DK147453B

DK147453B - Fremgangsmaade til fremstilling af 1-desoxynojirimycin

Info

Publication number: DK147453B
Application number: DK077180AA
Authority: DK
Inventors: Werner Frommer; Delf Schmidt
Original assignee: Bayer Ag
Priority date: 1979-02-23
Filing date: 1980-02-22
Publication date: 1984-08-13
Also published as: US4282320A; DK77180A; DE3060037D1; JPS55114294A; DE2907190A1; EP0015388B1; DK147453C; ATE328T1; ES488865A1; EP0015388A1; JPS6328599B2

Description

o i 147453

Det er kendt, at en række actinorayceter, først og fremmest Actinoplanaceae, danner inhibitorer for glucosid-hydrolaser, fortrinsvis fra fordøjelseskanalens carbonhydrat-spåltéftde enzymer, jfr. DE-offentliggørelsesskrift nr. 2.064.092.

5 Desuden er det kendt, at nojirimycin, et bakterio- statisk virkende antibioticum fra stammer af slægten Streptomyces, hæmmer visse mikrobielle a-glucosidaser, jfr. T. Niwa et al., Agr. Biol. Chem., 966, (1970).

Det er yderligere kendt, at inhibitorer for glu-10 cosidhydrolaser, især 1-desoxynojirimycin, dannes af organismer fra familien Bacillaceae, især af stammer fra slægten Bacillus, i gængse næringsopløsninger ved temperaturer på ca. 15°C til ca. 80°C under luftning i gængse fermenteringsbeholdere, idet dyrkningen altid gennemføres 15 ved en konstant temperatur inden for det angivne temperaturområde, jfr. DE-offentliggørelsesskrift nr. 2.726.899.

Overførelse af denne i laboratorieskala særdeles gode fremgangsmåde til en gæringsbeholder i stor størrelse har hidtil været ledsaget af udbyttetab. Denne ulempe har 20 nu overraskende nok kunnet overvindes, og samtidig er der ved ændring af nogle fremgangsmådeparametre blevet opnået en flere ganges udbyttestigning i forhold til den hidtidige laboratoriefremgangsmåde.

Den foreliggende opfindelse angår således en forbed-25 ret fremgangsmåde til fremstilling af 1-desoxynojirimycin ved dyrkning af en stamme af slægten Bacillus i en gængs næringsopløsning ved en temperatur på ca. 15°C til ca.

80°C under beluftning i en gængs fermenteringsbeholder og efterfølgende isolering af 1-desoxynojirimycinet, hvilken 30 fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man i næringsopløsningen anvender sorbit som carbonkilde. Fremgangsmåden er desuden fortrinsvis ejendommelig ved, at man starter dyrkningen ved en temperatur mellem 15°C og 30°C, og inden for et tidsrum, som omfatter den anden halvdel af den logarit-35 miske vækstfase samt den første halvdel af den stationære 2

O

1Λ7Λ53 fase, forhøjer temperaturen til 30 C til 50 C.

1-Desoxynojirimycin på særlig ren form og i særdeles godt udbytte fremstilles ved, at man gennemfører isoleringen på den følgende måde. Efter fraskillelse af cellerne 5 adsorberes kulturopløsningen først på stærkt sure ionbyttere (H+-form), desorberes derpå med 0,5 N til 2 N ammoniakopløsning, hvorefter de aktive fraktioner adsorberes på en svagt sur ionbytter (H+-form), desorberes med o,02 N til 0,1 N mineralsyre, f.eks. saltsyre, og de aktive frak-10 tioner chromatograferes derefter på en stærkt basisk ionbytter (OH -form), og det basiske, aktive eluat inddampes til tørhed, optages ved forhøjet temperatur i et polært opløsningsmiddel, fortrinsvis 60 til 100%·s vandig metha-nol, og krystalliseres ved afkøling.

15 Der anvendes organismer fra slægten Bacillus, hvor arterne B. subtilis, B. subtilis var. niger, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. longisporus og B. polymyxa er særligt egnede. Af disse arter er stammerne DSM 292, DSM 356, DSM 36, DSM 740, DSM 741, DSM 1, 20 DSM 479, DSM 365, DSM 742, DSM 7, DSM 372, DSM 675, DSM 704, DSM 1060, DSM 1061, DSM 1062, DSM 1063, DSM 1054, DSM 1065, DSM 1066 og DSM 1067 at foretrække.

De bedste resultater opnås med stammerne DSM 7 og DSM 704.

25 ··

Stammerne er deponeret i Deutsche Sammlung fur

Mikroorganismen i Gottingen og kan rekvireres derfra.

Udførlige beskrivelser af stammerne, for så vidt de er deponeret som patentstammer hos DSM, fremgår af DE-offent- liggørelsesskrift nr. 2.726.899. Dette litteratursted beskri-30 ver også udførligt metoder til at finde frem til egnede stammer, den tekniske anvendelse af 1-desoxynojirimycin som 35 147453 3

O

inhibitor for glucosidhydrolaser, afprøvningsmetoder til konstatering af inhibitionsvirkningen af 1-desoxynoji-rimycinet som amylase-inhibitor, saccharase-inhibitor og maltase-inhibitor samt farmaceutiske præparater af 1-des-5 oxynojirimycin og deres fremstilling.

På tale som nitrogenkilde til næringsopløsningerne kommer de mest forskelligartede, organiske substanser, eksempelvis gærekstrakt, sojamel, peptoner og kødekstrakt.

Koncentrationen af sorbit og nitrogenkilder samt 10 næringssalte, hvorunder eksempelvis kan nævnes FeS04,

CaC03 og MgSO^, kan svinge inden for vide grænser. I mange tilfælde kan man helt give afkald på den separate tilsætning af næringssalte, da de ofte er indeholdt som iblandinger i de komplekse nitrogenkilder.

15 Da dannelsen af 1-desoxynojirimycin ofte er stærkt afhængig af sammensætningen af næringssubstraterne, kan det anbefales at dyrke stammerne i forskellige næringsopløsninger til optimering af produktionsydelsen. Tilsvarende forslag fremgår af eksemplerne.

20 1-Desoxynojirimycin er et krystallinsk produkt med 540.000 SIE/g. (SIE = Saccharase-Inhibitor-Enhed; definitionen fremgår af DE-offentliggørelsesskrift nr.. 2.726.899, side 4).

Forbindelsen har strukturformlen

H

25 CH,OH

Η0-""'—

J[_H H °H

30 Forbindelsen blev beskrevet første gang af S. Inoye et al., Tetrahedron, 23, 2125, (1968). Forfatterne fremstillede 1-desoxynojirimycin ad kemisk vej ved hydrering af antibiotiket nojirimycin. Udgangsproduktet nojirimycin fremstilles ifølge T. Niida et al., J. Anti- 35 biotics, Ser. A. 20, 62, (1967) ved fermentering af organismer af slægten Streptomyces.

O

147453 4 1-Desoxynojirimycin tjener desuden som udgangsprodukt til fremstilling af N-substituerede 1-desoxynojiri- myciner, som ligeledes udviser inhibitorisk virkning over for glucosishydrolaser, jfr. DE-offentliggørelsesskrift 5 nr. 2.738.717.

De følgende eksempler tjener til nærmere belysning af fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Sammenlfgningseksempei 10 Hvis man poder en 1 1 Erlenmeyerkolbe, som indeholder 120 ml af en næringsopløsning med sammensætningen 6.5 vægt-% glycerol 3.0 vægt-% sojamel 0,2 vægt-% CaCOg 15 ledningsvand indtil 100 vægt-%, og som steriliseres ved 30 minutters opvarmning til 121°C, med en sporesuspension af stammen DSM 7 og dyrker i kolben på en rundrystemaskine ved 28°C, opnår man efter 5 dages 20 dyrkning en aktivitet på 630 SIE/ml.

Eksempel 1

Hvis man poder en 1 1 Erlenmeyerkolbe, som indeholder 25 120 ml af en næringsopløsning med sammensætningen 6.5 vægt-% sorbit 3.0 vægt-% sojamel 0,2 vægt-% CaCO^ ledningsvand indtil 100 vægt-%, 30 og som steriliseres ved 30 minutters opvarmning til 121°C, med en sporesuspension af stammen DSM 7 og dyrker i kolben på en rundrystemaskine ved 28°C, opnår man efter 5 dages dyrkning en aktivitet på 1320 SIE/ml.

35 147453 5

O

Eksempel 2

Hvis man dyrker udgangsblandingen ifølge eksempel 1 i 45 timer ved 28°C og derefter forhøjer temperaturen til 5 35°C, dannes der efter i alt 5 dages fermentering en kul turvæske med 1820 SIE/ml.

Eksempel 3 10 Hvis man dyrker udgangsblandingen ifølge eksempel 1 i 65 timer ved 28°C og derefter forhøjer temperaturen til 42°C, dannes der efter i alt 5 dages fermentering en kulturvæske med 2070 SIE/ml.

15 Eksempel 4

Hvis man dyrker udgangsblandingen ifølge eksempel 1 i 45 timer ved 28°C og derefter forhøjer temperaturen til 420c, dannes der efter i alt 5 dages fermentering en kul-20 turvæske med 2530 SIE/ml.

Sammenligningseksempel

Hvis man poder en 1 1 Erlenmeyerkolbe, som indeholder 25 120 ml af en næringsopløsning med sammensætningen 5.0 vægt-% glycerol 0,9 vægt-% caseinhydrolysat 1.0 vægt-% gærekstrakt 0,1 vægt-% CaCO^ 30 0,1 vægt-% k2hpo4 ledningsvand indtil 100 vægt-%, og som steriliseres ved 30 minutters opvarmning til 121°C, med en sporesuspension af stammen DSM 704 og dyrker i kolben på en rundrystemaskine ved 28°C, opnår man efter 5 dages 35 dyrkning en aktivitet på 25 SIE/ml.

o 147453 6

Eksempel 5

Hvis man poder en 1 1 Erlenmeyerkolbe, som indeholder 120 ml af en næringsopløsning med sammensætningen 5 5,0 vægt-% sorbit 0,9 vægt-% caseinhydrolysat 1,0 vægt-% gærekstrakt 0,1 vægt-% CaCO-j 0,1 vægt-% K2HP04 10 ledningsvand indtil 100 vægt-%/ og som steriliseres ved 30 minutters opvarmning til 121°C, med en sporesuspension af stammen DSM 704 og dyrker i kolben på en rundrystemaskine ved 28°C, opnår man efter 5 dages dyrkning en aktivitet på 120 SIE/ml.

15

Eksempel 6

Hvis man dyrker udgangsblandingen ifølge eksempel 5 i 45 timer ved 28°C og derefter forhøjer temperaturen til 20 35°C, dannes der efter i alt 5 dages dyrkning en kultur væske med 339 SIE/ml.

Eksempel 7

ftC

Hvis man dyrker udgangsblandingen ifølge eksempel 5 i 45 timer ved 28°C og derefter forhøjer temperaturen til 42°C, dannes der efter i alt 5 dages dyrkning en kulturvæske med 342 SIE/ml.

30 Eksempel 8_

Til 360 1 kulturvæske ifølge eksempel 1 sættes der 3,6 1 2 M oxalsyre, og derefter indstilles der med halv-koncentreret HNO^ på en pH-værdi på 3,2. Der omrøres i 35 30 minutter og centrifugeres derefter i en overløbscen- 7

O

147453 trifuge ved2500 omdr./min. Den 300 1 let uklare, ovenstående væske sættes til en 30 x 50 cm med den stærkt sure ionbytter Lewatit ® SC 104 H+ (Bayer AG) fyldt kolonne med en strømningshastighed på 200 1/h.

5 Derefter vaskes der med 400 1 afioniseret vand.

Gennemløb og vaskevand er inaktivt og kastes bort. Kolonnen desorberes derefter med 130 1 IN ammoniak, og eluatet opsamles i 10 1 fraktioner. De aktive fraktioner 4 til 9 samles og sættes til en 15 x 80 cm, med den svagt 10 sure ionbytter Lewatit® CNP H+ (Bayer AG) fyldt kolonne.

Der vaskes med 150 1 af ioniseret vand, og de inaktive gennemløbs- og vaskevandsfraktioner kastes bort. Der·? efter elueres der med 0,05 N HC1 med en strømningshastighed på 20 1/h. Eluatet opsamles i 10 1 fraktioner,

15 og de aktive fraktioner 3 til 10 samles og sættes til en 15 x 40 cm, med den stærkt basiske harpiks Lewatit® M

5.00 OH (Bayer AG)· fyldt kolonne. Der efterelueres med destilleret vand. Gennemløb og vaskevand fra M 500 kolonnen fraktioneres i 10 1 portioner, og de aktive frak-20 tioner 1 til 12 samles og koncentreres under formindsket tryk til ca. 400 ml. Til det fremkomne, sirupagtige koncentrat sættes der under opvarmning (50°C til 60°C) 1600 ml methanol, de uopløste partikler skilles fra ved filtrering i varm tilstand, og man lader det klare filtrat afkøle.

25 i løbet af natten begynder krystallisationen efter tilsætning af podekrystaller. Efter 2 dage ved 4°C skilles krystallerne fra ved sugning, vaskes 2 gange med methanol, 1 gang med acetone og 1 gang med ether og tørres under formindsket tryk. Udbyttet er 360 g ren desoxynojirimycin-30 base. Yderligere råsubstans kan udvindes af krystallisa-tionsmoderludsvæskerne ved yderligere koncentrering.

35