物
培地中の本質的な成分と結合している請求の範囲１５に
記載の試薬。
【請求項１７】クローン化核酸がマーカーを有する請求
の範囲１３〜１６のいずれかに記載の試薬。
【請求項１８】後に続くクローン化核酸と前記プローブ
のハイブリダイゼーションを生起し得る条件下で支持体
上に固定されていることを特徴とする請求の範囲１３〜
１７のいずれかに記載の試薬。