DK157367B - Fremgangsmaade til fremstilling af intravenoest administrerbart humant immunoglobulin - Google Patents

Description

DK 157367 B

Den foreliggende opfindelse angâr en fremgangsmâde til fremstilling af et hidtil ukendt intraven0st administrerbart nativt, kemisk uforandret og ikke enzymatisk nedbrudt, stabilt immunoglobulin, der ikke udvi-ser nogen antikomplementær aktivîtet.

5 Humane immunoglobuliner spiller en betydelig rolle ved profylakse og behandling af infektionssygdomme og antistofmangellidelser. Gammaglo-buliner anvendes fx til profylakse af infektioner af viral oprindelse sâsom hepatitis, mæslinger, r0de hunde, fâresyge eller rabies, eller af bakteriel oprindelse sâsom stivkrampe, difteritis eller kighoste. Ved 10 antibiotikaresistente infektioner, der fx er forârsaget af staphylococ-cer, Escherichia coli, Pseudomonas, etc., anvendes gammaglobuliner terapeutisk. Specifikke immunoglobuliner (IgG) anvendes ogsâ til profylakse af rhesusinkompatibilitet.

Derudover er behandling ved hjælp af gammaglobuliner til beskyttelse 15 af immundeficiente patienter mod infektion, der lider af agamma- eller hypogammaglobulinæmi, saerdeles vigtig.

Den saedvanlige intramuskulære administration har dog nogle vaesent-lige mangler: 1. Der kan kun injiceres en begrænset mængde pâ hpjst 10 ml.

20 2. Resorptionen gennem ôrganismen er stærkt forsinket. R. Martin du Pan et al., Bfut 5, 1959, s. 104, observerede fx, at der efter 5 dage stadig fandtes 35-40% af immunoglobulinet ved injektions-stedet.

3. En stor del af immunoglobulinet nedbrydes ved injektionsstedet pâ 25 grund af protéolyse. Jfr. S. Barandun et al., Vox Sanguirtis, 28, 1975, s. 157-175.

I modsætning hertil forer den intravenpse injektion eller infusion hurtigt til et hojt immunoglobulinblodspejl, som det fx er nodvendigt til behandling af septisk/toxiske infektioner.

2

DK 157367 B

Til întraven0s anvendelse mâ der dog ikke anvendes et immunoglo-bulin, der er fremstiilet ved kendte fraktioneringsfremgangsmlder ud fra biodplasma, sérum eller placenta og kun egner sig til intramusku-lær anvendelse. Jfr. Cohn et al., J. Amer. Chem. Soc. 68, 1946, s.

5 459, A.J.L. Strauss et al., J. Immunol. 93, 1964 s. 24, A. Horejsi et al., Acta Med. Scand. 155, 1956 s. 65, A. Poison et al., Biochem.

Biophys. Acta 82, 1964 s. 463.

Ved intravenos administration af sidanne immunoglobuliner optræder der hos ca. 15-30% af patienterne anafylaktoide inkompatibilitetsreak-10 tioner (C.A. Janeway et al., New Engl. J. Med. 278, 1968 s. 919).

Hos immundeficiente patienter, der i særlig h0j grad har behov for en fgG-tilf0rsel, and rager antallet af disse anafylaktoide inkompatibilite-ter ca. 90%. Der er i dag ikke nogen fuldstændig tilfredsstillende forklaring pâ disse reaktioner. Man ved dog, at de h0jst sandsynligt 15 bliver udl0st pl grund af komplementbindende IgG-aggregater, der hyppigt kan pâvises i de kommercielle immunogiobulinpræparater.

Herfor taler det forhold, at der er blevet pâvist en direkte sammen-hæng mellem de kliniske inkompatibilitetsreaktioner, mængden af cirkulerende komplement og immunoglobulinernes in vitro bestemte 20 antikomplementære aktivitet. Et hovedformâl med fremstillingen af întravenpst administrerbare immunoglobuliner er derfor fjernelsen af deres antikomplementære aktivitet (S. Barandun et al., Vox Sanguinis 7, 1962, s. 157-174).

Til nedsættelse af immunoglobulinernes (IgG) antikomplementære 25 aktivitet kendes hidtil flere muligheder:

Det er blevet foreslâet at fjerne IgG-aggregaterne ved ultracentrifu-gering eller chromatografisk adskillelse. De præparater, der fâs ved disse metoder, er dog ustabile og bliver hurtigt igen antikomplementære, sandsynligvis som fplge af reaggregation af monomererne (S.

30 Barandun et al., Vox Sanguinis 7, 1962, s. 157).

If0lge pstrigsk patentskrift nr. 359.640 kan den antikomplementære aktivitet reduceres ved blanding med albumin eller sérum. De ved denne fremgangsmâde vundne præparater kan dog ikke mere betegnes 3

DK 157367 B

immunoglobuliner, da der til den n0dvendige nedsættelse af den antikomplementære aktivitet skal tilsættes si meget aibumin eller sérum, at IgG-andelen af hele proteinmængden bliver for Mlle.

Fjernelsen af IgG-aggregaterne er ogsâ blevet forsogt ved adsorption 5 ved hjælp af aktivkul (M. Steinbuch, Vox Sanguinis 13, 1967, s.

103), med stivelse, med silicater (tysk offentliggprelsesskrift nr. 2.658.334), samt ved udfældning med polyethylenglycol (tysk offent-liggprelsesskrift nr. 2.751.717). Ingen af disse metoder muliggpr en fuldstændig fjernelse af den antikomplementære aktivitet.

10 Ved partiel enzymatisk nedbrydning af immunoglobulin fremstilles præparater uden komplementbindende aktivitet, da proteolytiske enzymer sâsom pepsin og plasmin fraspalter eller pdelægger fortrinsvis Fc-delen af IgG-molekylet, hvilken del indeholder molekylets komplementbindende omrêde.

15 Den store ulempe ved denne metode er dog den fulstændige ophævelse af de biologiske funktioner, der er forbundet med Fc-delen i IgG-mo-lekylet, sâsom den cytofile aktivitet, opsonisationen eller cytolysen (bakteriolysen), der aile kræver en ubeskadiget Fc-del, der kan binde til Fc-receptorer. Desuden opstâr der ved den enzymatiske 20 spaltning af immunoglobulinmolekylet Fab og FCab'^-fragmenter, der ganske vist er i stand til at binde det specifikke antigen, men som kun har en meget kort biologisk halveringstid, nemlig 18-24 timer i stedet for 18-22 dage, som det er tilfældet med det hele IgG-molekyle.

Trods disse væsentlige ulemper findes flere enzymspaltede, intrave-25 npst administrerbare immunoglobulinpræparater i handelen: I fransk patentskrift nr. 2.382M beskrives produkter behandlet med pepsin, hvor FCab'^-fragmenterne udgpr ca. 80%. Kun 3-5% af IgG-molekylerne har modstâet proteolysen. Disse præparater har ingen antikomplementær aktivitet, og FCab'^-fragmenterne er i stand til at 30 neutralisere toxiner og vira.

4

DK 157367 B

Plasminbehandlede IgG-præparater er fx beskrevet i tysk offentliggp-relsesskrift nr. 2.752.694. De indeholder ca. 30-40% intakt IgG (un-derklasse 2 og 4), der ikke spaltes proteolytisk. Dette praeparats komplementbindende aktivitet er svag (20-50 mg/ml/2CH5Q).

5 Ved hjælp af syrebehandling ved pH-værdi 4 i 24 timer ved 37°C kan den antikomplementaere aktivitet af IgG ifplge fx S. Barandun et al.,

Vox Sanguinis 7, 1962, s. 157, nedsættes stærkt. De vundne præpa-rater bestir af 85-90% monomert IgG og 10-15% IgG-aggregater. Den komplementbindende aktivitet af disse produkter er svag (50-70 10 mg/ml/2CHgQ). Deres biologiske halveringstid er dog forkortet til ca.

14 dage, og præparaterne er under lagringen ikke stabile, og deres antikomplementaere aktivitet tiltager atter. Et stabilt, lyofiliseret præ-parat, der fremstilles i henhold til denne metode, er for nylig kommet i handelen.

15 Det er ogsi mange gange blevet fors0gt og foreslâet at fâ intraven0st anvendelige IgG-præparater ved indvirkning af reaktive kemikalier.

a) Med β-propiolacton blokeres komplementreceptorerne pi IgG's Fc-del. De sâledes vundne produkter binder ikke mere noget komplement og bestir for 90%’s vedkommende af monomerer, men 20 deres biologiske halveringstid er dog nedsat til 4-12 dage. Jfr.

europæisk patentanspgning nr. 13.901, S. Barandun et al., Afhandling Alfergy 9, Karger, Basel 1975, s. 39-60.

b) Ved reduktion og sulfonering af disulfidbroerne i IgG-molekylet kan den antikomplementære aktivitet if0lge T. Yamanaka et al., 25 Vox Sanguinis 37, 1979, s. 14-20, ligeledes formindskes stærkt.

c) Ved reduktion og alkylering i henhold til et forslag fra D.D. Schroder et al., Vox Sanguinis 40, 1981, s. 383-394, eller ved amidering if0lge tysk offentligg0relsesskrift nr. 2.442.655 kan der fis intraven0st administrerbare IgG-præparater.

30 Ændringer af molekylstrukturen og forekomsten af nye antigene de-terminanter pi IgG-molekylet kan med disse kemiske indgreb ikke udelukkes.

5

DK 157367 B

Der kendes hidtil intet ideelt immunoglobulinpræparat til intravenos administration. Enten modificeres IgG-molekylerne ved enzymatisk nedbrydning med tab af de egenskaber, som er afhængige af Fc-frag-mentet, eller ved kemiske indgreb med forandring af molekylstruktu-5 ren, idet ogsâ den biologiske halveringstid sædvanligvis bliver for-kortet, eller ogsê bliver der, nâr der overvejende arbejdes med fysiske forholdsregler, stadig en vis antikomplementaer aktivitet i IgG-præparatet tilovers.

Formllet med den foreliggende opfindelse er at rense og behandle 10 immunoglobulin pâ en sldan mâde, at der fis et stabilt produkt, hvis naturlige molekylstruktur forbliver intakt, der sâledes bevarer den oprindelige antistofaktivitet, og som ikke har nogen antikomplementaer aktivitet, der er pâviselig in vitro, og som derfor kan anvendes intraven0st uden risiko ogsi hos særlig udsatte immundeficiente pati-15 enter.

Dette mal nas if0lge den foreliggende opfindelse ved en fremgangsmâ-de, der bestâr af en kombination af tre pi hinanden fplgende og efter hinanden afstemte trin, hvorved immunoglobulinernes antikomplemen-tære aktivitet i hvert trin formindskes.

20 Det f0rste trin bestêr i en grundlæggende adskillelse af monomert immunoglobulin G og aggregater deraf ved hjælp af en ionbytter, idet IgG-monomererne selektivt elueres, medens IgG-aggregaterne forbliver bundne pâ ionbytteren. De eluerede monomerer binder kun komple-mentet svagt, men er særdeles ustabile og bliver hurtigt igen anti-25 komplementære, nâr de ikke stabiliseres.

Denne stabilisering opnâs i et andet trin efter den i og for sig kendte metode, der er beskrevet af S.l. Miekka et al., Vox Sanguinis 29, 1975, s. 101, ved en svag syrebehandling og/eller tilsætning af polyalkylenglycoler, sukkere og/eller polyoler, idet tilsætningen af en 30 polyalkylenglycol og sukker er obligatorisk.

Fjernelsen af de sidste spor af antikomplementært virkende aktivitet opnâs slutteligt i et sidste trin, der bestâr af en selektiv adsorption til aluminiumhydroxid.

6

DK 157367 B

Rækkef0lgen af disse tre trin er udslagsgivende for resultatet.

Det ved denne fremgangsmâde vundne immunoglobulin har ikke læn-gere nogen antikomplementær aktivitet og beholder sin oprindelige molekylstruktur og ogsâ en uforandret antistofaktivitet.

5 Dette h0je mal kan kun opnâs ved kombinationen if0lge opfindelsen af de tre fremgangsmidetrin.

Den foreliggende opfindelse angâr sâledes en fremgangsmâde til frem-stilling af intraven0st administrerbart immunoglobulin til forstærkelse af den menneskelige organismes immunforsvar, hvilken fremgangsmâde 10 er ejendommelig ved, at et antikomplementært immunoglobulin, der ved kendte fremgangsmâder er isoleret fra humant plasma eller placenta, f0rst bindes til en ionbytter, det monomère immunoglobulin selektivt elueres derfra med en 0,02-0,2 molær pufferopl0sning, pH 4,0-5,5, koncentreres, i det væsentlige befries for den antikomplementære 15 aktivitet ved behandling med en svag syre med en pH pâ 4,1-4,6 og eventuelt ved inkubation ved 30-45°C i 1/4-1 time, og derefter diafil-treres med en fortyndet puffer, pH 5,8-6,1 og/eller stabiliseres ved tilsætning af en polyethylenglycol eller polypropylenglycol og saccharose, lactose, maltose eller mannose og/eller sorbitol eller mannitol, 20 idet tilsaetningen af en polyalkylenglycol og sukker er obligatorisk, og de sidste rester af antikomplementær aktivitet til slut fjernes ved adsorption til aluminiumhydroxid.

I detaljer bestâr fremgangsmâden i, at a) et ved kendte metoder isoleret immunoglobulin anbringes pâ en 25 ionbytter, hvorfra det monomère immunoglobulin elueres med en 0,02-0,2 molær pufferoplpsning, der har en pH-værdi pâ ca. 4,0-5,5, b) det i det væsentlige monomère eluat diafiltreres efter koncentra-tion, eller inkuberes ved 30-45°C i ca. 1/4-1 time som en svagt 30 sur oplpsning med en pH-værdi, der er >4 og <5, og diafiltreres, 7

DK 157367 B

den sâledes stabiliserede immunoglobulinopl0sning tilsættes en polyalkylenglycol, en sukker og eventuelt en polyol, og c) en aluminiumhydroxidgel til sidst tilsættes, hvortil de sidste rester af antikomplementær aktivitet adsorberes, adsorptionsmidlet 5 igen skilles fra, og den vundne, stabiliserede immunoglobulinfrak- tion pâ kendt mâde oparbejdes til et intravenpst injicerbart immu-noglobulinpræparat, der egner sig til lagring.

Som udgangsmateriale til fremgangsmiden ifolge opfindelsen anvendes et immunoglobulin, der er fremstillet ved kendte fraktioneringsfrem-10 gangsmlder ud fra humant plasma eller human placenta, fx ved en ethanolfraktioneringsfremgangsmâde (Cohn et al.), udfældning med salte (Strauss et al.), polyethylenglycoler (Poison et al.) eller et acridinderivat slsom Rivanol® (Horejsi et al.) eller ved en chromato-grafifremgangsmlde. Placentalt immunoglobulin, der kan anvendes som 15 udgangsmateriale, fis fx ifplge H.L. Taylor et al., J. Amer. Chem.

Soc. 78, 1956 s. 1356, ud fra den isotoniske vandige placentaekstrakt ved fraktioneret udfældning med 95%'s éthanol.

Man kan som udgangsmateriale anvende immunoglobulin fra normalt eller hyperimmunt humant plasma eller fra tilsvarende placenta.

20 Til behandling af infektionssygdomme og til profylakse kræves der immunoglobuliner med specifikke antistoffer.

Til sâdanne indikationer anvendes immunoglobuliner, der er udvundet fra plasma eller placenta, og som indeholder antistoffer mod bestemte virale eller bakterielle infektioner, fx antivirale antistoffer mod hepa-25 titis, mæslinger, rode hunde, fâresyge eller rabies, eller antibakteri-elle antistoffer mod stivkrampe, difteritis, kighoste, staphylococcer, Escherichia coli, Pseudomonas, etc. Til behandling af Morbus haemoly-tikus neonatorum anvendes immunoglobuliner fra plasma eller placenta, der indeholder anti-D(Rho)-antistoffer.

8

DK 157367 B

Det som udgangsmateriale anvendte naturlige immunoglobulin anvendes i en proteinkoncentration pâ 20-40 mg/ml og en pH-værdi pl 4,0-5,5.

Fx indstilles en Cohn-fraktion I og III, en slutudfældning af ven0st eller placentalt immunoglobulin eller et lyofilisat ved oplpsning eller en 5 éventuel endog ethanolholdig immunoglobulinoplpsning ved tilsvarende fortynding og syretilsaetning til pH-vaerdi 4,0-5,5.

Denne oplpsning af IgG-monomerer, IgG-dimerer, IgG-trimerer og IgG-polymerer adskilles med ionbytter (chromatograferes).

Som ionbytter foretrækkes en kationbytter. Især har carboxymethyl-10 celluloser (CMC) vist sig at være egnede. lonbytteren ækvilibreres fprst med en 0,01-0,04 moiær pufferoplpsning med pH-værdi 4,0-5,0.

Under disse betingelser bliver al immunoglobulin bundet til ionbytteren;

Som pufferoplpsning til ækvilibrering af ionbytteren og eluering af 15 IgG-monomererne kan der anvendes en hvilken som helst biologisk uskadelig puffer slsom acetatpuffer, phosphatpuffer, citratpuffer eller aminosyrepuffer. Acetatpuffer er foretrukken. IgG-monomererne elueres med en 0,02-0,2 molær puffer med pH-værdi 4,0-5,5, der yderligere indeholder 0,05-0,15 mol natriumchlorid.

20 IgG-aggregaterne og ogsâ polymererne sâvel som trimererne og dime-rerne forbliver bundne til ionbytteren og kan senere frigpres med en h0jmolær puffer.

Den antikomplementære aktivitet af den monomère IgG-fraktion er svag, nemlig 60-80 mg/mI/2CHgQ i sammenligning med udgangsmateri-25 alet (0,3-1,0 mg/ml/2CH^Q). lgG-monomeropl0sningen koncentreres og inkuberes ved en pH-værdi pâ fortrinsvis 4,1-4,6 ved 30-45°C i 1/4 til 1 time. Inkubationen kan udelades, nâr udgangsmaterialet allerede har en relativt ringe antikomplementær aktivitet.

9

DK 157367 B

Immunoglobulinopl0sningen diafiltreres nu mod en pufferopl0sning med pH-værdi 5,8-6,1, fx mod en 0,005-0,015 rnolaer phosphatpuffer. Citrat-, phthalat- og aminosyrepuffere kan ogsâ anvendes til dette formai. Den ved diafiltreringen rensede IgG-opIpsning tilsaettes til 5 yderligere stabilisering en polyglycol, en sukker og eventuelt en polyol. Som polyglycol anvendes fortrinsvis 0,05-0,3% (w/v) af en polyethylenglycol (PEG 1000-6000) eller en polypropylenglycol, som sukker 3-7% (w/v) saccharose, lactose, maltose eller mannose, idet saccharose sædvanligvis foretrækkes, som polyol 0-7% (w/v) sorbitol 10 eller mannitol. Den vundne oplpsning indstilles til pH-værdi 6,4-6,β.

Det tredje fremgangsmâdetrin er uundværligt til fjernelse af de sidste spor af antikomplementær aktivitet. Derfor sættes der til den neutra-liserede IgG-opIpsning 5-20% (w/v) aluminiumhydroxidgel. Suspensi-onen omrpres fra 20 minutter til 2 timer ved stuetemperatur eller 15 natten over ved 4°C, centrifugeres derefter ved ca. 10.000 x g og sterilfiltreres. Filtratet fyldes pl færdigbeholdere, fx ampuller eller serumflasker, og lyofiliseres derefter.

Det saledes fremstillede immunoglobulin har efter oplpsning af lyofili-satet i destilleret vand eller en 0,05 molær natriumchloridoplesning 20 f0lgende egenskaber: 1. Det indeholder ikke mere nogen mâlbar antikomplementær aktivi- tet.

2. Andelen af monomert immunoglobulin (IgG), bestemt ved gelchro-matografi, er pi mellem 85 og 95%. Der forekommer ikke fragmen- 25 ter.

3. I immunoelektrophoresen mod anti-humant-antiserum er kun en enkelt IgG-udfældningslinje synlig. Spaltningsprodukter kan ikke pâvises.

4. Fordelingen af IgG-underklasserne i normal sérum bevares.

DK 157367 B

10 5. Antistofspektrets aktivitet, beregnet ud fra proteinkoncentratio-nen, forbliver uforandret.

Sammenligning mellem antikomplementær aktivitet udtrykt i (mg/ml/-2CH50) af kommercielle intravenpst administrerbare immunoglobulin-5 præparater og det ved fremgangsmlden ifplge opfindelsen vundne naturlige, uforandrede og ikke-nedbrudte, stabiliserede immunoglobu-lin:

Den antikomplementære aktivitet angives i mg protein pr. ml, der er nodvendige for at hæmme to enheder komplement. Den bestemmes ved 10 den 50%'s hæmolyse af sensibiliserede flre-erythrocytter (mg/ml/- 2CHgQ) ved den af M.M. Mayer, Experimental Immunochemistry, 2. udgave, s. 133-240, Charles C. Thomas, Springfield, samt US Department of Health, Education and Welfare Public Health Monograph No. 74, "Standardized diagnostic complément fixation method and 15 adaptation to micro test" beskrevne standardfremgangsmâde. Tabellen er vist pâ side 11.

De ved fremgangsmlden ifplge opfindelsen fremstillede immunoglobulin-præparater administreredes intravenpst i doser pâ 2,5-10 g (pro dosi) til 48 patienter. Præparaterne havde en god tolerabilitet, idet der 20 ikke kunne iagttages nogen uventede bivirkninger. I denne forprpv-ning deltog udelukkende patienter, der ikke viste tegn pâ immun-deficiens. Pâ grundlag af disse erfaringer er en klinisk afprpvning pâ patienter med en medfpdt eller senere erhvervet immundeficiens, hos hvem den livsnpdvendige immunoglobulinterapi under anvendelse af 25 aile hidtidige præparater er forbundet med en vis risiko, retfærdig-gjort.

DK 157367 B

11

Tabel

Antikomplementær ak-

IgG-Præparat tivitet (mg/ml/2CH^g) 5 - 16% Standard-igG 0,5 - 1,5 (til intramuskulær anvendelse)

Ved adsorption renset IgG 3-30 f$-Propiolactonbehandlet IgG 40 - 50 10 Syrebehandlet IgG 60 - 80

Plasminspaltet eller delvis nedbrudt IgG 20 - 50

Pepsinspaltet eller delvis nedbrudt IgG ingen mâlelig aktiviitet

Det ved fremgangsmlden ifplge 15 opfindelsen fremstillede IgG

(eksempel 1)

Udgangsmateriale 0,7 CMC-Monomerfraktion 60 - 88

IgG-præparat efter stabiliserlng 150 - 200 20 Slutprodukt (eksempel 1) ingen mâlelig aktivitet

Fordelen ved præparatet fremstillet ved fremgangsmlden if0lge opfindelsen fremfor de kendte præparater er âbenbar.

EKSEMPEL 1 25 6 g lyofiliseret immunoglobulin (IgG), der er fremstillet efter den kendte COHN-fremgangsmâde nr. 9 ud fra normalt humant plasma, opl0ses i 90 ml destilleret vand. Oplpsningen indstilles efter en klar-filtrering med 10%'s eddikesyre til pH-værdi 4,6 og optages pâ en med 1 liter 0,02 molær acetatpuffer med pH-værdi 4,6 forækvilibreret 30 carboxymethylcellulosekolonne (CMC-kolonne) (7 cm lang x 6 cm i diameter). Immunoglobulinet adsorberes til ionbytteren, og kolonnen 12

DK 157367 B

vaskes med 500 ml af den ovennævnte acetatpuffer. Det monomère IgG elueres derefter med 1,5 liter 0,1 molær acetatpuffer med pH-vaerdi 4,6, der indeholder 8,18 g NaCI pr. liter, og koncentreres dernæst med et ultrafilter til 50 ml. Denne opl0sning, der har en proteinkon-5 centration pâ 70-80 mg/ml, inkuberes ved pH-værdi 4,1 i 30 minutter ved 37°C i vandbad. Ved diafiltreringen mod 1 liter phosphatpuffer (0,015 M, pH-værdi 6,05) indstilles pH-værdien lidt efter lidt til 5,8.

Til stabilisering tilsættes produktet 0,3% (w/v) PEG 4000 og 7% (w/v) saccharose. pH-Vaerdien indstilles til 6,4 med 0,1 N NaOH. Efter 10 tilsætning af 10% (w/w) aluminiumhydroxidgel omrpres oplpsningen i 30 minutter ved stuetemperatur. Suspensionen centrifugeres i 20 minutter ved 10.000 x g, og supernatanten sterilfiltreres. Præparatet fordeles sterilt i brugsbeholdere og lyofiliseres. Herved fyldes der si meget IgG-opIpsning i brugsbeholderne (ampuller, serumflasker, etc.), at 15 der ved opl0sning af lyofiiisatet i 2 x destilleret vand eller 0,05M natriumchloridopl0sning fis en 5%'s protein-(lgG)-opl0sning, der egner sig til intraven0s injektion eller infusion.

EKSEMPEL 2 6 g lyofiliseret IgG opl0ses, filtreres og renses over CMC pâ den i 20 eksempel 1 beskrevne mâde. Monomerfraktionen diafiltreres efter koncentration uden syrebehandling direkte mod den 0,015 molære phosphatpuffer, pH-værdi 6,05, indtil oplpsningens pH-vaerdi bliver 5,8. Efter tilsætning af 0,5% PEG 4000 og 3,5% af henholdsvis maltose og mannitol til oplpsningen indstilles pH-værdien til 6,4, og der 25 blandes med 10% (w/w) aluminiumhydroxidgel. Suspensionen omrpres i 15 timer ved 4°C, centrifugeres, filtreres og videreforarbejdes som beskrevët i eksempel 1.

EKSEMPEL 3

Som udgangsmateriale anvendes slutudfældningen fra COHN-frem-30 gangsmâde nr. 9, der endnu indeholder éthanol. Bundfaldet oplpses i iskoldt vand og videreforarbejdes ved den i eksempel 1 beskrevne

DK 157367 B

13 metode, idet adskillelsen pâ CMC-kolonnen dog udfores ved 4°C. De 0vrige operationer udf0res som beskrevet i eksempel 1. I stedet for saccharose tilsættes en lige stor mængde lactose.

Slutproduktet har de samme fordelagtige egenskaber som slutproduktet 5 fra eksempel 1.

EKSEMPEL 4

Som udgangsmateriale anvendes lyofiliseret IgG, der er fremstillet ved COHN-fremgangsmâde nr. 9 ud fra humant hyperimmunt plasma med en h0jt specifikt anti-tetanus-titer. Udgangsmaterialet indeholder ved 10 10% proteinkoncentration 2S0 I.E. Te/ml. Den vandige oplpsning af dette lyofilisat, som indeholder 30 mg protein/ml, adskilles, renses og stabiliseres ved den i eksempel 1 beskrevne tretrinsfremgangsmâde. Produktet er fri for antikomplementær aktivitet og indeholder som en 5%'s proteinopl0sning 150 I.E. tetanus/ml.

15 EKSEMPEL 5

Som udgangsmateriale anvendes IgG, der indeholder specifikke anti-D-antistoffer (150 yg/ml i en 10%’s proteinopl0sning), der behandles som beskrevet i eksempel 1. Slutproduktet indeholder som en 5%’s lgG-opl0sning 85 yg/ml specifikke anti-D-antistoffer og er fri for 20 antikomplementær aktivitet.

EKSEMPEL 6-12

Analogt med det i eksempel 4 og 5 beskrevne fâs ogsâ intravenpse optimalt kompatible præparater, der indeholder fplgende specifikke antistoffer: 25 6. Anti-difteritis-antistoffer, 7. anti-hepatitis-B-antistoffer,

DK 157367 B

14 8. anti-rpde hunde-antistoffer, 9. anti-firesyge-antistoffer, 10. anti-rabies-antistoffer, 11. anti-mæslinger-antistoffer og 5 12. anti-B. Pertussis-antistoffer.

Disse produkter beholder - beregnet ud fra proteinindholdet - deres hpje specifikke antistofaktivitet.

EKSEMPEL 13-22

Immunoglobulinfraktioner, der fis ud fra isotoniske vandige placenta-10 ekstrakter ved udfældning med 95%'s éthanol, indstilles til en protein-koncentration pi 30 mg/ml og en pH-værdi pâ 5,0 og adskilles, renses og stabiliseres ved den i eksempel 1 beskrevne fremgangsmâde. Pro-dukterne er fri for antikomplementær aktivitet og er dermed intrave-npst optimalt kompatible og indeholder det i udgangsmaterialet tilste-15 deværende antistofspektrum.

13. IgG med uspecifikt antistofspektrum, 14. IgG med anti-rpde hunde-antistof, 15. IgG med anti-tetanus antistof, 16. IgG med anti-D-antistof, 20 17. IgG med anti-difteritis-antistof, 18. IgG med anti-hepatitis-antistof, 19. IgG med anti-fâresyge-antistof, 20. IgG med anti-rabies-antistof, 21. IgG med anti-mæslinger-antistof og 25 22. IgG med anti-B. Pertussis-antistof.

Claims (3)

1. Fremgangsmlde til fremstilling af intraven0st administrerbart immunoglobulin til forstærkelse af den menneskelige organismes immunfor-svar, 5 kendetegnet ved, at et antikomplementært immunoglobulin, der ved kendte fremgangsmâder er isoleret fra humant plasma eller placenta, fprst bindes til en ionbytter, det monomère immunoglobulin selektivt elueres derfra med en 0,02-0,2 molær pufferoplpsning, pH 4.0- 5,5, koncentreres, i det væsentlige befries for den antikomple-10 mentære aktivitet ved behandling med en svag syre med en pH pâ 4.1- 4,6 og eventuelt ved inkubation ved 30-45°C i 1/4-1 time, og derefter diafiltreres med en fortyndet puffer, pH 5,8-6,1 og/eller stabiliseres ved tilsætning af en polyethylenglycol eller polypropylen-glycol og saccharose, lactose, maltose eller mannose og/eller sorbitol 15 eller mannitol, idet tilsætningen af en polyalkylenglycol og sukker er obligatorisk, og de sidste rester af antikomplementær aktivitet til slut fjernes ved adsorption til aluminiumhydroxid.

2. Fremgangsmâde if0lge krav 1, kendetegnet ved, at der anvendes immunoglobulin fra 20 normalt eller hyperimmunt humant plasma eller fra tilsvarende placenta.

3. Fremgangsmâde if0lge krav 2, kendetegnet ved, at der anvendes immunoglobulin, der indeholder antistof mod bestemte virale eller bakterielle sygdomsfor-25 voldere eller anti-D-antistof.