DK149942B - Fremgangsmaade til fremstilling af en pasteurellose-vaccine - Google Patents

Description

149942 i

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af en pasteurellose-vaccine, der kan anvendes til forebyggelse og bekæmpelse af pasteurellose hos får, kvæg og andre dyr.

Pasteurellose er en almindelig åndedrætssygdom hos får og 05 kvæg, der ofte kan føre til dødsfald, især i tilfælde af unge dyr, og forebyggelsen og bekæmpelsen af denne sygdom er derfor af stor betydning for landmænd med opdræt af får og kvæg. Hos får optræder sygdommen som enten en pneumonia eller en septicæmisk tilstand i afhængighed af det inficerede dyrs alder og stammen af den infice-rede organisme, hvorimod sygdommen hos kvæg primært mødes som en pneumonia i områder med tempereret klima. Pasteurel la haemolytica er blevet identificeret som hovedirsagsmidlet til sygdommen hos får, og to af serotyperne af denne organisme sammen med stammer af en associeret organisme, Pasteurella multocida synes at være ansvarlig 15 for den pneumoniske sygdom hos kvæg. To biotyper af Pasteurella haemolytica er blevet identificeret, hvoraf A-biotypen i almindelighed er associeret med septicæmi hos unge lam og pneumonia i ældre får, mens T-biotypen i almindelighed er associeret med septicæmi hos voksne får, og inden for disse to biotyper er tolv forskellige sero-20 typer blevet identificeret. Kun A-biotyperne og ikke T-biotyperne af P. haemolytica synes at være involveret i pneumonia hos kvæg.

Vacciner er idag tilgængelige til brug ved forebyggelse og bekæmpelse af pasteurellose hos får og kvæg, hvoraf fårevaccinerne omfatter formal in-dræbte hele organismer af en række serotyper af 25 P. haemolytica. Disse vacciner synes imidlertid ikke at tilvejebringe tilfredsstillende beskyttelse mod pasteurellose.

I GB patentskrift nr. 1.441.098 forslås det at anvende en vaccine baseret på et materiale opnået ved ekstraktion af indkapslede celler af P. multocida eller P. haemolytica med det formål at udfælde 30 en endotoxin komponent og dyrkning af supernatanten. Patentskriftet indeholder ingen specifik beskrivelse angående P. haemolytica.

Det har nu vist sig, at effektive pasteurellose-vacciner for får og muligvis kvæg kan fremstilles, såfremt opmærksomheden rettes mod fremgangsmåden til formulering af forskellige serotyper af P.

35 haemolytica antigent materiale, som inkorporeres i vaccinerne.

De forskellige serotyper af P. haemolytica, der i det følgende omtales som f.eks. A1- og A2-serotyperne, kan bestemmes ved hjælp 149942 2 af fremgangsmåder, der tidligere har været beskrevet og forstås inden for denne teknik, f.eks. ved hjælp af de serotypebestemmel-ses-metoder, som er beskrevet af Biberstein et al (Biberstein, E.L.,

Gills, M. & Knight, H. (1960), Cornell Veterinarian 50, side 283).

05 I henhold til den foreliggende opfindelse tilvejebringes der en fremgangsmåde til fremstilling af en pasteurellose-vaccine, især til får, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man fremstiller antigent materiale ud fra organismer af A1- og A2-serotyperne af P. haemolytica og formulerer det antigene materiale til en vaccine, hvori TO det antigene materiale omfatter kapselekstrakt af A1-serotypen og varmedræbte hele organismer af A2-serotypen.

Kapselekstrakter af P. haemolytica udviser i almindelighed fordelagtige antigene egenskaber, som er særligt ønskelige til vaccineformulering, i forhold til dræbte hele organismer, såsom formalindræb-15 te hele organismer. Det er således særlig overraskende, at varmedræbte hele organismer af A2-serotypen af P. haemolytica tilvejebringer et materiale med signifikant bedre antigene egenskaber end en kapselekstrakt.

Forsøg har vist, at formalindræbte hele organismer af A2-sero-20 typen af P. haemolytica er ineffektive som vaccinekomponent, mens varmedræbte hele organismer af A-2 serotypen er effektive.

Vacciner fremstillet i henhold til opfindelsen kan anvendes inden for landbruget til forebyggelse og bekæmpelse af pasteurellose i almindelighed til imødegåelse af såvel dyretab som utilstrækkelig kød-25 produktion på grund af sygdommen. Især er de omhandlede vacciner egnede til vaccination af får og kvæg. I almindelighed kan vaccinerne indeholde yderligere antigent materiale ud over det af P. haemolytica A1- og A2-serotyperne afledte antigene materiale, og det vil kunne indses, at arten af sådant yderligere antigent materiale kan afhænge 30 af dyrearten og den sygdomsform, hvorpå vaccinen er beregnet.

Ifølge en udførelsesform af fremgangmåden ifølge opfindelsen inkorporeres der antigent materiale afledt af andre Pasteurel I aorgan ismer end A1- og A2-serotyperne af P. Haemolytica i vaccinen. Foruden antigent materiale afledt af A1- og A2-serotyperne af P. haemolytica 35 kan vacciner til får således omfatte antigent materiale afledt af mindst en anden serotype af P. haemolytica og vacciner til kvæg omfatter typisk antigent materiale afledt af stammer af P. multocida. Endvidere 149942 3 kan f.eks. flrevacciner, der er beregnet til specifikt kun at bekæmpe den pneumoniske form af sygdommen hos voksne får, omfatte antigent materiale afledt af kun A-serotyperne af P. haemolytica. Alternativt omfatter flrevacciner, der er beregnet til bekæmpelse af både 05 de septicæmiske og pneumoniske former af sygdommen, typisk antigent materiale afledt af en kombination af A- og T-serotyper.

Fortrinsvis omfatter flrevacciner i henhold til opfindelsen antigent materiale afledt af A6-serotypen af P. haemolytica og i en udførelsesform tilvejebringes en trivalent vaccine omfattende A1-, A2-10 og A6-serotype antigent materiale til anvendelse ved bekæmpelse af pneumonia hos voksne får. Alternativt, eller fortrinsvis, omfatter flrevacciner desuden antigent materiale afledt af A9-serotypen, og specielt også A7-serotypen. Endvidere omfatter fårevacciner til bekæmpelse af både pneumonisk og septicæmisk pasteurellose, foruden 15 yderligere A-serotype antigent materiale, f.eks. A6, fortrinsvis A6 + A9, eller især A6 + A9 + A7 serotype antigent materiale, desuden T-serotype antigent materiale, fortrinsvis en kombination af T3-, T4- og T10-serotype antigent materiale.

Kvægvacciner omfatter typisk antigent materiale afledt af pas-20 sende stammer af P. multocida, som f.eks. type A og D (Carter, G.R. (1955), Am. J. Vet. Res. 18/ side 481) fortrinsvis en kombination af A- og D-typerne af P. multocida.

Foruden det yderligere antigene materiale afledt af arter af Pa-steurellae kan de omhandlede vacciner omfatte antigent materiale af-25 ledt af andre organismer inklusive andre bakterier og desuden virus.

F.eks. kan vaccinen således også omfatte antigent materiale afledt af virus associeret med Pasteurellae-organismer i ætiologien for pasteurellose som f.eks. antigent materiale afledt af parainfluenzavirus, f.eks. parainfluenzavirus type 3 (P13).

30 Det yderligere antigene materiale ud over det af A1- og A2-sero- typerne afledte, som er indeholdt i de omhandlede vacciner, kan antage enhver passende form, idet dog det dog fortrinsvis har høj immunogen og antigen karakter. Det yderligere Pasteurella antigene materiale kan således omfatte dræbte hele organismer af P. haemolytica 35 og/eller P. multocida, fortrinsvis varmedræbte hele organismer. Specielt omfatter det yderligere antigene materiale imidlertid en ekstrakt af P. haemolytica og/eller P. multocida f.eks. en kapselekstrakt.

149942 4

EnflYidero Kan det døg i &srlige Hrørslififtnnfr ?fden fore- liggende opfindelse være ønskeligt at inkludere antigent materiale i form af kapselekstrakt af A2-serotypen af P. Haemolytica i vaccinen sammen med det antigene materiale, som omfatter varmedræbte hele 05 organismer af A2-serotypen. Det antages, at en sådan kombination af kapselekstrakt og varmedræbte hele organismer af P. haemolytica A2-serotype kan give anledning til forbedrede antigene og immunogene egenskaber i forhold til vacciner, der alene indeholder varmedræbte hele A2-organismer, især til brug i vacciner indeholdende 10 antigent materiale afledt af adskillige serotyper, f.eks. i det mindste tre af P. haemolytica og/eiler andre organismer.

Det antigene kapselekstraktmateriale i de omhandlede vacciner omfatter polysaccharid-kapselmateriale og kan fremstilles som en ekstrakt fra hele celler ved hjælp af enhver egnet ekstraktionsmetode 15 såsom de, der kendes af fagmanden inden for vaccinefremstilling og immunologi, f.eks. ekstraktion med saltopløsning. Fortrinsvis omfatter det antigene kapselekstraktmateriale dog protein, og specielt også lipopolysaccharid antigent materiale foruden kapsel-polysaccharid antigent materiale. Det antages, at inkluderingen af disse yderligere 20 protein- og lipopolysaccharid-cellekomponenter i kapselekstrakten giver anledning til forbedrede antigene og immunogene egenskaber i forhold til kapselekstrakter, der i overvejende grad kun indeholder polysaccharidkapselmateriale. Kapselekstrakter, som indeholder disse yderligere komponenter, kan fremstilles ud fra celler ved anvendelse 25 af passende ekstraktionsbehandlinger, såsom anvendelse af thiocyanat- -opløsninger, eller det kvaternære alkylammoniumsalt Cetavlon® eller Cetrimid. En særlig foretrukket ekstraktionsbehandling til fremstilling af protein- og lipopolysaccharid-holdige kapselekstrakter til anvendelse i de omhandlede vacciner er behandling med salicylater, f.eks. van-30 dig natriumsalicylat.

Til fremstilling af de omhandlede vacciner bliver de passende organismer dyrket eller på anden måde opnået, det tilsvarende antigene materiale opnås fra organismerne og formuleres til vaccinen.

Antigent kapselekstraktmateriale kan opnås fra organismerne ved 35 hjælp af enhver egnet teknik. F.eks. behandles hele organismer med salicylat, f.eks. natriumsalicylat, ved koncentrationer i området fra ca. 0,1M til ca. 10M, især 1M, fortrinsvis under omrøring i et 5 1A9942 tidsrum fra ca. 1 til ca. 5 timer, specielt ca. 3 timer, cellerester fjernes, f.eks. ved centrifugering, og det opløselige antigene produkt renses og koncentreres. Antigent materiale omfattende dræbte hele organismer kan fremstilles ud fra levende organismer ved enhver 05 egnet fremgangsmåde, herunder anvendelse af formalinbehandling.

Fortrinsvis, eller i det særlige tilfælde af A2-serotype antigent materiale, fremtilles dog det antigene materiale af hele organismer ved varmebehandling af levende organismer. F.eks. varmebehandles de levende organismer ved en temperatur på mindst 50°C i et tidsrum 10 på mindst 10 minutter, fortrinsvis mindst 16 minutter, f.eks. ved ca. 60°C i ca. 16 minutter.

Det som ovenfor eller på anden måde fremstillede antigene materiale inkorporeres i et vaccinepræparat, der sædvanligvis også omfatter andre komponenter, herunder adjuvanser og andre materialer, 15 såsom præserveringsmidler. Enhver egnet adjuvans kan anvendes, herunder komplet Freund's adjuvans (CFA) eller ukomplet Freund's adjuvans (IFA). Ifølge en foretrukket udførelsesform har det dog vist sig, at en aluminiumhydroxidgel-olieadjuvans er særlig egnet til anvendelse med de omhandlede vacciner, idet man med fordel undgår 20 visse af de uønskede bivirkninger, f.eks. udbredt lokal-inflammation, der optræder ved podning med vacciner omfattende Freund's adjuvanser. F.eks. er et særlig foretrukket adjuvans en aluminiumhydro-xidgel-olieadjuvans, f.eks. Alhydrogel®-olie adjuvans, hvor det antigene materiale adsorberes på Alhydrogel®, og den resulterende suspen-25 sion emulgeres med en passende olie, såsom en paraffinolie, f.eks.

Bayol F®, fortrinsvis indeholdende 10% mannidmonooleat, f.eks.

Arlacel®.

Koncentrationen af antigent materiale i vaccinen kan varieres efter behov, f.eks. i henhold til vaccinens doseringsmængde, og i 30 denne henseende er den normale dosis, som i almindelighed anvendes, ca. 1 til ca. 2 ml. I almindelighed omfatter hver vaccinedosis ca. 0,1 til ca. 20 mg antigent materiale, specielt fra ca. 0,5 mg indtil ca. 10 mg, f.eks. ca. 5 mg antigent materiale af hver serotype, som er indeholdt i vaccinen.

35 Til forebyggelse og bekæmpelse af pasteurellose, f.eks. til brug ved landbrugsmæssig husdyravl, administreres de omhandlede vacciner til dyrene, f.eks. får eller kvæg, sædvanligvis i form af en subku- 6 149942 tan injektion. Dyrene kan vaccineres hurtigt efter fødslen for at bibringe dem beskyttelse mod pasteurellose på et tidligt stade af deres tilværelse, men det kan dog være ønskeligt at lade et mindstetidsrum hengå efter fødslen før vaccinationen for at tillade dyrets 05 immunologiske system mere fuldstændigt at udvikle evnen til at reagere på vaccinen. F.eks. kan det i tilfælde af lam være ønskeligt at lade et mindstetidsrum på 4 uger hengå mellem fødsel og vaccination.

Endvidere kan vaccination udføres i bestemte tidsrum af året for at tilvejebringe beskyttelse mod sædvanlige sæsonmæssige udbrud af 10 pasteurellose. F.eks. kan fåreflokke vaccineres sent forår eller deromkring med de omhandlede vacciner omfattende P. haemolytica A-se-rotype antigent materiale for at tilvejebringe beskyttelse mod udbrud af pneumonisk pasteurellose, der sædvanligvis forekommer i fåreflokke om sommeren.

15 Den foreliggende opfindelse tilvejebringer for første gang en effektiv vaccine, der giver effektiv beskyttelse mod pneumonisk pasteurellose i får. Med fordel kan de omhandlede vacciner også anvendes til at tilvejebringe beskyttelse mod pasteurellose i almindelighed, herunder septicæmisk pasteurellose i får og pneumonisk pasteurellose 20 i kvæg.

Opfindelsen belyses nærmere i de følgende eksempler, som vedrører fremstillingen af pasteurellosevacciner og testningen af disse vacciner i får. Kun eksempel 3 og 4 er eksempler ifølge opfindelsen, men eksempel 1 og 2 angår A2-serotype komponenter og er derfor 25 også relevante for opfindelsen.

Eksempel 1

Tre monovalente vacciner fremstilles ud fra A2-serotypen af 30 Pasteurella haemolytica og testes i får mod angreb med en aerosol af den homologe serotype. De tre vacciner omfatter: 1. varmedræbte hele organismer (HKO) i en aluminiumhydroxidgel (A!hydrogel®)/olie adjuvans (AO), 2. kapselekstrakt (CE) i komplet Freund's adjuvans (CFA) og 3. samme ekstrakt i aluminiumhydroxidgel (Alhydrogel®)/ 35 olie adjuvans (AO). Fremstillingen af de tre vacciner sker som følger: 149942 7

Vaccinefrerostilling HKO i AO

Organismer af P. haemolytica serotype A2, stamme FA2, dyrkes, 05 undersøges for renhed og podes på Oxoid nr. 2® kødekstraktsubstrat, der dyrkes ved 37°C i 18 timer med omrøring. Den resulterende vækst podes i 1,5 liter Oxoid nr. 2® substrat, som dernæst inkuberes i 6

Q

timer under samme betingelser. Vækst findes at være i området 10 organismer pr. ml, bestemt ved hjælp af tælning af levedygtige og 10 ved hjælp af et nefelometer af mærket EEL. Bakterierne udvindes ved centrifugering ved 4°C i 20 minutter ved 12.000 g. Bakterierne dræbes dernæst ved varmebehandling ved 60°C i 16 minutter.

Den optimale koncentration af varmedræbte organismer til adsorption pi aluminiumhydroxidgelen (Alhydrogel®, Miles Laboratories, 15 Slough, England) bestemmes ved titrering i henhold til fabrikantens instruktioner (Miles Laboratories, Slough, England). Antigenerne adsorberes dernæst på aluminiumhydroxidgelen, og den resulterende suspension emulgeres i et lige så stort volumen Bayol F® (Esso Petroleum, New Jersey, U.S.A.) indeholdende 10% Arlacel A® (Sigma Che-20 mical Co., St. Louis, Missouri, U.S.A.).

Kapselekstrakt i AO

Serotype A2-, stamme FA2, organismer dyrkes og udvindes som 25 ved fremstillingen af vaccinen af HKO i AO beskrevet ovenfor. Efter udvindingen suspenderes bakteriemassen imidlertid i 1,0 M natrium-salicylat i destilleret vand til 1/10 af det oprindelige volumen. Suspensionen rystes dernæst ved 37°C i 3 timer og centrifugeres ved 2800 g ved 4°C i 40 minutter. Den ovenstående væske dialyseres 30 dernæst i dialyserør over for tre ændringer med phosphat-forpufret saltopløsning (pH 7,2) ved 4°C over et tidsrum af 48 timer og koncentreres dernæst til en trediedel volumen ved inddampning ved 37°C.

Den antigene aktivitet af koncentratet kan bestemmes ved titrering ved en indirekte hæmagglutinationstest over for et standard 35 kanin-antiserum mod den homologe serotype af P. haemolytica. Kapselekstrakten kan frysetørres og opbevares ved -20°C.

Som for HKO-vaccinen bestemmes den optimale koncentration af δ 149942 kapsel-antigen ved titrering, idet kapselekstrakten adsorberes pi

Alhydrogel®, og den resulterende suspension emulgeres med et lige så stort volumen Bayol® indeholdende Arlacel® til opnåelse af en A2- kapselekstrakt i AO-vaccine.

05

Kapselekstrakt i CFA

Kapselekstrakt af type A2-, stamme FA2, organismer af P. haemo-lytica fremstilles som beskrevet ovenfor. A2-kapselekstrakten inkorpo- 10 reres dernæst ved samme koncentration som i kapselekstrakten i AO-vaccine, ved homogenisering i destilleret vand i CFA (én del kapselekstrakt pr. én del adjuvans).

Vaccination og angreb 15

Grupper pi syv 2-3 uger gamle, specifikt patogenfrie (SPF), hysterektomiserede, kolostrum-befriede lam vaccineredes ved subkutan injektion med 2-ml portioner af HKO i AO, kapselekstrakt i AO og kapselekstrakt i CFA-vaccine. Otte lam forblev ubehandlede 20 for at fungere som kontroldyr. Lammene tappedes for blod før vaccination, med ca. 3 ugers intervaller og ved nekropsi. Otte uger efter vaccination inficeredes lammene intranasalt og intratrakealt med log^Q 7,2 TCIDj-q P^3 parainfluenzavirus og udsattes en uge senere i 15 minutter for en aerosol indeholdende 3,1 x 105 P. haemolytica 25 type A2-, stamme FA2, organismer pr. liter. Det skønnes, at hvert lam modtog en dosis pi ca. 1,0 x 10 organismer.

Lammene iagttoges i 5 dage efter udsættelse for P. haemolytica aerosolen, og kliniske vurderinger af sygdomsgraden registreredes.

6 af de 29 lam, 4 i gruppen kapselekstrakt i AO og 2 uvaccinerede, 30 døde eller aflivedes pa grund af alvorlig sygdom inden for 5 dage fra angrebet. De resterende lam aflivedes i tilfældig rækkefølge mellem 7 og 10 dage efter angreb, og alle lammenes lunger undersøgtes for læsioner, og vurderinger registreredes.

Grundlaget for de kliniske vurderinger og læsionsvurderingerne 35 er følgende: træghed, pyrexia (>42,8°C) eller abnorm respiration tildeltes hver ét point og død 4 point, hvilket giver et pointantal for hvert lam varierende mellem 0 og 4 for hver dag. Overfladeare- 149942 9 alerne af læsionerne pi de dorsale og ventrale dele af lungediagrammerne måltes med et planimeter og udtryktes som en procentuel mængde: 0 = ingen læsioner, 5 = indtil 10%, 10 = 11-25%, 20 = >25% af lungeoverfladen angrebet. Ved forsøgets afslutning adderedes de daglige _ kliniske pointantal for hvert dyr. Statistiske forskelle mellem de kli-05 niske pointantal, lungelæsionspointantal og totale pointantal (klinisk + læsionspointantal) for grupperne bestemtes ved hjælp af Mann-Whit-ney testen (Snedecar & Cochrane (1967) Statistical Methods, 6. udgave, (side 130)).

De opnåede resultater er gengivet i tabel 1 nedenfor sammen 10 med resultatet af statistisk analyse ved hjælp af Mann-Whitney testen.

Som det kan ses, var der ingen statistisk skelnelig forskel mellem de kliniske pointantal for nogen af de vaccinerede grupper og de uvaccinerede kontroldyr. Der var imidlertid signifikant lavere pneumoniske iæsionsantal i grupperne, der var vaccineret med HKO 15 i AO og kapseiekstrakt i CFA. De totale pointantal i vaccinaterne med HKO i AO var signifikant forskellige fra pointantallene hos lam vaccineret med kapselekstrakt.

Sera fra lammene testedes for antistoffer mod P. haemolytica serotype A2 ved den indirekte hæmagglutineringstest (IHA) 3, 6 og 9 uger efter vaccination og ved nekropsi. Ingen lam havde påviselige antistoffer. Ved anvendelse af immuno-fluorescens-antistoftesten (FAT) viste det sig imidlertid, at 21 af de 22 vaccinerede lam havde påviseligt antistof 6 uger efter vaccination, og alle vaccinater testet ved nekropsi havde titre på mellem 1/256 og 1/2048.

25

De alt ialt opnåede resultater viser de overlegne immunogene egenskaber af varmedræbte hele organismer af A2-serotype i forhold til kapselekstrakt og viser også eksistensen af en ønskelig kombinationsvirkning af disse varmedræbte organismer med den specifikke Alhydrogel®-olie adjuvans.

149942 ίο _ _ ffl ^ fvj /"N ^ +3 ro * cvi rv cn oo _ C > * _ I'' co <*>

® +J +S m Lf) 4J ^ I I

:§* = £ *, “i· ^00 ^<0 ·- o O - O O Γ". O »I- O) r- Φ Jj> p Q-v—' t— r-·^/ CVI w CM'w'

o E g E

E (D

P

+J 0) _ /-s <u 150 o c* Ό j) I 4-1 m t- ^ O ?.

O O) u) r s O O CVI

Q. O m C ro ^ * — * CM CVI 0) - # S u * # *1 I D o_ C Q Ό .2 C +B VI CO 1 LO _ Q. Q.

C £ "Q 1/) ·— J" O I * ^ s Ο Λ — <d § ni ο ,E cvj in in in co r· ~ρ — JZ Έ. — Q.'s iflv/ i— w r- r- p' O gj _ c — o

ro Φ PE

Ptj S_ P

c ^-S P C

5 Ό iC CVI o S

C ! E « *" ^ O « * ^ 0 75 (t! j_ .— f'' ^ '“.ρω r. α ¢3 5-2?« cvj. in , r- . «

Z ·« såsS “i t, cm-cm oV I I

Q) <0 s_ Έ. JC O.'S ifl v in P' v >p r*v—O

9 O O) H U

(U ΰ Γ 0(0 k *§ 5 > O) s 3 ° 0) 3 ,, Ο _ Ό 1 XI 0)

Mi. OP

C (D E c

° C ® _. P

‘in *. % 5 q P 0)

So £ .2 Ϊ c — tg ^ <1) c ^ 0)

Cl> IJL^L - C

Cco+iatfBp c<u 3uC=s_x a> e — +3 < a> Ό a> I > 't CM Ep * > Era

0) η to M

S W

II) C

.- <U w r- c o m o

·-£. O

v - o ^ · ο v ο. c \y = a> a.

ra q. a. w a ^ _ id P — ω

*3 J- 0) JC

c σ> ^ η Γ" i*· co r··- l a « : p c c m to ^ P P iZ ~

o ± x ± -* m -p C

.E <u P < ® i Εό π).~ o on Spu- 2 p o 9® ·-(/) o ri zi- Q. tn,. 0. u) E. £?$- tn <0 ^ 10 ^ O (0 ^ ^ ^ 0) jf > i._ 'iC to.- X to.- 3c *# 149942 11

Eksempel 2

En kombineret varmedræbt hel-organisme (HKO) og kapsel-eks-05 trakt (CE) monovalent vaccine i en aluminiumhydroxidgel/olie adjuvans (AO) fremstilles ud fra A2-serotypen af P. haemolytica og testes i får. På HKO- og CE-antigent materiale fremstilles og formuleres til en AO-adjuvans vaccine i det væsentlige som beskrevet i eksempel 1 til dannelse af en vaccine indeholdende 2,2 mg HKO og 5,6 mg CE 10 antigent materiale pr. 2 ml dosis. En gruppe på 10 lam vaccineres med 2-ml doser af vaccinen, og denne gruppe udsættes dernæst sammen med en kontrolgruppe på 10 lam for angreb med en aerosol af A2-organismer og bestemmes for kliniske sygdomstegn og efterfølgende ved post mortern lungeundersøgelse i det væsentlige som 15 ovenfor beskrevet. De opnåede resultater er gengivet i Tabel 2 nedenfor, hvoraf den effektive beskyttelse, som opnås ved hjælp af den kombinerede A2-vaccine, fremgår.

149.942 12 ε tt g i *D C +j

O u W

c > σ» gis -m o - υ ε _ o m cd .c +3 o <o c c ° (0 ' <B _ ^ £ O Ό rtl V ® £*_ ε x

0 X jg Jr CvJ X

Q. S: rj) O «.

i ε ooooor-tnooo ,® ro _ s_

CV! 10 C-fl <U

+J O ® D)

»5^0) ,E

i i -o c s- r 1 g® φa v gSc ?*å i I „ <“ i i

in u C -J-JOOOOOr- 1 O I I

O) >> — ο o <£ 2 _ c CO tt ^ S C λ) ,σ r- r- » .£ <i> s_ r- moomcor-cotocoor- co

03 <U

V · O c »au .2 ·- 5 w -.£§£ 8 o * ^ I -1 _J ιηιηωιηωΛίοιοοο m U) o tf ro o ··» v c o i£ OOOOCOCOi-iOCOOr- 00 11 CO °- 2 > c 1>

c C

< i-CVIC0>il/)<0h-C003O +J+J

^ ΈΞ t. «2 5 O) El +» a) c S c = c 9- ,E c ro Q- u fl) 5 py O* 1. rø O > 149942 13 co oo rv lo oo oo oo o o o o o o o w _T-5— t— t— τ— *“ ||

g X X X XX X

Jr I— CO in COr- 00 <D

Π) Jx -* -» *» *- ·Ρ

<. Z HI cf r O W Ο Ο O r- ID

L? C

& o O) (j C in jE in oo m oooo i*· > <uooo ο o o s_ i3 t— i— i— Ι-Γ- 00 i— o

m C O

0).2 xxx xx *- x - _

§ j (O (O OO ' (O 00 X 00 +S

inr-^oor-tn jjj

+J

— £ (0 o

+j Q

,° h* to cd r* r^-CDj- h r-ojcvjocooor^. r^cocvi r- oj > m2 +J ο c ο ϋ o y +j w . ^ o

ffiooo OO Or-^JO

-J c- ¢- cm o cm cm in m m cm r-s. +j i« ® > oi

— (Q

V O) +J

w Ό £ .E Q Ω Ω Ω ^- ·§ £ — cd cd r*» « q> 2L· 1--- r- h** O r- r· CV1 r- ^ r- OO *π Φ Ό ^ _ ο Ό-Χ ™ c o o " 11 +j “ o o __ s_< r-cMco'iintor'·' oo o c- +J ll Ω i 2 c f- l/> CM 2 ® _ a g i a) Ω. +j tu £3 C 0 m l o h 0 * 149942 14

Eksempel 3 Kombineret P. haemolytica A1- og A2-serotype vaccine

Organismer af P. haemolytica serotype A2, stamme FA2 og serotype Al, stamme FA1, dyrkedes og blev udvundet som foran beskre-05 vet for serotype A2 i eksempel 1. Kapselekstrakt fremstilledes ud fra A1-organismerne, og A2-organismerne varmedræbtes også som foran beskrevet. Frysetørret kapselekstrakt af serotype A1 rekonstitueredes og inkorporeredes ved homogenisering i destilleret vand i CFA eller I FA (Difco Laboratories, West Molesey, Surrey, England) 10 (1 del kapselekstrakt pr. 1 del adjuvans). Dræbte hele organismer af serotype A2 frysetørredes og homogeniseredes i CFA Difco eller I FA i en mængde på 10 mg/ml vaccine.

21 SPF-lam, der var mellem 9 og 25 dage gamle, fordeltes tilfældigt i grupper på hhv. 10 og 11 lam. I gruppen på 10 vaccinere-15 des hvert dyr subkutant med 1 ml CFA-vaccine indeholdende 19 mg/ml P. haemolytica type A1 kapselekstrakt og 10 mg/ml type A2 HKO.

En måned senere revaccineredes de samme lam med de samme antigener i I FA. Fire uger efter den anden vaccination inficeredes begge grupper af lam med P13-virus (10 ' TCID^q) og en uge senere med en aerosol 20 af P. haemolytica type A1 og type A2 i samme mængder. Som i eksempel 1 udsattes lammene i tilfældigt placerede grupper på 4 i 15 minutter.

5

Atmosfæren indeholdt 2,7 x 10 organismer/liter med begge serotyper til stede i lige store mængder. Lammene undersøgtes for tegn på klinisk sygdom i et tidsrum på 5 dage efter infektion med P. haemo-25 lytica. Lam, som overlevede, aflivedes mellem 7 og 10 dage efter udsættelse for aerosolen, og alle lammenes lunger undersøgtes for læsioner. Kliniske og lungelæsionspointantal bestemtes som i eksempel 1, og de opnåede resultater er anført i Tabel 3 nedenfor.

149942 15 ro

S- o ro O Q Q

0) +» -η ro g) ^ c _ c > « 10 -S ·η ro * s= ' r-t^C+J 00 +> 00 Εϊ Ό·;? ' '00 ro PJ ·- o .h cvicvj Ο'Μ 7 if. Σ Q.W i- w (VI V-/

li. ro I

n ro ft e c

V) (Q O

— '55 _ _

_ ro ro uC

ro Ό — -p ro o

v* ro c > M

roro^-Sa) * — ro +JrOC+j *+j η

c .= Ό ~ c m S

.= o ·- O ,!= '1 o 0 U S CL w CD (VI p α ro h.

> v 0> ϋ 3 W o 00 -3 ·“ c _ £

» s? g I

xi οι c > *- ^ -* £ ° c -S ™ ro *= ^ Ό . ,E Ό c « #+j 'il ro

Lu Ό ·= c oo ' P

2 υ = o ,r 'i o oo s ro S Q-w m v> r- v-/ xj .2 > ro in c $U m π) JS u ro .- ro +3 ro ti w c

?£ si g I

-1 i (D — v <0 1 5 I fc8 “ <2 . < ro .=1 i cd c Q. ° 2Ό g ° ^ ro .2 v E £ >- o.

M <“» v,^/ O -° E w — o ? ro < ro

n „ ro ro -X

α <?x: ο. - in C . ίΓ r- u < O. & < o 4-> ro c π» Ό ro io £ £

Si t: - ro α-^^Ε ,E E c

Ω. ro ί° X ro Oro CD

a .X h — u — jo; □ I (/) ' o 5 r· rn -X r- Xj t— * CD < ro < ^ * 149942 16

Seks uvaccinerede lam døde eller mitte aflives inden for 4 dage fra angrebet. Ingen vaccinerede får døde. Alle pi nær ét af vacci-naterne udviste imidlertid nogen klinisk abnormitet, selvom deres kliniske pointtal var signifikant forskellige (P<0,01) fra de uvacci-05 nerede lams. Alle uvaccinerede lam havde pneumoniske læsioner, der involverede mere end en fjerdedel af lungeoverfladen, hvorimod to vaccinerede lam ingen læsioner havde, fem havde læsioner, som højst påvirkede 10% af lungeoverfladen, og tre havde mere vidtgående læsioner. Både lungelæsionspointantallene og de totale pointan-10 tal var signifikant forskellige (P<0,01) i det vaccinerede og uvaccinerede iam.

Vaccination med denne kombinerede A1- og A2-serotype vaccine reducerer signifikant alvorligheden af pneumonia forårsaget ved angreb med en kombination af de samme serotyper.

15

Eksempel 4 Kombineret P. haemolytica Al-, A2- og A6-serotype vaccine

Organismer af P. haemolytica serotyper A1, A2 og A6, hhv. stammer FA1, FA2 og FA6, dyrkedes og blev udvundet som beskre-20 vet i de foregående eksempler og inkorporeret i en AO-adjuvans vaccine. Varmedræbte hele organismer af type A2 fremstilledes også som foran beskrevet. Kapselekstrakter af stammer FA1 og FA6 fremstilledes ved natriumsalicylat-ekstraktion. Natriumsalicylat-ekstrakten centrifugeredes ved 40.000 g i 30 minutter, og den ovenstående 25 væske dialyseredes over for 0,02 M phosphat og 0,03 M natrium- chforid ved pH 7,6 i 48 timer og koncentreredes til 1/10 af voluminet ved ultrafiltrering gennem en membran. Koncentratet testedes for in vitro antigen aktivitet ved en IHA-test, og tørstofkoncentrationen bestemtes efter yderligere dialyse mod destilleret vand. Kap-30 selekstrakterne og HKO inkorporeredes i AO-adjuvans som foran beskrevet til opnåelse af vaccine indeholdende 0,18 mg pr. ml A1-kap-selekstrakt, 0,75 mg/ml A2-HKO og 0,21 mg/ml A6-kapselekstrakt.

149942 17 64-2 eller 4 uger gamle - SPF-lam fordeltes tilfældigt i otte grupper, nemlig fire grupper til vaccination og parrede kontrolgrupper, siledes at aldersfordelingen i vaccinater og kontroldyr var ens. Lam i fire grupper vaccineredes subkutant bag øret med 2 ml 05 til hvert individ af AO-vaccine indeholdende 0,37 og 0,42 mg/ml kapselekstrakt af hhv. stammer FA1 og FA6, samt 1,51 mg/ml HKO af stamme FA2. Otte uger efter vaccination inficeredes alle lammene intranasalt og intratrakealt med 10^'^TCIDj.q P13-virus. En uge senere blev grupperne af lam angrebet ved udsætttelse for en 10 aerosol af P. haemolytica. Vaccinerede og parrede uvaccinerede kontrolgrupper blev udsat i tilfældigt fordelte grupper på fire for aerosoler af hhv. stammer FA1, FA2, FA6 og FA9, hvor stamme FA1-aerosolen indeholdt 3,8 x 10^, FA2 1,2 x 10^, FA6 1 x 10^ og 4 FA9 3,1 x 10 organismer/liter.

15 Overlevende lam aflivedes 7 dage efter angreb. Kliniske under søgelser og post mortern undersøgelse af lungelæsioner foretoges som i foregående eksempler, og de opnåede resultater sammen med statistisk analyse af resultaterne bestemt ved Mann-Whitney testen fremgår af Tabel 4 nedenfor.

20 De opnåede resultater viser, at den kombinerede A1-, A2- og A6-serotype vaccine tilvejebringer god beskyttelse mod angreb af A1- og A6-serotype og endvidere nogen beskyttelse mod angreb af A2-serotypen. Det antages, at beskyttelsesniveauet mod A2-angreb kan forøges ved ændring af koncentrationen af det A2 HKO antigene 25 materiale i vaccinen.

149942 18 ro o +j > ό ±ί S <n 0) +f ~ <o ii .2 75 /-s oo JC (-«SiOCOOTO^r-inui . φ ro £ m ^ co oo oo co co OL Ό c -S CM I Γ" 1 001 l>. I *1 CO I 001 Ull Π ·- O „ CM O r- r-O O LD - O 00 O CO 00 CO ΙΟ

JjJ S o.^ r-w OM w t- CM 'W 00 ' r- w r-'s r- ^ ε J, a! o 0 2 Tg ^ α SSoo^ooo £ +j Φ ro £ CM CM r- CM in CM cm cm — -fe t cS looi i cm i * i i m i i 2·ό·-(-<ο ·- co -· in oo « _ — t ”0,5 l.o r- tn -o r- in -o vin o in o in _„ *= 2> Q.s^ s*/ r- ςθ ' t—w CMs—' t— w- r- ΠΪ c ε ·* ro O w 4-> <n ·= c £ ·— Ί-* — ^ ^ O 0) JC S m /"s /"v -'"v /"s ^ ^ _ Cljo r- -ς co oo ^ o^r- m i** J <U ® 1-3¾ r-r-r-r-CO^-T-i- £ li1 ?£? S» « ' in · CO · CM ' co in ' * O (0 ·- o ,Z vO CM ro- v r- vo 'O v© v co vo 2 Q-V> Wl/ r- -V> Ό- w OT 'w' r-w 'w- CO w O ^ _ o> O) o °ro J, .£ -g £

c O

° 8 » ros.

£ ® <i) 5 — ^ < (U CM «3- r- O O r- CM 00.

tf) 3 ·= ro 5 ®

1 _ I

3 ro c g S ε Jo a. < iS 0^000100000005(^1^ v ό <u · JO .0 > tf) 0) _

” S. (U

,E o) x — C c- CM CO OT in

* < < < < < O

£-

H

ro ro (i) ro c Ό ι-ό s-Ό c-Ό Ε1? ro > ro >ro >(u >· ,£ 2 .£ 2 .£ 2 .£ 2 g u+j u-t-1 U+-1 u +- ,ϋ' UCUCUCUCy) rooroorooroo >X>X>X>X* 149942 19

De i de foregående eksempler opnåede resultater er sammenfattet udtrykt som forholdet mellem gruppemiddelværdien af det totale pointantal hos vaccinater og kontroldyr i Tabel 5 nedenfor, som gi-ver en indikation af den relative beskyttelse, som tilvejebringes ved hjælp af de forskellige undersøgte vacciner. Resultatet 0,90 for A9-serotypen i den trivalente vaccine, jfr. eksempel 4 ovenfor, hidrører fra, at A9 repræsenterer et heterologt angreb, da den ikke var til stede i vaccinen.

Symbolerne har den i eksempel 1 forklarede betydning.

Tabel 5 BESKYTTELSE UDTRYKT SOM: 15

GRUPPEMIDDELVÆRDI AF TOTALT POINTANTAL FOR VACCINATER GRUPPEMIDDELVÆRDI AF TOTALT POINTANTAL FOR KONTROLDYR

VACCINER

20

MONOVALENT DIVALENT TRIVALENT

A1 CE, A1, A6, CE

A2 HKO C FA A2 HKO/AO

25 A1 CE/CFA 0,4 A1 0,45 A1 0,45 A6 CE/CFA 0,37 A2 0,55 A2 HKO/AO 0,38 A6 0,28 A2 CE/CFA 0,50 A9 0,90 A2 CE/AO 1,0

30 A2 HKO

+ A2 CE/AO 0,43 A9 CE/AO 0,19