DK160429B

DK160429B - N-heterocyclisk glycosid med antitumorvirkning, fremstilling deraf samt farmaceutisk praeparat indeholdende glycosidet

Info

Publication number: DK160429B
Application number: DK035684A
Authority: DK
Inventors: Jr Donald Edward Nettleton; James Allen Bush; William Turnbull Bradner; Terence William Doyle
Original assignee: Squibb Bristol Myers Co
Priority date: 1983-01-28
Filing date: 1984-01-26
Publication date: 1991-03-11
Also published as: FI840301A0; ES529170A0; US4487925A; DK35684D0; AU2372084A; IE56651B1; FI840301L; CA1220149A; DK160429C; KR840007257A; FI77264C; KR910002856B1; PT78019B; EP0115350B1; IE840201L; ES8607396A1; DE3473459D1; ATE36540T1; AU564256B2; GR81748B

Description

i

DK 160429 B

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte N-heterocycliske glycosider med antitumorvirkning, fremstillingen deraf samt farmaceutiske præparater indeholdende sådanne glycosider.

De hidtil ukendte N-heterocycliske glycosider er ejendommelige ved 5 det i krav l's kendetegnende del angivne.

En struktur, der ligner anti-tumormidlet ifølge opfindelsen, har anti-tumormiddel staurosporin (også kaldet AM-2282), der fås ved fermentation af Streptomyces staurosporeus. Staurosporin er beskrevet i J.C.S.

Chem. Comm., 1978, side 800-801 og i J. Antibiotics 30(40): 275-282 10 (1977).

Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 19(6): 459-460 (1980) omhandler flere indolpigmenter, der er opnået ud fra slimsvampens Arcyria denudata frugtlegeme, som er strukturelt beslægtede med staurosporin. Visse af pigmenterne udviser aktivitet over for Bacillus brevis og B.

15 subtilis.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved dyrkning af en rebeccamycin-producerende stamme af Nocardia aerocolonigenes, fortrinsvis Nocardia aerocolonigenes stamme C38.383-RK2 (ATCC 39243) eller en mutant heraf med væsentligt samme egenskaber i et vandigt nærings-20 substrat under submerse aerobe betingelser indtil en betydelig mængde af rebeccamycin er produceret af den førnævnte mikroorganisme i dyrkningsmediet, hvorefter rebeccamycin udvindes fra dyrkningsmediet, hvorpå man, om ønsket, acetylerer eller 5'-N-methylerer rebeccamycinet til dannelse af henholdsvis tetraacetatet med formlen II eller 5'-methylderivatet med 25 formlen III. S'-N-methyleringen kan ske med methyl iodid og kalium-carbonat i et inert opløsningsmiddel såsom acetone.

Rebeccamycin og dets tetraacetat og 5'-N-methylderivater udviser aktivitet over for eksperimentelle animalske tumorsysterner, fx. P-388 leukæmi i mus.

30 Der er således med den foreliggende opfindelse tilvejebragt rebeccamycin med formlen 35

DK 160429 B

H τ’ 2 j/ny^o é\_/6* /5&5e-\

|Pa $ 5 51 ^ l^a^TV

-Cl 1 c:L

J.l"

10 O Ax>H

HO. 5^ \ i 3“

15 ru” 0H

och3 20 rebeccamycin-5',2",3",6"-tetraacetat med formlen

8 H

O T/N \ T

dy_/6' 25 2/k,. wv\sb·. ,1! JLJs- „ 14 5 5 j i*s>rv

30 Cl AC Cl N

30 · J.i" ' ' - Ac= -CCH3 C> Α-OAc · 1 Γ

AcO 5J 1 - · 35 X// J 3" 6” · //Ί

Zf OAc U” OCH3

II

3

DK 160429 B

og 5'-N-methylrebeccamycin med formlen

8 H

°ΤΊ=° 5 1 6\--/6' ν^Ή-υ' 10 L ch3 ^ 9 Z--OH -sJg5.

15 H0\

V OH

OCH3 20 III .

Rebeccamycin-anti-tumormidlet ifølge den foreliggende opfindelse produceres som nævnt ved fermentation af en rebeccamycin-producerende 25 stamme af Nocardia aerocolonigenes.

En særlig foretrukket rebeccamyi n-producerende stamme er blevet isoleret fra en jordprøve indsamlet i Panama og bestemt af opfinderne som stamme C38.383-RK2. Kulturer af denne stamme er deponeret i The American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, og indføjet i den 30 permanente samling af mikroorganismer som ATCC 39243.

Resultaterne af de taxonomiske studier udført på stamme C38.383-RK2 indikerer, at stammen skal klassificeres som en atypisk art af slægten Nocardia. Baseret på de nedenfor anførte karakteristika ser det ud til, at stammen C38.383-RK2 tilhører artsgruppen Nocardia aerocolonigenes.

35 Stamme C38.383-RK2 har følgende egenskaber:

Morfologi

Stamme C38.383-RK2 danner éncellede trådformede celler, som udvik- 4

DK 160429 B

ler sig til substrat- og luftmycelium. Begge mycelier er lange, velfor-grenede og fragmenterer ikke i korte tråde (0,5 μια i bredden). Artrosporer dannes i hele luftmyceliet. Disse sporer er arrangeret med indskudte tomme hyfer eller som en kontinuert kæde. Ligesom ved spore-5 dannelsen hos Nocardiopsis dassonvillei, (Inti. J. Syst. Bacterial. 26: 487-493, 1976) er stamme C38.383's lufthyfer inddelt i lange segmenter, der efterfølgende deles op i sporer af uregelmæssig størrelse. Kæderne af indskudte eller kontinuerte sporer er lige eller bugtede. Ekstremt lange sporekæder, der-indeholder 50 til 100 sporer i en kæde, dannes 10 samtidig med kæder af kort og moderat længde. Sporerne er cylindrisk formede, 0,5~0,7x0,7~5/tmi størrelse og har en glat overflade.

Sclerotia dannes på luftmyceliet, men sporangia, bevægelige sporer og kranse observeres ikke.

15 Dyrkningskarakteristika

Stamme C38.383 er en obligat aerob antinomycet, der vokser godt i de fleste agarmedia. Luftmyceliet dannes rigeligt på Czapeks saccharose-nitratagar, ISP-medium nr. 2, 4, 5 og 7, næringssubstratagar og Bennett's agar, men ringe på giucose-asparaginagar og ISP-medium nr. 3 20 og 6. Luftmyceliets farve er hvidt, hvidgult eller bleggult. Et gulligt pigment dannes i substratmyceliet, der spreder sig lidt ned i agarmediet. Dette pigment er ikke en pH-indikator. Melanoidpigment produceres ikke. Dyrkningskarakteristika er vist i tabel 1.

25 Fysiologiske karakteristika

Den optimale væksttemperatur for stamme C38.383 ligger mellem 28°C og 37°C og moderat vækst ses ved 20°C og 41°C. Ingen vækst observeres ved 7°C og 45°C. Gelatine og stivelse bliver nedbrudt. Tyrosinasere-prøven er negativ. Væksten inhiberes ved tilstedeværelse af 8% NaCl, men 30 ikke af 0,01% lysozym. Stamme C38.383 udnytter de fleste sukkerarter til vækst. De fysiologiske karakteristika og udnyttelsen af carbonhydrider er vist i hhv. tabel 2 og 3.

Aminosyrekomponenter i cellevæggen og sukkerkomponenter i hele cellen 35 Aminosyresammensætningen i cellevæggen blev undersøgt i overens stemmelse med metoderne beskrevet af Becker et al. (Appl. Microbiol. 13: 236-243, 1965) og Yamaguchi (J. Bacteriol. 89: 441-453, 1965) og sukkerkomponenterne i hydro!ysatet af hele cellen blev identificeret i over- 5

DK 160429 B

ensstemmelse med de procedurer, som er angivet af Lechevalier og Lechevalier i Biology of the Actinomycetes and Related Organisms 11: 78-92, 1976. Stamme C38.383's cellevæg indeholder meso-diaminopimelinsyre, men mangler glycin. Hydrolysatet af hele cellen viser tilstedeværelsen 5 af glukose, gal aktose, mannose og rhamnose. Den ovennævnte cellevægsammensætning og fuldeelle-sukkerkomponenterne indikerer, at stamme C38.383 er en actinomycet-art af cellevægstype IIIC.

Taxonomi 10 Stamme C38.383 blev sammenlignet med otte slægter af ordenen Actinomycetales, deriblandt Nocardia, Micropolyspora, Microtetraspora, Nocardiopsis, Saccharopolyspora, Pseudonocardia, Actinomadura og Streptoalloteichus, der alle producerer sporekæder på luftmyceliet og indeholder mesodiaminopimeli nsyre i cellevæggen. Blandt disse otte 15 slægter er slægten Nocardiopsis nærmest beslægtet med stamme C38.383 med hensyn til sporekæderne og sporemorfologi, men er forskellig fra stamme C38.383 ved mangel af galaktose og mannose i helcelle-hydrolysatet.

Gordon et al. (J. Gen. Microbiol. 109: 69-78, 1978) karakteriserer 14 taxa af nocardiae baseret på de fysiologiske egenskaber og den 20 kemiske sammensætning af hydrolysatet af hele cellen. Stamme C38.383 lignede mest Nocardia aerocolonigenes med hensyn til aminosyre- og sukkersammensætningen i hydrolysatet af hele cellen. Derfor sammenlignedes stamme C38.383 med de diagnostiske fysiologiske egenskaber af N. aerocolonigenes. Som vist i tabel 4 viste det sig, at stamme C38.383 er 25 nært beslægtet med N. aerocolonigenes, men er signifikant forskellig fra Nocardia (Nocardiopsis) dassonvillei. Imidlertid mangler eller mister alle 14 stammer af N. aerocolonigenes evnen til at danne sporer og luftmycelium. Således må stamme C38.383 betragtes som værende en sporedannende art af klassen Nocardia aerocolonigenes.

30 Stamme C38.383 viste sig også at miste evnen til at danne luft mycelium og sporer. Efter fem på hinanden følgende overføringer havde 70% af enkel ti sol aterne mistet disse evner. Sådanne egenskaber ved stamme C38.383 ser ud til at stemme overens med de rapporterede variationer hos Nocardia aerocolonigenes ved dannelsen af sporer og luft-35 mycelium.

6

DK 160429 B

Tabel 1

Dyrkningskarakteri stika af stamme nr. C38.383*

Trypton-gærkødekstrakt G**: moderat; fnugget, lysegule 5 (ISP nr. 1) pellets D : intet

Saccharose-nitratagar G : rigelig (Czapeks agar) R : stærk gul (84)*** til Γ livlig gul (82) 10 A : moderat, gulligt hvidt (92) til bleggult (89) D : mørkt grågult (93) til lyst olivenbrunt (94) GIukose-asparaginagar G : ringe 15 R : hvid (263) A : knebent, gulligt hvidt (92) til bleggult (89) D : intet

Glycerol-asparaginagar G : rigelig 20 (ISP nr. 5) R : strålende gul (83) til stærk gul (94) A : rigeligt, bleggult (89) til lysegult (86) D : grågult (93) til gråligt gult 25 (90)

Uorganisk salte-stivelsesagar G : rigelig (ISP nr. 4) R : bleggul (89) til stærk gul (84) A : rigeligt, hvidt (263) til gul- 30 ligt hvidt (92) D : intet 7

DK 160429 B

Tabel 1 - fortsat

Tyrosinagar G : rigelig (ISP nr. 7) R : strålende gul (83) til stærk 5 gul (84) A : moderat, bleggult (89) til ly segult (86) D : bleggult (89) Næringssubstratagar G : rigelig 10 R : gullig hvid (92) til bleggul (89) A : rigeligt, hvidt (263) D : intet Gærekstrakt-maltekstraktagar G : rigelig 15 (ISP nr. 2) R : strålende orangegul (67) til stærk orangegul (68) A : rigeligt, gulligt hvidt (92) til bleggult (89) D : mørkt orangegult (72) til mo- 20 derat gulligt brunt (77)

Havremelsagar G : moderat (ISP nr. 3) R : lysegul (86) til strålende gul (83) A : knebent, gulligt hvidt (92) 25 til bleggult (89) D : intet

Bennets agar G : rigelig R : strålende gul (83) til stærk gul (84) 30 A : rigeligt, gulligt hvidt (92) til bleggult D : livligt gult (82)

Pepton-gærekstrakt-jernagar G : moderat (ISP nr. 6) R : bleggul (89) til lysegul (86) 35 A : ringe, hvidt (263) til gulligt hvidt (92) D : intet 8

DK 160429 B

* observeret efter inkubation i 3 uger ved 28°C

** Forkortelser: G = vækst; R = bagsidefarve; A = luftmycelium; D = diffunderbart pigment *** Farve og nummer i parenteser følger farvestandarden i Kelly, 5 K.L. & D.B. Judd: ISCC-NBS farvebetegnelses-kort illustreret med Centroid-farver. US Dept, of Comm. Cir. 553, Washington, D.C., nr., 1975".

9

DK 160429 B

+->

I X

Φ ·£ ,E ra £ s- 5 14-) t»(/) rtT*f v ^ m E £ % w « g ® £ m £ ~ £ CD (u^ Λ -* ra £ <λ° J2 <\i 3 « op j ? ϋ 2 «s is “i · s; ε 01 8 f °o£ - - * « * og g " ΰ ^ 1¾¾ g

Τι O <Λ ω ± % 3 S - ® 05 — W

ω 5 -g « & λ g S??S <*> > £ cm "5 c_ s 2 a I αί* -5 jhof ^ ^ O m ^ 2 ro cdcdl.« - ^ c « 3 tf ·, " w cd i- s* ! i s s li o"! !f|;a f« l°i? iMil^i it|"i ro > £ * ® ~ £ > £ 2 n fjj ^« £ oSo £ 2 8 r£<ca * i; co Q Η.^<υαοοΟ cq cm b a u *-* 5: 10 . ^ έ u c; Φ O oU <d —

JsC r^ 0 D) ί- a.

S " 5 o° 1 ? < 5 ^ g> ί » E _ ^

4)U,,rn w cnt.UpS

-* O ^ g' XI - 0) 03 > u w °q o — ^ - Z n >- *— CVl O t \ ^ il) Q f-

σ cm U <t- χ _.0 w E

^ I "8 X3 °r- - σ> o α ϋ 03 “ Q_ ? f > S S : » S S ϊ i a h- m^+-> ti ® +-> α +-> r- 4-1 o q_| CO $ m tf <D — tf W W Π CO > tø S Ό ^ Ό ^ Ό 0 CO >0) - ® O) Q) 0)0)0)0} <D > CO .2 £ ro to η * C -- ·-> > μ Γ μ - o p ,y (j+j.bs_cS O o+° ·*-> χ X (nCu)Ci_(n-r ^ w ro m — i-Qj^ro ro tf tf . ra Ό rn ω u .* a CD cow W « D) ϋ) ® ή IK m t. 0) ro o f? E > $ <d <d <D O o tf C 1“ c ° .™ c o: 2 Σ - io x - a c ca a > - > - b > 0

i I

ε u (0 +-> CO 4-> 4-4

5 C E

fB — E -* > « to § 5- β Ω.

3 % 2 > E 0 r

-nrnw££° Ο) CO

12 S? >. 3 ' JS 4J Oo "2 .E <D Sc o) 5 E c £ w E <o O ® υ £

o £ -D - *_ £ £ 3 % V

3 p^'t-CDO)-, ro£o.x rn w-Siconj^o ω-Εί° *— r“ »Λ O — .— t- 0 -H> ^ <f

0) .— — 'Σ1 0> ΙΛ 4-> +J I N

a t» o)^; c ο® ® π 0 l·-!- ocooiQl-z 10 2 —i *

DK 160429 B

10

Tabel 3

Stamme nr. C38.383' carbonhydratudnyttelse

Glycerol + 5 D(-)-arabinose + L(+)-arabi nose + D-xylose + D-ribose + L-rhamnose ~ + 10 D-glukose + D-galaktose + D-fruktose + D-mannose + L(-)-sorbose 15 Saccharose +

Laktose +

Mel i bi ose +

Trehalose +

Raffi nose + 20 D(+)-melezitose

Opløselig stivelse +

Cellulose +

Dulcitol

Inositol + 25 D-mannitol + D-sorbitol

Salicin + obsereveret efter inkubation i 3 uger ved 37°C 30 Basis-medium: +: positiv udnyttelse -: negativ udnyttelse DK 160429 8 η

Tabel 4

Sammenligning af diagnostisk fysiologiske egenskaber mellem stamme C38.383, Nocardia aerocolonigenes og Nocardiopsis dassonvillei

Stamme Nocardia* Nocardiopsis* 5 C38.383 aerocolonigenes dassonvillei (14)** (33)**

Dekomponering af:

Adenin - + 10 Kasein + + +

Hypoxanthin + + +

Tyrosin + + +

Urinstof - +

Xanthin - - + 15 Resistent over for:

Lysozym + +

Rifampin Hydrolyse af:

Aesculin + + 20 Hippurat V +

Stivelse + + +

Syre af:

Inositol + +

Laktose + + 25 Mel ibiose + +

Raffinose + V

Udnyttelse af:

Benzoat -

Citrat + + + 30 Mucat -

Succinat + + +

Tartrat -

Nitrat af nitra + V +

Overlevelse ved 50°C, 35 8 timer - V + 5

DK 160429 B

12 +: positiv, negativ, V: 15 til 84% af stammerne positive * Data af Gordon et al. (J. Gen. Microbiol. 109: 69-78, 1978) ** Antal undersøgte stammer I stedet for den ovenfor beskrevne særlig foretrukne stamme C38.383 kan man anvende sådanne mutanter heraf med væsentligt samme egenskaber, som kan fremstilles ved konventionelle metoder såsom røntgenbestråling, UV-bestråling, behandling med nitrøse gasser, fag-eksponering o.l.

10

Fremstilling af rebeccamycin

Rebeccamycin kan fremstilles ved dyrkning af en rebeccamycin-producerende stamme af Nocardia aerocolonigenes, fortrinsvis en stamme med karakteristika som Nocardia aerocolonigenes stamme C38.383-RK2 (ATCC 15 39243) eller en mutant heraf under submerse aerobe betingelser i et vandigt næringsmedium. Organismen dyrkes i et næringsmedium, der indeholder en assimilerbar carbonkilde, fx. saccharose, laktose, glukose, rhamnose, fruktose, mannose, melibiose, glycerol eller opløselig stivelse. Næringsmediet bør også indeholde en assimilerbar nitrogenkilde 20 såsom fiskemel, pepton, soyabønnemel, jordnøddemel, bomuldsfrømel eller majsstøbevæske. Uorganiske næringssalte kan også sættes til mediet.

Sådanne salte kan omfatte alle almindelige salte, der kan afgive natrium, kalium, ammonium, calcium, fosfat, sulfat, chlorid, bromid, nitrat, carbonat eller lignende ioner.

25 Produktion af rebeccamycin kan ske ved enhver temperatur, der bidrager til en tilfredsstillende vækst af organismen, fx. 20°-41°C, men udføres normalt ved en temperatur på ca. 27°C.

Fermentationen kan udføres i kolber eller laboratorie- eller industri fermenteringsapparater af forskellig kapacitet. Når en fermente-30 ringstank anvendes, er det ønskeligt at producere et vegetativt podestof i en næringssuppe ved at indpode en lille smule af dyrkningsmediet med skrå- eller jordkultur eller en frysetørret kultur af organismen. Efter at et aktivt podestof er fremstillet på denne måde, føres det aseptisk over i fermenteringstankens medium til fremstilling af rebeccamycin i 35 stor målestok. Mediet, i hvilket det vegetative podestof fremstilles, kan være det samme som eller forskelligt fra det, der udnyttes i tanken, sålænge det er sådant, at en god vækst af den producerende organisme kan opnås.

13

DK 160429 B

I almindelighed opnås den optimale produktion af rebeccamycin efter ca. 7 dages inkubation.

Rebeccamycin er hovedproduktet ved fermenteringen og findes kun i myceliet. Udvinding fra myceliet kan ske ved en ekstraktion med et orga-5 nisk opløsningsmiddel såsom tetrahydrofuran eller acetone. Efter reduktion af ekstraktets volumen i vakuum til et vandigt koncentrat bundfælder rebeccamycin som et fint fast stof. En vaskning med diethylether, methyl-tert.-butylether eller andre relativt non-polære opløsningsmidler udføres dernæst for at fjerne olier, der gør efterfølgende filtrering 10 vanskelig. Det rå rebeccamycinkoncentrat flyder i fasegrænsen og kan let isoleres ved filtrering. Ren krystallinsk rebeccamycin kan fås ved omkrystallisation af råproduktet fra en passende organisk opløsningsmiddelblanding såsom tetrahydrofuran-methanol.

15 Rebeccamycins fysiske-kemiske egenskaber

Renset rebeccamycin har følgende fysisk-kemi ske egenskaber:

Rebeccamycin er et gult krystallinsk stof, der fluorescerer intenst ved 254 og 366 nm lys, gult som fast stof og grønt til blåt i opløsninger. Det er opløseligt i tetrahydrofuran og dimethyl sulfoxid og let 20 opløseligt i acetone og blandinger af lavere alkoholer med methylen-chlorid eller chloroform.

Smeltepunktet for rebeccamycin er 326-330°C (dek.).

Infrarødt spektrum: Rebeccamycins infrarøde absorptionsspektrum (KBr) har hovedbånd ved følgende bølgelængder: 3418, 3355, 1752, 1704, 25 1575, 1465, 1431, 1411, 1379, 1327, 1273, 1213, 1191, 1174, 1144, 1110, 1075, 1048, 970, 799, 788, 757 cm"1.

Ultraviolet spektrum: Ved en koncentration på 0,01138 g/1 i methanol udviser rebeccamycin følgende maxima og absorptiviteter: 238 nm (75,75), skulder ved 256 nm (29,79), 293 nm (55,27), 314 nm 30 (90,51), 362 nm (8,35), 289-391 nm (7,91).

NMR: a. 100 MHz pmr-spektrum: Når rebeccamycin blev opløst i dimethyl sul foxid viste spektret følgende kemiske skiftværdier i ppm og koblingsmønstre: 11,37 (s, IH, N5'-H), 10,30 (s, IH, N8-H), 9,27 (d, IH, 35 Cl-H), 9,09 (d, IH, Cl'-H), 7,74 og 7,69 (ds, 2H, C3-H og C3'-H), 7,45 (t, 2H, C2-H og C2'-H), 6,97 (d, IH, Cl"-H), 5,45 (d, IH, C3"-0H), 5,36 (t, IH, C6"-0H), 5,03 (d, IH, C2"-0H), 3,90 (bt, 2H, C6"-CH2), 3,66 (kvintet, IH, C5"-H), 3,56 (dt, IH, C2"-H), 3,53 (t, IH, C4"-H), 3,48

DK 160429B

14 (s, 3H, OCH,), 3,45 (utydelig, IH, C3"-H).

^ 13 b. 25 Mhz cmr-spektrum: Når rebeccamycin var opløst i DMSO dg, viste spektret følgende observerede kemiske skiftværdier: 5 PPM Beskrivelse 170.3 C7 170,1 C7' 137.4 C4a 137.0 C4a' 10 129,7 C3' 129.5 C5a og C5a' 126.9 C3 124.9 C5 123 C5' 15 123 Cl 123.1 Cl' 122.4 C2 og C6 121.9 C2' 120.4 C6' 20 119,2 C4' 117.5 C4 116,0 C5b og C5b' 84,2 Cl" (80.1) C3" 25 (79,0) C4" (77.2) C5" 72.0 C2' 60.0 0CH3 59,7 C6" 30 21 21

Optisk drejning (tetrahydrofuran), α = +131; α - +137,4; D 578 α21 = +166,1.

546 35 Analyse af rebeccamycin i blandinger udførtes ved højeffektiv væskekromatografi (HPLC) på et RCM-100 (Waters Associates, Milford, Mass.) system ved Radial Pack Silica kolonne, 8 mm ID x 10 cm, 10/t pakning, med 2% methanol i chloroform som opløsningsmiddel. Observerede 15

DK 160429 B

retentioner var k' = 2,46 - 2,60.

Fremstilling af rebeccamycinderivater

Rebeccamycin kan omdannes til dets 5',2",3",6"-tetraacetat (formel 5 II ovenfor) ved acetylering i et inert opløsningsmiddel. Fx. kan man lade rebeccamycin reagere med eddikesyreanhydrid med pyridin som opløsningsmiddel. Tetraacetatderivatet viste sig også at have effekt over for eksperimentelle animalske tumorsystemer.

Methylering af rebeccamycin såsom ved behandling med methyliodid og 10 kaliumcarbonat i et inert opløsningsmiddel såsom acetone giver 5'-N-methylrebeccamycinderivatet, der også viser effekt over for eksperimentelle animalske tumorsystemer.

Biologisk aktivitet af rebeccamycin og dets derivater 15 Rebeccamycin blev testet med hensyn til antitumor-aktivitet over for transplanteret museleukæmi P-388 i overensstemmelse med procedurerne fra Geran, et al., Cancer Chemother. Rpts. 3: 1-103, 1972. Forlænget overlevelse af mus med leukæmi blev observeret ved adskillige doser mellem 8 og 256 mg/kg. Testresultaterne vises nedenfor. Midlet, der 20 sammenlignes med, NSC 38270, er olivomycin A.

DK 160429B

16

Tabel 5

Rebeccamycins effekt over for P-388 leukæmi Materiale Dosis, IP MST MST Gennemsnitlig Antal over- mg/kg/inj dage % T/C vægtforandring levende mus 5 gm dag 5 på dag 5/ oprindeligt antal mus 10 NSC 38270 0,8 11,5 144 -1,1 6/6 (Olivomycin A) 0,4 11,0 138 -0,6 6/6

Rebeccamycin 15 256 13,0 163 -0,8 6/6 128 12,0 150 -0,7 6/6 64 10,5 131 -0,2 6/6 32 10,0 125 -1,1 6/6 16 10,0 125 +1,0 6/6 20 8 10,0 125 +2,2 6/6

Kontrol saltvand 8,0 - +1,6 10/10 g 25 Tumorpodestof: 10 ascitite celler, ip Værtsdyr: CDFj hunmus

Behandling: kun på dag 1 (undtaget NSC 38270 på dag 1, 4 og 7)

Toxicitet: En given lægemiddeldosi s anses for toksisk, hvis mindre end 4 mus er i live på dag 5 ud af oprinde-30 ligt 6 mus.

Vurdering: MST = middel overlevelsestid

Effekt: % T/C = (MST behandlet/MST kontrol) x 100

Kriterium: % T/C £ 125 anses for at være signifikant anti tumoreffekt 35 17

DK 160429 B

Når der testedes for antimikrobiel virkning over for en række gram-positive og gram-negative bakterier, udviste rebeccamycin ingen signifikant antimikrobiel aktivitet.

5 Terapeutisk brug

Som nævnt ovenfor udviser rebeccamycin og dets 5',2", 3",6"-tetra-acetat og 5'-N-methylderivater anti-tumor-aktivitet over for maligene tumorer i pattedyr, fx. P-388 leukæmi i mus.

De kan derfor bruges til terapeutisk behandling af et pattedyr 10 angrebet af en mal igen tumor, fx. P-388 leukæmi, der er følsom over for rebeccamycin eller dets tetraacetat eller 5'-N-methylderivater, ved hvilken man administrerer en effektiv tumor-hæmmende dosis rebeccamycin eller tetraacetat eller 5'-N-methylderivatet til ovennævnte pattedyr.

Opfindelsen angår derfor også et farmaceutisk præparat, der er 15 ejendommeligt ved, at det omfatter en effektiv tumor-hæmmende mængde rebeccamycin eller dets tetraacetat eller 5'-N-methylderivatet i kombination med en inert farmaceutisk acceptabel bærer eller fortynder. Disse præparater kan tilberedes i enhver hensigtsmæssig farmaceutisk form, der passer til den ønskede administreringsvej.

20 Eksempler på passende præparater inkluderer faste præparater til oral administration såsom tabletter, kapsler, piller, pulvere og granulater, flydende præparater til oral administrering såsom opløsninger, suspensioner, siruper og elikserer, og præparater til parenteral administrering såsom sterile opløsninger, suspensioner eller emulsioner. De 25 kan også fremstilles som sterile faste præparater, der kan opløses umiddelbart før brug i sterilt vand, fysiologisk saltvand eller andre injicerbare sterile medier.

Det er åbenbart, at den aktuelle foretrukne dosering af rebeccamycin (eller et derivat heraf) vil variere i overensstemmelse med den 30 specielle forbindelse, der bruges, det særlige præparats formulering, anvendelsesmåden og det specifikke sted, vært og sygdommen, der behand les. Mange faktorer, der modificerer et lægemidlets virkning, må tages i betragtning af fagmanden, fx. alder, legemsvægt, køn, diæt, administrationstid, stofskifte, værtens tilstand, lægemiddelkombinationer, over-35 følsomhedsreaktioner og hvor alvorlig sygdommen er. Administrering kan ske kontinuert eller periodevist inden for den maksimalt tolerante dosis. Optimale anvendelselmængder ved et givet sæt betingelser kan bestemmes af fagmanden ved benyttelse af konventionelle dosisbestemmel- DK 160429 B j 18 sestests.

Opfindelsen belyses nærmere i de følgende eksempler.

i

Eksempel 1 j 5 Fremstilling af rebeccamycin j i A. Fermentering j

En kultur af Nocardia aerocolonigenes stamme C38.383-RK2 (ATCC j 39243) blev overført til reagensglas med skråagar bestående af gær-10 maltekstrakt. Dette medium består af 4,0 g glukose, 4,0 g gærekstrakt, i 10 g maltekstrakt og 20 g agar fyldt op til 1 liter med destilleret vand. For hver overføring blev skråagaren inkuberet i 7 dage ved 27°C.

For at fremstille podestof til produktionsfasen overførtes overflade-væksten fra skråkulturen til en 500 ml Erlenmeyer-kolbe, der indeholdt 15 100 ml medium af følgende sammensætning: 30 g glukose, 10 g soyamel, 10 g bomuldsfrøspiremel og 3 g CaCOg fyldt op til 1 liter med destilieret vand. Den vegetative kultur inkuberes ved 27°C i 48 timer i en Gyrotory rækkeryster (model G53, New Brunswick Scientific Co., Inc.) sat på 210 omdr./min. i en cirkel med en diameter på 5,1 cm. 4 ml vegetativ kultur 20 overførtes til en 500 ml Erlenmeyer-kolbe indeholdende 100 ml sterilt produktionsmedium bestående af 60 g majsstivelse, 10 g glukose, 15 g hørfrømel, 5,0 g autolyseret gær, 1,0 g FeS04.7H20, 1,0 g NH^PO^, 1,0 g (NH^JgSO^ og 10 CaC03 fyldt op til 1 liter med destilleret vand. Produktionskulturen inkuberedes ved 27°C i samme ryster som brugt til den 25 vegetative kultur. Omdrejningshastigheden blev sat til 250 omdr./min.

Efter 168 timer var rebeccamycinudbyttet ifølge HPLC-analyse 183 /tg/ml.

B. Isolering

Den frisk høstede fermentation (8 liter) udført i overensstemmelse 30 med eksempel 1A filtreredes med diatoméjord-filterhjælp (filterhjælpen blandedes med suppen og brugtes også til at danne filterkage). Filtratet kasseredes og filterkagen ekstraheredes med tetrahydrofuran (10 1), der indeholdt ca. 0,025% butylerede hydroxytoluener som konserveringsmiddel.

Filtratet fra dette trin koncentreredes i vakuum indtil alt organisk 35 opløsningsmiddel var fjernet og efterlod en mælket vandig remanens indeholdende små faste partikler og olier. De sidste fjernedes ved ekstraktion med diethyleter eller (ved større produktioner) med methyl-tert.-butylether, idet det tilbageværende bundfald danner en masse fine gul- 19

DK 160429 B

lige partikler i fasegrænsen. Efter fjernelsen af klar væske fra begge faser filtreredes fasegrænsen og gav 1,74 g rå rebeccamycin.

Den faste rå rebeccamycin opløstes i tetrahydrofuran (50 ml) og der inddampedes til ca. 20 ml. Der tilsattes varm methanol og kogningen 5 fortsattes under tilsætning af mere alkohol indtil krystallisation begyndte. Blandingen afkøledes til 8°C og de faste stoffer opsamledes ved filtrering, hvilket gav 1,13 g produkt i form af fine gule nåle.

En portion på 750 mg af dette materiale omkrystalliseredes fra methanol-tetrahydrofuran ved at genopløse i tetrahydrofuran, filtrering 10 gennem et Millex-SR (Millipore Corp., Bedford, Mass.) 0,5 /im filter og behandledes som ovenfor, hvilket gav 363 mg rebeccamycin efter tørring i vakuum over kogende ethanol i 6 timer.

Eksempel 2 15 Fremstilling af rebeccamycin-5/,2",3",6"-tetraacetat

Eddikesyreanhydrid (1 ml) sattes til 10,1 mg rebeccamycin i 2 ml pyridin og blandingen henstod ved stuetemperatur (~21°C) i 17 timer.

Blandingen fortyndedes med overskud af vand og ekstraheredes med ethyl -acetat. Opløsningsmiddel fasen vaskedes med vand, tørredes og koncen-20 treredes. Krystallisation fra hexan-ethylacetat gav tetraacetatet som fine, elfenbenshvide nåle, 9,5 mg, snip. 243-244°C.

Ultraviolet spektrum: Ved en koncentration på 0,01214 g/1 methanol udviser tetraacetatderivatet følgende maxima og absorptiviteter: 234 nm (58,5), 294 nm (50,2), 315 nm (70,8), 360 nm (8,1), 394 nm (6,3).

25 Infrarødt spektrum: Det infrarøde absorptionsspektrum af tetraacetatderivatet (KBr) udviser hovedbånd ved følgende bølgelængder: 3362, 2940, 1782, 1740, 1703, 1541, 1492, 1460, 1427, 1410, 1364, 1327, 1277, 1225, 1202, 1142, 1094, 1047, 790, 758, 590 cm"1.

Proton-NMR-spektrum: Kemiske skiftværdier observeret ved 10,34 (s, 30 IH, N8-H), 9,18 (d, IH, Cl-H), 9,05 (d, IH, Cl'-H), 7,84 og 7,80 (ds, 2H, C3-H og C3'-H), 7,58 (t, IH, C2-H), 7,52 (t, IH, C2-H), 7,36 (d, IH,

Cl"-H), 5,60 (t, IH, C2"-H), 5,14 (t, IH, C2"-H), 4,84-4,79 (m, H, C6"-H2), 4,75-4,64 (m, 2H, C5"-H og C6M-Hb), 3,98 (t, IH, C4"-N), 3,49 (s, 3H, 0CH3), 2,65 (s, 3H, COCH3), 2,10 (s, 3H, COCH3), 1,88 (s, 3H, COCH3 35 og 1,04 (s, 3H, 2"-C0CH3) ppm.

Analyse:

Beregnet for ^35^29^^ 2®11: 20

DK 160429 B

C, 56,92; H, 3,96; N, 5,69; Cl, 9,60

Fundet: C, 56,65; H, 4,11; N, 5,56; Cl, 9,47

Eksempel 3 5 Fremstilling af S'-N-methylrebeccamycin

Rebeccamycin (50 mg) og 4 g vandfrit kaliumcarbonat suspenderedes i 25 ml acetone, idet supernatanten blev farvet dybt orange. Efter tilsætningen af 4,0 ml methyliodid bragtes blandingen til kogning og varmedes under tilbagesvaling i ca. 90 minutter. Efter afkøling til stuetempe-10 ratur filtreredes reaktionsblandingen, hvilket gav en heterogen blanding af ureageret carbonat og et dejagtigt gult materiale. Dette opsamledes i vand og der indstilledes til pH 5,5 ved forsigtig tilsætning af iseddike, hvilket gav et gult bundfald, der er meget tungt opløselig i ethyl acetat. Bundfaldet opsamledes ved filtrering på inert filterhjælp 15 og den tørrede filterkage udvaskedes fuldkommen i tetrahydrofuran. Krystallisation fra tetrahydrofuran-methanol gav 5'-N-methylrebeccamycin, 31,5 mg.

Inddampning af filtratet fra reaktionsblandingen gav en gul remanens, der ved opløsning i tetrahydrofuran, filtrering for at fjerne 20 rester af carbonat og krystallisation som beskrevet ovenfor gav yderligere 5'-N-methylrebeccamycin, snip. 386-387°C (dekomp.).

Ultraviolet spektrum: Ved en koncentration på 0,01251 g/1 methanol udviser 5'-N-methylrebeccamycinderivatet følgende maxima og absorptivi-teter: 239 nm (72,1), 292 nm (68,7), 316 nm (73,2), 362 nm (skulder 25 9,2), 394 nm (7,4).

Infrarødt spektrum: Det infrarøde absorptionsspektrum af 5'-N-methyl-rebeccamycinderivatet (KBr) udviser hovedbånd ved følgende bølgelængder: 3345 (bredt), 1760, 1708, 1576, 1565, 1464, 1410, 1384, 1325, 1272, 1226, 1198, 1140, 1113, 1071, 1050, 790, 769, 768, 750, 727 30 cm"*.

Proton-NMR-spektrum: Kemiske skiftværdier observeredes ved 10,67 (s, IH, N8-H), 9,30 (d, IH, Cl-H), 9,13 (d, IH, Cl'-H), 7,75 (d, IH og 7,71 (d, IH), (C3 og C3'Hs), 7,46 (overlappende dublet fremtræder som en triplet, 2H, C2 og C2'Hs), 6,96 (d, IH, Cl"-H), 5,43 (d, IH, C3"-QH), 35 5,32 (t, IH, C6"-0H), 5,04 (d, IH, C2"-0H), 5,04 (s, 3H, N-CH3), 3,98 (bt, 2H, C6"-CH2), 3,85 (m, IH, C5"-H), 3,69 (m, IH, C2'-H), 3,66 (t, IH, C4'-H), 3,59 (s, 3H, 0CH3), 3,58 (m, observeret, IH, C3"-H).

21

DK 160429 B

Analyse:

Beregnet for ^g^C^NjOy. 1/2^0: C, 57,33; H, 4,32; N, 6,92; Cl, 11,67 Fundet: C, 57,50; H, 4,32; N, 6,85; Cl, 11,65 5

Claims

1. N-heterocyclisk glycosid med antitumorvirkning, KENDETEGNET ved, AT det er rebeccamycin med formlen

5. T/IsT rV^lWS2' U T 5 5' n ije>rV cl ' " H cl J.1" 15 4u0* i r HOv 51 l / J 3” 6” /\ K* oH* 20 ** OCH3 25 eller dets 5',2",3",6"-tetraacetat med formlen 30 35 DK 160429 B 3\ ^ 3\X^3 ’ V»i& ς (γιΤν^ , rrLi 10 uT I· 5 ] Uo p Cl C Cl. /7'1"' 0\ Z-0AC \ 12" 15 \ \ AcCL 5j l \X/ JiB” 6" //1 nT" 0AC

20 OCH3 IX o il 25 hvori Ac betegner -CCH3, eller 5'-N-methylrebeccamycin med formlen 30 35 DK 160429 B o τ/ν^Γ χ· 5 5 =>^ // /\ A^Y NS2' ’Vj^ v1^ j^3'

10 C1 . “3 L Æ . p" H°v - 5j· 15 \x7 3" 6" //i V OH och3

20 III .

2. Fremgangsmåde til fremstilling af det N-heterocycliske glycosid ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at man dyrker en rebeccamycin-producerende stamme af Nocardia aerocolonigenes i et vandigt næringsmedium, der 25 indeholder assimilerbare carbon- og nitrogenkilder under submerse aerobe betingelser indtil en væsentlig mængde rebeccamycin er blevet produceret af organismen i dyrkningsmediet, hvorpå rebeccamycin udvindes fra dyrkningsmediet, hvorefter man, om ønsket, acetylerer eller 5'-N-methylerer rebeccamycinet til dannelse af henholdsvis tetraacetatet med formlen II 30 eller 5'-N-methylderivatet med formlen III.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, KENDETEGNET ved, at den rebeccamyci n-producerende stamme er Nocardia aerocolonigenes ATCC 39243 eller en mutant heraf med væsentligt samme egenskaber.

4. Farmaceutisk præparat, KENDETEGNET ved, at det omfatter en 35 effektiv tumor-hæmmende mængde af en forbindelse udvalgt fra gruppen bestående af rebeccamycin, rebeccamycin-5/-2“,3'',6"-tetraacetat og 5'-N-methylrebeccamycin i kombination med en inert farmaceutisk acceptabel bærer eller fortynder.