NO151225B - Fremgangsmaate ved fremstilling av pasteurellosis-vaksiner - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte ved fremstilling av en pasteurellosis-vaksine.

Pasteurellosis er en vanlig åndedrettsykdom hos sau og storfe

som ofte kan føre til døden, spesielt hos yngre dyr, og det er derfor meget viktig å forebygge og kontrollere denne sykdommen for bønder som driver med sau og storfe. Hos sau opptrer sykdommen enten som pneumoni eller en septicaemisk tilstand avhengig av alderen til det infiserte dyr og stammen av infeksjons-organismen, mens sykdommen hos storfe primært forekommer som en pneumoni i områder med temperert klima. Pasteurella. haemolytica er funnet å være hovedårsaken til sykdommen hos sau, og

to av serotypene av denne organismen sammen med stammene av en assosiert organisme, Pasteurella multocida har vist seg å være ansvarlig for den pneumoniske sykdom hos storfe. To biotyper av P. haemolytica er identifisert, A-biotypen som i alminnelig-het forbindes med septicaemis hos unge lam og pneumonier hos eldre sau og T-biotypen som generelt forbindes med septicaemi hos voksne sauer, og innen disse to biotyper er det funnet 12 forskjellige serotyper. Bare A-biotypene, men ikke T-biotypene av P. haemolytica viser seg å ha forbindelse med storfe—pneumo-nier .

For tiden er vaksine tilgjengelig i handel for å forebygge og kontrollere pasteurellosis hos sau og storfe. Sauvaksinene består av formalindrepte serotyper

av P. haemolytica. Disse vaksiner viser seg imidlertid ikke å gi tilstrekkelig beskyttelse mot pasteurellosis. Det er nå funnet at effektive pasteurellosis-vaksiner for sau og muli-

gens storfe kan fremstilles dersom det tas omhyggelig hensyn

til opphavet og formuleringsmetoden fra P. haemolytica antigen-materiale som inngår i vaksinene.

De forskjellige serotyper av P. haemolytica som det heretter refereres til, f.eks. Al-og A2-serotypene, kan bestemmes ved metoder som er forut beskrevet og kjent innenfor områdetj f.

eks. slik som bestemt ved serotypimetodene beskrevet av Biber-

stein et al (Biberstein, E.L. Gills, M., & Knight H. (1960)

Cornell Veterinarian 5_0, side 283).

Ifølge foreliggende oppfinnelse fremstilles en pasteurella-vak-

sine av antigenmateriale som stammer fra Al-og A2-serotyper av Pasteurella haemolytica, hvor i Al-serotype antigenmateriale

består av kapselekstrakt og A2-serotype antigenmateriale be-

står av varmedrepte hele organismer.

Oppfinnelsen omfatter således en fremgangsmåte for frem-

stilling av pasteurellosis-vaksiner hvori antigenmateriale fremstilles fra organismer av Al- og A2-serotyper av P. haemolyticdi og antigenmaterialet formuleres som en vaksine

hvori antigenmaterialet består av kapselekstrakt fra Al-

serotypenog varmedrepte hele organismer av A2-serotypen.

Vaksiner fremstilt ifølge oppfinnelsen kan brukes i jordbruksapplika-

sjoner for å forhindre og kontrollere pasteurellosis generelt for å nedsette både tap av dyr og ineffektiv kjøttproduksjon på grunn av sykdommen. Spesielt er vaksiner fremstilt ifølge oppfinnelsen egnet for vaksinasjon av sau og storfe. Generelt kan vaksine inneholde ytterligere antigenmateriale i tillegg til antigen-materiale som stammer fra P. haemolytica av Al-og A2-serotypene;

og det skal være klart at arten av sådant ytterligere antigen-materiale kan avhenge av dyrerasene og den form for sykdom som vaksinen er ment mot. Således kan i tillegg til antigenma-

teriale som stammer fra Al-og A2-serotypene av P. haemolyticaf vaksiner for sau inneholde antigenmateriale som stammer fra andre serotyper av P. haemolytica og vaksiner for storfe be-

står gjerne av antigenmateriale som oppnås fra stammer av P. multocida. Videre kan f.eks. sauevaksine som spesifikt er

ment for å bare bekjempe en pneumonisk form av sykdommen hos voksne sauer innholde antigenmateriale som stammer fra A-serotyper bare av P. haemolytica. Alternative sauevaksiner som er ment for å bekjempe både de septicaemiske og pneumoniske former av sykdommen består gjerne av antigenmateriale som stammer fra en kombinasjon av A-og T-serotyper.

Fortrinnsvis består sauevaksiner fremstilt ifølge oppfinnelsen av antigen-materiale som stammer fra A6-serotypen av P. haemolytica og i en utførelsesform tilveiebringes en trivalent vaksine bestående av Al-, A2-og A6- serotype antigenmateriale for bruk ved bekjemp-elsen av pneumonier hos voksne sauer. Alternativt eller fortrinnsvis i tillegg kan sauevaksiner omfatte antigenmateriale som stammer fra A9-serotypen og spesielt også A7- serotypen.

Videre omfatter sauevaksiner for bekjempelse av både pneumoniske

og septicaemiske pasteurellosis i tillegg til ytterligere A-serotyp antigenmateriale, f.eks. A6-, fortrinnsvis A6-+ A9-,

eller spesielt A6-+ A9-+ A7- serotype antigenmateriale, T-serotype antigenmateriale, fortrinnsvis en kombinasjon av T37 T4-og T10-serotype antigenmateriale.

Storfevaksiner omfatter gjerne antigenmateriale som stammer

fra egnede stammer av P. multocida så som f.eks. typene A og D (Carter, G.R. (1955) Am. J. Vet. Res..18, side 481), fortrinnsvis en kombinasjon av A-og D-typer av P. multocida.

I tillegg til det ytterligere antigenmateriale som stammer fra arter av Pasteurella, kan vaksinen fremstilt ifølge oppfinnelsen inneholde antigenmateriale som stammer fra andre organismer så som andre bakterier og også virus. Således kan f.eks. vaksinen også inneholde antigenmateriale som stammer fra virus med tilknytning til Pasteurellae organismer i etiologi med Pasteurellosis, så

som f.eks. antigenmateriale som stammer fra parainfluensa-

virus f.eks. parainfluensavirus type 3 (P13).

Det ytterligere antigervmateriale i tillegg til det som stam-

mer fra Al-og A2-serotypene i vaksinene kan

ha entwer egnet form, men har fortrinnsvis sterk immunogen og antigen karakter. Således kan det ytterligere Pasteurella antigenmateriale omfatte drepte hele organismer av P. haemolytica og/eller P. multocida, fortrinnsvis varme-drepte hele organismer. Spesielt omfatter imidlertid det ytterligere antigenmateriale et ekstrakt av P. hapmnlyt- ica og/eller P. multocida, f.eks. et kapsel-ekstrakt. I denne siste henseende er det ifølge foreliggende oppfinnelse funnet at kapselekstrakter fra P. haemolytica generelt viser fordelaktige antigenegenskaper, sem er spesielt ønskelige for vaksine-formulering, sammenlignet med drepte hele organismer så som formalin-drepte hele organismer. Det er derfor spesielt overraskende at varme-drepte hele organismer av A2-serotypen av P. haemolytica gir et materiale med betydelig bedre antigenegenskaper enn et kapsel-ekstrakt .

Videre kan det i spesielle utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse være ønskelig å innføre A2-kapselekstraktantigenmateriale i vaksinen sammen med A2-antigenmateriale som omfatter varmedrepte hele organismer. Det antas at en slik kombinasjon av kapselekstrakt og varmedrepte hele organismer fra P. haemolytica A2-serotypen kan gi opphav til forsterkede antigen- og immunogene egenskaper sammenlignet med vaksiner som inneholder A2-varme-drepte hele organismer alene, spesielt for bruk i vaksiner som inneholder antigenmateriale fra flere serotyper f.eks. minst tre av P. haemolytica og/eller andre organismer .

iCapselekstrakt-antigenmateriale fra vaksinen fremstilt ifølge oppfinnelsen omfatter alltid polysaccharid— kapselmateriale og kan fremstilles som et ekstrakt fra hele celler ved en hver passende ekstrak-sjonsmetode så som slike som er velkjente for fagfolk innen vaksine-produksjonen og immunologiområdet,f.eks. ekstraksjon med saltløsning. Fortrinnsvis omfatter imidlertid kapselekstrakt-antigen materiale protein og spesielt også lipopolysaccharid-antigen materiale 'i tillegg til kapsel-polysaccharid-antigenmateriale. Det antas at innføringen av disse ytterligere protein-og lipopolysaccarid-cellekcmponenter i kapselekstraktet gir opphav til forsterkede antigen- og immunogene egenskaper sammenlignet med kapselekstrakter som hovedsaklig

inneholder bare polysaccharid-kapselmateriale . Kapselekstrakter som inneholder disse ytterligere komponenter kan fremstil-

les fra celler ved bruk av egnede ekstraksjonsbehandlinger så

som anvendelse av tiocyanat-løsninger,"Cetavlon" eller "Cetrimid"

En spesielt foretrukket ekstraksjonsbehandling for fremstilling

av protein og lipopolysaccharid som inneholder kapselekstrak-

ter for bruk i vaksinen ifølge oppfinnelsen er behandling med salicylat, f.eks. vandig natriumsalicylat.

I fremstillingen av vaksiner ifølge oppfinnelsen blir de rik-

tige organismer dyrket eller erholdt på annen måte, og det tilsvarende antigenmateriale erholdes fra organismene og formuleres som vaksine. Kapsel -ekstrakt -antigen-rmateriale kan erholdes fra organismene ved hvilken som helst egnet teknikk.

F. eks. behandles hele organismer med salicylat f .eks. natriumsalicylat ved konsentrasjoner i området fra 0,1M til 10M, spesielt ca.

IM, fortrinnsvis under røring over et tidsrom fra 1 opp-til

5 timer, spesielt ca. 3 timer, celleavfall fjernes f.eks.

ved sentrifugering, og det løselige antigenprodukt renses og kon-sentreres. Ytterligere antigenmateriale som består av drepte hele organismer, kan fremstilles fra levende organismer ved en hver egnet metode som innbefatter bruk av formalinbehandling eller varmedreping, hvorav sistnevnte foretrekkes. Varme-

dreping av organismene av A2-serotypen, av P. haemolytica eller av organismer som gir ytterligere antigenmateriale, kan utføres ved oppvarming av de levende organismer ved en tempe-ratur på minst 50°C over et tidsrom på minst 10' minutter fortrinnsvis minst 16 minutter f.eks. ved ca. 60°C i ca. 16 minutter.

Antigenmateriale som er fremstilt ovenfor eller på annen måte, innføres i en vaksineformulering som normalt også inneholder andre komponenter inklusive hjelpestoffer og andre materialer så som konserveringsmidler. Alle egnede hjelpestoffer kan brukes innbefattet fullstendig Freund's hjelpestoff (GFA) eller ufullstendig Freund<1>s hjelpestoff (IFA). I en foretrukket ut-førelsesform er imidlertid et aluminiumhydroksyd gel-olje hjelpestoff funnet å være spesielt egnet "for bruk i vaksinene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse, hvilket på fordelaktig måte unn-går noen av de uønskede bivirkninger, f.eks. sterk lokal in-flammasjon som følger etter inokulering med vaksiner hvilke inneholder Freund's hjelpestoffer. F.eks. er et spesielt foretrukket hjelpestoff et'■/ AHi<y>dro<g>el-olj<e>"-hjelpestoff, idet antigen-materialet adsorberes på Aihydrogel og den resulterende suspensjon emulgeres med en egnet olje så som"Bayol F<u>som fortrinnsvis inneholder 10 % " Aracel".

Konsentrasjonen av antigenmateriale i vaksinen kan variere

som ønsket, f.eks. avhengig av doseringshastigheten til vak-

sinen, og i denne henseende er den normale anvendte dose gene-

relt ca. 1 til 2 ml. Generelt inneholder hver vaksinedose ca.

0,1 - 20 mg antigen-materiale, spesielt fra ca. 0,5 mg opp til 10 mg f.eks. ca. 5 mg antigenmateriale av hver serotype som inngår i vaksinen.

For forebygning og kontroll av pasteurellosis, f.eks. for

bruk i husdyrhold, gis vaksine fremstilt ifølge oppfinnelsen til dyrene, f.eks. sau eller storfe, normalt i form av en subkutan injeksjon. Dyrene kan vaksineres raskt etter fødselen for å gi dyrene beskyttelse mot pasteurellosis i et tidlig stadium av livet,

selv om det kan være ønskelig at et visst tidsrom etter fødselen har gått før vaksine gis slik at dyrets immunologiske system får anledning til å utvikle mer fullstendig evne til å reagere på vaksinen. I tilfelle av lam kan det f.eks. være ønskelig å la et minimum tidsrom på fire uker gå mellom fødsel og vaksinasjon. Vaksinasjonen kan også utføres ved spesielle tider på året for å gi beskyttelse mot vanlige årstidsbetingede ut-

brudd av pasteurellosis. F.eks. kan saueflokker vaksineres sent på våren eller derC.omkring med vaksiner fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse som inneholder P. haemolytica A serotype antigen-materiale for å gibeskyttelse mot utbrudd av pneumonisk pasteurellosis som gjerne opptrer i saueflokker om sommeren. Den foreliggende oppfinnelse gir for første gang en effektiv vak-

sine som gir effektiv beskyttelse mot pneumonisk pasteurel-

losis hos sau. Med fordel kan vaksiner fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse også brukes for å tilveiebringe beskyttelse mot pasteurellosis generelt inklusive septacaemisk pasteurellosis hos sau og pneumonisk pasteurellosis hos storfe.

Oppfinnelsen er videre beskrevet i illustrerende hensikt gjennom de følgende eksempler som vedrører fremstilling .av pasteurellosis-vaksiner og prøving av disse vaksiner i sauer.

Eksempel 1

3 monovalente vaksiner fremstilles fra A2-serotype av Pasteu-realla haemolytica og prøves på sau mot angrep av en aerosol av den homologe serotype. De tre vaksiner inneholder: 1. varme-drepte hele organismer (HKO) i en aluminiumhydroksyd-gel (Al-hydrogel)/olje hjelpemiddel (AO), 2. "kapselekstrakt i fullstendig Freund<1>s hjelpestoff (CFA) og 3. det samme ekstrakt i

II

aluminiumhydroksyd-gel ( Alhydrogel)-olje-hjelpestoff (AO) . Fremstillingen av de tre vaksiner er som følger:

Vaksine- fremstilling

HKO i AO

Organismer av P. haemolytica serotype A2, stamme FA2 dyrkes, renheten kontrolleres og inokuleres i "Oxoid nr. 2"medium som dyrkes ved 37°C.i 18 timer under røring. Den resulterende vekst inokuleres i 1,5 liter "Oxoid nr. 2" medium som deretter inkuberes 6 timer under de samme betingelser. Vekst fast-slåes å være i området 10 9 organismer pr. ml bestemt ved levedyktighets—tellinger og ved hjelp av et EEL nefelo-meter. Bakteriene høstes ved sentrifugering ved 4°C i 20 minutter ved 12 000 g. Bakteriene drepes deretter ved varmebe-handling ved 60°C i 16 minutter.

Den optimale konsentrasjon av varme-drepte organismer for ad-sorpsjon på aluminiumhydroksyl—gel ( "Al-hydrogel") , bestemmes ved filtrering. Antigenene adsorberes så på aluminiumhydroksyd-gel og den resulterende suspensjon emulgeres i samme volum av "Bayol F" som inneholder 10 % "Aracel A".

Kapselekstrakt i AO

Serotype A2, stamme FA2 organismer dyrkes og høstes som i fremstillingen av HKO'et i AO—vaksinen som ovenfor er beskrevet. Etter høsting oppslemmes imidlertid bakterie—avsetning i 1,0 M natrium-salicylat i destillert vann til 1/10 av det opprinnelige volum. Suspensjonen rystes så ved 37°C i 3 timer og sentrifu-geres ved 2 800 g ved 4°C i 40 minutter. Supernatanten i dia-lyserør dialyseres deretter mot tre skift av fosfatbufferet saltvann (pH 7,2) ved 4°C over et tidsrom på 48 timer og kon-sentreres deretter til en tredjedel av volumet ved fordampning ved 37°C.

Antigen-aktiviteten til konsentratet kan bestemmes ved titrering i en indirekte haemagglutineringsprøve mot et standard kanin-antiserum av den homologe serotype av P. haemolytica. Kapselekstraktet kan frysetørkes og lagres ved -2 0°C.

I likhet med for HKO-vaksinen bestemmes den optimale konsentrasjon av kapsel-antigen ved titrering, kapselekstraktet adsorberes på"Aihydrogel" og den resulterende suspensjon emulgeres med et likt volum "Bayol" som inneholder "Aracel"hvilket gir et A2-kapselekstrakt i AO-vaksine.

Kapselekstrakt i CFA

Kapselekstrakt av type A2, stamme FA2, organismer av P. haemolytica fremstilles som ovenfor beskrevet. A2-kapselekstrakter i den samme konsentrasjon som i kapselekstraktet i AO-vaksinen innføres så ved homogenisering i destillert vann i CFA (én del av kapselekstrakt til én del hjelpestoff).

Vaksinasjon og inokulering

Grupper på syv 2-3 uker gamle spesifike patogenfrie (SPF), hysterektomisk avledede, råmelkawente lam ble vaksinert ved subkutan injeksjon med 2 ml alikvoter av HKO i AO, kapselekstrakt i AO og kapsel-ekstrakt i CFA-vaksine henholdsvis.

Åtte lam fikk bli ubehandlet for å virke som kontroller. Blodprøve ble tatt av lammet før vaksinasjon, ved ca. 3 ukers intervaller og ved nekropsi. Åtte uker etter vaksinasjon ble lammene infisert intranasalt og intratrakialt med log-^Q 7,2 TCID n av P13 parainfluensa—virus og en uke se5nere utsatt 15 minutter for en aerosol som inneholdt 3,1 x 10 P. haemolytica type A2 stamme FA2 organismer pr. liter. Det anslås at hvert

7

lam fikk en dose på ca. 1,0 x 10 organismer..

Lammene ble observert 5 dager etter eksponeringen med P. haemolytica aerosol og kliniske poeng for sykdomsgrader ble registrert. 6 av de 29 lam, fire i kapselekstrakt AO-gruppe og

to uvaksinerte døde eller ble avlivet på grunn av sterk sykdom innen 5 dager fra inokulering. Resten av lammene ble avlivet i tilfeldig rekkefølge mellom 7 og 10 dager etter inokul-lering, og lungene til lammene ble undersøkt med hensyn til lesjoner og poengene registrert.

Basis for de kliniske poeng og lesjonspoeng er som følger: Matthet, pyrexia (>4 2,8°C) eller abnormal respirasjon fikk hvert et poeng, og død fire poeng hvilket ga et poengtall for hvert lam mellom 0 og 4 pr. dag. Overflateområdene av lesjonene på rygg og bukdelene av lungediagrammene ble målt med et plani-meter og uttrykt som en andel: 0 = ingen lesjoner, 5 <=> opp til 10 %, 10 <=> 11 til 25 %, 20 = >25 % angrepet lungeflate.

På slutten av eksperimentet ble de daglige kliniske poengtall for hvert dyr addert. Statistiske forskjeller mellom de kliniske poengtall, lungelesjons-poengtall og totale poengtall (klinisk + lesjonspoengtall) for gruppene ble bestemt ved hjelp av Mann-Whitney forsøket (Snedecar & Cochrane (1967) Statis-tical Methods 6. utg. (side 130)).

De erholdte resultater er angitt nedenfor i tabell 1 sammen med resultatet av statistisk analyse ved Mann-Whitney rangerings-forsøket.

Som man ser er det ingen statistisk påviselig forskjell mellom de kliniske poengtall for hver av de vaksinerte grupper og de uvaksinerte kontroller. Imidlertid er det betydelig lavere pneumoniske lesjonspoengtall i gruppene som er vaksinert med HKO i AO og kapselekstrakt i CFA. De totale poengtall i HKO

i AO-vaksinater var tydelig forskjellig fra sådanne for kapsel-ekstrakt—vaksinerte lam.

Serum fra lammene ble undersøkt med hensyn til antistoffer mot P. haemolytica serotype A2 ved den indirekte haemaggLutinerings-prøven (IHA) 3, 6 og 9 uker etter vaksinasjon og nekropsi. Ingen lam hadde påviselige antistoffer. Ved imidlertid å bruke Immunofluorescensantistoff-prøven (FAT), ble 21 av de 22 vaksinerte lam funnet å ha påviselig antistoff 6 uker etter vaksinasjon, og alle vaksinater som var prøvet ved nekropsi hadde styrker på mellom 1/256 til 1/2048.

De samlede erholdte resultater indikerer de overlegne immunogene egenskaper for varmedrepte hele mikroorganismer av A2 serotype i sammenligning med kapselekstrakt, og indikerer også eksistens av en ønsket kombinasjonseffekt av disse varmedrepte organismer med det spesifike Al-hydrogel-ol je-h jelpestof f et.

Eksempel 2

En kombinert varme-drept helorganisme (HKO) og kapselekstrakt (CE) monovalent vaksine i et aluminiumhydroksyd-gel/olje-hjelpestoff (AO) fremstilles fra A2—serotypen av P. haemolytica og prøves i sau. HKO-og CE-antigenmaterialet fremstilles og formuleres i en AO-hjelpestoff-vaksine hovedsaklig som beskrevet i eksempel 1 og gir en vaksine som inneholder 2,2 mg HKO og 5,6 mg CE antigenmateriale pr. 2 ml dose. En gruppe på ti lam vaksineres med 2 ml dose av vaksinen, og denne gruppe sammen med en kontrollgruppe på ti lam inkuberes deretter med en aerosol av A2-organismer og kontrolleres med hensyn til kliniske tegn på sykdom og deretter ved post mortem lungeundersøkelse hovedsaklig som tidligere beskrevet. De erholdte resultater er gitt nedenunder i tabell 2 som angir den effektive beskyttelse som nås ved kombinasjon 1s A2-vaksine.

Eksempel 3

Kombinert P. haemolytica Al- og A2- serotype- vaksine

Organismer av P. haemolytica serotype A2, stamme FA2 og serotype Al, stamme FAl ble dyrket og høstet som forut beskrevet for serotype A2 i eksempel 1. Kapselekstrakt ble fremstilt fra Al-organismene og A2-organismene ble varme-drept også som forut beskrevet. Frysetørket kapselekstrakt av serotype Al ble rekonstituert og innført ved homogenisering i destillert vann i "CFA" eller "IFA"

(1 del kapselekstrakt til 1 del hjelpemiddel). Drepte hele organismer av serotype A2 ble frysetørket og homogenisert i CFA Difco eller IFA ved en styrke på 10 mg/l vaksine.

21 SPF lam mellom 9 og 25 dager gamle ble tilfeldig oppdelt i grupper på 10 og henholdsvis 11 lam. Gruppene på 10 ble alle

vaksinert subkutant med 1 ml CFA-vaksine som inneholdt 19 mg/ml P. haemolytica type Al, kapselekstrakt og 10 mg/ml type A2 HKO. En måned senere ble de samme lam revaksinert med de samme antigener i IFA. Fire uker etter den andre vaksinasjonen ble begge grupper av lam infisert med P13-virus (10 7 ' 3TCID^^) og en uke senere med en aerosol av P. haemolytica type Al og type A2 i like forhold. Som i eksempel 1, ble lammene eksponert i tilfeldig oppdelte grupper på fire i 15 minutter. Atmosfæren innneholdt 2,7 x IO<5> organismer/l med begge serotyper tilstede i like store andeler. Lammene ble undersøkt med hensyn på kliniske sykdomstegn over et tidsrom på 5 dager etter infeksjon med P. haemolytica. Lam som overlevde ble drept mellom 7 og 10 dager etter eksponering for aerosolen og lungene til alle lammene ble undersøkt med hensyn til lesjoner. Kliniske og lungelesjons-poengtall ble bestemt som i eksempel 1 og resultatene er angitt nedenfor i tabell 4.

Seks uvaksinerte lam døde eller måtte drepes i løpet av fire dager fra inkubasjonen. Ingen vaksinerte sauer døde. Alle bortsett fra en av de vaksinerte viste imidlertid noen klinisk abnormalitet selv om deres kliniske poengtall var betydelig forskjellig (P 0,01) fra de uvaksinerte lammene. Alle uvaksinerte lam hadde pneumoniske lesjoner som innbefattet mer enn 1 fjerde-del av lungeoverflaten, mens to vaksinerte lam ikke hadde noen lesjoner, fem hadde lesjoner som ikke berørte mer enn 10 % av lunge-overf laten og tre hadde mer utstrakte lesjoner. Både lungele-sjonspoengtallene og de totale poengtall var betydelig forskjellige (P<0,01) hos de vaksinerte og uvaksinerte lammene.

Vaksinasjon med denne kombinerte Al- og A2-serotype-vaksine reduserer betydelig graden av pneumoni som følger av inkubasjon med en kombinasjon av de samme serotyper.

Eksempel 4

Kombinert P. haemolytica Al-, A2- og A6- serotype- vaksine

Organismer av P. haemolytica serotyper Al, A2 og A6, stammer

FA1, FA2 og FA6 henholdsvis, ble dyrket og høstet som beskrevet

i foregående eksempler, og innført i en AO hjelpestoff-vaksine. Varme-drepte hele organismer av type A2 ble fremstilt også som forut beskrevet, kapselekstrakter av stammer FA1 og FA6 ble fremstilt ved natrium-salicylat-ekstraksjon. Natriumsalicylat-ekstraktet ble sentri-fugert ved 40 000 g i 30 minutter og supernatanten dialysert mot 0,02 M fosfat og 0,03 M natriumklorid ved pH 7,6 i 48 timer og ble så konsentrert til 1/10 av volumet ved ultrafiltrering gjennom"XM 100A Diaflo Amicon" membran.

Konsentratet ble under-

søkt med hensyn på in vitro antigen-aktivitet ved et IHA-for-

søk og tørrstoff-konsentrasjonen bestemt etter ytterligere dialyse mot destillert vann. Kapselekstraktene HKO ble innført i AO-hjelpestoffet som forut beskrevet og ga en vaksine som inneholdt 0,18 mg/ml av Al-kapselekstrakt, 0,75 mg/ml A2-HKO og 0,21 mg/ml A6-kapselekstrakt.

64, 2 og 4 uker gamle/ SPF-lam ble tilfeldig inndelt i åtte grupper, som skulle vaksineres og tilhørende kontrollgruppe slik at aldersområdet på vaksinerte og kontroller var likt. Lam i fire grupper ble vaksinert subkutant bak øret med 2 ml til

hvert individ AO-vaksine som inneholdt 0,37 og 0,42 mg/ml kapselekstrakt fra stammene FA1 og FA6 henholdsvis, og 1,51 mg/ml HKO fra stammen FA2. Åtte uker etter vaksinasjon ble alle lammene infisert intranasalt og intratrakialt med 10 7 ' 7TCID^q av P13-virus. En uke senere ble gruppene av lam inkubert ved eksponering for en aerosol av P. haemolytica. Vaksinerte og til-hørende uvaksinerte kontrollgrupper ble utsatt i tilfeldig inn-delte grupper på fire for aerosoler av stammene FAl, FA2, FA6 og FA9 henholdsvis, stamme FAl aerosol inneholdt 3,8 x 10 4, FA2 1,2 x 10<4>, FA6 1 x IO<3> og FA9 3,1 x IO<4> organismer/l.

Overlevende lam ble drept 7 dager etter inkubering. Kliniske undersøkelser og post mortem eksaminasjon av lunge-lesjoner ble utført som i foregående eksempler og de erholdte resultater sammen med den statistiske analyse av resultatene bestemt ved Mann-Whitney rangeringsforsøket er gitt nedenfor i tabell 5.

De erholdte resultater viser at den kombinerte Al-, A2-og A6-serotype-vaksine gir god beskyttelse mot infeksjon med Al-og A6-serotype og også noe beskyttelse mot angrep av A2-serotype. Det antas at beskyttelsesgraden mot A2-angrep kan økes ved å endre

konsentrasjonen av A2-HKO antigen-materiale i vaksinen.

De erholdte resultater i de foregående eksempler er sammenfat-tet med hensyn til forholdet av gruppens gjennomsnittelige totale poengtall for vaksinerte til sådanne for kontroller i tabell 6 nedenunder og viser den relative beskyttelse som oppnås gjennom de forskjellig undersøkte vaksiner. Resultatet på 0,90 for A9-serotypen i det trivalente vaksinetilfelle d.v.s eksempel 5 ovenfor, kommer av at A9 representerer en heterolog inkubasjon da den ikke var til stede i vaksinen.

Claims (7)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av en pasteurellosis-vaksine, karakterisert ved at antigen-materiale fremstilles fra organismer av Al- og A2-serotypene av P. haemolytica og antigenmaterialet formuleres som en vaksine hvori antigenmaterialet består av kapselekstrakt fra Al-serotypenog varmedrepte hele organismer av A2-serotypen.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at antigenmateriale som stammer fra hvilke som helst andre Pasteurella haemolytica eller P. multocida organismer ved siden av Al- og A2-serotypene av P. haemolytica, inn-føres i vaksinen.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at kapselekstraktantigenmateriale av A2-serotypen av P. haemolytica innføres i vaksinen sammen med antigenmaterialet av varmedrepte, hele A2-organismer.

4. Fremgangsmåte ifølge kravene 1 til 3, karakterisert ved at kapselekstraktantigenmaterialet fremstilles ved salicylatbehandling av organismer.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at organismene behandles med salicylat i konsentrasjoner i området fra 0,1 M opp til 10 M i et tidsrom på 1 til 5 timer.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at organismene behandles med salicylat ved en konsentrasjon på 1 M i et tidsrom på 3 timer.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1 til 6, karakterisert ved at antigenmaterialet absorberes på alu-miniumhydroksydgel som deretter emulgeres med en egnet olje.