DK151271B - Fremgangsmaade til fremstilling af en glucoseisomerase - Google Patents

Description

151271

O

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af en glucoseisomerase, hvor man under aerobe betingelser dyrker en stamme af slægten Bacillus i et medium indeholdende egnede næringsstoffer, hvor-5 på enzymet udvindes fra dyrkningsmediet.

Søde sirupper anvendes i udstrakt grad i f.eks. bageri-, konfiture- og drikkevareindustrien. Disse sirupper består i almindelighed af sucrose-(rørsukker) eller dextrose-holdige produkter fremstillet ved stivelseshydro-10 lyse som den principielle sødende bestanddel. Når der kræves en sirup, som er sødere end den, der fås fra sucrose, anvendes der en invertsukkersirup. Denne fremstilles ved syrehydrolyse af sucrose til dannelse af en blanding af ca. 50% glucose (dextrose) og ca. 50% fructose (lævulose).

15 Medens glucose er noget mindre sød end sucrose, er fruc-tosen betydeligt sødere end sucrose, således at den totale sødhedsgrad forøges i sammenligning med sucrose.

Det er velkendt, at dextrose under alkaliske betingelser kan omdannes til fructose. Denne omdannelse har 20 stor potentiel værdi ved fremstillingen af søde sirupper.

Den alkaliske omdannelse har imidlertid ikke været nogen kommerciel succes, eftersom der ved den alkaliske reaktion dannes et uønsket højt askeindhold i produktsiruppen, og fordi denne aske er uøkonomisk at fjerne. Sirup-25 pen er ikke acceptabel, medmindre den nævnte aske fjernes. Alkalisk isomerisering og de dertil hørende problemer er diskuteret nærmere i USA-patentskrift nr.

3.383.245. I den kendte teknik er man siden gået over til en enzymatisk omdannelse af glucose til fructose. Det har 30 vist sig, at mange arter af Bacillus-mikroorganismer kan producere en glucoseisomerase, jfr. f.eks. Biol. Zh. Arm.

32(9), 919-922 (1979). Andre Bacillus-arter, der kan producere glucoseisomerase, er beskrevet i dansk patentansøgning nr. 124/74, som svarer til DK-fremlæggelsesskrift 35 nr. 145.503, og i DE offentliggørelsesskrift nr.

O

2 151271 2.164.342. Anvendelsen af Bacillus stearothermophilus til produktion af glucoseisomerase er beskrevet i GB--patentskrift nr. 1.457.177 og i US-patentskrift nr.

3.826.714, og anvendelsen af Bacillus coagulans til pro-5 duktion af glucoseisomerase er beskrevet i US-patentskrift nr. 3.979.261. Intetsteds i den kendte teknik foreslås imidlertid anvendelsen af stammen Bacillus li-cheniformis ATCC 31604 til dannelse af en glucoseisomerase, der har vist sig at have de ønskelige egenskaber, 10 at den er stabil under såvel pH- som temperaturbetingelser inden for et bredt område.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen, der er af den i det foranstående angivne art, er således ejendommelig ved, at man som Bacillus-stamme anvender Bacillus li-15 cheniformis ATCC 31604.

Den organisme, der anvendes ifølge opfindelsen, er blevet isoleret fra en jordprøve og er blevet klassificeret som Bacillus licheniformis i overensstemmelse med velkendte klassificeringsmetoder. Den bestemte stam-20 me af Bacillus licheniformis, der anvendes ved fremstillingen af den nye glucoseisomerase, er blevet deponeret i American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, og har fået identifikations-/deponeringsnummeret ATCC 31604. Den pågældende deponerede kultur er tilgæn-25 gelig for offentligheden uden restriktioner.

Organismen Bacillus licheniformis ATCC 31604 vedligeholdes på agarskråkulturer og kan vokse i et medium indeholdende egnede næringsstoffer. Mediet indeholder fortrinsvis xylose, majsstøbevæske og en nitrogenkilde.

30 Fortrinsvis indeholder mediet også egnede salte. Illustrerende eksempler på nitrogenkilder er gærekstrakt, pepton, kødekstrakt og aminosyrer. Eksempler på uorganiske salte er ammoniumsulfat, dikaliumphosphat, magnesiumsulfat og mangansulfat. Den xylose, der anvendes i 35 vækstmediet, kan være på en renset form, eller den kan

O

3 151271 være i form af et råt, xyloseholdigt materiale.

Organismen dyrkes fortrinsvis under submerse fermenteringsbetingelser i fra ca. 18 til ca. 20 timer ved en temperatur fra ca. 50 til ca. 60°C. Ved temperaturer 5 under ca. 50°C bliver enzymudbyttet ret lavt, og ved temperaturer over ca. 60°C er væksten af organismen ringe med tilhørende lav enzymaktivitet. Den foretrukne dyrkningstemperatur er fra ca. 50 til ca. 55°C. Der anvendes fortrinsvis atmosfæretrykbetingelser, men tryk over og 10 under atmosfæretryk kan anvendes, såfremt det ønskes, u-den nogen særlige fordele eller ulemper. Dyrkningsmediets pH-værdi bør holdes i området fra ca. 6 til ca. 8,2.

Ved pH-værdier under ca. 6 og over ca. 8,2 dannes der ikke noget enzym. Den foretrukne pH-værdi ligger fra ca.

15 6,5 til ca. 7,5.

Glucoseisomerasen dannes i det indre af de bakterieceller, som dyrkes under enzymfremstillingen. Cellerne kan skilles fra gæringsvæsken på velkendt måde, f.eks. ved filtrering eller centrifugering, og anvendes direkte 20 som en kilde til glucoseisomerase. Sådanne celler kan ag-glomereres, og enzymaktiviteten deri kan immobiliseres på velkendt måde, f.eks. ved den behandling med glutaralde-hyd, der er beskrevet i USA-patentskrift nr. 3.779.869. Alternativt kan cellerne sprænges enten mekanisk eller 25 ved autolyse, og det opløselige enzym kan skilles fra celleresterne. Det opløselige enzym kan anvendes direkte, eller det kan immobiliseres på en egnet bærer under anvendelse af velkendte metoder.

Opfindelsen illustreres nærmere i de følgende ek-30 sempler.

Eksempel 1.

En kultur af Bacillus licheniformis ATCC 31604 ud-stryges over et fast medium af en vandig blanding inde-35 holdende 3,0% agar-agar, 8,0% majsstøbevaske, 0,4% xylo-

O

4 151271 se, 0,5% gærekstrakt, 0,5% (NH4)2S04, 0,1% K2HP04, 0,02%

MgSO^, 7 H20 og 0,005% MnS04,H20, og indstilles på en pH-værdi på 7,0 med natriumhydroxid. Alle de ovennævnte procenter er på vægt/rumfangs-basis. Det inokulerede me-5 dium inkuberes ved 55-60°C i 20 timer. De resulterende celler afskrabes derpå fra mediets overflade og suspenderes i 0,9%'s vandig natriumchloridopløsning til dannelse af en forholdsvis koncentreret cellesuspension.

1 ml af en vandig opløsning indeholdende 8,0% glu-Ί0 cose, 0,5% MgS04,7H20, 0,05% CoC12,6 H20 og 0,0001 M tris-(hydroxymethyl)-aminomethan anbringes i en egent beholder. De angivne procenter er på vægt/rumfangsbasis.

Der tilsættes yderligere 0,2 ml chloroform. Blandingens pH-værdi indstilles på 6,5 med saltsyre. Til blandingen 15 sættes der 1 ml af den ovennævnte suspension, og den fremkomne blanding inkuberes ved 70°C i 4 timer. 1 dråbe af produktblandingen anbringes på Whatman No. 1 chroma -tografipapir. 1 dråbe 0,5 vægt-%'s vandig fructoseopløs-ning anbringes også på papiret. Efter at de to pletter 20 er tørret, bringes hver plet i kontakt med en farveudvik-lingsopløsning bestående af en blanding af 250 mg naph-thalendiol, 250 ml ethanol og 20 ml koncentreret saltsyre. De to behandlede pletter tørres derpå i 30 minutter ved 25°G og opvarmes dernæst til 60°C i op til 20 minut-25 ter. Der fremkommer en brunrød farve af samme karakter i hver plet. Dette indikerer, at glucoseisomerase-enzym-aktiviteten i cellesuspensionen har omdannet noget af den ovennævnte glucoseopløsning til en fructoseopløs-ning indeholdende mindst 0,5 vægt-% fructose. Forsøget 30 viser også dannelsen af en glucoseisomerase, der er aktiv ved den forhøjede temperatur på 70°C.

Eksempel 2.

Portioner af en kultur af Bacillus licheniformis 35 ATCC 31604 overføres hver til ni 250 ml afskærmede kol- 5

O

151271 ber, der hver indeholder 100 ml af en vandig blanding indeholdende 1% xylose, 8,0% majsstøbevæske, 0,5% gærekstrakt, 0,5% (NH4)2S04, 0,1% K2HP04, 0,02% MgS04,7 H20 og 0,005% MnS04,4 H20. Procentværdierne er på vægt/rumfangs-5 -basis. pH-værdien er 6,8-7,0 efter sterilisering. Kulturerne tilsættes i en mængde på 2 rumfangsprocent. Kolberne inkuberes derpå ved 50°C i 20 timer på et roterende rystebord, der roterer med 300 o/min. Indholdene af de ni kolber slås derefter sammen til dannelse af et ensartet 10 inokulum.

Portioner af det som ovenfor beskrevet fremstillede inokulum sættes til to omrystede og beluftede gærings-beholdere, der hver indeholder 10 liter af det ovenfor beskrevne vandige medium. Det anvendte inokulum tilsættes 15 i en mængde på 2,25 rumfangsprocent til hver gæringsbeholder .

Omrystningsanordningen roteres med 500 ο/min., og der ledes luft gennem mediet med en hastighed på 0,75 rumfang luft pr. rumfang medium pr. minut. Der tilsættes 20 i det fornødne omfang et antiskumningsmiddel til nedsæt telse af skumdannelsen til et minimum. pH-værdien holdes på 7,0 ved tilsætning af 50 vægtprocents vandig xylose-opløsning, så snart pH-værdien begynder at stige til over 7,0. Fermenteringen fortsættes ved 50°C i 20 timer. Ind-25 holdene af begge gæringsbeholderne kombineres derefter.

En portion på 6,1 liter af den kombinerede gæringsvæske centrifugeres derpå til fraskillelse af cellerne. Cellerne opslæmmes derpå i afioniseret vand til et totalrumfang på 700 ml.

30 Til en portion på 230 ml af den nævnte opslæmning sættes der under omrøring 5,8 ml af en 10 vægtprocents vandig glutaraldehydopløsning. Den fremkomne blanding får dernæst lov at henstå uden blanding i 1 time ved omgivelsernes temperatur (25°C). Opslæmningens viskositet synes 35 at stige efter henstand. Den resulterende opslæmning for-

O

6 151271 tyndes derpå med 460 ml afioniseret vand under omrøring.

Under fortsat omrøring tilsættes der langsomt 30 ml af en 5%'s (vægt/rumfangs-basis) vandig polyethylenimin-op-løsning. Under denne tilsætning dannes der en meget 5 tung, fnugagtig masse. Den resulterende cellemasse opsamles ved filtrering, og filterkagen vaskes med ca. 200 ml afioniseret vand. Den vaskede kage tørres natten over ved 60°C. Der fås i alt 22,2 g tørret materiale. Det resulterende materiale formales derefter og sigtes til fremstil-10 ling af fraktioner, der (1) passerer gennem en 20 mesh sigte, men tilbageholdes på en 30 mesh sigte, og som (2) passerer gennem en 30 mesh sigte, men tilbageholdes på en 40 mesh sigte. De angivne sigtestørrelser hidrører fra US Screen Series. En blanding af 5 g af den ovennævnte 15 fraktion (1) og 3,6 g af den ovennævnte fraktion (2) anbringes i en egnet beholder og hydratiseres i 4 timer med 100 ml af en 30 vægtprocents vandig blanding af 95 DE majssirup indeholdende 4,1 mmol MgS0^,7 H20 og 4,1 mmol NaHSOgf der er indstillet på en pH-værdi på 8,5. Den 20 hydratiserede opslæmning overføres derpå til en 1,5 x 100 cm kolonne med glaskappe og med et 5 ml lag af aluminiumoxid som basisunderstøtning for enzympartiklerne. Kolonnen fyldes derefter med den ovennævnte majssirupsub-stratblanding, og indholdet opvarmes til 65°C ved hjælp 25 af et cirkulerende vandbad. Afgangsrøret fra kolonnen er forbundet til en polystaltisk pumpe til regulering af substratstrømmen gennem enzymlaget. Kolonnens top er forbundet til et substratreservoir. Substratstrømmen gennem kolonnen indstilles således, at der opretholdes et kon-30 . stant fructoseindhold på 42 vægtprocent i den væske, der forlader kolonnen. Kolonneindholdet holdes ved en pH-vær-di på 8,0. Det tager ca. 29 dages kontinuerlig drift, inden enzympartiklernes aktivitet er faldet til 50% af den oprindelige aktivitet, og 37 dage, inden partiklernes ak-35 tivitet er faldet til 25% af den oprindelige aktivitet.

7 151271 o

Dette viser den lange nyttige levetid for Bacillus liche-niformis-glucoseisomerasen ved 65°C.

Eksempel 3.

5 Til 1 ml portioner opslæmmede celler af Bacillus licheniformis ATCC 31604, der er fremstillet som beskrevet i eksempel 2, anbringes hver for sig i 16 x 125 mm skruelågsglas. pH-værdien af indholdet i de forskellige glas reguleres individuelt til specifikke værdier mel-10 lem 6,5 og 8,5. Fem af glassene holdes ved omgivelsernes stuetemperatur (ca. 25°C) i 1 time, og de øvrige fem glas holdes ved 70°C i 1 time. I løbet af dette tidsrum er prøverne ikke i kontakt med en glucoseopløsning eller med nogen stabiliserende metalioner.

15 Indholdet af hvert af glassene undersøges derpå for glucoseisomerase-aktivitet i overensstemmelse med den' følgende procedure. Til hvert glas sættes der 0,5 ml af en vandig opløsning indeholdende 1 M glucose, 0,1 M Hepes puffer (pH 7,0), 0,02 M MgS0^,7 ^0 og 5 mmol NaHSOg.

20 Glassene inkuberes dernæst ved 70°C i 30 minutter. Reaktionen bringes til afslutning derefter ved tilsætning af 10 ml 1 M HC104· Glassene underkastes derefter centrifugering. En portion på 0,05 ml af den ovenstående væske fra hvert glas blandes derpå med 1 ml 0,5 vægtprocents 25 vandigt cystein-hydrochlorid og 4,5 ml 75 vægtprocents vandig ^SO^. Blandingen inkuberes i 30 minutter ved 35°C og får derpå lov at henstå i 15 minutter ved omgivelsernes stuetemperatur. Absorbansen af den fremkomne, gulfarvede opløsning ved en bølgelængde på 412 nm måles deref-30 ter og sammenlignes med tilsvarende absorbansværdier for opløsninger indeholdende kendte mængder fructose til bestemmelse af prøvens fructoseindhold. Glucoseisomeraseak-tiviteten udtrykkes i enheder, idet enhederne svarer til det antal mikromol fructose, der dannes pr. minut under 35 bestemmelsesbetingelserne. Den specifikke prøve, der ef- 151271

O

8 ter bestemmelse som ovenfor angivet har den højeste glu-coseisomeraseaktivitet, udvælges derpå arbitrært som den udgangsprøve, med hvilken de øvrige prøver sammenlignes. Resultaterne fremgår af den følgende tabel.

5

Tabel

Relativ aktivitet (hele celler) pH-værdi Stuetemperatur Opvarmet til 7Q°C

6.5 73,9 70,1 10 7,0 87,0 83,6 7.5 97,0 88,9 8,0 92,6 93,5 8.5 100,0 97,5 15 Det fremgår af de ovenstående data, at glucoseiso- merasen, der produceres af Bacillus licheniformis ATCC 31604, generelt ikke påvirkes i ugunstig retning af pH--værdier i området fra 6,5 til 8,5 og ej heller af forhøjet temperatur (70°C) i fraværelse af stabiliserende 20 glucose eller metalioner.

Claims (1)

1. O 151271 Patentkrav, Fremgangsmåde til fremstilling af en glucoseiso-merase, hvor man under aerobe betingelser dyrker en stam-5 me af slægten Bacillus i et medium indeholdende egnede næringsstoffer, hvorpå enzymet udvindes fra dyrkningsmediet, kendetegnet ved, at man som Bacillus--stamme anvender Bacillus licheniformis ATCC 31604.