DK145506B - Analysefremgangsmaade til enzymatisk bestemmelse af substrater i biologiske vaesker - Google Patents

Description

(19) DANMARK [{&

a \RB

W (12) FREMLÆGGELSESSKRIFT (11) 11(-5506 B

DIREKTORATET FOR

PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning nr. 999/75 (51) IntCI.3 C 12 Q 1/00 (22) Indleveringsdag 12. mar. 1975 (24) Løbedag 12. mar. 1975 (41) Aim. tilgængelig 15· s ep. 1975 (44) Fremlagt 29 · HOV. 1982 (86) International ansøgning nr.

(86) International indleveringsdag (85) Videreførelsesdag - (62) Stamansøgning nr. -

(30) Prioritet 14. mar. 1971), 2412554, DE

(71) Ansøger BOEHRINGER MANNHEIM GMBH., 6800 Mannheim-Waldhof, DE.

(72) Opfinder SIgmar Klose, DE: August Wilhelm Wahlefeld, DE:

Alexander Hagen, DE.

(74) Fuldmægtig Firmaet Chas. Hude.

(54) Analysefremgangsmåde til enzymatisk bestemmelse af substrater I biolo= giske væsker.

Den foreliggende opfindelse angår en analysemetode til enzymatisk bestemmelse af substrater i biologiske væsker, navnlig i legemsvæsker, især serum, ved phosphorylering af substratet eller et deraf enzymatisk opnået omsætningsprodukt med ATP i nærværelse af en specifik kinase under frigørelse af ADP, omsætning af sidstnævnte med phos-phoenolpyruvat i nærværelse af pyruvatkinase under dannelse af pyru-vat, hydrogenering af pyruvatet ved hjælp af NADH i nærværelse af lactatdehydrogenase og måling af NADH-forbruget.

00 p Ved analyser bestemmes bestanddele i biologiske væsker hyppigt efter S) følgende generelle reaktionsskema:

JO

% S + ATP spec· kinase^ s_pll0Spliat + ADP

^ ADP + PEP ATP + pyruvat Ω pyruvat + NADH v L-lactat + NAD.

2 145506 I de ovenstående ligninger betyder S substratet, der skal bestemmes, eller et deraf ved en forudgående enzymatisk reaktion opnået omsætningsprodukt, ATP adenosintriphosphat, S-phosphat phosphoryleret substrat eller omsætningsprodukt, ADP adenosindiphosphat, PEP phos-phoenolpyruvat, PK pyruvatkinase, NADH reduceret nikotinamid-adenin-dinukleotid, LDH lactatdehydrogenase og NAD oxideret nikotinamid-ade-nin-dinukleotid.

Ved den ovenstående reaktionsrækkefølge er mængden af det ved den første reaktion dannede ADP direkte proportional med den ubekendte mængde S. Måleresultatet udtrykkes ved forbruget af NADH, som måles rutinemæssigt ved bestemmelse af absorptionsformindskelsen ved 340 nm, Hg 365 eller Hg 335. Det ovennævnte reaktionssystem er generelt anvendeligt til bestemmelse af materialer, som under indflydelse af en specifik kinase kan phosphoryleres ved hjælp af ATP under dannelse af ADP, eller til bestemmelse af materialer, fra hvilke tilsvarende phos-phorylerbare omsætningsprodukter kan opnås.

Det ovenfor anførte reaktionsskema benyttes navnlig i det klinisk-kemiske laboratorium i stort omfang til bestemmelse af forskellige substrater, hvorved specificiteten for et bestemt substrat opnås ved hjælp af den specifikke kinase. Systemet har imidlertid den ulempe, at der i biologiske væsker, såsom legemsvæsker, og navnlig i serum i reglen foreligger andre materialer, som ligeledes kan føre til en MDH-forbrugende reaktion. Dette gælder ganske særligt for endogent pyruvat. En yderligere grund til at tage hensyn til en blindprøve-værdi er den forskellige egenabsorption hos biologiske væsker eller legemsvæsker ved de nævnte bølgelængder, f.eks. på grund af deres bilirubinindhold. Man har derfor hidtil i reglen gennemført sådanne bestemmelser under medtagning af en blindprøveværdi, ved hvilke bestemmelser den specifikke kinase, altså det phosphorylerende enzym, mangler. Ved subtraktion af de ved de to parallelbestemmelser opnåede resultater kan indholdet af det søgte materiale bestemmes.

Det er derved en ulempe, at der kræves dobbelt så meget af de i sig selv meget dyre enzymatiske reagenser, end det ville være påkrævet til bestemmelsen, hvorfor reagensudgifterne praktisk taget fordobles. En ulempe er det endvidere, at gennemførelsen af fremgangsmåden med de for tiden brugbare analyseautomater kun er mulig, når to målekanaler står til rådighed.

3 145506

En anden mulighed for afhjælpning af den som følge af endogene materialer forårsagede fejl består i, at de endogene materialer lades afreagere før tilsætning af den specifikke kinase, at NADH-forbruget måles ved en første bestemmelse, at den specifikke kinase derpå tilsættes, og at NADH-forbruget på ny bestemmes. Denne fremgangsmåde er tidsrøvende og har den særlig alvorlige ulempe, at den overhovedet ikke er gennemførlig på de kendte automatiske analyseapparater.

Opfindelsen tager derfor sigte på at angive en fremgangsmåde af den ovenfor beskrevne art, ved hvilken der kun skal gennemføres en enkelt måling, og ved hvilken forbruget af enzymer formindskes. Desuden skal fremgangsmåden være egnet til gennemførelse på sædvanlige analyseautomater.

Dette opnås ifølge opfindelsen ved hjælp af en analysefremgangsmåde af den indledningsvis nævnte art, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at væskeprøven i fravær af den specifikke kinase og under tilstedeværelse af et NADH-regenererende enzymatisk system omsættes med de til reaktionsrækkefølgen krævede reagenser, at enzymerne derpå skilles fra reaktionsopløsningen ved hjælp af en semipermeabel membran, at den specifikke kinase, pyruvatkinase og lactatdehydroge-nase sættes til filtratet, og at målingen::, gennemføres.

Det bemærkes, at eftersom NADH har en tilstrækkelig lav molekylvægt, diffunderer den gennem den semipermeable membran.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen egner sig principielt til alle enzymatiske analysefremgangsmåder, ved hvilke enten selve substratet, som skal bestemmes, eller også produktet fra en forudgående enzymatisk reaktion omsættes med ATP og den tilsvarende specifikke kinase under dannelse af ADP. Eksempler på sådanne fremgangsmåder er bestemmelsen af fri glycerol (Klin. Wschr. 40, 362 (1962)), neutralfedt (Klin. Wschr. 44, 262 (1966)), creatinin (Scand. J. Clin. Lab. Invest. 29, suppl. 126 (1972)), glucose (Biochem. Z. 328, 499 (1957)).

Hvis selve den specifikke kinases substrat bestemmes, eksempelvis i tilfælde af målingen af frit glycerol, så tilsættes kun den herfor specifikke kinase, i det pågældende tilfælde altså glycerolkinase. Såfremt kinasen phosphorylerer et fra substratet, som egentlig skul 4 145506 le bestemmes, enzymatisk opnået omsætningsprodukt, kræves endvidere det enzymatiske reaktionssystem til udvinding af omsætningsproduktet fra substratet i det første fremgangsmådetrin.

Et eksempel herpå er neutralfedtbestemmelsen (triglyceridhestemmelse), hvorved fedtstofferne omsættes med lipase og eventuelt esterase under dannelse af glycerol og fedtsyre, og dannet glycerol derpå atter phosphoryleres med ATP og glycerolkinase.

De til reaktionsrækkefølgen nødvendige reagenser er foruden de nævnte.enzymer ATP, PEP og NADH samt hjælpestoffer, såsom puffermaterialer, uorganiske salte, eksempelvis magnesiumsulfat, eventuelt overfladeaktive stoffer og lignende. Alle disse stoffer er kendt for fagmanden indenfor rammerne af den reaktionsrækkefølge, som skal gennemføres, og behøver ikke her at blive beskrevet i enkeltheder.

Eet UAEH-regenererende enzymatiske system består i det væsentlige af en NAEH-specifik dehydrogenase samt et substrat for denne dehydrogenase. Ifølge opfindelsen foretrækkes et sådant system, som indeholder alkoholdehydrogenase og som substrat alkohol. Andre NÆH-specifikke dehydrogenaser og substrater for disse kan imidlertid anvendes på samme måde.

Som semipermeabel membran anvendes en membran, som tilbageholder æggehvidestoffer, men som lader lavmolekylære materialer gå igennem. Fortrinsvis anvendes dialysemembraner, ultrafiltreringsmembraner og ‘membraner for omvendt osmose.

Ved gennemførelsen af fremgangsmåden ifølge opfindelsen på en i handelen gående analyseautomat kan der som semipermeabel membran til fraskillelse af proteiner anvendes det i sådanne apparater i reglen tilstedeværende dialyseapparat. Det er derfor muligt at gennemføre fremgangsmåden ifølge opfindelsen på sådanne automater uden at måtte ændre disse, og uden at en anden målekanal er nødvendig. Ved denne udførelsesform for opfindelsen gøres derfor i princippet brug af en sektionsopdeling af omsætningerne, hvorved de enzymatiske reaktioner, med undtagelse af phosphoryleringen med ATP (som følge af mangel på den specifikke kinase), forløber i en første sektion, at de lavmolekylære bestanddele derpå gennem den semipermeable membran overgår 5 145506 til en anden sektion, uden at nogen som helst målinger er nødvendige, at den specifikke kinase, PE og LDH derpå tilsættes i den anden sektion, og at NADH-forbruget måles fotometrisk. Eftersom også det NADH-regenererende system ved hjælp af den semipermeable membran ud-kobles som følge af fraskillelse af den hertil nødvendige dehydrogenase, svarer det målte NADH-forbrug kun til mængden af phosphoryle-ret substrat under udelukkelse af forstyrrende reaktioner. Omfanget af de således undgåede forstyrrende reaktioner ses, når man f. eks. for serum sammenligner de dér sædvanlige pyruvatkoncentrationer med de koncentrationer, som forskellige materialer til bestemmelse ved den ovenfor beskrevne fremgangsmåde normalt har i serum:

Koncentration % pyruvatindhold normalområde regnet i forhold til o , . ,, . , n, substratet, der skal

Serumbestanddel (mmol) , , ______bestemmes_

Pyruvat 0,05 - 0,07 ---- triglycerid 0,8-1,94 3% til 10% frit glycerol 0,03 - 0,145 30% til 200% creatinin 0,07 - 0,13 40% til 100%

Den ovenstående tabel viser, at blot den som følge af pyruvat betingede forstyrrelse kan andrage op til det dobbelte af den som følge af substratet betingede måleværdi. Hertil kommer, at også andre generende stoffer, såsom bilirubin, i mange tilfælde er til stede i de biologiske væsker, hvilke stoffers indflydelse ligeledes udelukkes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Por at vise dette blev stigende mængder bilirubin (indtil 10 mg/100 ml) opløst i en serum. Bestemmelsen af glycerolindholdet med en sådan reagensblanding resulterede i samme værdier med og uden bilirubin. Ved udeladelse af det NADH-regenererende system opnåedes ca. 10# højere måleværdier, som beror på det endogene pyruvatindhold, men som på overraskende måde var praktisk taget uafhængigt af bilirubinkoncentrationen. Ved hjælp af fremgangsmåden ifølge opfindelsen udelukkes derfor også forstyrrelser, som kan føres tilbage til en egenfarvning af den biologiske væske. Hvorpå denne virkning beror, er ikke kendt.

6 145506

Ved fjernelsen af nødvendigheden af at bestemme en blindprøveværdi nedsættes forbruget af dyre enzymer med indtil 50%, og samtidigt bibeholdes ikke blot fremgangsmådens automatanvendelighed, men det bliver også muligt at arbejde med sådanne analyseautomater, som kun har * en enkelt målekanal, I analyseautomater med to målekanaler friholdes ikke alene en målekanal til andre bestemmelser, men også håndteringen bliver væsentligt enklere, eftersom den tidsmæssige, elektroniske og optiske afbalancering af to analyseautomatkanaler spares.

Ifølge opfindelsen udelukkes også forstyrrelser som følge af et indhold af højmolekylære proteiner, som spreder lyset kraftigt og på denne måde simulerer en lysabsorption, eksempelvis i stærkt lipæmi-ske sera.

Særligt gode resultater blev ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen opnået med ethanol og alkoholdehydrogenase som HADH-regenererende system, når ethanolkoncentrationen i det mindste androg 2 g/100 ml puffer, og ADH-koncentrationen i det mindste androg 180 IU/ml. Egnet viste sig i dette tilfælde navnlig triethanolamin-puffer, 0,05 til 0,2 M, med pH 7-8.

Opfindelsen belyses nærmere i de følgende eksempler.

Eksempel 1.

Glycerolbestemmelse.

Ved bestemmelsen blev en vandig prøve med en glycerolkoncentration på 30 mg/100 ml benyttet. Indflydelsen af pyruvat blev studeret ved tilsætning af 2, 4, 6, 8 og 10 mg pyruvat/100 ml til prøven. Bestemmelsen blev udført på autoanalysatoren II. generation, en analyseautomat fra firmaet Technicon i U.S.A. Dette apparat arbejder med et kontinuerligt strømningssystem, og doseringerne af de enkelte reagenser angives derfor i enheden ml/min. Til fraskillelse af enzymerne benyttedes en i handelen gående dialysecelle fra firmaet Technicon i II.S.A. Prøven blev (0,05 ml/min.) fortyndet med en opløsning indeholdende triethanolamin-puffer, 0,1 molær, pH = 7,6, HADH (0,025 mmol), ATP (0,13 mmol), PEP (0,04 mmol), magnesiumsulfat (1,0 mmol), ethanol (2 g/100 ml), og enzymerne IDH (1,6 IU/ml), PK (0,3 IU/ml) 145506 7 samt ADH (alkoholdehydrogenase) (180 iu/ml) med en strømningshastighed på 0,8 ml/min. Der dialyseres mod en opløsning indeholdende tri-ethanolamin-puffer, o,l molær, pH = 7,6, med NADH (0,1 mmol),ATP (o,53 mmol), PEP (o,18 mmol) , magnesi-emsulfat (1,0 mmol), LDH (6,4 IU/ml) , PK (1 IU/ml) med en strømningshastighed på 0,6 ml/min.

Dialysatet tilsættes opløsningen af glycerokinasen (2 iu/ml i 7,5 mmol magnesiumsulfat) under blanding, strømningshastighed o,l ml/min. Ekstinktionsformindskelsen udtrykt i skaladele måles efter en inkubationstid på 7,5 min. ved 37°C. Resultaterne er opført i tabel 1.

8 145506

DO VO MD CO

-¾¾. cn o o o o oo cn ο ο ο ο σ\

i—I i—! rH rH

ri cd_____ do ra CD i-l 0J DSD 02

+3 H td H

H s S cd lo lo lo cd l·! Ή ~ ^

ft ·Η <H Cd H CM C\l CM CM H

co ft h o- r~- o- c- c~- o cd

ra J

"Ο ri —---—--- ni l> cd rtf +3 •H ri ? nri cd ri

^jL) h go to cn t- Ή- CD

SCD^-OOHHCMDO r-j

j> ri HHi—IHHH H

<tl CD 'ri CM ri ri f.

Μ ·Η 0) 0 P

ri CD H b0 CD - ' “ 02

rl -P P ®-P 'O

'ri Η I ri ra cd ri cd 0 I t>i H cd •H ft pi tri ra CD LO LOLA bo

CHCoriP'O - ~ S

d CD<t! Cd LO 00 H CO H CO cd CD 02¾ H r-D-OOGOO'iCO bo cts cd

ri ri rM O

CD CD m +3 Ό) τΗ s s ^ ---— 0 H 2

Μ H

rH ri * , CD ·Η Ή ‘d

,£2 >ri OH C— CD

cd ri ri ~ H

^ æ ·Η Ο O CM Ο Η Ο Ο > <Η Ο Ο Ο Ο Ο Ο ri

πΗ ri Η Η Η Η Η Η CD

Η ri d> <|| ο •Η bfl 1 CD Η Η +0,0¾¾. b0

Η I

cd 0 ___ ω ft ri 9

CO ri CD

CD Η

02 CD LO O

ri -

>ri cd CM CM Ή’ CM DO CM O

CD H C— D— D— t~- Lft 0 Cd * M ri ra cd

— ..... - 11 iH

o bOH »ri i ri ø .2

-P -H oH

cd ri o ri ί>-ΡΟ I CM Ή" CO GO O ·Η

ri æn rH

ri ra^ H

>>H bO

Ρ4·Η 0 02 -P > $ —---- ri Η fri

CD CD

i> i> s &= = = = = ri ri

Ph Pc 145506 9

Det ses tydeligt, at kun fremgangsmåden ifølge opfindelsen (spalte 3) med en målekanal giver overensstemmende værdier i forhold til den som korrekt vurderede 2-kanal-metode med prøve-blindværdi (spalte 1).

Eksempel 2

Bestemmelse af neutralfedt i humanserum.

Som prøve valgtes humane sera, som blev tilsat pyruvat i koncentrationerne 2, 4» 6, 8 og 10 mg/100 ml. Der blev arbejdet med apparatur som i eksempel 1 beskrevet. Opløsningerne indeholder følgende bestanddele og pumpes med følgende strømningshastighed:

Prøve: 0,05 ml/min.

Opløsning 1: 0,1 molær triethanolamin-puffer, pH = 7,8, med 0,8 ml/min., indeholdende: 0,025 mmol NADH, 0,13 mmol ATP, 0,04 mmol PEP, 1,0 mmol magnesiumsulfat, 2 g/100 ml ethanol, 1,6 IIJ LDH/ml, 0,26 IU PK/ml, 180 IU ADH/ml, 11 IU esterase/ml, 400 IU lipase/ml og 0,1 mg Na-dodecyl= sulfat/ml.

Opløsning 2 (dialysat): 0,1 mol triethanolamin-puffer, pH - 7,6, med 0,6 ml/min., indeholdende: 0,1 mmol NADH, 0,53 mmol ATP, 0,18 mmol PEP, 1,0 mmol magnesiumsulfat, 6,4 IU LDH/ml og 1,0 IU PK/ml.

Opløsning 3: 7,5 mmol magnesiumsulfat med 0,1 ml/min., indeholdende: 2 IU glycero= kinase/ml.

Inkubationstiden andrager 7,5 min. ved 37°C.

Måleværdierne er opført i tabel 2.

145506 10 OOCMOOO oooooo ^..oooooo oooooo H H Η Η Η Η ri ri ri ri ri ri

Pi 0)______ cm ra

0) H

(D tiO Q) 0) P ri H ri „

H s ri 0) irs o O O

cd Η H 'ri > ·* ·» ·> ft HH cd cn os os css os cn σ\ m m cn cn cn

CO ft H CM CM CM CM CM CM HHHHHH

o cd M ra.

0)

H

H ri

H 0) CO

ri ri ·»

830) VO CM V£> tA 00 H- CA ri O 00 CM 5A

d o cm 5A irs vo co ri ks la vo os ri

HO) HHHHHH ri ri ri ri ri CM

CM ri ri

5)Q H 0) S

ri 0) H 5)00)--—

Η P P 0) P

Η Η i ri co 0) ri cd 3 I ^3 r-3 Λ . .H ft id Μ ra 0) in ιλ in irs irs irs irs Η· Η ω ri fri 'ri » ·> ·< ~ ~ d ω<! cd η irs os η- os la ri la co cm vo o Q) m Η H 1A KS tA Η" Η- IA w c\i cm in m O cd

ri ri M

0) 0) m

Η H

ri ri CM__;____

Η M

0) ri

p Η H

cd H 'ri r_j JLj a3 h oooc-t-c- l> H o o o os css os

H ri fri Η H

H ri ω •H 5)0

0) H

- P P

Hl cd 3_____ ft ri co ri o;

0) H

co o> ri ri cd os os os oo co oo

0) ri CM CM CM CM CM CM

3 I

CQ

5)0 I ri ri P H S cd ri

f>PO I CM ri- M5 CO O I CM ri· U) CO O

ri 830 ri ri ri 0)ri i^ri\ PM H 5)0 P S -__ 5)0 I O S 5)0 I O 3 riSriOri cMSriOri cd ri ri cd ri ri α) ω co ri^· 0) o)ri-ri\0) t> !>tAPPCQ >riPPC0 s <sri dri ®ri dri ri ri co o) ri ri co Q) ri

PM ft II S H 3 ftlldHS

145506 11

Eksempel 3

Udelukkelse af interferenser fra andre farvede materialer.

En prøve, i hvilken neutralfedt skal bestemmes, blandes med en prøve, som har en høj bilirubinkoncentration. (Bilirubin er et i legemet forekommende nedbrydningsprodukt af blodfarvestoffet og viser ved 340 eller 366 nm en grænseabsorption, idet maksimum ligger ved 450 nm). I øvrigt overholdes eksperimentelt de samme betingelser som i eksempel 2 med den undtagelse, at der til kontrol blev målt uden kinase (glycerokinase) i forsøgsrækken i spalte 3.

Resultaterne fremgår af tabel 3.

145506 12 φ <d ra „ ω «cd o o o o o o H ri a κί s φ ·Η «Η m -----

<D ·Η i—I

-p © ø-n-H a-ti φ Μ ω cd o S-dcbH ft m -H id'—' cd co Φ Ή 'ri _

EiO ft ftj Cd o o o o o o

•H O <D H

H 8 $ m r

W

O

•ri S

rd g in ^ m in in ri Ml φ - - - - 83 o+1 2 3 4 5 cn in cn cn σι c<n

> CQ

td t>j CM ri W Φ taD -H cis_____ ri ω H —φ •g +> P ri ri Η I (D ri Φ ri cd a ω φ h •H ft ri cd ri ω Τ' 'Τ' ΤΓ T? "T" tH CO ri ri Φ + + + + + + ri (D Ή ri Cd c- c- t- kn (D CQ H 0) H - - - - *> *

CiJ rictiHHHrHHH -P

ri ri® μ ί id æ M o p d Ti ® fj ri ri ri ^ ΚΛ___- &

_. +> a; W) S

42 φ ri ® 0j 'ri ij Ή W) E4 'ri ri 'ri C- CM o ri ajr" ri ~ Λ 's 83 ri "P *ri o o o cm c- o ri t>a>(D<H o o o o cn o φ

•ririrriri H i—f i—( < f H

3 pj & ud <!I <π <|! a> o ri a) o ri 43 +! fcO* ^ cd θ ri____ ft ri i a--- φ CO ri ω 0) (D “ 0) ί—1 + r-1 s m «I cq cd in in ia ri ri i>3 ri - - ft ri tncdHOOOOCOC-C- Φ (Qirir-IHHrHHHCft ri ri cd cd

ri S * S

CQ ’d ri ---.---æ i>

Mrl Φ 2 ri ri S ri •ri -ri ri 42 ri o φ 3

ri + O O O CM irv O O O

4

ri æn H

ri ra^ 'Τ' ri ri M + •ri -r| a PQ+'-' h c7~ ^ ω Φ CD Φ ί> f> i> !> 5 S S = s E s ri ri ri ri fri ft ft Pi