DK146822B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af derivater af 4-desacetyl-vinblastin eller salte deraf - Google Patents

Description

(19) DANMARK

(12) FREMLÆGGELSESSKRIFT ud 146822 B

DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Patentansøgning nr.: 3985/77 (51) Int.CI.3: C 07 D 519/04 (22) Indleveringsdag: 07 sep 1977 (41) Alm. tilgængelig: 09 mar 1978 (44) Fremlagt: 16 jan 1984 (86) International ansøgning nr.: -(30) Prioritet: 08 sep 1976 US 721650 (71) Ansøger: EU "LILLY AND COMPANY; Indianapolis, US.

(72) Opfinder: George Joseph "Culllnan; US, Koert "Gerzon; US.

(74) Fuldmægtig: Patentbureauet Hofman-Bang & Boutard _ (54) Analogifremgangsmåde til fremstilling af derivater af 4-desacetyl-vinblastin eiler salte deraf

Den foreliggende opfindelsen angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte derivater af 4-desacetyl-vinblastin med ® den i krav l’s indledning anførte almene formel I eller farmaceutisk

CM

acceptable salte- deraf, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved CO

(ø det i krav l's kendetegnende del anførte.

T"

Disse hidtil ukendte derivater af 4-desacetyl-vinblastin er nyttige Ω som anti-neoplastiske midler.

146822 2

Adskillige naturligt forekommende alkaloider, der opnås ud fra Vinca rosea, har vist sig at være aktive ved "behandling af eksperimentelt inducerede ondartede sygdomme hos dyr. To af disse alkaloider, nemlig vinblastin (VLB) og leurocristin, markedsføres nu som midler til behandling af ondartede sygdomme, især leukæmi og lignende sygdomme, hos mennesker. Af disse forbindelser er leurocristin den mest aktive og nyttige forbindelse ved behandling af leukæmi, men samtidig det antineoplastiske alkaloid i Vinca rosea, der findes i mindst mængde.

Kemiske modifikationer af Vinca-alkaloider har kim været foretaget i begrænset omfang. For det første er de omhandlede molekylære strukturer ekstremt komplekse, og det er vanskeligt at udvikle kemiske reaktioner, der kun påvirker en bestemt funktion i molekylet. For det andet synes den antineoplastiske aktivitet at være begrænset til meget specifikke strukturer, og chancerne for at opnå mere aktive midler ved modifikationer af disse strukturer synes derfor at være tilsvarende små. Blandt de modifikationer, der er gennemført med held hos de fysiologisk aktive alkaloider, er fremstillingen af vinblastin-C-3-carboxamid-derivater, hos hvilke man har fundet en væsentlig in vivo virkning over for transplanterede tumorer hos mus (belgisk patentskrift nr. 813 168). Et eksempel på en sådan forbindelse er vindesin (4-desacetyl-viriblastin-C-3-carboxamid), den eneste af de nævnte forbindelser, der markedsføres kommercielt.

Det har nu vist sig, at de med den foreliggende opfindelse tilvejebragte derivater af 4-desacetyl-vinblastin udviser aktivitet over for en eller flere neoplastiske sygdomme. De har en væsentlig grad af specificitet i deres virkning. Neoplastiske sygdomme udvikler ofte modstandsdygtighed over for et aktivt middel. Det har vist sig, at de omhandlede forbindelser har virkning overfor visse leukæmistammer, der er resistente overfor vineristin og vindesin. Disse hidtil ukendte forbindelser giver således lægen yderligere midler til anvendelse mod neoplastiske sygdomme. De udgør også alternativer til midler, over for hvilke der er udviklet modstandsdygtighed. De omhandlede forbindelser har tilsyneladende en nedsat neurotoxicitet sammenlignet med vineristin.

3 140822

Ikke-toxiske syrer, der kan anvendes til dannelse af de farmaceutisk acceptable syreadditionssalte af aminbaserne, omfatter salte afledt af uorganiske syrer, såsom saltsyre, salpetersyre, phosphor-syre, svovlsyre, hydrogenbromidsyre, hydrogeniodidsyre, salpetersyrling, phosphorsyrling og lignende samt salte af ikke-toxiske organiske syrer, omfattende alifatiske mono- og dicarboxylater, phenylsubstituerede alkanoater, hydroxyalkanoater og alkandioater, aromatiske syrer, alifatiske og aromatiske sulfonsyrer etc. Sådanne farmaceutisk acceptable salte omfatter således sulfat, pyrosulfat, bisulfat, sulfit, bisulfit, nitrat, phosphat, mono-hydrogenphosphat, dihydrogenphosphat, metaphosphat, pyrophosphat, chlorid, bromid, iodid, acetat, propionat, decanoat, caprylat, acrylat, formiat, isobutyrat, caprat, heptoanat, propiolat, oxalat, malonat, succinat, suberat, sebacat, fumarat, maleat, butyn-1,4-dioat, hexyn-1,6-dioat, benzoat, chlorbenzoat, methylbenzoat, dinitrobenzoat, hydroxybenzoat, methoxybenzoat, phtlialat, tereph-thalat, benzensulfonater, toluensulfonat, chlorbenzensulfonat, xylensulfonat, phenylacetat, phenylpropionat, phenylbutyrat, citrat, lactat, 2-hydroxybutyrat, glycollat, malat, tartrat, metbansulfonat, propansulfonat, napb.tb.alen-1 -sulfonat og naph-thalen-2-sulfonat.

Det som udgangsmateriale ved den omhandlede fremgangsmåde anvendte 4-desacetyl-vinblastin-C-3-carboxazid kan fremstilles på følgende måde:

Man behandler VLB (vinblastin) eller dennes 4-desacetyl-derivat med hydrazin til dannelse af det tilsvarende hydrazid. Produktet af denne reaktion med udgangsmaterialer indeholdende en intakt 4-ace-tylgruppe er sædvanligvis en blanding af forbindelser, hvori C-3-carbomethoxygruppen er omdannet til en carboxhydrazidgruppe, men hvori C-4-acetylgruppen tillige er helt eller delvis fjernet. De således fremstillede C-4-desacetyl-derivater renses ved adskillelse ved hjælp af chromatografi. Generelt udfører man reaktionen ved at starte med 4-desacetyl-derivatet af VLB.

146822 4 C-4-Desacetyl-C-3-carboxhydrazid-derivatet omdannes derefter til det tilsvarendecarboxazid ved behandling med salpetersyrling, -nitrosylchlorid, nitrogentetroxid, amylnitrit eller et lignende middel på kendt måde. Det således fremstillede C-3-carboxazid omsættes herefter ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen med en amin med formlen (CH2)m-CH2-SY, hvori m og Y har de i krav 1 angivne betydninger. Den ovennævnte azid-amin-omdannelse sker på den måde, som er beskrevet af Stoll og Huffman, Helv. Chim. Acta., 26, 944 (1943) — se også USA patentskrifterne nr. 2 090 429 og nr. 2 090 430. I eksemplerne nedenfor udførtes reaktionen i methylenchlorid. Andre egnede opløsningsmidler, der heller ikke reagerer med azidet, er chloroform, acetonitril, acetone, benzen og toluen.

De hidtil ukendte derivater fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen benævnes kun med reference til de nye grupper, der er indført ved et givet carbonatom. For eksempel vil den forbindelse, der fremstilles ved at erstatte methylesterfunktionen i VLB ved C-3 med en amidfunktion, simpelt blive kaldt VLB C-3 carboxamid og ikke VLB C-3 descarbomethoxy C-3 carboxamid.

De omhandlede forbindelser i form af deres frie baser kan være hvide eller lysebrunt farvede, amorfe, faste stoffer. Det foretrækkes imidlertid, hvor det er muligt, at isolere og krystallisere carbox-amiderne i form af deres anioniske salte, dannet med ikke-toxiske syrer. Sådanne salte er højtsmeltende, hvide, krystallinske eller amorfe, vandopløselige faste stoffer.

Følgende eksempler illustrerer nærmere fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

EKSEMPEL 1 ^lDSSåoetYl-VLB-C-3-N2l2-methYlmercaptoethYl2“carboxamid

En opløsning af 1,8 g 4-desacetyl-VLB-C-3-carboxhydrazid i vandig methanol blev omsat med 100 ml IN saltsyre, og den herved opnåede opløsning blev afkølet til 0 °C. Der tilsattes 180 mg natriumnitrit, og den fremkomne reaktionsblanding omrørtes i 10 minutter, medens 146822 5 temperaturen holdtes ved 0 °C. Reaktionsblandingen blev herefter gjort basisk ved tilsætning af et overskud af kold 5% vandig natrium-bicarbonat. Det dannede 4-desacetyl-VLB-C-3-carboxazid opløstes i methylenchlorid, og opløsningen anbragtes i en kolbe forsynet med et tørrerør og en omrører. Der tilsattes 4 g methylmercaptoethyl-amin, og reaktionsblandingen omrørtes natten over ved stuetemperatur. Opløsningen vaskedes herefter en gang med vand, tørredes over natriumsulfat og filtreredes, og opløsningsmidlet afdampedes i vakuum. Remanensen ledtes til en silica-kolonne og elueredes med ethyl-acetat-methanol (3:1) som elueringsmiddel. Fraktionerne indeholdende N-(2-methylmercaptoethyl)-carboxamid kombineredes, og opløsningsmidlet afdampedes i vakuum. Udbyttet var 540 mg, og carboxamidet havde følgende fysiske egenskaber: Elementæranalyse, S blev fundet til 3,47% (3,87% beregnet); infrarødt absorptionsspektrum, toppe ved 1740 og 1675 cm-1; NMR tf 2,12 (-SCH3), tf 2,80 (-NCH3), tf 3,58 (-COOCH3), tf 3,78 (ArOCH3); massespektrum 827 m/e 841 (transmethy-lering) 486 (vindolin-halvdel), ingen top ved 813.

Sulfatsaltet fremstilledes på sædvanlig måde.

EKSEMPEL 2 iiDesacetyl-VLB-C-S-N-n-methYlmercagtggrggYlJcarbgxamid 4,0 g 4-desacetyl-VLB-hydrazid omdannes til det tilsvarende azid med 200 ml IN saltsyre og 400 mg natriumnitrit som beskrevet i eksempel 1. 5 g methylmercaptopropylamin sattes til en opløsning af azidet i methylenchlorid, og opløsningen omrørtes natten over ved stuetemperatur under samme betingelser som i eksempel 1. Opløsningen vaskedes en gang med vand, tørredes over natriumsulfat, filtreredes og inddampedes. Remanensen ledtes til en silica-kolonne og elueredes med methylenchlorid:ethylacetat:methanol (1:1:1). Passende fraktioner kombineredes, og opløsningsmidlet afdampedes i vakuum. Udbyttet var 1,86 g. Carboxamidet havde følgende fysiske karakteristika: Grundstofanalyse 53,71% (beregnet 53,80%); infrarøde absorptionsmaksima ved 1720 og 1660 cm ^; NMR: tf 2,08 (-SCH3), S 2,79 (1-NCH3), S 3,58 (-COOCH3), tf 3,76 (~ArOCH3); massespektrum 841 m/e 855 (transmethylering) 500 (vindolinhalvdel).

146822 6

Sulfatsaltet fremstilledes på sædvanlig måde.

EKSEMPEL 3 ilDɧS£StYiiYLB-C-3-_(_N22-merca£tgethYl2carboxamid_og_bis-i[4-des-acetyl-VLB C-3-(N-2-ethylcarboxamid)]disulfid 12 g 4-desacetyl-VLB-C-3-carboxhydrazid omdannedes til det tilsvarende azid ved metoden beskrevet i eksempel 1. Herefter opløstes 68,2 g 2-mercaptoethylamin-hydrochlorid i en minimal mængde vand, og den fremkomne sure opløsning blev gjort alkalisk med koncentre-.ret vandig natriumhydroxid. Den således dannede 2-mercaptoethyl-amin som fri base separeredes fra, idet den var uopløselig i den alkaliske fase, og den ekstraheredes derefter med eth'ylacetat. Den vandige fase ekstraheredes yderligere med ether og med methylenchlo-rid. De organiske ekstrakter blandedes, og opløsningsmidlerne fjernedes derfra ved afdampning. Den tiloversblevne amin opløstes i en minimal mængde methylenchlorid og sattes til en opløsning af azi- det fremstillet som ovenfor i 500 ml methylendichlorid. Reaktionsblandingen opvarmedes til 100 °C i 5 minutter og afkøledes derefter.

20 ml pyridin tilsattes, og blandingen omrørtes natten over ved stuetemperatur. Herefter tilsattes et overskud af 5% vandig natriumbicarbonat, og den organiske og vandige fase adskiltes.

Den organiske fase vaskedes tre gange med vand og tørredes, og opløsningsmidlet fjernedes ved afdampning i vakuum. Remanensen, der bestod af en blanding af 4-desacetyl-VLB-C-3-(N-2-mercapto-ethy1)carboxamid og bis-[4-desacetyl-VLB-C-3-(N-2-ethylcarboxamid)] disulfid dannet ved reaktionen ovenfor, adskiltes ved chromatogra-fi over silica, idet der anvendtes 1:1:1 methylenchlorid/ethyl-acetat/methanol indeholdende 2% triethylamin. Det opnåedes to fraktioner, en med en R^ = 0,5 og en anden med R^ = 0,25. Begge fraktioner havde adskillige i det væsentlige identiske fysisk-kemis- · ke egenskaber som følger: m/e = 827 (molecularion + transmethy-lering), 486; infrarødt spektrum: toppe ved 1730 og 1670 cm ^ (i chloroform); NMR i det væsentlige identiske.

146822 7

Materialerne blev differentieret efter struktur ved følgende kriterier: Det hurtigt bevægende materiale, der benævnes = 0,5-‘ fraktion, havde tre titrerbare grupper (i 66 procent vandig dime-thylformamid) ved pK 5,3, 7,38 og 11,8. Den langsomt bevægende fraktion = 0,25, havde kun to titrerbare grupper, og disse fremkom ved pK 5,2 og 7,5. Det hurtige materiale havde således en ekstra titrerbar gruppe, der kan være sulfhydrylgruppen ved 03 amider. Sulfhydrylgruppen er naturligvis ikke til stede i disulfidet, der er fraktionen med R^ = 0,25. Endvidere viser NMR-analyse, at begge fraktioner havde toppe i 173,6 - 173,8 området i overensstemmelse med et sekundært amidcarbon (vindesin — et 03 car-boxamid og også et primært amid - har en top ved 176,7). Begge prøver havde mange identiske toppe, og de eneste to fremmede toppe i Rf = 0,5 fraktionen var ved 42,3 og 24,2, og R^ = 0,25 fraktionen havde ekstra toppe ved 38,0 og 37,6. Fortolkning af disse 13C NMR-spektre viser, at førstnævnte stofs toppe stemmer med carbon-atomeme i de usubstituerede sidekæder (mercaptoethylamid), og sidstnævnte toppe stemmer med samme fortolkning, dog med den undtagelse, at svovlet er substitueret (som i disulfidet). Molekylvægten bestemt ved osmose for Rf = 0,25 fraktionen var 1770 (beregnet 1624), hvilket igen svarer til en disulfidstruktur. Sulfidanalysen for R^ = 0,5 fraktionen var 0,8, og for R^ = 0,25 fraktionen var den 0.

De omhandlede forbindelser med formel I har nyttige biologiske virkninger i sammenligning med beslægtede forbindelser, der i stedet for gruppen -NH-fC^ ^-CE^-SY indeholder en gruppe -NEL,. Sådanne forbindelser findes eksempelvis omtalt i tysk offentliggørelsesskrift nr.

2 415 980, og de omfatter den velkendte og kommercielt markedsførte forbindelse vindesin.

P388 ,er en leukæmiart, som hyppigt anvendes i eksperimenter med mus til afprøvning af anti-tumormidler. Man har udviklet en stamme af P388/ som er resistent over for vineristin, og som benævnes P388/VCR (Biochem- Pharmaco1. 24, 751 (1975)). P388/S er den normale stamme, som er følsom overfor behandling med VDS (vindesin), VLB (vinblastin) eller VCR (vineristin) og tillige overfor behandling med Bis-ES (bis-^Z-desacetyl VLB C-3 carboxamidoethyl/disulfid).

146822 8

Mens P388/VCR er resistent overfor VDS og VCR, er den følsom overfor både Bis-ES og MME (4-desacetyl VLB C-3 /N-2-methylmercapto-ethylcarboxamid/. Dette fremgår af eksperimentelt arbejde udført af The National Cancer Institute (I), Lilly Laboratories (II) og The Southern Research Institute (III) (se den efterfølgende tabel).

I forsøg I angiver de anførte data den procentvise livsforlængelse beregnet på dag 49. T angiver toxicdteten. VDS, VCR og Bis-ES udviser en mærkbar livsforlængende virkning på mus i ikke-toxiske dosisniveauer overfor P388/S. VDS og VCR udviste ingen livsforlængelse overfor P388/VCR, men Vis-ES frembragte en væsentlig forlængelse.

I forsøg II udviste hverken VDS eller VCR nogen livsforlængende virkning, mens det modsatte var tilfældet for såvel MME som Bis-ES.

I forsøg III er livsforlængelsen udtrykt i procent udregnet på dag 49. Antallet af levende cancerceller i musene blev også beregnet. Under de anvendte forsøgsbetingelser bevirkede VCR og VDS en livsforlængelse på henholdsvis 50 og 100%. Ved anvendelse af lavere doser udviste Bis-ES en større forøgelse af levetiden, nærmere bestemt 85-145%. En optælling af cancercellerne er imidlertid mere g afslørende. Alle dyr blev podet med 10 P388/VCR-celler. I mus behandlet med VCR forøgedes tallet 270 gange; i mus behandlet med VDS formindskedes tallet med 75%. Hos mus behandlet med Bis-ES af-- tog tallet med 99,95% og blev derved mindre end 1/2000 af det oprindelige tal (dosis 1,6 mg/kg).

Tre laboratorier har således med tre forskellige stammer af mus samstemmende fundet, at Bis-ES er mere virksom overfor P388/VCR-leukæmi end BDS, og et af forsøgene (forsøg II) viste, at også MME er mere virksom end VDS.

146822 9

TABEL

Aktivitet af vindesin-analoge overfor leukæmier af typerne P388/S, P388/VCK og P388/VCR/I/63 a forsøg Id forsøg iie

forbindelse13 dosisc P388/S P388/VCR dosisc P388/VCR

VDS 3,00 T(0) T(0) 1,20 3(0) 1.80 138(0) -8(0) 0,90 5(0) 1.08 129(0) 0(0) 0,60 0(0) 0,648 96(0) 4(0) MME ikke udført 1,20 6(0) 0,90 42(0) 0,60 20(0)

Bis-ES 3,00 T(0) T(0) 1,20 22(0) 1.80 50(1) 33(0) 0,90 54(0) 1.08 96(1) 46(0) 0,60 35(0) 0,648 129(0) 50(0) VCR 1,67 96(1) T(0) 1,20 0(0) 1.00 138(1) 0(0) 0,90 0(0) 0,60 83(0) 0(0) 0,60 5(0) 0,36 83(0) 0(0) forsøg ΙΙΙ3/:£ omtrentligt omtrentligt median celledrab/ antal celler - dosis i live ved , døds- (logarit- behandlingens forbindelse” dosisc dag %ILS misk)_slutning_

Bis-ES l,6g 24,5 +145 2,9 4,5 X 10^ 1.0 21,5 +115 2,3 3,0 X 1θ£ 0,7 18,5 +85 1,7 2,0 X 10 VDS 2,0 20,0 +100 2,0 2,5 X 105 VCR 1,5 15,0 +50 1,0 2,7 X 108

— C

10° cellepodestof implanteret ip på dag 0. Data er angivet som % forøgelse af levetiden (overlevende på dag 49) ^Sulfatsalt cDosis i mg/kg ip på dag 1, 5 og 9-Grupper på 8 hanmus CD2Flf NCI.

146822 10 eGrupper på 10 B6D2F^ mus. Test udført på Lilly Laboratories ved anvendelse af den cellestamme, der opnåedes fra NCI anvendt i forsøg I.

^Data fra Southern Research Institute, Birmingham, Al.

Grupper på 10 Dublin-CDF^ hanmus. Kontroldyrenes gennemsnitlige dødsdag: 10,0. xCellernes fordoblingstid: 0,49 dage.

146822 11

Ved anvendelse af de omhandlede carboamider som antineoplastiske midler kan enten den parenterale eller orale vej ved indgivelsen anvendes. Til oral dosis blandes en passende mængde af et farmaceutisk acceptabelt salt af en base med formel I dannet med en ikke-toxisk syre med stivelse eller et andet forstrækningsmiddel, og blandingen anbringes i teleskop-gelatinekapsler, indeholdende hver 7,5 - 50 mg aktivt materiale. På lignende måde kan det antineoplastiske aktive salt blandes med stivelse, et bindemiddel og et smøremiddel, og blandingen kan presses til tabletter, der hver indeholder 7,5 - 50 mg af saltet. Tabletterne kan deles, hvis lavere eller neddelte doser skal anvendes. Til dette formål anvendes isotoniske opløsninger indeholdende 1-10 mg/ml af et salt af et 4-desacetyl-vinblastin-derivat med formlen I. Forbindelserne indgives i mængder fra 0,01 til 1 mg/kg og fortrinsvis fra 0,1 til 1 mg/kg legemsvægt en eller to gange om ugen eller hver anden uge afhængig af både aktiviteten og toxiciteten af midlet. En alternativ metode til at nå til en terapeutisk dosis er baseret på lege-mets overflade med en dosis på 0,1 til 10 mg/m legemsoverflade hver 7. eller 14. dag.

Claims (5)

12 146822 P_a_t_e_n_t_k_r_a_v__;

1. Analogifremgangsmåde til fremstilling af derivater af 4-des-acetyl-vinbiastin med den almene formel I s' OH 7' eV\ ---4*Π---C2H5 , Α·=\·ν m· \v5 Y^7 C-O-CHa 14 | ' || Formel I H | 0 I 8 ! ,4 '°t— i <a s *-* 3·----CHa-CHa CHa-O—i^6 Jl. i® 4l—OH V»Vo^/ ’7 1 ; “3 !

6-NE-(CH„) -CH0-SY II 2 ra 2 0 hvori m er 1, 2 eller 3, og Y er H, C^_C^-alkyl eller en binding til endnu et svovlatom i endnu en enhed med formlen I eller farmaceutisk acceptable salte deraf, kendetegnet ved, at man omsætter 4-desacetyl-vinblastin-C-3-carboxazid med formlen: 13 146822 s' OH t--- /\<°’\’0'vx 12. i—8 I

13 X /\e'/\e'/' Formel II >, 5 7 \~C-0-CHs 14 i | II H 0 I 8 ! 14 ,oj—f7^!]7 i .· "I l’° !!e 1<ί ---CH2-CH3 CHs-O—i’6 i X 4l—OH vw " <k I J I i-Ns II 0 med en amin med formlen H2N-(C^^"‘-^“SY, hvori m og Y har samme betydning som defineret ovenfor med den begrænsning, at Y er H eller C^-C3~alkyl, og udvinder produktet med formel I i form af det frie amid eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf.

2. Analogifremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at reaktionen udføres i methylenchlorid.

3. Analogifremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at reaktionen udføres ved stuetemperatur.

4. Analogifremgangsmåde ifølge krav 1, 2 eller 3 til fremstilling af bis-[4-desacetyl-vinblastin-C-3-carboxamidoalkyl]-disulfider, kendetegnet ved, at man omsætter 4-desacetyl-vinblastin- C-3-carboxazid med formel II med en amin med formel H-N-(CH~) -CH--SH 2. m 2 i nærværelse af en base.

5. Analogifremgangsmåde ifølge krav 1-4 til fremstilling af bis-[4-desacetyl VLB C-3 (N-2-ethylcarboxamid)]-disulfid, kendetegnet ved, at man omsætter 4-desacetyl VLB C-3-carboxazid med 2-aminoethylmercaptan i nærværelse af en base.