JPS58170496A - Ｂ型肝炎ウイルスの診断テスト方法，その診断薬及びその診断試薬及びその診断テスト器具一式 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、核酸交配によるＢ型肝炎ウィルスの検出の方
法及び試験器具に関するものである。より詳細には９本
発明は９人間または実験動物の血清中のＢ型肝炎ウィル
ス−ＤＮＡ　（以下９時によっては）ＩＢＶ−ＤＮＡと
呼ばれる。）の存在を検出するだめの方法に関するもの
である。

なお特定して言うと２本発明は、血液、血液生成物、ワ
クチン及び他の体液中のＨＢＶ　−ＤＮＡを直接検出す
るだめの方法に関する。

本出願は、１９８１年３月３１日に受理されたＢ型暦炎
ウィルスの診断テストについての発明者による出願（出
願番号２４９ｊ６９）と部分的に続いているものである
。

１１１１年にもわたって、血清及びその他の体液中のＢ
型肝炎ウィルス（以下９時によりＨＢＶと呼ぶ。）成分
の存在を検出するために、数種類のテストが行われてき
た。これらのテストは９本質的にはＦに免疫学的なもの
で、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、Ｂ型肝
炎つィルス核抗原（ＨＢｃＡｇ）又は。

Ｂ型肝炎ウィルス「Ｅ」、抗、原（ＨＢｅＡｇ）のよう
な特定のウィルス蛋白質を検知することから９人間又は
動物の体中で作られる抗体の存在に依存していた。最も
感度の良い免疫学的技法と考えられてきた放射免疫分析
では、、１２５ヨードでラベルされた抗体を用いる。放
射免疫分析は、　　ＨＢ、Ａｇのナノグラム（１０１グ
ラム）量を検知するのに充分な感度を持つ。しかし、免
疫学的テストは間接的であって、非特定の抗原−抗体反
応が起き、誤まった陽性判定をする結果となる。その上
、ある場合には。

血液提供者の血清が、抗原−抗体テストで陰性であって
も、輸血された人がＢ型肝炎ウィルスに感染することが
ある。米国において献血された血液全てをＨＢ８Ａｇを
見出すために綿密に放射免疫分析するにもかかわらず、
輸血後の肝炎症のかなりの割合が、検知を逃れたＨＢＶ
で汚染された血液の輸血によって起きている。このため
、放射免疫分析及び他の免疫学的テストは、大きな欠点
を持ち、用途も限られ１重大なウィルスによる伝染性の
間接的な指数を提供するだけである。

血清中の強力な伝染性ウィルスを特定するだめに行なわ
れる他のテストの中には、ウィルス性合成酵素分析及び
顕微鏡検査がある。多くの場合。

こＪｌらの方法は、比較的感度が低くて手のかかる分析
で、研究室での日常的スクリーニング法として用いるに
は実用的ではない。

本発明は１分子交配と組換ＤＮＡ技法を用いて人間の血
清中のＨＢＶ−ＤＮＡを直接検知するＢ型肝炎ウィルス
の簡単で感度の高い大量スクリーニング法の免μも含む
。本発明によれば、交配消息子は。

Ｂ型肝炎ウィルス−ＤＮＡをクローン化することで作ら
ｔする。クローン化されたＨＢＶ−ＤＮＡは２組換プラ
スミドから精製され、交配消息子を作るため、３２Ｐ又
ｒ、ｔ１２５ｔで高度な特定活動にラベルされる。交配
消息子は、適当な基質に植えつけたテストサンプル（Ｈ
ＢＶを含む疑いのある）につけられ、消息子を持つサン
プルは、ラベルされたＨＢＶ−ＤＮＡがテストサンプル
中に存在するＨＢＶ−ＤＮＡ連鎖のみと交配（結合）す
るような交配条件のもとで培養される。

培養の後、結合しなかったＨＢＶ−ＤＮＡ消息子は、基
質から取り除かれて、交配上たＨＢＶ−ＤＮＡの存在が
。

基質の液体シンチレーション分光又はオートラジオグラ
フィによって、つきとめられる。陽性分析結果は、テス
トサンプルがＨＢＶのＤＮＡを含んでいることの証明に
なる。

この交配分析は、血清その他の体液中のＨＢＶ又はＨＢ
Ｖ蛋白質を検知するために現在用いられている方法より
９本質的に感度が高い。その上、このテストでは、ウィ
ルスの蛋白質抗原の存在を示すことによってではなく、
ウィルス粒子のＤＮＡを見分けることでウィルス性伝染
力を直接証明する。

このテストは、　　ＨＢＶに限られ１間違いの陽性結果
を全く除去出来、精製された核酸交配消息子が作れるも
のであれば、他のＤＮＡ又はＲＮＡテスト方式にも用い
ることが出来る。本発明の方法の主たる利点＆：ｌ：　
、　　大した前処理なしにテストされるサンプルる・内
接使えるという点である。本発明の分析を行うに必要な
物件は、テストキットの形で用意さＪｌ、研究室職員が
、最少量の訓練でたやすく利用出渠るものである。

本発明の［ｊ的は、血清又は体液中のＨＢＶを検知する
方法を提供することである。

さらに９本発明の目的は、ウィルス中に含まれる特殊な
りＮＡの存在を明らかにすることによって。

ＨＢＶを検知するための感度の高い大量スクリーニング
法を提供することにある。

本発明の目的としては、さらに、他の検知方法ではｋｌ
されることもあるＨＢＶ保菌者を確定するＪｌ法を提供
することがある。

本究明の目的は、　　Ｉ（ＢＶ−ＤＮＡの存在によって
明らかにされるように、血清又は体液中にウィルス性止
自′ｅ■たけを持つ人々と９強く完全な伝染性ウィルス
を持つ患者達とを見分ける簡単なテストを提供すること
にある。

本究明の他の目的は、患者の末梢循環系統又は体液中の
伝染性ＨＢＶ−ＤＮＡのレベルを検査する方法を提供す
ることにある。

本発明の他の目的は、　　ＨＢＶ−ＤＮＡ交配消息子、
検知基質、及びテスト試剤を培養するだめの密封容器、
そして、希望すればテストを行なうに必要な他の物質、
即ち、培養液から成るテスト器具一式を提供することで
ある。

主題となる発明に関する参考資料として。

５ｈｏｕｖａｌ　ｅｔ　ａｌ、、　　ｒ臨床研究」２８
巻、２号、１９８０年４月（摘要）。

Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ　ｅｔ　ａｌ、　「Ｎａｔｕｒ
ｅ　Ｊ　２８６巻、５７７２号。

５３１〜５３３ページ、１９８０年７月３１日。

５ｈｏｕｖａｌ　ｅｔ　ａｌ、、　　「国立科学アカデ
ミ−議事録」（ＰＮＡＳ）Ｕ、Ｓ、Ａ、、ｙ　ｙ巻、１
０号、　　６１４７〜６１５１ページ、　　１９８０年
１０月。

Ｂｏｎｉｔｏ　ｅｔ　ａｌ、　「消化器病学」７９巻、
５号、　１９８０年１１月、　　１００６ページ。

５ｈａｆｒｉｔｚ　ａｎｄ　Ｋｅｗ、　　ｒ肝啄病学」
１巻、１号、１〜８ページ、１９８１年１月〜２月。

米国特許４，０５４，０７２号。

米国特許４，０３８，５７８号 がある。

本発明は、特定のウィルスの遺伝情報又は遺伝暗４（は
、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）又はデオキシリボヌクレ
オチド（ＤＮＡ）のポリマーから成る核酸から成り一シ
二っているという事実に基づいている。

）ｆＢＶｔよりＮＡウィルスである。互いに補足し合う
ヌクレオチド分そは、溶液中で「水素結合」によって相
ｌｊ作用をして安定した塩基対を作ることが知ら７１て
いる。こうして、アデニンは、チミディンを認知し、グ
アニンはシトシンを認知する。補足し合うヌクレオチド
が互いに認知し合えるような策件の溶液中に、二つの一
本鎖の補足し合うＤＮＡ分子が存在する時、これらの分
子は互いに反応し合い、安定した二重構造を作る。この
二重構造は。

一本鎖のＤＮＡを完全に崩壊させてしまうヌクレアゼの
攻勢にも抵抗力を持つ。そのため、二重形成の範囲を、
かなりの精度でつきとめることが出、来る。溶液中で反
応するポリヌクレオチド中の塩Ｊｌ（鎖のこの相互反応
は、「再焼きなまし」又は「分子交配」とよばれ１間違
った相互反応は起きない特殊な条件のもとで行われる。

本発明によれば、特定の二本鎖ＤＮＡ鎖（ＨＢＶ−ＤＮ
Ａ　’Ｉは分離され、クローン化によって増殖され。

均質になるよう精製され、検知可能な目しるしでラベル
される。精製されラベルされたＤＮＡは、変性され（例
えば、１００℃で煮沸して）一本鎖に分けられ、テスト
されるサンプルからの変性された核酸を含むテスト溶液
に加えられる。溶液の水成条件（イオン強度、極性、ｐ
Ｈ及び温度）は、核酸の内焼きなましく再結合）が行え
るように調整されるこのようにして、ラベルされた分子
は、ラベルされていない相手と結びつく。こうして、ラ
ベルされ精製されたＨＢＶ−ＤＮＡは、テスト溶液中で
Ｂ型肝炎つィルス鎖と結びつく。精製されたＤＮＡ消息
子は、ガラス容器内で放射能によって高い特定活動（１
ミクログラムＤＮＡ当り、毎分２〜４Ｘ１０”呂１数（
ＣＰＭ））にラベルされ、テストサンプル中のＤＮＡの
ピコグラム（１０”　ｇｍ　）単位の量を検知出来るよ
うにする。重着比較基準では、　　ＨＢＶ−ＤＮＡ検知
のだめの本技法は、これまでＨＢＶ蛋白質抗原を検知す
るのに用いられてきた放射免疫分析より約１０３倍も感
度が良い。

好ましい実施例では、精製されクローン化されたＢノル
（１肝炎ウイルスＤＮＡから成るテスト試剤、テスト中
、患者の血清サンプルを保持する基質、交配作用の間基
質を培養するだめの容器とから構成されるテストキット
を用いて、血清又は他の末梢体液中のＢ型肝炎ウィルス
を検知するだめに９本発明は改良されている。作業を行
う時、試剤はＢ型肝炙ウィルスのクローン化によって作
られる。

それから、　　ＨＢＶ−ＤＮＡは以下の二段階処理によ
って制限酵素で組換プラスミドから精製される。即ち（
１）組換ＤＮＡ　葡その構成分子に分けるだめの制限酵
素による１組換プラスミドの処理、そして（２）従来あ
る分子・市廿分離法を用いてのＨＢＶ−ＤＮＡ鎖の再分
離である。精製段階は、誤まった陽性分析を避ける１段
として大きな重要性がある。好ましい実施例では、精製
されたＨＢＶ−ＤＮＡは、高い特定活動に。

望ましくは３２ｐ又は１２５Ｉでラベルされる。血清サ
ンプルを患者から集め、基質（望ましくは、ニトロセル
ローズ・フィルタ）上に置かれる。放射能でラベルされ
たＨＢＶ−ＤＮＡ交配消息子は、フィルタの上でサンプ
ルと接触させられ、フィルタは、交配条件のもとて交配
溶液の入った密封容器内で培養される。

本発明に用いられる交配溶液は、水成又は部分的に有機
的（疎水性の、又は「非水成」の）どちらでも良い。水
成交配溶液は、はぼ中性のｐＨで。

イオン強度を調整する塩分、変性された保菌ＤＮＡ。

変性されたＤＮＡ又は一本鎖ＤＮＡがフィルタに非特定
粘着するのを防ぐためのデンハート溶液を含む。

イオン洗浄剤（例えば、硫酸ラウリルナトリウム）の０
．１から０．５　＄　Ｗ／Ｖも含まれている。

培養は１通常６５℃〜７０℃で１２〜６６時間行われる
。

好ましい交配ｐＨ条件は、ｐＨ６，５からｐＨ８，０の
範囲のｐＨ価が、満足すべき結果をもたらすことが分っ
ているが、はぼ中性ｐＨである。

交配は、水成条件での雑種の溶解温度より約１０℃トの
あらかじめ決められた温度で行う。部分的に４１機的で
ある溶液中の雑種の融解点は、いくらか低く、それ故、
交配を行う温度範囲は、雑種溶解点から５〜７℃下であ
れば良い。多くの場合。

水成では約６５°と７０℃の間（望ましくは６５℃）の
温度１部分的に有機的な交配溶液では、比較的高いイオ
ン強度で約４０〜４５℃（望ましくは４２℃）の間が、
効果的であることが分っている。

このテストの条件下で安定したポリヌクレオチド雑４４
を形作るには、約２００のヌクレオチドが最小限の長さ
として要求される。そのため、　　）ＩＢＶゲノムの２
００のヌクレオチド塩基対のどの部分も。

あるいは、もっと長いＨＢＶゲノム全長の３２００４５
００の塩基対でも、クローン化し２分離し、精製し。

交配消息子として用いることが出来る。

一般的に、交配は約８時間と約３６時間の間にあらかじ
め決めだ時間中に行う。交配時間は重要Ｃはない。交配
作用時間が長くなっても害はなく。

通常はより完全な交配が行なわれる。交配期間が終ると
、放射能のある廃液は捨て、フィルタは密封容器からは
ずし、結合しなかっ九ＨＢＶ−ＤＮＡ（ラベルされた）
を全てとり除かれるように洗う。フィルタを乾燥した後
、液体シンチレー７ｉ＋７計数のために細かく切り分け
るか、フィルタシート全体を低温（−６０℃と約−８６
℃の間が充分である）で−晩、ラジオオートグラフィに
さらしておいてもよい。陽性のサンプル（ＨＢＶ−ＤＮ
Ａを含む）は、フィルタ上の放射能計′数の滞留によっ
て明らかになる。オートラジオグラフィを用いた場合は
。

陽性サンプルは、テストサンプルが最初におかれた位置
に黒い（暗くなった）円型の点としてＸ線フィルム上に
見出される。

Ｂ型肝炎ウィルスはＤＮＡウィルスは、電子顕微鏡によ
り、急性の感染患者又は慢性Ｂ型肝炎保菌者の血清中に
、しばしば「ディン」粒子とよばれる４２ナノメートル
の球体として認められる。ウィルスの外殻はＢ型肝炎表
面抗原（ＨＢ８Ａｇ）を含み、中核又はヌクレオカプシ
ド（約２７ナノメードル）は、Ｂ型肝炎核抗原（ＨＢｃ
Ａｇ）と、Ｂ型肝炎ｒＥＪ抗原やＢ型肝炎ウィルスＤＮ
Ａ　（ＨＢＶ−ＤＮＡ）を含めた他のウィルスの蛋白質
も含んでいる。

ＨＢＶ−ＤＮＡは２円形で二本鎖になっているが、一本
の鎖（ｂ鎖）は不完全で、他の一本（ａ鎖）は完／Ｉ）
ではあるが、「切れて」（完全だが共有原子価は閉鎖さ
れていない。）いる。不完全な鎖は、その連鎖全数の１
５から４５パ一セント不足している。、　　Ｒｏｂｉｎ
ｓｏｎ、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　、
　５１．５５７〜５７７（１９７７）　；　Ｓｕｍｍｅ
ｒｓ　ｅｔ　ａｌ、国立科学アカデミ−議事録、　　Ｕ
、Ｓ、Ａ、　７２．４５９７〜４６０１（１９７５）。

特殊な合成酵素（ウィルスの合成酵素）は、ウィルスの
中核にあゆ、不完全なり鎖にデオキシリボヌクレオチド
を加える。この作用は二重鎖の円を完成させバクテリア
プラスミド又はバクテリオファーシラノ・ダ中でクロー
ン化するだめの全長で二重鎖のＨＢＶ−ＤＮＡを作るの
に役立つ。

本発明の望ましい実施例を実行する時に用いる高い特定
放射能レベルでは、他のＤＮＡ種分子が１００万個に対
してＨＢＶ−ＤＮＡ分子−個より少ない濃度、又は、人
間ゲノム１コピーあたり０．１コピー以ドの濃度でも、
　　ＤＮＡ種の混合物中のＨＢＶ−ＤＮＡ鎖を検知可能
である。この状況のもとで９人間の血清中のディン粒子
から得られたＨＢＶ−ＤＮＡは９本発明で分子交配消息
子として用いるには充分ではない。ディン粒子ＨＢＶ−
ＤＮＡは、ある条件下では間違いの陽性反応を作り出す
ことが分っている「不純物」をかなりの割合で含、んで
いる。従って１本発明の重要な点は、完全に精製された
ＨＢＶ−ＤＮＡ鎖を２分子交配消息子として使うという
ことである。

ＨＢＶ−ＤＮＡ（７）精製ｕ、ＨＢＶ−ＤＮＡを含む組
換プラスミド又はバクテリオファージ要素を用意し、と
の組換要素で適当なバクテリア細胞を感染させて組換分
子のコピーを多量に作り、大きな規模でプラスミド（又
はラムダファージ）を含む組換ＨＢＶ　−ＤＮＡを再分
離し、その後に組換ＤＮＡ分子からＨＢＶ−ＤＮＡ鎖を
再精製することによって達成される。精製されたＨＢＶ
−ＤＮＡを用いることは特に重要なことである。何故な
らば、現在のテスト方式では、前もってＤＮＡを抽出し
たり、電気泳動又は同様な精製を行わずに直接に基質（
例えば、ニトロセルローズ・フィルタ）に置いた未加工
の血清標本を使っているからである。

本発明で用いるＨＢＶ−ＤＮＡのクローン化の望ましい
ｈ式は、　　ＣｕＣｕｍｍ１ｎ　ｅｔ　ａｌが２国立科
学アカデミー１議ｆμ録Ｕ、Ｓ、Ａ、７７：１８４２〜
１８４６．　１９８０に記述Ｌ−Ｃおり、その発表が参
考としてここに取り入れられている。

他のプラスミド又はバクテリオファージ要素を使う代り
となるクローン化方式は（これらは本発明で用いるのに
も充分なものである。）分献の中に記述しである。（例
えば、　　Ｂｕｒｒｅｌｌ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｎａｔｕｒｅ　２７９　：４５〜４７．１９７９　：Ｃ
ｈａｒｎａｙ、　ｅｔ　ａｌ。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、
７６　：　２２２２〜２２２６１９７９；　５ｎｉｎｓ
ｋｙ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｎａｔｕｒｅ　２７９：３４６
−５４８１９７９及びＶａｌｅｎｚｕｅｌａ、　ｅｔ　
ａｌ、　Ｎａｔｕｒｅ、　２８０　：　ＥＸ　り−８１
９、１９７９゜上記の参考資料は、ここにとり入れらｌ
ｒている１、）クローン化の過程で、　　ＨＢＶ−ＤＮ
Ａをｒｌむディン粒子は、−晩１０５，０００倍重カで
、超遠心分離器で、５〜１０ｍ１の人間の血清から凝縮
される。、ゲイン粒子ＤＮＡのｂ鎖を完全にし、クロー
ン化のだめの完全な二本鎖のＨＢＶ−ＤＮＡを抽出する
ために、　　Ｓｕｍｍｅｒｓ、　ｅｔ　ａｌ　、ＰＮＡ
Ｓ　７５：　４５５５〜４５５７゜１９７８　（この発
表は、参考として使われている。）の方式を採用した。

球形になったウィルス粒は、１００マイクロリツトルの
合成酵素反応緩和剤（α１ＭＴｒｉｓ　ＨＣＩ、　ｐＨ
ａｎ、　２０　ｍＭ　ＭｇＣｌ２．α５ＭＮａＣ１゜［
１２ｍＭＭｄＡＴＰ、　ｄＧＴＰ、、　ｄｃＴＰ及びｄ
ＴＴＰ、　１　ｍＭジオスレイトール及びα１　％　Ｔ
ｒｉｔｏｎ　ＸＸ−１００（ＲｏｈとＨａａｓ、　Ｐｈ
１ｌａｄｅｌｐｈｉａ、　ＰＡ）あ中に懸濁させる。合
成酵素反応は、３７℃で２時間、懸濁したウィルス粒を
培養することから始まる。反応は１反応容器に、５０マ
イクロリツトル（３／６量）の１０　ｍＭＴｒｉｓ　Ｈ
ＣＩ、　ｐＨ７，４，１０ｍＭＥＤＴＡ、プロナーゼ１
１あたりｌ１１５Ｍ９のα２チ硫酸ラウリルナトリウム
（ＳＤＳ）を含む溶液を加えることによって停止する。

全てのウィルス蛋白質と汚染源の人間蛋白質は。

溶液を３７℃で２時間培養することによって分解される
。培養混合物の核酸成分は、残留蛋白質を除くためフェ
ノールで抽出することで分離され、完全に二本鎖になっ
たＨＢＶ−ＤＮＡはエタノール中に沈澱する。完全な二
本鎖になったＨＢＶ−ＤＮＡは。

その後、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏ　Ｒ１（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、　Ｂｅｖｅｒｌｙ、
　Ｍａｓｓ、）で処理することによって線形にされ、ヘ
キサヌクレオチド鎖では。

１１ＢＶ−ＤＮＡの６鎖の一ケ所が欠ける。

５’−Ｇ↓ＡＡＴＴＣ−５’ ｓ’　−ＣＴＴＡＡ　Ｇ−ｓ’ ＤＮＡを、３７℃で６から１２時間、　１００ｍＭＴｒ
ｉｓＨＣＩ、ｐＨ７，５，５０ｍＭＮａＣ１，及び５　
ｍＭ　Ｍ　ｇ　Ｃ１２を含む緩和された溶液中で、ＤＮ
Ａ１マイクログラムあたり１ユニツトのＥｃｏＲ１制限
を用いて培養する。

線形になったＨＢＶ−ＤＮＡは、これでバクテリアプラ
スミド又はバクテリオファージと結合する準備が出来た
。本発明で用いられるのに望ましいプラスミド９．　　
ＰＡＯＩ　（ＣｕＣｕｍｍ１ｎ、　ｅｔ　ａｌ、国立科
学アカノ°ミー議事録Ｕ、Ｓ、Ａ、７７−１８４２〜１
８４６．１９８０に記ａ）及びｐＢ　Ｒ５２２（Ｂｌ　
１ｖａｒ　ｅｔ　ａｌ、Ｇｅｎｅ　２゜９５〜１１５（
１９７７）に記載）（参考にここにそう人した。）ｐＡ
Ｏｌは、自分がその中で自己複製化するバクテリア細胞
にカナマイシン耐性を与えるプラスミドである。プラス
ミドｐＡＯ１を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ
　ＫＨ９、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ培養収集品の中
に貯蔵されており、ＡＴＣＣＩ録番号３１８７３で要求
すれば手に入る。）それは、　　Ｃｏｖｅｙ　ｅｔ　ａ
ｌ、がＭｏ１ｅｃ、　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ　１ｃｓ１
４５：１５５〜１５Ｂ（１９７６）で、けじめに記述し
たプラスミドｐｃＲ１から作られる。（参考のために挿
入した。）ｐｃＲｌは、　　ａ７００塩基対プラスミド
である。

ｐＡＯｌは、ｐｃＲｌの二つのＰｓｔ１個所の間に小さ
な欠失部分を含み、制限酵素ＰｓｔｌでｐｃＲｌを分解
し。

再焼きなましすることで作られる。プラスミドｐＡＯ１
は、　ｐｃＲｌと同様な機能を持つが、残留Ｐｓｔ１個
所を一つしか持たない利点がある。このプラスミドは、
また、　　ＨＢＶ−ＤＮＡを挿入するために使えるＥｃ
ｏＲ１個所を一つ持っている。ｐＡＯｌによって形質転
換されたバクテリアは、カナマイシン耐性によって選び
出され１組換クローンは、標準的技法（Ｇｒｕｎｓｔｅ
ｉｎとＨｏａｇｎｅｓｓ、国立科学アカデミ−議事録、
　　Ｕ、Ｓ、Ａ、７２−５９６１−３９６５１９７５　
）　　によって。

ＨＢＶ−ＤＮＡの存在をテストすることが出来る。本発
明の目的にとって、　　ｐＡＯｌは比較的大きなプラス
ミドであり１組換分子中のＨＢＶ−ＤＮＡ鎖から簡単に
切り離仕るという利点を持っている。）ＩＢＶ−ＤＮＡ
のクロン化により頻繁に使われるブラづミドは、プラス
ミドＰＢＲ３２２である。このプラスミドも、また。

回［二ように制限されたＨＢＶ−ＤＮＡの挿入に使うこ
との出来る一つのＥｃｏＲ１個所（又は一つのＰｓｔ１
個所）をａんでいる。一つの利点は、　　ｐＢＲ３２２
は市販されていることである。（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂａｒ−ａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ
、、　Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　Ｍｄ　、　）　Ｌかし、そ
のサイズ（４５８０塩塙対）は、完全な長さノＨＢＶ−
ＤＮＡ　（３２００−ｓｓｏｏニー基χ・ｔ　＞のサイ
ズに比較的近く、クローン化と増’４＋の後で、これら
の成分を分シさせ、ＨＢＶ−ＤＮＡを＋１精製すること
は、より困難である。プラスミドｐ　ＡＣＹＣ１８４（
Ｃｈａｎｇ及びＣｏｈｅｎ；Ｊ、Ｂａｃｔ、、１３４１
１４１．１１５６　（１９７Ｂ）　；　ＰＣＲＩ　（Ｃ
ｏｖｅｙ　ｅｔ　ａｌ、Ｍｏ１ｅｃ。

Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１４５二１５５〜１５８．
１９７６）　　及びその他の多くのプラスミドが２本発
明での使用に適しＣいる。プラスミドの代りに９例えば
、　　Ｃｈａｒｏｎ（Ｂｌａｔｔｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ　
５ｃｉｅｎｃｅ　１９６：１６１〜１６９．１９７７）
又は、　　Ｌａｍｂｄａ　ｇｔ　Ｗｅｓ　、　Ｌａｍｂ
ｄａ　Ｂシリーズ（Ｌｅｄｅｒｅｔ　ａｌ　５ｃｉｅｎ
ｃｅ　１９６；１７５〜１７７、１９７７；　前出の条
項の内容は、参考資料によってここにまとめられた。）
を使っても良い。これらのバクテリオファージの双方は
、　　Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂａ
ｒａｔｏｒｉｃｓ。

Ｉｎｃ、、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ
から市販されている。本方式では、プラスミド（例えｉ
ｆ、　　ｐＡＯｌ又はｐＢＲ３２２）は、制限酵素（例
えば、’Ｅｃｏ旧）で分裂させられる。制限酵素での分
裂の方法は、　Ｇｒｅｅｎｅ　ｅｔ　ａｌ。

「分子生物学」、９巻、　　Ｅｄ　−Ｗｉ　ｃｋｎｅｒ
、　Ｒ，Ｂ、　（Ｍａ−ｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ　Ｉｎ
ｃ、、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）　、　　［ＤＮＡ複製及び
生体内化学合成Ｊ　、　　Ｍｅｒｔｇ　ＪＤａｖｉｓ、
国立科学アカデミ−議事録Ｕ、Ｓ、Ａ、、　６９．５５
７０（１９７２）に記述されている。バクテリアプラス
ミド（例えば、　ｐＡＯｌ又はｐＢＲ３２２）は、Ｅｃ
ｏＲｌで処理され、ＥｃｏＲ１処理されたＨＢＶ−ＤＮ
Ａと同じような連鎖と重複する切断点（「粘着性のある
末端」）を作り出す。二つのＤＮＡは、　　Ｃ１ａｒｋ
、　Ｌ、と、　Ｃａｒｂａｎ、　Ｊ、；国立科学アカデ
ミ−議事録Ｕ、Ｓ、Ａ、、　７２：４３６１〜４５６５
．１９７５の方式を一部修正した方法で１合着され、別
種の組織から成る雑種（組換ＤＮＡ　）が作られる。こ
の過程において、　　ＥｃｏＲｌ　（制限酵素）の等分
子量、線形になったＨＢＶ及び組換を作るために使われ
たプラスミドＤＮＡが、　　１０　ｍＭＴｒｉｓＨＣＩ
、ｐＨ７，４，１００ｍＭＮａＣ１及び１ｍＭＥＤＴＡ
の溶液に混合される。この溶液を、５５℃で１時間、４
６℃で１時間、３７℃で１時間、最後に室温で２〜４時
間と連続して培養ｒる。雑種分子ｄ、　　Ｔ４ＤＮＡ連
結酵素を用いて容器内連結反応によって共有原子価によ
る密着をさせるが、この過程は必要不可欠ではない。エ
ンドヌクレア−・ゼ分解は、中位の温度（約２０°〜４
０℃の・ｍｌｌ円内で、適切に緩和された水成媒体（一
般的には、約６．５とａ５の間のｐＨで）中で正常に行
なわＪ＋る１２反応混合物中の全ＤＮＡ含有駿は９通常
。

約（１１〜１．　Ｏｕｇ／Ｍεになるだろう。反応に要
する時間は変動かあり、ＤＮＡに対する酵素の割合によ
って２．５分から数時間の範囲になる。エンドヌクレ°
）′−ゼの５ｚ剰分は、一般的には制限反応に用いられ
、　　ｊｆｉ常、６〜１２時間の培養時間にＤＮＡ　１
０マイクｌｊダラ！−ｈｉにエンドヌクレアーゼ約５〜
１０ユニツトになる１、＆！形になったプラスミドとＨ
ＢＶ−ＤＮＡのび）合体の後９組換ＨＢＶ−ＤＮＡ分子
は、良く出来た転位方式によってバクテリア細胞内で増
殖される。

一般的には、に１２シリーズ（例えは、　ＨＢｌｏｌ、
Ｃ６００゜ｘ１７７６その他）のＥ、Ｃｏ１１派生体が
９本発明でのクローン化に使われるが、他のバクテリア
でも形質変換可能であれば用いることが出来る。望まし
くは１組換プラスミドＨＢＶ−ＤＮＡの１マイクログラ
ムが、　　２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ、　ｐＨａ６
．　２０　ｍＭＮａｃｌ及び１、　ＯｍＭ　ＥＤＴＡを
含む１００〜３００ｖ（クロリットルノ反応混合液中で
、３７℃で２０分間、　　ｌＸ１０７の有力なバクテリ
アと共に培養される。この形質変換過程の修正案は数多
くあるが、その全ては、Ｃｏｈｅｎｅｔａｌ、が国立科
学アカデミ−議事録Ｕ、Ｓ、Ａ、　７０　：３２４０〜
５２４４　（１９７３）で概略を述べた基本的方法に従
っており、その発表がここで参考としてまとめられてい
る。もう一つの有益な形態変換案は。

Ｖｉｌｌａ−Ｋｏｍａｒｏｆｆ　ｅｔ　ａｌ、、国立科
学アカデミ−、Ｕ、Ｓ、Ａ。

７５：５７２７〜３７３１　（１９７８）によって記さ
れている。

感染を受けたバクテリア細胞を、１．０％寒天皿上の塩
分、グルコース、加水分解蛋白質、鉄分及び他の栄養素
を含むＬｕｒｉａ汁（Ｌ−汁）中に、利用されｊｃ特定
ゾジスミド装素に対応して選択された抗生物ｎ（抗生物
質のカナマイシンはプラスミドｐＡＯ１に用いられ、一
方、アンピシリン及び／又はテトフザイクリンは従来ま
でプラスミドｐＢＲ５２２の場合に用いられている。）
を用いて、薄く伸ばされる。、媒体１リツトルあたりの
し一汁寒天皿の組成は、１０ｇｍのバクトドリブトン、
　５ｇｍバクト・イースｔ−，１０ｇｍのプレイン・ハ
ート混和剤、１０ｇｍのＮａＣ１，１８ｇｍのグルコー
スである。ＨＢＶ−ＤＮＡを持つ組換クローンの各々は
９分離され、クロラムフェエコル増殖を用いて、Ｌ−汁
懸濁培地で大規模（１〜ＳＬ）に育成される。

組換シラスミドＨＢＶ−ＤＮＡは、その後、　　Ｋａｔ
ｚ、ｅｔａｌ、、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１１
４　：５５７〜５９１．１９７３に書かれた洗浄剤溶解
「清浄溶解」方式で再分離される。

このツノ°人でｉ；ｉ、８００ｘｇの遠心分離でバクテ
リアを東め、バクテリア細胞壁を溶かすために１　ｍｌ
あたり１〜のリゾチームと３０〜４０　ｍＭのＥＤＴＡ
を含む溶液で処理する。ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を２体
積で１〜５ｑｂの間の最終濃度に加えてバクテリアを分
離し、溶液を５ｏｒｖａ１１遠心分離機で、４℃で１時
間３０．ＯＯＯＲＰＭで再び遠心分離させ、細胞砕片及
びクロマチンを粒状にする。プラスミドＤＮＡは９表面
に浮く破片の中に留まっており、集められる。プラスミ
ドは塩化セシウムこの配中に４８時間集合することによ
って精製される。プラスミド成分 ブロマイド螢光で認められ、遠心分離機チューブの側壁
に針で穴をあけ、スポイトで螢光プラスミド物質を直接
観察できるように取抄出す。こう配からの物質は塩化セ
シウムで飽和されたインプロパツルで抽出し、塩化セシ
ウムを除去するため１２〜２４時間透析を行ない、フェ
ノールで抽出しエタノールで沈澱させる。

）ＩＢＶ−ＤＮＡは、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲ
１処理で１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ、　ｐＨ７，５
，５０ｍＭ　ＮａＣ１，及び５ｍＭのＭｇＣ１，を含む
緩和された溶液中でＤＮＡ　１マイクログラムあたりＥ
ｃｏＲｌを１ユニツトを用いて、クローン化媒体物から
再分離される。ＥｃｏＲｌは、ＨＢＶ−ＤＮＡが、プラ
スミド（又紘、ラムダファージ）に挿入された個所を判
別出来るので１組換ＤＮＡをもその後、　　ＨＢＶ−Ｄ
ＮＡ部分は、再分離され、サクロ−ズこう配遠心分離、
及び／又は、予備アガロースゲル電気泳動によって、　
　３，２５０のヌクレオチド塩塙対の長さの重分子種に
精製される。望ましい方式でけ、　　ＥｃｏＲ１処理さ
れたプラスミドＨＢＶ−ＤＮＡの５０マイクログラムで
割り切れる数を、　　１０ｍＭＴｒｉｓ　ＨＣＩ、ｐＨ
７，４，１００ｍＭＮａＣ１及び１ｍＭＥＤＴＡを含む
溶液中でミネラルオイルのもとで、　５虹′以ＩＺ＋７
）１０〜５０ｑｂサクローズこう配の上に置き。

Ｂｅｃｋｍａｎ　５Ｗ４１０−ターで１６〜２０時間遠
心分離する。

α２５ｊＩＬの破片をぜん動ボ／ブを用いてこう配チュ
ーブの底から集める。流れ出る液の紫外線吸収は、従来
からあるＵＶ監視装置で２６０ナノメートルで常に監視
される。重いポリヌクレオチド鎖（即ち、約ａ７００塩
俵対を含むプラスミド成分）が、こう配からまず溶離し
、それより短かい長さの）ＩＢＶ−ＤＮＡ切片が、その
後で溶離する。ＨＢＶ−ＤＮＡ群を含むこう配破ハｔま
、貯えられ、２．５容蓋のエタノール中で沈澱させ、少
量のＴＥ緩和剤（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣ１゜ｐＨ７
４；１ｍＭ　ＥＤＴＡ）中で再溶解され、ＣＬＢ％の５
ｍＭ厚さのアガローズ厚板ゲル上で電気泳動にかけられ
る。１０〜２０マイクログラムのＤＮＡを、ゲルの溝一
つ一つに入れる。電気泳動に適した緩和剤にはｉｌｌ緩
和剤（４０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ、　ｐＨ２８，２０
ｍＭ酢酸ナトリウム、及び１．ｍＭＥＤＴＡ）、又は「
Ｐ及びＤ」緩和剤（ＤｉｎｇｍａｎとＰｅａｃｏｃｋ　
；　ｒ生化学Ｊ７：６５９〜６６７．１９６８に発表さ
れた。）がある。５０ボルトで８〜１０時間の電気泳動
が、残留バクテリア細胞とプラスミドＤＮＡ分子からＨ
ＢＶ−ＤＮＡを切り離すのには、充分であることが分っ
ている。緩和剤１履ｌあたり１マイクログラムのエチジ
ウムブロマイドが、アガロースゲルを作るのに用いられ
る。ＤＮＡの移動を追いゲル中のＨＢＶ−ＤＮＡ群の位
置をつきとめるため、２６０ナノメートルの紫外線でエ
チジウムブロマイド螢光を用いる。ＨＢＶ−ＤＮＡ群を
含む部分を薄く切り。

透析袋の中で少量の緩和剤に入れ、１リツトルのＨ，０
中にα６　ｇｍ　Ｔｒｉｓ基と２００ｕｌの氷酢酸を含
む溶液の中で、室温で２００ボルトで５０〜６０分間、
切り取りたゲルを電気溶離にかけてＨＢＶ−ＤＮＡをゲ
ルから溶離させる。

精製された）ＩＢＶ−ＤＮＡは、バクテリア酵素ＤＮａ
ｓｅと合成＃素Ｉが存在すると非常に高い特定放射性を
持つ５２ｐ又Ｈ１２５１デオキシリボヌクレオチドで。

ガラス容器内培養することによってラベルされる。

こＪｌらの酵素は、二本鎖のＤＮＡ中で、ラベルされた
デオキシリボヌクレオチドが、ラベルされないヌクレオ
チドと入れかわるか９代りをするのを可能にする。この
飾未反応は、「刻み翻訳」　（参照：Ｒｉｇｂｙ、　ｅ
ｔ　ａｌ、　「分子生物学ジャーナルＪ１１５：２５７
〜２５１．１９７６）と呼ばれ、”ＰｄＣＴＰと”Ｐｄ
ＧＴＰ（４００〜８００Ｃｉ／ｍモル）を、−）ベルさ
れないｄＡＴＰとｄＴＴＰと共に基質として用いた時、
１ピコグラム（１０−１！グフム）のＤＮＡあたり、１
分間に２００〜４００カウントの間の特定強度で、ラベ
ルされた５　２　ＰＤＮＡを生産する。標準的オートラ
ジオグラフ技法と液体／／チレー’／！ｉン分光器技法
で、１分間あたり５０カウントの３２ｐ放射能を簡単に
検知出来、また。

本発明の培養方法のための背景となる放射能は非常に低
い（即ち、１分間１０カウント以下）ので。

本発明の検知テストの感度の最低限は、Ｂ型肝炎ウィル
スＤＮＡの［１，１から［Ｌ５ピコグラムの間にある。

本発明で用いられる他の検知ラベル化システムには９例
えば、生物発光ラベル、微球体膠着法。

螢光法のようなものがある。

上記のように作られた。精對され、ラベルされたＨＢＶ
−ＤＮＡは９本発明での使用のため、密封容器に入れ、
冷蔵庫（２℃）で保°存される。

本発明のＨＢＶ−ＤＮＡ分析を行う場合、ラベルされた
ＨＢＶ−ＤＮＡは、しっかしした母体に取り付けたテス
トサンプル（例えば、患者の血清あるいは他の末梢体液
）と直接反応させる。本発明で使用するに適した母体と
しては、ニトロセルローズフィルタ紙（望ましくは［１
，２又はα４５ミクロン孔サイズで。

Ｍｉ　１１ｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　Ｂ
ｅｄｆｏｒｄ、　Ｍａｓｓ　、、又は５ｃｈｌｅｉｃｈ
ｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ　Ｉｎｃ、、　Ｋｅａｎ
ｅ、　Ｎｅｗ　Ｈａｍ−ｐｓｈｉｒｅから市販されてい
る。）、がある。ＤＮＡ又はＲＮＡが粘着する（例えば
、米国特許４．１３９ｊ４６号に記載されたジアゾベン
ジルオキシメチル−セルローズ紙（ＤＢＭ紙）のような
）ものであれば、薄板、ビーズ又は織物の形をした殆ん
どどんな基質又は母体であっても９本発明の工程を行う
基質物ｅ走として使用出来る。

本発明の培養テストを行う上で、ここに記載したような
交配媒体が存在する特定の交配条件のもとで、テストサ
ンプルとＤＮＡ消息子を培養する必要がある３、加熱操
作中の液体損失と反応剤の損失と汚染を防ぐために、培
養は容器内で行うことが９ジましいことが分っている。

容器は、煮沸に耐えるＨ質で作られなければならない。

容器は、密封出来る作りになっていた方が良いが、その
他の形状をＬあまり重要ではない。容器がグラスチック
の袋である場合、その袋は加熱密封出来るものであるこ
とが望ましい。本発明の望ましい形式の一つとして９反
応が行なわれる母体又は基質は、小さい柔軟性のある加
熱密封出来るプラスチック袋の中で培養される。密封に
先立って袋の中の空気の入部外を押し出せるように９袋
は柔軟性のある構造になっている方が良い。テストを嫌
気性条件のもとて行うことは本発明の必要条件ではない
が。

培養溶液に泡が含まれていると、交配を妨害し。

又はフィルタ上に高いバックグラウンド域を作って逆効
果を持つことが分っており、培養袋から空気を押し出す
時にこの泡も′大部分は除去される。

テスト過程は単純で比較的簡明である。血液標本は、静
脈穿刺又は指を刺して取り、室温で凝固させる。血清は
通常の診療用遠心分離法で分離され、すぐ使用するか、
後でテストを行うために一１０℃と一８０℃（望ましく
は一７０℃）の間の温度で冷凍状態で保存する。ＨＢＶ
−ＤＮＡを含むと思わねる水成溶液はどれでも９本テス
トで分析される標本として使える。しかし、　ＨＢＶ含
有含有比較的低い標本では、ウィルス粒を沈澱させるた
めに、　１１００Ｊ）００ｘ又はそれ以上の遠心分離に
２〜４時間かけてウィルス粒を濃縮することが望ましい
ことが分っている。ウーイルス粒は、それから、　　１
０　ｍＭ　ＴｒｉｓＩ（ＣＩ、ｐＨ７，４及び１００ｍ
Ｍ　ＮａＣ１を含む溶液中に懸濁させる。

少量の血清標本をニトロセルローズフィルタシート又は
上記の他の母体に円形の点として置く。

こ＃１．ｉｉ、　　５〜１０マイクロリツトルの約数分
をフィルタンートに直接点在させるか、アルカリ性にし
た血清（ｏ、１〜０．２Ｍ　ＮａＯＨ）又は０．１〜０
．５％の硫酸ローリルナＩ・リウムと０．５〜１．０　
ＭＮａＣｌを加えた血清を２００マイクロリツトル塗布
することによって行われ。

す°ンプルは３７℃に５〜１０分間温める。その後、こ
ｆ＋らのサンプルは多重濾過装置を用いて、ニトロセル
＋、ｘ−，（ｌＫｍ、ｉされる。ニトロセルローズフィ
ルタ７−ト（１２センチメニトル×１２センチメートル
）は１００個（１，２ｃＩｌ広さ）の部分に分けらｈ　
、同じシート上で同時に１００個の標本血清をテストす
ることが可能になる。同じテストで、陽性と陰性調節を
含めて多くのサンプルを包括することが出来る。

ｔ’ｈ体は空気乾燥し、緩和剤を浸透させてから。

約２０℃と５７℃の間の温度で真空炉で再び乾燥さ亡る
。フィルタは体は、その後で、蛋白質は全て分解するが
核酸はフィルタに残したままにする酵素溶液に侵す。３
７℃で約３０〜１２０分間浸す。

蛋白質が分解すると、血清標本が置かれた個所が通常は
県えなくなる。適当な蛋白質分解剤として０．３　ＭＮ
ａＣｌと０．０５Ｍ（えん酸ナトリウムの水成溶液に入
ったプロナーゼ又はプロテナーゼ酵素がある、。

望ましくは、この溶液は、’＋ｍｅあたり蛋白質分解酵
素を１００〜２００ミリグラム含んでいるのが良い。

その後、母体を注意深く洗って蛋白質分解酵素の痕跡を
除く。一般的に洗浄は、軽い塩分溶液（例えば、　　０
．３　ＭＮａＣｌ及びｏ、ｏ３Ｍ（えん酸ナトリウムの
水成溶液１００〜２ｏｏｍｇ）の中で行なわれる。乾燥
の後、フィルタ母体は、水の沸騰点に耐える密封容器（
例えば、加熱密封プラスチック袋）の中に置く。多量の
水成又は部分的に有機的な前交配溶液を袋に加える。下
記の表１及び表２は９本発明を実行する際に使える二つ
の代表的水成及び部分的に有機的な前交配溶液の成分を
明らかにしている。

表１−水成前交配溶液（４ｘ　５ＳＣ）０．６　　　Ｍ
ＮａＣｌ ０．０６Ｍ（えん酸ナトリウム（ｐＨ７，０）０．１％
　　ポリビニルピロリドン（ｐｖｐ）０１多　ファイコ
ル ０１％　牛血清アルブミン（Ｗ／Ｖ） ０１係　　硫酸ローリルナトリウム（Ｗ／Ｖ）０、５　
ｍｙ／ｍｅ　　変性子牛胸ＰＭ（又は鮭の精子）ＮＡ 表２一部分的に有機的な前交配溶液（５ｘ　５ＳＣ）５
０％　　脱ヨード化フォルムアミド（Ｖ／Ｖ　）０７５
Ｍ　　塩化ナトリウム ０．０７５Ｍ＜えん酸ナトリウム（ｐＨ７，０）０１％
　牛血清アルブミン（Ｗ／Ｖ） ０１チ　フィニル ０１％　ポリビニルピロリドン ２５ｍＭ　　燐酸ナトリウム（ｐＨ６，５）０１チ　硫
酸ローリルナトリウム（Ｗ／Ｖ）０３ｍ９７ｍｌｉ変性
子牛胸腺（又は鮭の精子）ＤＮＡ１　％　グリシ／（Ｗ
／Ｖ） ＋免明で、前交配溶液に続いて用いられる交配Ｒ７液は
、基本的には前交配溶液と同じ成分と割合構成を持つが
、交配溶液中では、フイコル、ポリビニルピロリドン及
びアルブミン濃度はそれぞれ０．０２％、０．０２％及
び００２％に減少させる。同様に。

１０％硫酸デキストランナトリウ゛ムを、交配を促進し
、８〜１２時間以内に完全な交配を確保するために加え
てもよい。本発明で用いられる交配溶液は。

適正で充分な交配を得るだめに、イオン強度、ｐ）（。

極性、温度が限度内になるよう調整されなけれ１はなら
ない。前交配溶液と交配溶液（水成及び部分的に有機的
な）のイオン強度は、３ｘＳＳＣと６ｘＳＳＣの間にな
ければいけない。ＳＳＣは、塩化ナトリウム−くえん酸
す）　ＩＪウム溶液の基準の略号である。基準媒体（１
ｘ　５ＳＣ）は、０．１５Ｍ塩化塩化ナトリウム、１５
Ｍ（えん酸ナトリウムをｐＨ７，０で含んでいる。

溶液が、３−６ｘＳＳＣの間、望ましくは”ｌ−５ｘＳ
ＳＣである時、交配溶液に必要とされるイオン強度は満
たされる。５　ｘ　ＳＳＣは、　　ｐＨ７，０で０．７
５Ｍ塩化ナトリウムとＱ、０７５Ｍ（えん酸ナトリウム
を含む溶液である。ポリビニルピロリドン、フィニル及
び硫酸ラウリルナトリウム（又は、他のイオン洗浄剤）
を。

変（’ｌ　ｔ−、ラベルされたＤＮＡが、非゛特定にフ
ィルタに粘着するのを防ぐ目的で、前交配及び交配溶液
−・加えても良い。部分的に有機的である交配溶液は２
本質的に水成溶液と相同であるが、脱イオン化したポル
ムアミドを体積でほぼ５０％、　　グリフ）を小）１１
で１０％含んでいる。ホルムアミドの割合構成を増加さ
せると、雑種の融点が下がるので。

はぼ５０％のポルムアミドでの望捷しい交配温度（ｄ４
２℃である。テンハート溶７ｉ　（Ｄｅｎｈａｒｄｔ、
　Ｂｉ−ｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　
Ｃｏｍｍｕｎ　、　２５　：　６４１〜６４６．１９６
６）は、変性した。あるいは、一本鎖のＤＮＡがフィル
タに１１特定粘着するのを防ぐために望ましい交配溶液
に１ノ１１えられる。（デフハート溶液は、８０２％ポ
リビＪ−ルビロリドン（ＰＶＰ）（平均ｍ、ｗ、は３６
０，０００−（：　、　　Ｓｉｇｍａ、　Ｓｔ、　Ｌｏ
ｕｉｓ、　Ｍｏ、から販売されている。）。

０．０２％７　イコ＃　（平均ｍ、ｗ、４００，０００
で、ＰｈａｒｍａｃｉａＦｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ
、　Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、　Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙで
手に入る。）及び、０２チ牛血清アルブミン（ＢＳＡ）
とから成る。）変＝ｌ’ｌ：　Ｌだ子牛の胸腺又は変性
した鮭の精子ＤＮＡが。

溶液中にラベルされた交配消息千金てを保ち、変性しラ
ベルされたＤＮＡがラベルりに非特定粘着するのを防ぐ
だめに、担体として交配溶液中に存在する。（０，１５
〜０．５ミリグラム／＋＋＋ｅＤＮＡ）交配溶液と母体
を入れている袋は、密封されて６５℃〜７０℃、望まし
くは６５℃の温度で約４〜６］１．￥間（望ましくは６
時間）、培養される。前交配溶ｌ夜は取り除かれ、新鮮
な交配溶液（水成又は非水成）と、１００℃で５〜１０
分間煮沸し前処理し、使用直前に氷の上で急速に冷やし
たラベルされた精製済みＨＢＶ−ＤＮＡ消息子（約１〜
２　Ｘ　１０’　ｃｐｍ、　又は約０１マイクログラム
ＤＮＡ　）の約数とで入れ換える。ポリヒ゛ニルピロリ
ドン、マイコルとアルブミンの濃度を・約０．０２％と
００４％の間、望ましくは、それぞれ０．０２％、０．
０２％及び０．０２％に減らした交配溶液を加える。交
配（培養）容器は再密封され、−晩又は４８時間、水成
交配条件では６５℃と７０℃の間。

望ましくは６５℃で９部分的に有機的（ホルムーノ′ミ
ド）条件では、約６７℃と４５℃の間、望ましくは４２
℃の温度で培養される。

培養後は、放射能廃液は捨てられ、フィルりを炎から取
り除き、洗浄する。適当な洗浄液は、０３ＹＡＡ　化ツ
ートリウム、０．０！ＩＭさく酸ナトリウム、及び０．
１チ燐酸ラウリル丈トリウムを含む。この洗浄は。

室（１４で行われる。洗浄過程は、　　０．０１５　Ｍ
ＮａＣｌ。

０．００１５ＭＮａさく酸、０１％燐酸ラウリうナトリ
ウノ、で、高くした温度２通常５０℃と６８℃の間で。

“イ（ましくは６０℃で、−回５０分で二回繰り返す。

空気乾燥した後、フィルタ母体は、液体シンチレー／ヨ
／分光のために切片に切り分けるか、薄４ル全体を、前
もって感光させたフィルムを用いて。

ｘ　ｍｙ強１ヒスクリーン（Ｄｕｐｏｎｔ照明又はＰｉ
ｃｋｅｒ　ＭａｘＢＸ線強化スクリーン）上に、７０℃
で一晩オートソジＡグラフィーにさらす。Ｘ線フづルー
ムを４１１、′、間後又は翌日現像する。

成体／／チレー／ヨン計数で確定するには、陽ｆ１テス
ト（テストサンプル中のＨＢＶ−ＤＮＡの存在を７１、
ス）　（（、ｆ、、　　１．２　ｃｒ／ｌのフィルタ切
片上に滞留するＣＩ’Ｍ　（１分間あたりの数）によっ
て証明される。

Ａ−トフジオグラフイーでは、　　）ＩＢＶ陽性標本は
。

＋ｆｕ　ｆ＾標本が最初に置かれた位置に黒い（濃くな
つた）円形点として、現像されたＸ線フィルム上に見出
される。円形テスト斑点の放射能を定−するだめの望ま
しい手法は１円筒状の４番コルク穴あけ器具で、フィル
タ母体から切り抜くものである。

切り取った斑点は、液体シンチレーンヨン分尤にかけら
れる。

下記の例は９本発明の望ましい実施例と利点をさらに説
明するだめのものである。

例■−精製されクローン化しラベルされたＨＢＶ−ＤＮ
Ａ交配消息子の作成 Ａ）組換プラスミドｐＡｏ　Ｉ−ＨＢＶの作成プラスミ
ドｐＡＯ１は、プラスミドｐｃＲ１（Ｃｏｖｅｙｅｔ　
ａｌ、　Ｍｏ１ｅｃ　、Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ　１４５
．１５５−１５８（１９７６）参照）から作られた。プ
ラスミドｐＣＲ１は、制限酵素Ｐｓｔ　ｌ　１０　ユニ
ットで、３０℃で６時間、２０ｍＭＴｒｉｓ　ＨＣＩ　
　ｐＨ７４，１０ｍＭＭｇｃ１２　、５０　ｍＭ　（Ｎ
Ｈ４）２５０４と１００マイクログラム／ｍ１ＢＳＡを
含む反応混合物１００マイクロリツトル中で、１０マイ
クログラムのｐｃＲｌを培養することによって作られる
プラスミドＣｏｌ　Ｅｌからの派生物であ抄、このこと
は、Ａｒｍ５〜ｔｒｏｎｇ　ｅｔ　ａｌ、　５ｃｉｅｎ
ｃｅ　１９６　：　１７２〜１７４　（１９７７）が記
述（２ている３、（参考としてここに挿入されている。

培養後、フェノールでの抽出によって蛋白質を除去し、
水成相の核酸は、　　ＮａアセテートｐＨ５，５を０、
２　Ｍ最終濃縮液に添加し、続いて２５容量の前もって
冷やした１００チエタノールを添加することで沈澱させ
た。ＤＮＡ球体は、ＴＥ緩和剤中に再懸濁され、０３８
％アガローズ厚板ゲルでＥ緩和剤中で８時間電気泳動さ
せた。プラスミド群はエチジウノ、ブ［１マイト螢光に
よって目に見えるようになり。

ソノスミド帯を含むゲル部分をメスの刃で除去し／こ５
、ｐＡＯｌは、溶離緩和剤２　ｍｌの入った透析袋中で
。

室ｒｆ＋Ａ　、　　２００ホルトで５０分間電気溶離さ
せて、ゲルから回収した。液体は袋から取り除かれ、０
２ＭＮａアセテート、　　ｐＨ５，５３，０容量の前も
って冷やしだエタノールを加えて核酸を沈澱させた。プ
ラスミドは、再焼きなまし緩和剤（１０ｍＭＴｒｉｓ　
ＨＣＩｐｌ（７，４；１００ｍＭ　ＮａＣ］　　：１ｍ
Ｍ　ＥＤＴＡ）　　１００マゝイ　り　ロリノトル中に
溶解し、５５℃で１時間、４６℃で１時間、５７℃で１
時間、室温で２時間熱して再焼きなましをした。焼きな
ましをしたプラスミドは、エタノール沈澱によって回収
された。プラスミドは、１０マイクロリツトルの連結緩
和剤（６６ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ　。

ｐＨ７，６，６６ｍＭ　Ｍｇｅｔ、　１０ｍＭジチオス
レイトル、α４ｍＭＡＴＰ）中で溶解され　（ｌ　１ユ
ニ７トのＴ、　ＤＮＡ　　連結酵素を加え、培養を４℃
で１６時間行った。連結されたプラスミド（ｐＡＯｌ　
）は、その後で、フェノール抽出とエタノール沈澱によ
って回収された。

５ＤＳ−７”ロナーゼ分解と７エノール抽出−エタノー
ル沈澱によって、不完全ウィルス鎖（ｂ鎖）がガラス容
器内合成酵素反応で充填されたディン粒子から得られた
１マイクログラムのプラスミドｐＡＯ１と１５マイクロ
グラムのＨＢＶ−ＤＮＡは、別々に、標準反応条件のも
とに制限酵素ＥｃｏＲ１で、１５履／のプラスチックの
円錐形エビンドルフ管の中で培養された。各サンプルは
、　　ｐＡＯｌに対し１ユニツトもしくは、ディン粒子
ＤＮＡに対してＣＬ５ユニットのＥｃｏＲｌを含む、５
０ｕｌ容量の１００　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ　、　ｐ
Ｈ７，５，５０ｍＭＮａＣ１，５ｍＭ　Ｍｇｃｔ、の中
にあり、培養は、３７℃で６時間行われた。反応混合物
は、抽出さｆ＋たフェノールと沈澱した水成相のエタノ
ールであった１、核酸法は、５０マイクロリツトルのＴ
Ｅ緩和剤中に再懸濁された。３００ナノグラムのＥｃｏ
Ｒｌの線形になったプラスミドと、１００ナノグラノ、
のＥｃｏＲｌの線形になった全長のディン粒子ＤＮＡ（
＃１は等しいモル濃度割合）を、１００マイクロリット
ル最終容＠：の再焼きなまし緩和剤中で混ぜ合わせ、標
準条件下で再焼きなましをした。焼きなましたプラスミ
ドの再連結は行わなかった。

Ｂ）プラスミド生産のためのバクテリア細胞の形１１転
換 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　菌株ＨＢ１０１の
初期培養菌は、　１　ｗｌｌあたり１００マイクログラ
ムのストレプトマイシン（汚染バクテリアの過生長を防
ぐため）を含む２０１１ｔのＬ−汁懸濁媒体中の寒天斜
面培養基で５７℃で絶えず通気をしつつ一晩生長させた
。培塙の１　ｍｌ、’を２０履ｌの新鮮な媒体に移し、
３時間で中（：（ｕラグ相（５５０ナノメートル波長で
（Ｌ８〜α９０Ｄユニット）まで生長させた。バクテリ
アを氷の１−で冷やし、遠心分離器で集め、１０ｍＭの
ＮａＣ１で洗浄した。細胞は、２０Ｉｌ／のＣａＣｌ２
−ＭｎＣ１２溶液（４０ｍＭＴｒｉｓ　ＨＣＩ、　ｐＨ
７，４，１００ｍＭ　ｃａｃｉ２゜５０　ｍＭ　ＭｎＣ
１ｇ　）の中で４℃で再懸濁することによって十分な形
質転換を受ける。バクテリアは氷の上に置かれ、再び球
状にされ、形質転換緩和剤２．０ｍｇ中に再懸濁され、
使用、さ九るまで氷の上に保った。（２時間以内） 、バクテリア細胞懸濁液２００マイクロリツトルを。

再焼きなました組換プラスミドに加え、その混合物を４
℃で４５分間培養した。前もって温めたし一汁を最終容
量の１．０　ｍｌに加え、その混合物を５７℃で２０分
間培養した。１／値釦履ｌの約数だけ。

１　ａｔあたり１００マイクログラムのストレプトマイ
シンと１　ｍｌあたり２５マイクログラムのカナマイシ
ンを含む一連の１．０チ寒天り一汁皿に塗り付ける。培
養皿は３７℃で二日間培養され、形質転換したバクテリ
アコロニーが作られる。ニトロセルローズフィルタをコ
ロニーの上にのせ、バクテリア物質をフィルタに移した
。もとの培養皿は冷蔵庫で保存する。形質転換したコロ
ニーにトロセルローズフィルタに移したもの）の中にＨ
ＢＶ−ＤＮＡが存在することは、下記に概要を記すよう
に容器内で「劾み翻訳」作用でディン粒子から作らｔｒ
、５２ｐでラベルされＨＢＶ−ＤＮＡを用いて、　　Ｇ
ｒｕｎ−ｓｔｅｔｎとＨｏｇｎｅｓｓ、　Ｌ＠Ｌ科学ア
カデミ−議事録Ｕ、Ｓ、Ａ。

７２：１６１〜５９６５　（１９７５）のコロニー交配
手法により−Ｃ判明した。容器内合成酵素分析によって
ラベルさｔまたディン粒子ＤＮＡも使用出来るが、得ら
れる生成物の特定活動力は低い。バクテリアコロニーを
持つフィルタ紙は、Ｃ５Ｍ　ＮａＯＨに５分間９表面を
ににして載せ、その後、　　Ｉ　Ｍ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ
、ｐＨ７，４を含む二つの連続したＷｈａｔｍａｎｎフ
ィルタパッドに移した。ニトロセルローズフィルタは、
その後。

１、５　Ｍ　ＮａＣ１（１５Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ　　ｐ）
１７．４を含むＷｈａｔｍａｎｎバンドの上に５分間置
かれ、真空中で５分間乾燥させた。プロテナーゼ水溶液
（１ｍ／あたり１ｍｇの（Ｌ１５ＭＮａＣＩ、　　αｏ
ｔｓＭＮａ＜えん酸）を加エテフィルタを覆い、６０分
間フィルタを培養し、１１５ＭＮａＣ１，０，０１５Ｍ
Ｎａ　＜えん酸で洗浄し、その後、９５チエタノール、
続いてクロロポルムで洗浄した。

フィルタをα５　Ｍ　ＮａＣ１に浸して、残留細胞砕片
を全て除去し、真空中で８０℃で２時間焼く。乾燥した
フィルタは、６時間前交配されて、フィルタ一枚につき
２Ｘ１０’　ｃｐｍの変性した３２ＰＨＢＶ−ＤＮＡを
用いて９表１に記された水成条件のもとて、６５℃で２
４時間交配した。６０℃でフィルタを洗浄して、交配さ
れなかったラベルを除去した後で。

ＨＢＶ−ＤＮＡ鎖を含むコロニーをオートラジオグラフ
ィーで判別した。

ＨＢＶ−ＤＮＡ鎖を持つ組換プラスミドを含むコロニー
を、小さな（５履ｌ）培養基で生長させた。プラスミド
を、洗浄剤溶解「清浄溶解」手法によってこれらのバク
テリア）・ら分離し、　　ＥｃｏＲｌで制限酵素分解で
分析し、線形になったプラスミドとＩ（ＢＶ−ＤＮＡ帯
を判別するための螢光標識として１マイクログラム／　
ａｔのエチジウムブロマイドを用いて。

０．８％アガローズゲル電気泳動を行った。プラスミド
は、８７００の塩基対の鎖長を持ち、　　ＨＢＶ−ＤＮ
Ａの全長は、　　５２００〜５３００の塩基対を持つ。

これらの位置での帯は９周知の鎖長な持つ標準的ＤＮＡ
標識との比較によって判別される。これらの実験のため
に、　　ＥｃｏＲｌで線形にされたプラスミドｐＢＲ３
２２（４３８０塩基対）とｐＢＲ３２２（３２，５６及
び１１１０塩基対）の二つのｌ１ｉｎｄｌｌ制限断片が
、標識として用いられた。。

Ｃ）精製された３２５０塩基対のＨＢＶ−ＤＮＡの分離
３２５０塩基対の範囲にあるＨＢＶ−ＤＮＡ帯を含むプ
ラスミド−個を選び大規模混合に使う。このプラスミド
を含むバクテリアコロニーを、−晩、１ｍｌあたり１０
０マイクログラムのストレプトマイシンと。

１　ｘｚｔ！あたり２５マイクログラムのカナマイシン
を３む１００酎のＬ−汁中で生長させた。この培養菌を
、　　５００ａｅのＬ−汁と抗生物質を入れた４本の大
フラスコ（２Ｌ）に播いた。培養菌を５５０ナノメター
でα９０．Ｄ、まで生長させ、１ｙｓｌあたり１００マ
イクログラムのクロラムフェニコールを加えてバクテリ
アの生長を止め、３７℃で一晩プラスミドを増殖させた
。翌朝、培養フラスコを冷却し。

バクテリアを、遠心分離で回収し、　　１０　ｍＭＮａ
ｃｌで洗浄し、　　５０　ｍＭＴｒｉｓ　ＨＣＩ　、　
　ｐＨａｎの２５チサクローズ（Ｗ／Ｖ）　２５　ｍｌ
中に懸濁させた。８　ａｔのリゾチーム（［１２５Ｍ　
Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ　、　ｐＨａＯＯ１２ＯＮ／１１　）
ヲ加え、バクテリアを５分間氷の上に保った。［Ｌ２５
ＭＥＤＴＡ、　ｐＨａＯを１５ｍｇ加え、続いて氷の上
で５分間、追加の培養を行った。５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ
　）ＩＣＩ　、　ｐＨａＯと［ＬＯ６２５ＭＥＤＴＡの
、１０Ｔｏ　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００５０ｍ１を、バ
クテリアの溶解を起こすために溶液を静かにかき回しな
からゆっく”り加えた。その後、溶液を、４℃で１時間
、　　５ｏｒｖａｌｌ遠心分離器で３　（ＬＯ００ｒｐ
ｍで遠心分離させ、プラスミドを含む水成部分を回収し
た。固体ＣｓＣ１（（１９Ｗ　／ｍｅ溶解剤）とエチジ
ウムブロマイド（１０１９７Ｍｅ保存溶液からの１１ｖ
／　ｍｅ溶解剤）を加え、その結果出来た溶液を。

Ｂｅｃｋｍａｎ超遠心分離器にかけ、４８時間４０．０
０Ｏｒｐｍで遠心分離し、プラスミドを集めた。遠心分
離の後。

プラスミド集団の位置を、暗闇の中でＵ、Ｖ、螢光によ
って傾斜部分の真中部分のバクテリア染色体のＤＮＡ集
団の下にあることが分った。遠心分離器のチーーブの側
壁に、スポイトにつけた針で穴をあけ、集団化したプラ
スミドを引き出して、プラスミド集団を種々のこう配チ
ューブから、暗闇の中でＵ、Ｖ、灯で直接見られるよう
に抽出した。プラスミド１１１片を貯えておき、エチジ
ウムブロマイドを。

同一゛のＣｓＣ１で飽和したインプロパツルで三回抽出
した。この抽出は、エチジウムブロマイドの螢光反応に
よってプラスミドが破壊されるのを防ぐ意味で重装であ
った。貯えられていたプラスミド物質を、寒い部屋で、
　　ＴＥ［和剤を各１リツトルずつ−ミ回変えて、透析
した。透析されたプラスミドをフェノールで抽出し、エ
タノールで沈澱させ、ＴＥ緩和削１　ａｔ中で溶解し９
組換プラスミド１１１片１ＨＢＶを１．２ＩＱ回収した
。

５５　マイクｏ　ｆ　ラムノｐＡＯ１−ＨＢＶをＥｃｏ
Ｒｌテ。

標準条件のもとで分解し、線形になったＨＢＶ−ＤＮＡ
部分を、サクローズ傾斜遠心分離によってｐＡＯ１部分
から分離させた。サクローズ傾斜から回収し？ｔ５２５
０塩基対のＨＢＶ−ＤＮＡ集団を、さらに、１スロット
毎に１０マイクログラムのゲルを用いてＥ緩和剤で、５
０ボルトで８時間０．８％アガローズゲル中で心気泳動
で精製した。３２５０塩基対集団は。

エチジウムブロマイド螢光によって、ゲル中に見えるよ
うになり、メスの刃で切り取った。Ｉ（ＢＹ−ＤＮＡは
、ゲル細片から電気溶離され、エタノール沈澱で回収さ
れ１０マイクログラムの精製された均質なりＮＡを作る
。

Ｄ）精製されたＨＢＶ−ＤＮＡのラベル化精製された３
２５０塩基対のＨＢＶ−ＤＮＡは、Ｒｉｇｂｙｅｔａｌ
、、　Ｊ、　Ｍｏ１ｅｃ、Ｂｉｏｌ、　１１３　：２５
７〜２５１　（１９７７）の方法に従って高い特定活動
にラベルされた。１　ｕｇのＨＢＶ−ＤＮＡを、５０ｍ
Ｍの燐酸カリウＡ、　　ｐ）Ｉ７．４．　５ｍＭ　Ｍｇ
ＣＩ２　、１５　μＭ　ｄＡＰＴとｄＴＴＰ、そして、
他の成分を加える前にチューブの中で前もって乾燥して
おいたα５２ｐｄＧＴＰ及びα”ｐｄＧＴＰ（それぞれ
４１０Ｃｉ／ｍＭの特定活動をする。）を各々（１２５
ｍＣｉを含む緩和溶液５０マイクロリツトル容量を入れ
たＥｐｐ−ｉｎｄｏｒｆチューブの中に置いた。１　ｍ
ｌあたり１ｍｇの原料から冷水で１／１ａ０００に薄め
たバクテリアＤＮＡ５ｅを１マイクロリツトルを加えて
、２５℃で１分間の培養をし、すぐ続けて、　　Ｐｏｌ
　Ｉ　（Ｂｏｈｒｉｎｇｅｒ　／Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を
五〇マイクロリットル（又は１２ユニット）加えて、数
時間１５℃で培養を行う。

１（ＢＹ−ＤＮＡのラベル化は、培養混合物を１マイク
ロリットル取り、それを、媒介体である鮭精子ＤＮＡ５
０マイク【１グラムの入った水溶ｄｉ　１　ｍｌに加え
ることでひんばんに行われた。ＤＮＡは、１０チの最終
績Ｉ龜に１００チドリクロロ酢酸（Ｗ／Ｖ）を加えて。

冷却沈澱させ、沈澱物中の氷放射能の中に１０分、問直
いた後、ニトロセルローズフィルタの上です／プルを濾
過して判別し、液体シンチレーシコン分九にかけた。放
射性ヌクレオチドのトリクロロ酢酸の不溶性物質への混
入は、徐々に進み、４時間後にサンプルを氷へ移し、５
０ｍＭの最終濃度にＥＤＴＡを加え、５分間６５℃に加
熱することで９反応６・１１・、めた。この時点で、Ｄ
ＮＡ１マイクログラムあたり５．０×１１０８ｃｐのＨ
ＢＶ−ＤＮＡ特定活動が達成された。媒介体鮭精子ＤＮ
Ａ　（５０マイクログラム）をす゛／プルに加え、又、
１１ＭＮａＣ１と０．１チ硫酸ラウリルナトリウムを含
むＴＥ緩和剤を同量加える。サンプルを、その後、　　
５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　５０の０．５Ｘ１０ｍの円柱に
入れ、同じ溶液のゲル濾過によって残留アイソトープか
ら分離させた。（ラベルされたＤＮＡは９円柱からの最
初の流出分の中に現われる。）３２Ｐ−ＨＢＶ−ＤＮＡ
を、エタノール沈澱によって流出分から回収し、使用時
まで７０％エタノール中で一２０℃で保存した。回収し
たラベルされたＨＢＶ−ＤＮＡの最終置け、　　１．８
ｘ１．Ｏ”、ｃｐｍであった。

例　　田 静脈血の１０ミリリツト°ルのサンプルを患者からとり
、試験管に入れ室温で凝固させた。血清は。

一般的診療用遠心分離で、・机上遠心分離器で２ρ００
ＲＰＭで分離させた。血清標本５マイクロリツトルを二
ｉ・ロセルローズフィルタ薄板（１４５ミクロン孔サイ
ズ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　ｅｏｒｐａｒａｔｉｏｎ　）
に円型のじみとして２回塗りつけた。

ニトロセルローズフィルタを空気乾燥サセ、０．５Ｍ水
酸化ナトリウムを浸透させたＷｈａｔｍａｎｎ　５　Ｍ
Ｍフィルタ紙の上に表面を上にして、室温で５分問直い
た。それから、フィルタ母体を、ＩＭＴｒｉｓＨＣＩ　
、　ｐＨ７，４で５分間浸透させたＷｈａｔｍａｎｎ　
７４ルタ紙に移して中和させた。この過程を繰り返し−
Ｃ，ノイルタ薄板を０．５　Ｍ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ　、
　ｐＨ７，４゜１．５　Ｍ　ＮａＣｌのバンドに５分間
移し、真空炉で室温で乾燥させた。炉から出した後、１
１１１１あたり０．２＃Ｖのゾロナーゼ、０．３Ｍ塩化
ナトリウム、０．０３（えん酸す）　ＩＪウム、ｐＨ７
，０を含む蛋白質分解液を入れた浅い皿に、５７℃で６
０分間浸した。皿から取り出すと、血清標本を塗ったし
みは見えなくなっていた。

フィルタは、２００ｍ１の０．３Ｍ塩化ナトリウムの水
成溶液と、　　１０５Ｍ酢酸ナトリウムの水成溶液とが
入った一個の容器に続けて浸すことによって洗浄し、室
温で空気乾燥した。前記の溶液でもう一度洗浄した後に
、８０℃で２時間真空炉で再び乾燥させ、熱湯にも耐え
、熱密封出来るポリエチレ／ゾシスチンク袋に入れた。

水成前交配溶液（表１の組成）を１０ｍ／加え９袋は密
封され、６５℃で６時間、水中で培養された。

前交配溶液を袋から出し、１０ｍ１の前交配溶液と、、
＋３リビニルビロリドン、フィニル及びアルプロンの一
度をそれぞれ０．０２　％　Ｖ／Ｖ、　０．０２　％　
Ｖ／Ｖ及びａ０２％Ｗ／Ｖ減らした点以外は同一な、新
らしい水成交配溶液１０ｍｊと入れ換えた。例１と同じ
ように作られた２ｘ１０’ｃｐｍ　３２ＰＨＢＶ−ＤＮ
Ａを５０マイクロリツトルのＴＥ緩和剤に溶解し、１０
０℃で５分間煮沸し８氷の上で急速に冷やし１袋の中味
に加えた。

袋は再び密封され、６５℃Ｓ−晩培養された。放射能廃
液を捨てた後フィルタを袋から取り出し。

ａ　３　Ｍ　ＮａＣ１、（１０３Ｍ　（えん酸ナトリウ
ム及び［Ｌ１％硫酸ラウリルナトリウムの溶液で５分間
に２回洗浄した。その後フィルタをα０１５Ｍ塩化ナト
リウム。

α００１５Ｍ＜えん酸ナトリウム及び１１％硫酸ラウリ
ルナトリウムを含む溶液で、３０分間、６０℃で二回洗
浄し、乾燥した。

乾いたフィルタ母体を、　　Ｄｕｐｏｎｔ照明と補強幕
を使って一７０℃で一晩、オートラジオグラフィーにさ
らし、Ｘ線フィルムを翌日現像した。サンプル（周知の
ＨＢＶ−ＤＮＡ保菌者から得た）は、血清サンプルを最
初に置いた個所に□黒い円形のじみとなって現われ、陽
性とわかった。用いられたＨＢＶ　−ＤＮＡ消息子は、
プラスミドｐＡＯ１中でクローン化された積装ＨＢＶ−
ＤＮＡから成り、５２５０塩基対分子として＋１１分離
させて、３２ＰｄＣＴＰ及び３２ＰｄＧＴＰ　　で。

１・？イクログラムのＤＮＡあたり３ｘ１０’ＣＰＭの
特定活動に１°刻み翻訳」することによりラベルされる
。

例　　Ｉ 放射免疫分析でＨＢ８Ａｇに対して陽性であると分った
ｗ者からと陰性比較基準の血清サンプル１０ｕｌを１本
発明のフィルタ交配法を用いて、　　ＨＢＶ−ＤＮＡの
ｉ！ｆ在を知るためにテストした。例Ｉ及び例謳と同様
の手法と試薬を用いた。Ｄｕｐｏｎｔ補強幕と前もって
感光させたフィルムを使って、−７０℃で４時間さらし
た後で、オートラジオグラフを現Ｉ象したところ、全て
のＨＢ、Ａｇ保菌者には陽性結果が見ら幻たが、比較基
準には見られなかった。表Ｉｔｉ、　　血清・サンプル
を塗ったフィルタ薄板の５個の円形個所（α５ｃｍｍ直
径）と１ｃ１１の空白個所の液体ン／チレーショ７分光
によって得た結果を示す。

？／ブｋ　　　ＨＢ、Ａｇ　（ＲＩＡ）　　ＨＢＶ−Ｄ
ＮＡ（ｃｐｎ）１ ２　　　　　　　　　　　　　　＋　　　　　　　　　
　　　１３４５　　　　　　　　　　　　＋　　　　　
　　　　　　　４４７４　　　　　　　　　　　　　＋
　　　　　　　　　　　　２０８５　　　　　　　　　
　　　＋　　　　　　　　　　　　７８６　１．０ｃｍ
！四方の空白個所　　　９（ｃｐｍ　＝　１分間あたり
の計数） 例Ｗ チンパンジーからとった血清標本を、放射免疫分析によ
に五個のＢ型肝炎ウィルスの蛋白質標識と１本発明のフ
ィルタ交配テストによりＨＢＶ　−ＤＮＡの存在を調べ
るためテストした。倒置と同様な工程だが、挿入され九
〇ＢＶ−ＤＮＡを持つ５２ｐでラベルされた組換ｐＡＯ
ｌプラスミドを含む原交配消息子を用いた最初の実験で
は、チンパンジーがＨＢＩＤＮＡ保菌者であるかどうか
に関係なくチンパンジー　ＤＮＡの交配を行った。それ
故、それに続く研究では全て例Ｉで作られたような再精
製された５２５０塩基対のＨＢＶ−ＤＮＡを利用した。

表Ａは、放射免疫分析研究と、フィルタ交配テストによ
る血清中のＨＢＶ−ＤＮＡの確認との相関関係とを示す
。ＨＢ、Ａｇで陽性たった５匹のチンパンジーハ、抗−
ＨＢｃ。

ＨＢｅＡｇ及びＨＢＶ−ＤＮＡに１６性であった。前Ｋ
　ＨＢＶ＆（ｍ　ｈ＆染し治ったもの（抗ＨＢ、、抗Ｈ
Ｂｃ、及び／又は抗１１Ｂｅ陽性）とＨＢＶにさらされ
たことのないもの（標識１・てに陰性）を含む他の全て
のチンパンジーは。

血清中のＨＢＶ−ＤＮＡについて陰性であった。

表Ａ チンパンジー ｆｉＭ認番吟ＨＢ、Ａｇ抗ＨＢ、抗ＨＢ、　ＨＢ、Ａｇ
抗ＨＢ、■ＢＶ−ＤＮＡ２１　　−　　−　　＋　　　
　　　＋　　　−３０）　　　　　＋　　　　＋＋−十 ５１　　　　　　ｔ　　　　　　−十十−＋５５−４＋
−十　　　　　　− １１６１−　　　　　＋＋−十 １２５　　　　　昏　　　　　−十＋＋＋３１９　　　
　−−　　　　−　　　　　＋　　　　　　−−−５２
５＋　　　　　−＋　　　　　　＋　　　　　＋　　　
　　　　＋３５６　　　　−　　　　−　　　　＋　　
　　　　−−−３４２−−−−−− ６４４−＋　　　　　＋　　　　　　−＋　　　　　　
　−説明二　−陰性 ＋　陽性 例　　■ いくつかの人間からの標本を、フィルタ交配テストによ
ってＨＢＶ−ＤＮＡの存在を調べるためテストした。Ｈ
ＢｓＡｇと）ＩＢｅＡｇに対して陽性であっだサノブル
は、　　ＨＢＶ−ＤＮＡに陽性であった。ＨＢ、Ａｇの
みに陽性の患者からの血清Ｕ、　、ＨＢＶ−ＤＮＡには
陰性であった。ディン粒子の濃縮調合液は、　　ＨＢＶ
−ＤＮＡに対して強い陽性であった。しかし、　ＨＢ５
Ａｇ−ＨＢｅＡｇ保菌者（腎臓透析患者）の−人からの
血清は、ティン粒子濃縮液が、この患者からの血清は高
い伝染力を持つことを示しているよりも交配反応におい
ては５〜１０倍も強いものであった。抗ＨＢｃたけに陽
性で他の標識には陽性でない（慢性抗ＨＢＣ保菌者）患
者からのザンプルは、　　１（ＢＶ−ＤＮＡには陰性で
あった。人間での試験の調合剤中のＨＢ５Ａｇワクチン
の２組は、ＨＢＶ−ＤＮＡに弱い陽性であり、肝細１ｔ
ｉ！！の悪性；匝瘍からのＤＮＡ抽出物及びＨＢ　、　
Ａｇ保菌者からの肝臓組織は、ＨＢＶ−ＤＮＡに陽性で
あった。テスト結果は９表Ｂに示される。

表　　Ｂ す／プル （患各の身＜）ＨＢ５Ａｇ抗ＨＢｓ［Ｂ、ＨＢｏＡｇ抗
Ｈ賜ＨＢＶ−ＤＮＡ１１、Ｈ，）　　　　　　　４　　
　　　　　＋　　　　　　十　　　　　　−十２Ｗ、Ｏ
，（−Ｎ、Ｄ、　　＋　　　（−−＋３　　Ｍ、Ｒ，←
　　　　　　＋−＋　　　　　　　−１−−十４Ｅ、Ｇ
、　　　　　　（−−＋　　　　　　十　　　　−＋５
　　Ｊ、Ｒ，＋、　　　　−→−＋−＋６”Ｄａｎｅ”
　　　ｌ　　　　−−＋　　　−＋ンＪ、Ｇ、−＋＋−
十− ８Ｅ、Ｅ、　　　−−−−−ｍ＝ ９　　Ｐ、Ｐ、　　　　−モ　　　十　　　−＋−１０
Ｗ、Ｔ、　　　−−モ　　−−− １１Ｗ、Ｐ、　　　　　　−）　　　　　　−＋　　　
　　　−十−１２Ｓ、Ｄ、−−−−ｍ＝ １５Ｃ，Ｍ、−４＋　　　　　−十　　　　　　−＋４
　Ｍ、Ｙ、　　　−−一一一− ＋５　Ｈ，Ｇ、　　　→−−＋　　　−−−１６Ｃ，Ｒ
，−＋−Ｎ、Ｄ、−＋　　　−１７８、Ｇ、　　　−−
一一一一 １８Ａ、Ｂ、　　　　　＋　　　　−＋　　　　　−＋
　　　　　　−１９８、Ｃ，−＋　　　　−−−−− ２０Ｍ、Ｅ、　　　　　−＋　　　　＋　　　　〜　　
　士　　　　　−２１０５−００５１−−＋　　　　　
−−−２２０５−００４５６−−＋　　　　　−−−２
３０５−００６６−−、＋、　　　−−−２４０５−０
０７９−−−＋　　　　　−−−２５Ｃ−１５２−−＋
’　　　　−−−２６Ｃ−２１５−−＋　　　　　−−
−−２７Ｃ−４６２−−＋　　　　　−−−−２８Ｃ−
４９０−−十　　　　　−−−２９Ｃ−５０１−−−＋
　　　　　−−−３ＤＣ−５４２−−Ｔ　　　＋　　　
　　−−一本テストは、どのような種類の犬がかりな前
処理もせずに、患者の血液（血清）又は他の末梢体液の
サンプルヲ、ニトロセルローズフィルタに塗布する直接
分析をすることができることは認識ｔべきことである。

分子交配は、放射性ラベルを持つクローン化され再精製
されたＨＢＶ−ＤＮＡで出来たＨＢＶ−ＤＮＡ消息子で
行われた。本テストの重要な而は、少なくとも約２００
塩基対の長さ又はそれより長いもの（消息子中の精製Ｄ
ＮＡの一部に対応する。）もあるテストサンプル中のヌ
クレオチド鎖又は破）１を認知するｆｒＦ力である。本
テストは、放射免疫分析より約１００倍の感度を持ち、
ａ在的患者を大１．１に極在するのに適している。精製
された組換ＨＢＶ−ＤＮＡは、血清で間違った陽性結果
を得る可能性を全く除去し、大勢の人達の検査方式とし
ての１４．頓性合・増力１１させた。

代理人弁理土　中　村　純之助

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　　Ｂ型肝炎ウィルスのＤＮＡ鎖の少なくとも一部
   を含むテスト標本中のＢ型肝炎ウィルスの存在を検出す
   る方法で。 該Ｂ型肝炎ウィルスＤＮＡを含むと疑われるテスト標本
   を、直接基質上に置き。 精製されクローン化されたＤＮＡの存在を検出するため
   のラベル用の物質を含む該精製されクローン化されたＢ
   型肝炎ウィルスＤＮＡから成る試薬に接触させてテスト
   標本を培養し。 ラベルされた精製されクローン化されたＨＢＶ−ＤＮＡ
   が、テスト標本のラベルされないＨＢＶ−ＤＮＡと合体
   させるようあらかじめ決められた条件のもとて該培養を
   行ない。 基質から合体しなかった精製され九〇ＢＶ−ＤＮＡを除
   去し。 該ラベルの存在を検出するために基質を調べることから
   成るＢ型肝炎ウィルスの診断テスト方法。 ２、　ラベルされクローン化されたＢ型肝炎つイＡスを
   、該培養段階に先たち、変性させて、該ラベルされクロ
   ーン化されたＢ型肝炎ウィルスＤＮＡの一本鎖を形成す
   る特許請求の範囲第１項記載のノｊンＪミ。 五　該テスト標本を、該培養段階に先だち基質の上で変
   性させ、　　ＤＮＡの一本鎖を形成することから成る特
   許請求の範囲第２項記載の方法。 ４、　該テスト標本を前もって精製せずに、該基？Ｊ　
   にに直接置くことから成る特許請求の範囲第２項記載の
   方法。 ５　テスト標本は、生物的物質の水成溶液又は治：濁液
   である特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６．１ル質が固体母体を成す特許請求の範囲第１拍記載
   の方法。 ７、　　＠Ｓｉもって決められた該交配条件が、前もっ
   て決めた所要時間と前もって決められた温度から成る特
   許請求の範囲第５項記載の方法。 ａ　テスト標本は、血液、血液生成物、血清及び末梢体
   液から成る群の中から選ばれた一つから成る特許請求の
   範囲第５項記載の方法。 ９　該テスト標本が９人間から採取した血清から成る特
   許請求の範囲第８１項記載の方法。 １α　該固体母体はニトロセルローズフィルターから成
   る特許請求の範囲第６項記載の方法。 １１、　　該ラベルは放射能物質から成る特許請求の範
   囲第１０項記載の方法ｂ １２、　　該放射能ラベル物質は、５２ｐから成る特許
   請求の範囲第１１項記載の方法。 仏　該放射能ラベルは１２５Ｉから成る特許請求の範囲
   第１１項記載の方法。 １４、該ラベルは、螢光又は免疫螢光物質から成る特許
   請求の範囲第１０項記載の方法。 １５、　　該基質は、核酸残滓と共有原子価結合の代り
   に、ジアゾ化したメタアミノベンジルオキシメチルを用
   いたセルローズの薄板又は織物からなる改良されたセル
   ローズの紙から成る特許請求の範囲第９項記載の方法。 １６、　　前もって決められた該時間は、約８時間から
   ５６　ｕ：；間の間である特許請求の範囲第７項記載の
   　ノＪ′／Ｊミ。 １７、　　前もって決められた該温度は、該ＨＢＶ　−
   ｒ）ＮＡの融点より約５度Ｃから１０度Ｃ低いものであ
   る特許請求の範囲第７項記載の方法。 １ａ　　該培養段階を、交配溶液の中で行なう特許請求
   の範囲第１７項記載の方法。 １９、　　該培養を密封容器内で行なうことから成る特
   許請求の範囲第１８項記載の方法。 ２０、　　該交配溶液は、３から６倍のｓｓｃで約６．
   ５からａ６の間の範囲のｐＨを持ち、変性された担体Ｄ
   ＮＡを含む水成塩分溶液から成る特許請求の範囲第１９
   項記載の方法。 ２１、　　該交配溶液は、ホルムアミドを含む部分的Ｋ
   １１ｈ的な溶液から成る特許請求の範囲第１９項記載の
   方法。 ２２少なくとも２００のヌクレオチド塩基対から成る周
   知のＤＮＡ鎖を検出する方法で。 該周知のＤＮＡ鎖の存在をテストするサンプルを基質に
   しっかり付け。 該す／プルを、鉄鎖を含むクローン化されたＤＮＡ　、
   鉄鎖を含む組換プラスミドからの制限＃素で再精製され
   た該ＤＮＡ　、検出可能な化学的ラベルを持った該ラベ
   ルされたＤＮＡから成る交配消息子に直接接触させ。 ラベルされたＤＮＡを該ヌクレオチド鎖を含むＤＮＡの
   みと交配させる交配条件のもとで、該消１子を該サンプ
   ルと接触させて培養し。 該サンプル中でＤＮＡと交配しなかったラベルされたＤ
   ＮＡを該基質から除去し。 該ラベルの存在を見つけるため該基質を分析することか
   ら成るＢ型肝炎ウィルスの診断テスト方法。 ２５、　　該周知のＤＮＡ鎖は、約４２５０塩基対の長
   さのＢ型肝炎ウィルスＤＮＡから成る特許請求の範囲第
   ２２項記載の方法。 ２４、該交配条件は、約７．０のｐＨを持ち、約５から
   ６　ＳＳＣで、変性された担体ＤＮＡを含む溶液の中で
   該培養を行うことから成る特許請求の範囲第２３珀＋ｉ
   ｅ載の方法、。 ２５、　　放射能で高い特定活動にラベルされた精製さ
   ｔｌり「１・−・／化されたＢ型肝炎ウィルス−ＤＮＡ
   から成る診断試薬。 ２、特許請求の範囲第２１項の試薬、熱湯温度に耐える
   材料で作った密封容器及び、　　ＤＮＡ又はＲＮＡが粘
   着出来る母体材料から成るＢ型肝炎ウィルスの存在を検
   出するための診断テスト器具一式。 ２７、　　ＪｔｉＥｔ　棒材ＨＧＬ　、　　ニトロセル
   ロースフィｋｌ−紙である特許請求の範囲第２６項記載
   の診断テ′Ａ１・器共一式。 ２ａ　　該母体拐料は、ジアゾベンジルオキシメチル−
   セルロース紙である特許請求の範囲第２７項記載の診断
   テスト器具一式。 ２９　ｐＨ６，５からｐＨａＯの間（ＤｐＨを持ち、６
   から６のＳＳＣで、変性されたＤＮＡの鮭精子又は子牛
   の胸腺を、′（む交配溶液から成る特許請求の範囲第２
   ７項記載の診断テスト器具一式。 ３０、　　さらに、ホルムアミドを含む部分的に有機的
   な交配溶液から成る診断テスト器具一式。 ３１．Ｂ型肝炎ウィルスの人間保菌者を見分る方法で。 該Ｂ型肝炎ウィルスの保菌者と思われる人から血液標本
   を採取し。 標本から血清を分離し、。 該血清を約５から２００ｕｔいかなるＤＮＡ精製前処理
   をせずに、ＲＮＡとＤＮＡを結合させる材料で作ったフ
   ィルター母体に塗布し。 該基質を、前もって決めた量の５から６倍ＳＳＣと、＃
   １１１１中性のｐＨを持つ水成交配溶液とＢ型肝炎ウィ
   ルスＤＮＡをクローン化し、クローン化したＢ型肝炎ウ
   ィルスＤＮＡを組換プラスミドから精製し。 ＤＮＡを高い特定活動にラベルして作った消息子ととも
   に密封容器に入れ。 容器を密封し。 ６５℃から６８℃の間の温度で約８から５６時間密封容
   器を培養し、ラベルされたＢ型肝炎ウィルスＤＮＡが、
   該血清中のいかなるＢ型肝炎ウィルスＤＮＡとも結合す
   るようにし。 該隻質から結合しなかったＤＮＡを除去し、また。 液体７ンチレ一シヨン分光又はオートラジオグラソイ−
   を用いて、該放射能ラベルの存在を見つけるため基質を
   分析することから成るＢ型肝炎ウィルスの診断テスト方
   法。