FI73597C - Foerfarande foer framstaellning av ett intravenoest injicerbart humanimmunoglobulin. - Google Patents

Description

! 73597

Laskimonsisäisesti annettavan humaani-immunoglobu1iinin valmistusmenetelmä

Esitettävä keksintö koskee uutta, laskimonsisäisesti annettavaa natiivia, kemiallisesti muuttumatonta ja entsymaattisesti hajoittamatonta stabiilia immunoglobuliinia, jolla ei ole lainkaan antikomplementtiaktiivisuutta, sekä sen valmistustapaa .

Humaani-immunoglobuliineilla on tärkeä tehtävä tartuntatautien ja vasta-ainepuutostilojen torjunnassa ja hoidossa. Gammaglobuliineja käytetään esimerkiksi suojakeinona virusperäisiä tartuntatauteja vastaan, kuten esimerkiksi maksatulehdusta, tuhkarokkoa, vihurirokkoa, sikotautia, vesikauhua vastaan tai bakteerien aiheuttamia tauteja, kuten jäykkäkouristusta, kurkkumätää ja hinkuyskää vastaan. Esimerkiksi stafylokokkien, Escherichia colin, Pseudomonas1 in ym. aiheuttamissa antibioottiresistenteissä tartuntataudeissa käytetään gamma-globuliinihoitoa. Spesifisiä gammaglobuliineja (igG) käytetään myös rhesus-inkompatibiliteetin ennaltaehkäisyyn.

Sitä paitsi gammaglobuliinihoito on erittäin tärkeä suojakeino infektioita vastaan potilailla, joilla esiintyy immuno-globuliinivajausta, jotka siis kärsivät agamma- tai hypo-gammaglobulinemiasta.

Tavanomaiseen lihakseen annettavaan hoitoon liittyy joitakin merkittäviä puutteita: 1. Voidaan injisoida vain rajoitettu määrä, enintään 10 ml.

2. Resorptio elimistön läpi on hyvin hidas. R.Martin du Pan et ai., Blut 5, 104 (1959) totesivat esimerkiksi, että viiden vuorokauden kuluttua vielä 35-40 % immunoglobuliinista oli jäljellä injektiokohdassa.

3. Injektiokohdassa tapahtuva proteolyysi hajoittaa suuren osan immunoglobuliinia, vrt. S. Barandun et ai., Vox Sanguinis 28, 157-175 (1975).

2 73597 Päin vastoin kuin edellä saadaan laskimoon annetulla injektiolla tai infuusiolla nopeasti veren korkea immunoglobulii-nitaso, mikä esimerkiksi septis-toksisissa infektioissa on välttämätöntä.

Laskimoon annettavaksi ei kuitenkaan sovellu veriplasmasta, seerumista tai istukasta tavanomaisin fraktioimismenetelmin valmistettu immunoglobuliini, joka soveltuu ainoastaan lihakseen annettavaksi. Vrt. Cohn et ai., J. Amer.Chem. Soc.

68, 459 (1946), A.J.L. Strauss et ai., J.Immunol. 9J3, 24 (1964), A. Horejsi et ai., Acta Med.Scand. 155, 65 (1956), A.Poison et ai., Biochem. Biophys. Acta 8_2, 463 (1964).

Kun näitä immunoglobuliineja annetaan laskimonsisäisesti, aiheuttaa se n. 15-30 %:lla potilaista anafylaktisiä sietämät-tömyysreaktioita /C.A. Janeway et ai., New Engl. J.Med. 278, 919 (1968J_/. Potilailla joilla on immunoglobuliini vajausta ja joilla on erityisen suuri IgG:n tarve, nousee tämä anafylak-tisten reaktioiden taso aina 90 %:iin. Tähän päivään mennessä ei näille reaktioille ole voitu antaa yksikäsitteisen tyydyttävää selitystä. Tiedetään kuitenkin mitä todennäköisimmin, että reaktion laukaisevat komplementtia sitovat IgG-aggregaa-tit, joita usein esiintyy tavanomaisissa kaupallisissa immu-noglobuliinivalmisteissa. Olettamuksen puolesta puhuu se, että on voitu osoittaa selvä yhteys kliinisesti todettavien sietämättömyysreaktioiden, verenkierrossa olevan komplementin määrän sekä in vitro osoitetun immunoglobuliinien anti-komplementtiaktiivisuuden kesken. Laskimonsisäisesti annettavien immunoglobuliinien valmistamisen päätavoitteena on siksi niiden antikomplementtiaktiivisuuden poistaminen /S. Barandun et ai., Vox Sanguinis Ί_, 157-174 (1962]y.

Immunoglobuliinien (IgG) antikomplementtiaktiivisuuden alentamiseksi tunnetaan nykyisin useita eri mahdollisuuksia:

On esitetty IgG-aggregaattien poistamista ultrasentrifugoi-malla tai kromatografisesti erottamalla. Näin valmistetut tuotteet ovat kuitenkin epästabiileja ja niiden antikomplementti- 3 73597 aktiivisuus kehittyy pian, todennäköisesti monoraeerien aggre-goituessa uudelleen. /S. Barandun et ai., Vox Sanguinis 1_, 157 (1962^7·

Itävaltalaisen patentin 359 640 mukaan voi antikomplementti-aktiivisuutta alentaa sekoittamalla albumiinin tai seerumin kanssa. Näitä valmisteita ei kuitenkaan enää voi kutsua immu-noglobuliineiksi, koska antikomplementtiaktiivisuuden alentamiseksi riittävästi ovat albumiini- tai seerumilisäykset niin huomattavat, että IgG:n osuus kokonaisproteiinista jää liian alhaiseksi. IgG-aggregaattien hävittämistä on myöskin kokeiltu aktiivihiiliadsorption avulla /M.Steinbuch, Vox Sanguinis 13, 103, (1967J_/, tärkkelyksen, silikaattien avulla (DE-OS

26 58 334) sekä polyetyleeniglykoleenisaostuksclla (DE-OS

27 51 717). Millään näistä menetelmistä ei voi täysin poistaa antikomplementtiaktiivisuutta.

Immunoglobuliinin osittaisella entsymaattisella hajoittami-sella saatiin valmisteita, joilla ei ollut komplementin sito-misaktiivisuutta, koska proteolyyttiset entsyymit kuten pepsii-ni ja plasmiini ensisijaisesti lohkaisevat tai tuhoavat IgG-molekyylin Fc-osan, johon tämän molekyylin antikomplementti-aktiivisuus paikallistuu.

Tämän menetelmän suuri haitta on kuitenkin IgG-molekyylin Toosaan liittyvien biologisten toimintojen täydellinen kumoaminen, kuten esimerkiksi sytofiilinen aktiivisuus, opsonisaatio eli sytolyysi (bakteriolyysi), jotka kaikki edellyttävät vahingoittamatonta Fc-osaa, joka voi kiinnittyä Fc-resepto-riin. Sitä paitsi immunoglobuliinimolekyylin entsymaattises-sa hajoituksessa muodostuu Fab ja F(ab')2~osia, jotka kyllä voivat sitoa spesifisen antigeenin, mutta tuotteen biologinen puoliintumisaika on hyvin lyhyt, nimittäin 18-24 h, kun sen sijaan täydellisellä IgG-molekyylillä se on 18-22 vrk.

4 73597 Näistä huomattavista haitoista huolimatta on kaupallisesti tarjolla useita entsymaattisesti hajoitettuja laskimonsisäisesti annettavia immunoglobuliinivalmisteita:

Ranskalaisessa patentissa 2.382M esitetään pepsiinillä käsiteltyjä tuotteita, joissa on jopa n. 80 % F(ab')2_osia· Vain 3-5 % IgG-molekyyleistä on säilynyt hajoamatta proteolyysissä. Näillä valmisteilla ei ole antikomplementtiaktiivisuutta ja F(ab')2~osa't: pystyvät neutraloimaan toksiineja ja viruksia.

Esimerkiksi DE-patentissa 27 52 694 on esitetty plasmiLnilla käsiteltyjä IgG-valmisteita. Niissä on noin 30-40 % intaktia IgG (alaluokka 2 ja 4), joka ei hajoa proteolyyttisesti. Näiden valmisteiden komplementinsitomisaktiivisuus on heikko (20-50 mg/ml/2 CH5Q).

Happokäsittelyllä pH:ssa 4 24 h 37°C voidaan esimerkiksi S. Barandun et al:n mukaan, Vox Sanguinis Ί_, 157 (1962)

IgG:n antikomplementtiaktiivisuutta voimakkaasti vähentää. Saadut valmisteet sisältävät 85-90 % monomeeristä IgG:tä ja 10-15 % IgG-aggregaatteja. Näiden tuotteiden komplementinsitomisaktiivisuus on heikko (50-70 mg/ml/2CH50). Niiden biologinen puoliintumisaika on lyhentynyt noin 14 vuorokauteen ja valmisteilla on varastoitaessa heikko stabiilisuus ja niiden antikomplementtiaktiivisuus lisääntyy jälleen. Jonkin aikaa on ollut kaupallisesti saatavissa tällä menetelmällä valmistettu stabiili kylmäkuivattu valmiste.

Useasti on yritetty ja ehdotettu laskimonsisäisesti annettavan IgG-valmisteen tuottamista reaktiokykyisten kemikalien avulla.

a) Beta-propiolaktonilla tehdään IgG:n Fc-osan komplementti-reseptorit tehottomiksi. Näin valmistetut tuotteet eivät enää sido komplementtia ja ne sisältävät aina 90 %:iin asti mono-meeriä, niiden biologinen puoliintumisaika on kuitenkin laskenut 4-12 vuorokauteen. Vertaa: eurooppalainen patenttihakemus

II

5 73597 13 901; S. Barandun ot ai., Monograph. Allergy, 9, 39-60 (Karger, Basel 1975).

b) IgG-molekyylin disulfidisiltojen pelkistämisellä ja sulfo-noinnilla voidaan T. Yamanaka et ai. mukaan, Vox Sanguinis 37, 14-20 (1979) antikomplementtiaktiivisuutta myöskin voimakkaasti alentaa.

c) D.D. Schröder et al:n, Vox Sanguinis 4Ό, 383-394 (1981) erään ehdotuksen mukaan pelkistämällä ja alxyloimalla tai DE-hakemusjulkaisun 24 42 655 mukaan amidioimalla voidaan päästä laskimonsisäisesti annettavaan IgG-valmisteeseen.

Näiden kemiallisten toimenpiteiden yhteydessä oi voi estää molekyylirakenteen muutoksia ja IgG-molekyylin uusien antigee-nideterminaattien esiintymistä.

Toistaiseksi ei ole olemassa mitään ihanteellista laskimonsi-säiseen käyttöön sopivaa iramunoglobuliinivalmistetta. IgG-molekyylit muuttuvat joko entsvmaattisen hajoamisen kautta, jolloin Fc-osiir, liittyviä ominaisuuksia menetetään, tai ne joutuvat kemiallisten reaktioiden kohteeksi ja niiden molekyylirakenne muuttuu, jolloin tavallisesti myös biologinen puoliintumisaika lyhenee, tai IgG-valmisteeseen jää, jos käytetään etupäässä fysikaalisia toimenpiteitä, vielä tiettyä antikomple-menttiaktiivisuutta.

Tämän keksinnön tarkoituksena on puhdistaa ja käsitellä immuno-globuliinia siten, että saadaan stabiili tuote, jonka natiivi molekyylin rakenne säilyy koskemattomana, ja jolla siten on alkuperäinen vasta-aineaktiivisuus ja jolla ei ole mitään in vitro osoitettavissa olevaa antikomplementtiaktiivisuutta ja jota sen mukaisesta voi vaaratta antaa laskimonsisäisesti erityisen vaaralle altistetuille potilaille, jotka kärsivät immunoglobuliinin puutetta.

6 73597 Tähän on esitettävän keksinnön mukaan päästy menetelmällä, joka koostuu kolmesta perättäisestä keskenään sopeutetuista vaiheista, siten että joka vaiheessa immunoglobuliinin anti— komplementtiaktiivisuus vähenee.

Ensimmäinen vaihe käsittää monomeerisen immunoglobuliini G:n ja sen aggregaattien alustavan erottamisen toisistaan lonin-vaihtajan avulla, jolloin IgG-monomeeri eluoituu selektiivisesti IgG-aggregaattien jäädessä sitoutuneeksi ioninvalhta-jaan. Eluoidut monomeerit sitovat komplementtia vielä vain heikosti, mutta ovat hyvin epästabiileja ja muuttuvat nopeasti jälleen antikomplementtisiksi, ellei niitä stabiloida.

Stabilointi tapahtuu toisessa vaiheessa sinänsä jo tunnetun S.I. Miekka et alin, Vox Sanguinis _29, 102 (1975) kehittämän menetelmän mukaan, jossa tuotetta käsitellään heikolla hapolla ja/tai lisätään polyglykoleja, sokereita ja/tai polyoleja, jolloin polyglykolin ja sokerin lisääminen on välttämätöntä.

Kolmannessa vaiheessa voidaan poistaa antikomplementaarisesti vaikuttavan aktiivisuuden viimeiset tähteet selektiivisellä alumiinihydroksidiadsorptiolla.

Onnistumisen edellytyksenä on kolmen eri vaiheen oikea järjestys .

Tällä menetelmällä valmistetulla immunoglobuliinilla ei ole enää antikomplementtiaktiivisuutta, sen molekyylirakenne on alkuperäinen ja vasta-aineen aktiivisuus on säilynyt muuttumattomana. Tähän korkealaatuiseen tulokseen päästään vain keksinnön mukaisen menetelmän kolmen eri vaiheen yhdistelmällä.

Keksinnön kohteena on siten ihmiselimistön immunologisen vastustuskyvyn vahvistamiseksi suoneen annettava humaani-immuno-globuliini (IgG), joka on tunnettu siitä, että se on natiivia, kemiallisesti muuttumatonta ja entsymaattisesti hajottamatonta

II

7 73597 immunoglobuliinia, jolla ei ole yhtään in vitro osoitettavaa 3ntikoiTiplenen11iaktiivisuu11a ja jolla on muuttumaton vaste— aineaktiivisuus.

Tämän laskimoon annettavan immunoglobuli inin valmistusmene— telmä on tunnettu siitä, että tavanomaisilla menetelmillä humaanip 1 asmasta tai -istukasta valmistettu immunoglobu1iini sidotaan ensiksi ioninvaihtajaan, josta seiektiivisesti cluoi— daan monomeerinen immunoglobu1iini, joka stabiloidaan käsittelemällä hyvin heikolla hapolla ja/tai polyglykoli- ja sokeri-lisäyksellä ja/tai polyolilisäykseilä, jolloin polyglykolin ja sokerin lisäys on välttämätön, jonka jälkeen välittömästi alumiinihydroksidi adsorption avu Ha antikomp1 emonttiakt iivisuu-den tähde poistetaan.

Menetelmän yksityiskohdat ovat seuraavat: a) tunnetulla menetelmällä eristetty immunoglobu1iini sidotaan ioninvaihtajaan, josta monomeerinen immunog]obuliini eluoidaan 0,02-0,2 molaarisella puskuriliuoksella, jonka pH on n. 4,0-5,5, b) väkevöinnin jälkeen lähes monomeerinen eluaatti dialysoi-daan tai liuoksen ollessa heikosti hapan (pH >4 - <5) inkuboi-daan 30-45°C 15-60 min ja sen jälkeen dialyso.idaen ja näin stabiloituun immunoglobuliini1iuokseen lisätään polyglykolia, sokeria ja tarvittaessa polyoiia, ja c) lopuksi lisätään alumiinihydroksidigeeliä, johon viimeiset antikomplementtiaktiivisuuden tähteet adsorboidaan, jonka jälkeen adsorptioaine erotetaan ja näin saatu stabiloitu immu-noglobuliinifraktio käsitellään tunnettuja menetelmiä käyttäen varastoitavaksi, laskimoon injisoitavaksi käyttökelpoiseksi immunoglobuliinivalmisteeksi.

Lähtöaineena käytetään keksinnön menetelmässä immunoglobuliinia, joka oli valmistettu tunnetuilla fraktiointimenetelmä 1lä 8 73597 humaaniplasmasta tai -istukasta, esimerkiksi etanolitruktioin-timenetelmällä (Cohn et ai.)/ suolasaostuksella (Strauss et ai.), polyetyleenisaostuksella (Poison et ai.) tai seostamalla akridiinijohdoksella kuten Rivanol^-'': 11a (Horejsi et ai.) tai kromatografisella menetelmällä. Käyttökelpoista istukka-immunoglobuliinia raaka-aineeksi saadaan esimerkiksi H.L. Taylor et ai., J . Amer. Chem. Soc . 7J3, 1356 (1956) mukaan isotonisesta istukan vesiuutteesta fraktloivasti saostamalla 95 % etanolilla.

Lähtöaineena voidaan käyttää normaalista tai hyperimmuunista humaaniplasmasta tai vastaavasta istukasta valmistettua immuno-globuliinia.

Tartuntatautien hoitoon ja ennaltaehkäisyyn tarvitaan spesifisiä vasta-aineita sisältäviä immunoglobuliineja.

Näillä indikaatioilla käytetään immunoglobuliineja, jotka valmistetaan sellaisesta plasmasta tai istukasta, joka sisältää vasta-aineita tiettyjä virus- ja bakteeriperäisiä tartuntatauteja vastaan, esimerkiksi virus-vastaaineita maksatulehdusta, tuhkarokkoa, vihurirokkoa, sikotautia ja vesikauhua vastaan tai bakteerivasta-aineita jäykkäkouristusta, kurkkumätää, hinkuyskää, stafylokokkeja, Escherichia coli'a, Pseudomonas'ia ym. vastaan. Morbus haemolyticus neonatarum'ia vastaan käytetään sellaisen plasman tai istukan immunoglobuliineja, joissa on anti-D(Rho) vasta-aineita.

Lähtöaineena käytettyä natiivista immunoglobuliinia käytetään liuoksena, jonka valkuaispitoisuus on 20-40 mg/1 ja sen happamuusaste pH 4,0-5,5. Esimerkiksi Cohn'in fraktio II ja III, joka sisältää saostettuna plasman tai istukan immunoglobuliineja, tai liuotettu lyofilisaatti tai jopa etanolia sisältävä immunoglobuliiniliuos saatetaan vastaavasti laimentamalla ja happoa lisäämällä säätää pH 4,0—5,0 happamuuteen. Tämä IgG-monomeerejä, IgG-dimeerejä, IgG-trimeerejä ja IgG-polymeerejä sisältävä liuos fraktioidaan (kromatografoidaan) ioninvaihta-jien avulla.

9 73597

Ioninvaihtajana on kationinvaihtaja edullisin. Suositeltavia ovat erityisesti karboksimetyyJ iselluloosat (CMC).

Ioninvaihtajat tasapainotetaan ensiksi 0,0 1.-0,04 molaarisessa puskuriliuoksessa pH 4,0-5,0. Näissä olosuhteissa sitoutuu kaikki immunoglobuliini ioninvaihtajaan.

Ioninvaihtajan tasapainottamiseen ja IyG-monomeerien eluoin-tiin käytetty puskuriliuos voi olla mikä tahansa biologisesti sovelias puskuri kuten esimerkiksi asetaattl-, fosfaatti-, sitraatti- tai aminohappopuskuri. IgG-monorneerit eluoidaan 0,02-0,2 mol aari solia puskurilla pH 4,0-5,5, joka sisältää 0,05-0,15 moolia keittosuolaa.

IgG-aggregaatit, niin polymeerit kuin myös trimeerit ja di-meerit jäävät ioninvaihtajaan sitoutuneiksi, ne voidaan myöhemmin liuottaa siitä korkeamo1 narise 1 la puskurilla. Monomee-risen IgG-jakeen antikomplementtiaktiivisuus on alhainen, nimittäin 60-80 mg/ml^CH^ lähtöaineeseen verrattuna (0,3-1,0 mg/ml/2CH^^) . IgG-monomeorili iios väkevöidään, se n pH säädetään 4,1-4,6 ja inkuboidaan 15-60 min ajaksi 30-45°C. Inku-bointia ei tarvitse suorittaa, jos jo lähtömateriaalin anti-komplementti akti ivisuus on suhteellisen alhainen.

Immunoglobuliin.il iuos dialysoidaan tämän jälkeen pH 5,8-6,1 puskuriliuosta vastaan, esimerkiksi 0,005-0,015 nolaarista fosfaattipuskuria vastaan. Voidaan myös käyttää sitraatti-, ftalaatti- ja aminohappopuskuria. Dialysoimal1 a puhdistettuun IgG-1 luokseen lisätään stabiili, suuden lisäämiseksi, polyg.lykolia, sokeria ja tarvittaessa polyolia. Polyglyko]ina käytetään edullisesti 0,05-0,3 % (paino/tilavuus) polyetyleeniglyko-liliuosta (PEG 1000-6000) tai polypropy1 eon 1g 1ykolia, sokerina 3-7 (paino/ti lavuus) sakkaroosia, laktoosia, maltoosia tai mannoosia, sakkaroosia pidetään yleensä soveliaimpana, poly-olina käytetään 0-7 % (paino/t ilavuus) sorbitolia tai manni-tolia. Saatu liuos säädetään pH 6,4-6,8.

10 7 3 5 9 7

Antikomplementtiaktiivisuuden poistamiseksi on kolmas toimenpide välttämätön. Sitä varten lisätään neutraloituun IgG-liuokseen 5-20 % (paino/paino) alumiinihydroksidigeeliä. Suspensiota sekoitetaan huoneen lämmössä 20-120 min tai yli yön 4°C:ssa, jonka jälkeen sentrifugoidaan n. 10000 x g ja suodatetaan steriiliksi. Suodos siirretään lyofilisointi-astioihin, esimerkiksi ampulleihin tai seerumipulloihin ja kylmäkuivataan.

Kun näin saatu lyofilisaatti liuotetaan tislattuun veteen tai 0. 05.molaariseen keittosuolaliuokseen, on saadulla immuno-globuliinilla seuraavat ominaisuudet: 1. Siinä ei enää ole mitattavaa antikomplementtiaktiivisuutta.

2. Geelikromat.ografiällä määritettynä saadaan monomeerisen immunoglobuliinin (IgG) osuudeksi 85-95 %. Sen osia ei esiinny.

3. Immunoelektroforeesissa anti-humaaniantiseerumia vastaan näkyy yksi ainoa IgG-presipitaatioviiva. Hajoamistuotteita ei ole osoitettavissa.

4. Normaaliseerumin IgG-alaluokkien suhteellinen jakauma säilyy muuttumattomana.

5. Proteiinikonsentraatioon verrattuna säilyy vasta-aine-spektrin aktiivisuus muuttumattomana.

Verrattaessa kaupallisen laskimoon annettavan immunoglobulii-nivalmisteen antikomplementtiaktiivisuutta (ilmaistu mg/ml/ 2CHj-q) keksinnön mukaisesti saatuun luonnolliseen, muuttumattomaan ja hajottamattomaan, stabiloituun immunoglobuliiniin, todetaan: Antikomplementtiaktiivisuus ilmoitetaan mg:na proteiinia/ml, joka vaaditaan kahden komplementtiyksikön estämiseen. Se määritetään herkistettyjen lampaan punasolujen 50 %:na hemolyysinä (mg/ml/2CH^0) M.M. Mayer'in standardimenetelmällä, Experimental Immunochemistry, 2nd Ed. s. 133-230, Charles C. Thomas, Springfield, sekä US Department of Health, Education and Wellfare Public Health Monograph No. 74, "Standardized diagnostic complement fixation method and adaptation to micro test". Katso taulukko s. 11.

tl 11 73597

Keksinnön mukaisesti tuotettua immunog lolnili irvi valmistetta annettiin 2,5-10 g annoksina 48 potilaulLe Laskimonsisäisesti. Valmisteiden siedettävyys oli hyvä, sillä mitään odottamattomia sivuvaikutuksia ei voitu havaita. Tähän esikokee-seen ottivat osaa pelkästään sellaiset potilaat, joilla ei ollut immunoglobuliinin puutetta. - Näiden kokemusten perusteella kliininen kokeilu on osoitettu oikeutetuksi sellaisille potilaille, joilla on joko synnynnäinen tai saatu immunoglobuliinin puutos, ja joilla sen johdosta kaikkien nykyisten valmisteiden käyttöön elintärkeässä immunogLobuliinihoidossa liittyy tietty riski.

Tau lukko

IgG-valmiste Antikom.pl ementti- akt i ivisuus (mg/nl/2C!Ir-0) 16 % standardi-IgG 0,5-1,5 (lihakseen annettuna)

Adsorption avulla puhdistettu IgG 3-3 )

Beta-propiolaktonilla käsitelty IgG 40-50

Hapoilla käsitelty TgG 60-80

Plasmiinilla pilkottu tai osittain hajoitettu IgG 20-50

Pepsiinillä pilkottu tai osittain ei mitattavaa hajoitettu IgG aktiivisuutta

Keksinnön mukai sesti valmistettu IgG (esimerkki ]) Lähtöaine 0,7 CMC monomeerijao 60-88

IgG-valmiste stabiloinnin jälkeen 150-200

Lopputuote (esimerkki 1) ei mitattavaa akti ivisuutta

Keksinnön mukaisen valmisteen ja menetelmän suoma etu valmistustapaan verrattuna on ilmeinen.

___ - T~ 12 73597

Esimerkki 1 6 g kylmäkuivattua immunoglobuliinia (IgG), joka on valmistettu tunnetun COHN:in menetelmän n:o 9 mukaisesti normaalista humaaniplasmasta, liuotetaan 90 ml:aan tislattua vettä. Liuos suodatetaan kirkkaaksi ja sen pH säädetään 10 % etikkahapol-la pH 4,6 ja siirretään 1 litralla 0,02 molaarista asetaatti-puskuria (pH 4,6) tasapainotettuun karboksimetyyliselluloosa-kolonniin (CMC-kolonni, 7 cm pitkä, 6 cm halkaisija). Ionin-vaihtaja adsorboi IgG:n ja kolonni pestään 500 ml :11a edellä mainittua asetaattipuskuria. Monomeerinen IgG eluoidaan sitten 1,5 1:11a 0,1 molaarista asetaattipuskuria pH 4,6, joka sisältää 8,18 g NaCl/ 1, jonka jälkeen eluaatti konsentroidaan ultrasuodatuksen avulia 50 ml:ksi. Saatu liuos, jonka proteiinipitoisuus on 70-80 mg/ml, inkuboidaan pH 4,l:ssa 30 min 37°C vesihauteella. Dialysoitaessa 1 1 fosfaattipuskuria (0,015 M, pH 6,05) vastaan asettuu liuoksen happamuus vähitellen pH 5,8:ksi. Liuoksen stabiloimiseksi lisätään tuotteeseen 0,3 % (paino/tilavuus) PEG 4000 ja 7 % (paino/tilavuus) sakkaroosia. Happamuus säädetään 0,1 N Na0H:lla pH 6,4:ksi. Liuokseen lisätään 10 % (paino/paino) alumiin1hydroksidigeeliä ja sekoitetaan 30 min huoneen lämmössä. Suspensio sentrifugoi-daan 20 min 10000 x g voimalla ja saatu yläosa steriilLsuoda-tetaan. Valmiste jaetaan kylmäkuivausastioihin ja kylmäkuiva-taan. Astiaan (ampulli, seerumipullo jne.) täytetään niin paljon IgG-liuosta, että kun kylmäkuivattu tuote liuotetaan kahdesti tislattuun veteen tai 0,05 M keittosuolaliuokseen, saadaan 5 % proteiini-(IgG)-liuos, joka on sopiva laskimoon injisoitavaksi tai infuusioksi.

Esimerkki 2 6 g kylmäkuivattua IgG:tä liuotetaan, suodatetaan ja puhdistetaan esimerkissä 1 kuvatun menetelmän mukaisesti. Mono-meerijae väkevöidään ja dialysoidaan ilman happokäsittelyä 0,015 molaarista fosfaattipuskuria pH 6,05 vastaan, kunnes liuoksen pH on 5,8. Liuokseen lisätään 0,5 % PEG 4000 ja 3,5 % maltoosia ja mannitolia kumpaakin, jonka jälkeen säädetään pH 6,4 ja tämän jälkeen lisätään 10 % (paino/paino) alumiini-hydroksidigeeliä. Suspensiota sekoitetaan 15 h 4°C, sentrifu- u 73597 goidaan, suodatetaan ja käsi toilään edelleen kuten esimerkissä 1.

Esimerkki 3 Lähtöaineena käytetään COIINrin menetelmällä n:o 9 saatua saostumaa, joka sisältäni viedä etanolia. Sakka liuotetaan jääkylmään veteen ja käsitellään esimerkin 1. mukaisesti edelleen siten, että erotus CMC-kolonnissa suoritetaan 4°C:ssa.

Muut toimenpiteet suoritetaan kuten esimerkissä ]. Sakkaroosin sijasta lisätään vastaava määrä laktoosia.

Lopputuotteella en samat edul1 isot ominaisuudet kuin esimerkin 1 lopputuotteella.

Esimerkki 4 Lähtöaineena käytetään kylmäkuivattua IgG:tä, joka on valmistettu COHN:in menetelmällä n:o 9 sellaisesta hyperimmuunista humaaniplasmasta, jolla on korkea spesifinen anti-tetanus-tiitteri. Lähtöaine sisältää 10 ?, proteiinia, sen tiitteri on 280 T.E. Te/ml. Kylmäkuivattu tuote .1 luotetaan veteen siten, että liuos sisältää 30 ing proteiinia/ml , suoritetaan esimerkin i mukainen kolmivaiheinen erotus, puhdistus ja stabilointi. Tuotteessa ei ole ant i. kömpi emon 11 i ak t i ivi suutta , siinä on 5 %:ssa proteiini liuoksessa 150 I.E. tetanus/ml.

Es imerkki 3 Lähtöaineeksi o e e tuai. spesi1istä anti-D-vasta-ainetta (150 mcg/ml 10 % protei1ni11uoksessa) sisältävää IgG:t ä, jota käsitellään esimerkin 1 mukaisesti. Lopputuote sisältää 5 %:ssa IgG-liuoksessa 85 mcg/ml spesifistä anti-D-vasta-ainctta eikä sillä ole antikomplementtiakti ivisuutta.

Esimerkit 6- i_2

Kuten esimerkeissä 4 ja 5 on kuvattu, saadaan laskimonsisäisesti annettavia opt._i.maa li sest i s i e det tavi ä va Imi st t i ta , jotka sisältävät a emg.inn lue te ituja spesifi s:i ä aneita: 14 73597 6. anti-kurkkumätä-vasta-aine 7. anti-maksatulehdus-vasta-aine 8. anti-vihurirokko-vasta-aine 9. anti-sikotauti-vasta-aine 10. anti-vesikauhu-vasta-aine 11. anti-tuhkarokko-vasta-aine 12. anti-B.hinkuyskä-vasta-aine

Proteiinipitoisuutta kohden ilmoitettuna ovat nämä tuotteet säilyttäneet korkean spesifisen vasta-aineaktiivisuuden.

Esimerkit 13-22

Isotonisista istukan vesiuutteista 95 % etanolilla saostamal-la saadut immunoglobuliinifraktiot säädetään proteiinipitoisuuteen 30 mg/ml ja pH 5,0, jonka jälkeen suoritetaan esimerkin 1 mukainen erotus, puhdistaminen ja stabilointi. Tuotteilla ei ole antikomplementtiaktiivisuutta ja näin ollen ne ovat laskimonsisäisesti annettuna optimaalisesti siedettäviä ja ovat säilyttäneet lähtöaineena esiintyvän vasta-aine-spektrin.

13. IgG, jolla on epäspesif i ner. vista-ainespektri 14. IgG, jolla on anti-vihurirokko-vasta-ainetta 15. IgG, jolla on anti-jäykkäkouristus-vasta-ainetta 16. IgG, jolla on anti-D-vasta-ainetta 17. IgG, jolla on anti-kurkkumätä-vasta-ainetta 18. IgG, jolla on anti-maksatulehdus-vasta-ainetta 19. IgG, jolla on anti-sikotauti-vasta-ainetta 20. IgG, jolla on anti-vesikauhu-vasta-ainetta 21. IgG, jolla on anti-tuhkarokko-vasta-ainetta 22. IgG, jolla on anti-B.hinkuyskä-vasta-ainetta.

Il

Claims (3)

15 7 3597

1. Menetelmä laskimonsisäisesti annettavan immunoglobu-liinin valmistamiseksi ihmiselimistön immuunivasteen vahvistamiseksi, tunnettu siitä, että tunnetuilla menetelmillä ihmisen plasmasta tai istukasta saatu antikomplementaa-rinen immunoglobuliini ensin sidotaan ioninvaihtajaan, josta selektiivisesti eluoidaan monomeerinen immunoglobuliini 0,02-0,2 molaarisella puskuriliuoksella pH:ssa 4,0-5,5, konsentroidaan tämä, poistetaan oleellisesti antikomplementtiak- tiivisuus käsittelemällä heikolla hapolla pH:ssa 4,1-4,6 ja o o mahdollisesti inkuboidaan 30 -45 C:ssa 1/4-1 tunti, sitten diasuodatetaan laimeaa puskuria, pH 5,8-6,1, vastaan ja/ tai stabiloidaan lisäämällä polyetyleeniglykolia tai polypro-pyleeniglykolia ja sakkaroosia, laktoosia, maltoosia tai man-noosia ja/tai sorbitolia tai mannitolia, polyalkyleeniglyko-lin ja sokerin lisäyksen ollessa välttämätön, ja sitten anti-komplementtiaktiivisuuden viimeiset tähteet poistetaan alu-miinihydroksidiadsorption avulla.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että käytetään normaalista tai hyperimmuunista humaaniplasmasta tai vastaavanlaisesta istukasta saatua immu-noglobuliinia.

3. Patenttivaatumuksen 2 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että käytetään sellaista immunoglobuliinia, joka sisältää vasta-aineita määrättyjä viraalisia tai bakteeriperäisiä patogeenisiä aineita vastaan tai anti-D-vasta-aineita.