DE2412354C2 - Enzymatisches Analysenverfahren - Google Patents
Enzymatisches AnalysenverfahrenInfo
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- DE2412354C2 DE2412354C2 DE19742412354 DE2412354A DE2412354C2 DE 2412354 C2 DE2412354 C2 DE 2412354C2 DE 19742412354 DE19742412354 DE 19742412354 DE 2412354 A DE2412354 A DE 2412354A DE 2412354 C2 DE2412354 C2 DE 2412354C2
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Description
40
45
Die Im lindling bezieht sich auf ein Analysenverfahren
zur enzymatischen Bestimmung von Substraten in biologischen Flüssig .eilen, insbesondere im Serum,
durch Phosphorylierung des Substrates oder eines daraus enzymatisch erhaltenen Uinsetzungsproduktes
tnit ATP in Gegenwart einer spezifischen Kinase unter Freisetzung von ADP. Umsetzung des letzteren mit
Phosphoenolpyruvat in Gegenwart von Pyruvatkinase '(inter Bildung von Pyruvat. Hydrierung des Pyruvals
mittels NADII in Gegenwart von Lactatdehydrogenäse
und Messung des NADI!-Verbrauchs.
In der Analytik werden Bestandteile in biologischen flüssigkeiten häufig nach folgendem allgemeinen Reaklionsseheina
bestimmt:
60
spez. Kinase
S -f ATP ■ S-Phosphat 4 ADP
S -f ATP ■ S-Phosphat 4 ADP
PK
ADP f PFP
ATP
DlI
'vruvai + NADII
Pviuvat
l.-I.actal 4 NAD
In den obigen Gleichungen bedeutet S das /u bestimmende
Substrat oder ein daraus durch eine vorgeschaltete enzymatische Reaktion erhaltenes Umsetzuntisprodukt.
ATl1 Adenosintriphosphat. S-Phosphat
phosphor)lieries Substrat oder Umsetzungsproduki.
ADP Adenosindiphosphat. PFP Phosphoenolpyruvat. PK PvTU\atkinase. NADH reduziertes
Nicotinamid-adenin-dinucleotid. LDi I Laciatdehvdrogenase
und NAD ox\dienes Nicolinamid-adenindinueleotid.
Bei der obigen Reaktionsfolge isl die Venge des m
der ersten Reaktion gebildeten ADPs direkt der unbekannten
Menge an S propone
>nai. Meßgröße i>' der Verbrauch an NADH. welches durch Bestimmung
der Absorpiionserniedrigung bei 340 nm. Hg 3(ö
oder Hg 335 routinemäßig gemessen wird. Das obige Reaklionssysiem ist allgemein anwendbar zur Bestimmung
von Substanzen, die unter dem Finfiuß einer spezifischen Kinase durch ATP unter Bildung
von ADP phosphors üert werden können bzw. von Substanzen, aus denen sich entsprechend phosphoiviieibarc
Umsetzungsprodukie erhalten kissen
Das oben dargestellte Reaklionsschema wird insbesondere
im klinisch chemischen Lahor in großem
Umfang zur Bestimmung verschiedene; Subsu-aubeniitzt.
wobei die Spezililäi für ein bestimmtes Substrat
leweils durch die spezifische Kinase erzieh wiui.
Das Svslem hat jedoch den Nachteil, daß m biologischen
Flüssigkeiten, wie Körperflüssigkeiten und insbesondere
im Serum, in der Regel andere Substanzen vorliegen, die ebenfalls /u einer NAl)I I-\ei biauehcnden
Reaktion führen. Dies gilt ganz besonders für endogenes Pyruvat. Lin wer.erer Grund fin die berücksichtigung
eines Probenleer" ei ies ist u;e unieischiedliche
Figenabsorption der biologischen bzw. Körperllüssigkeiten bei den genannten Wellenlängen.
/. B. auf Cirund ihres Biliruhingehalies. Man hat daher
derartige Bestimmungen bisher in der Regel unter Mitführung eines Probenleei wertes, in dem die spezifische
Kinase. also das phosphorylierendc 1 nzvm. fehlt, durchgeführt. Dureil Subtraktion der in ilen
beiden Parallelbestimmungen erhaltenen Prgebnisse läßt sich dann der Gehalt an der gesuchten Substanz
bestimmen. Nachteilig daran ist. daß doppell so viel der an sich sehr teuren enzymaiischen Reageniien benötigt
werden als für die Bestimmung erforderlich wäre, mithin die Reagentienkosien praktisch verdoppelt
werden. Nachteilig ist weiter, daß the Durchführung
des Verfahrens mil dem derzeit gebräuchlichen Analvsenautomalen nur möglich ist. wenn zwei
Meßkanäle zur Verfügung stehen.
Fine andere Möglichkeit zur Beseitigung des durch endogene Substanzen verursachten Fehlers besteht
darin, die endogenen Substanzen vor /ugahe der spezifischen
Kinase abreagieren zu lassen, in einer eisten Bestimmung den NADH-Veibrauch zu messen, dann
die spezifische Kinase zuzusetzen und erneut den NADll-Verbrauch zu bestimmen. Dieses Verfahren
ist aufwendig und hat den besonders schweren Nachteil, daß es auf den bekannten automatischen Analysengerälcn
überhaupt nicht durchführbar isl.
Der Fründung liegt daher die Aufgabe zugrunde,
ein Verfahren der oben beschriebenen ArI zu schaffen,
bei welchem nur eine einzige Messung durchgeführt werden muß und bei welchem der Verbrauch an
Fnzymen verringert wird. Außerdem soll das Verfahren
zur Durchführung auf gebräuchlichen Analvsenautomalen ueeiüiu'i sein.
Gelöst wird diese Aufgabe hei einem Verfahren der
obengenannten Art ciTmdungsgemäß dadurch, dall
4k· Flüssigkeitsprone in Abwesenheit der spe/iiischen
Kinase und in fieren wart eines NA D! l-rcüt'P.erierjp.-4c
η en/>niatisehen Systems mil den für die Reaktions-
|t)lge benötiglcn Reagenzien umgesetzt wird, anschließend
die 1 nzvine durch emc semipermeable
Membran aus der Reaktionslösung abgetrennt werden. die spezifische Kinase. Pyruvatkinase und I.aclatdehydrogenase
dem l-'illr;it zugesetzt werde.ι und die Messung durchgeführt wird.
Das \'erl"ahren der Frfindung eignet sich prinzipiell
für alle en/ymatischen Analyseiiverfahren. bei welchen
entweder das zu bestimmende Substrat ;elbsl oder aber das Produkt einer vorgcschaltclen en/ymatisehen
Reaktion mit Ali1 und der entsprechenden spezitiichen
Kinase umgesetzt wird unter Bildung von Al)P.
Beispiele für derartige Verfall!cn sind die Bestimmung
ton freiem Glycerin iKhn. Wschr.. 40. .Vi2 I1IWOI.).
Neulralletl (Kim. Wschr.. 44. 2(>2 | l%f,]t. (reaiinm
(Scand. .I.Ciin. I.ab. ln\est.. 2'). Suppl ! 2fi j I9721I.
Glucose (Bii'chem. /.. >2N. 4'J1J | 1957 ||.
Wird das Substrat der spezifischen Kin.ise selbst
bestimmt, beispielsweise im lalle der Mcssun-j. um
fteiem Ghcerin. so wird nur die hierfür spezilische
Kinase. im Beispielslali also (jlycerinkinase. zugesetzt.
I alls die Kinase ein aus dem eigentlich zu Iv
stimmenden Subsirai enzv malisch erhaltenes I m
set/ungsproduki phosphoryücrl. ist zusätzlich noch
das enzymatische Reaklionssystem zur Gewinnung des l:mselzungsproduktes aus dem Substrat in der
ersten Verfahrenssl nie erforderlich.
um Beispiel hierfür ist die Neulrallclthesiimmung
(Triglyderidbestimmungl. wobei die Fette mit I.ipase
und gegebenenlalls Isteiase umgesetzt werden unter Hildung von Glycerin und Fettsäure und gebildetes
Glycerin dann wiederum mit AIP uud Glycerinkinase
phosphorvliert wird.
Die für die Reaktionsfolge benötigten Reagenzien sind a 111.Wr den erwähnten Fnzymen AIP. PI. P und
NAf)H auch die llilfsstoffe wie PulTersiibstanzen. anorganische
Salze, beispielsweise Magnesiumsulfat, gegebenenfalls
oberflächenaktive Substanzen u. dgl. Alle diese Stoffe sind dem Fachmann im Rahmen dei
durchzuführenden Reaktionsfolge bekannt und brauchen hier nicht im einzelnen beschrieben zu werden.
Das NADIl-regencrierende en/ymatisehc System
besteht im wesentlichen aus einer NADl !-spezifischen
Dehydrogenase sowie einem Substrat für diese Dehydrogenase. Bevorzugt wird im Rahmen der Frfindung
ein derartiges System, welches Alkoholdehydrogenase
und als Substrat Alkohol enthüll. Andere NADH-spezifisehe Dehvdrogenasen und Substrate
Tür diese können jedoch in gleicher Weise verwendet werden. ss
Als semipermeable Membran wird im Rahmen der lirfindung eine Membran verwendet, welche F.iweißstoffe
zurückhält, niedermolekulare Substanzen jedoch durchläßt. Beispiele für geeignete Membranen dieser
Art sind Dialysemembranen, IJItrafiltrationsmcmbranen.
Membranen für die umgekehrte Osmose und ähnliche.
Bei Durchführung des crlindungsgcmäßcn Vcifahrens
aiii einem der handelsüblichen Analysenaulomalen
kann als semipermeable Membran zur Abtrennung der Proteine der in derartigen Apparaten
in der Regel vorgesehene Dialyseapparat eingesetzt werden. J is ist daher möglich, das eriindungsgemäße
Verfahren auf derartigen Automaten durchzuführen, ohne diese abändern zu müssen und ohne daß ein
zweiter Meßkanal erforderlich ist. Bei dieser Aus-ΠΐΙΐΓ.ιη.ιΛ^.,
.-l..r l-'i-Krwlimx .lir/l rl-ih.-r im Prm/!·"!
1 UIM ^ll^JI Vl III VJ*-! I.I IIIIUUllL. ηιι-ι U *4 . · t- ι ·.·· -f
von einer Kompartmenlierung der Umsetzungen Gebrauch
gemacht, wobei die en/ymatischen Reaktionen, ausgenommen die Phosphorylierung mit Al P !infolge
Fehlens der spezifischen Kinase) in einem ersten !■Compartment ablaufen, die niedermolekularen Bestandteile
dann durch die semipermeable Membran in ein /weites (Compartment übertreten, ohne daß irgendwelche
Messungen erforderlich sind, im zweiten (Compartment dann die spezifische Kinase. PK und
Ff)Ii zugesetzt werden und der NADH-Verbratich pholometrisch gemessen wird. Da durch die semipermeable
Membran auch das NADH-rcgenerierende System infolge Abtrennung der hier/u benötigten Dehviirot'crfa.sc
ausgeschalte! uird. cn!spr;chi der gemessene
NADH-Verbrauch allem der Menge de·,
phosphorylierten Substrates unier Ausschaltung der Stön■ ■ ikiionen. Das Ausmali tier so \ eniiieilenen
Slöi u.iklionen wird dabei erkennbar, wenn man
z. B. für Serum die dort üblichen Pyrir.atkonzeniralionen
mit den Konzentrationen vergleich.!, die \crschiedene
nach dem oben beschriebenen Verfahren zu bestimmende Substanzen im Sei um noi ma!erwci\c
aulweisen:
.Hl! Sllll-Ü.Ii
iiiiMi
P\ruvat
Tngiyceride
Ireies (ilvcerm
( real mm
Ireies (ilvcerm
( real mm
0.(15 0.07
O.X 1.94
0.03 0.145
0.07 0.13
y„ bis io"
."MI",, bis 200"
4(1",. bis KHV1
4(1",. bis KHV1
Die obige I abellc liißt erkennen, dal* allem die
durch Pyruval bedingte Störung ein mehrfaches des durch das Substrat bedingten Meßwer'cs ausmachen
kann. Hinzu kommt, daß in den biologischen Flüssigkeiten
in vielen Füllen auch andere störende Stoffe wie
Bilirubin vorliegen, deren Finfluß ebenfalls beim erfindungsgemäßen
Verfahren ausgeschaltet wird I 111
dies zu zeigen, wurden steigende Mengen Bilirubin (bis zu 10 mg KM) mil in einem Serum gelöst. Die Bestimmung
des (ilyceringchaltes mit einem derartigen Reagensgemisch ergab mit und ohne Bilirubin gleiche
Werte Bei Weglassung des NADI !-regenerierenden
S\stems ergaben sich etwa 10"» höhere Meßwerte.
die auf dem endogenen Pyrtnatgchalt beruhen, ledoch überraschenderweise von der Bilirubinkonzentraiion
praktisch unabhängig waren. Durch das erlindimgsgemäße
Verfahren werden daher auch Störungen ausgeschaltet, tue auf eine 1 igenlarbung der biologischen
Flüssigkeit zurückzuführen sind. Woraul dieser I llekt
beruht, ist nicht bekannt.
Durch die Beseitigung der Notwendigkeit, einen Probeiilcerwer! zu bestimmen, wird der Verbrauch an
teuren Pnzymen bis zu 5()"„ herabgesetzt, und gleichzeitig
wild die Aulomalengängigkeit des Verfahrens nicht nur beibehalten, sondern es wird auch möglich.
mit solchen Analysenaiilomalen zu arbeilen, die nur
einen einzigen Meßkanal aufweisen. Bei Analysenauloniaten
mil zw>'i Meßkanälen wird nicht nur ein Meß-
kanal für andere Bestimmungen freigehalten, sondern
aueh die Handhabung wird wesentlich einfacher, denn
der /eilliche, elektronische und optische Abgleich 7WViLT Analvsenaulomatenkanälc wird eingespart
hilindungsgemäß werden auch Störungen durch s
einen Gehalt an hochmolekularen Proteinen, die das
Licht stark streuen und auf diese Weise eine Lichiabsorplion
vortäuschen, ausgeschaltet, beispielsweise bei stark lipämischen Seren.
Besonders gute Hrgebnissc wurden im criindungsgemälk-n
Verfahren er/ielt mit Äthanol und Alkoholdehydrogenase
als NADH-regenerierendes Svslem.
wenn die Alhanolkon/entraiion mindestens 2 g 100ml Puffer und die ADH-Kon/entralion mindestens
1X0 11.' ml betrug. Geeignet erwies sich in diesem I alle insbesondere Triäihanolamin-Puffer 0.05 bis
0.2 M. pH 7 bis X.
Die folgenden Beispiele erläutern die I ilindung » eiler.
B e 1 s ρ ι ■_· I 1
Gh ceri η best i mm im ti
In die Bestimmung wurde cmgeset/l cmc wäHrigc
Probe. Gheenn-Kon/enlralion von 30 mg 100 ml.
Der 1 i η Π ιι (Λ von Pyruval wurde studiert durch /usal/
von 2. 4. 6. S und H) mn Pvruval 100 ml zur Pii.be.
Aussei uhr ι wurde die Bestir,mnni^ am Aulo-Anah/ci.
II. (ienemlion. einem Anahscnauiomatcn der 1 um.:
"I echnicon. LSA. Dieser Apparai aibeiiei mil einem
Kontinuierlichen 1-1IeHr11 sicm, die Dosieiungeii dei
em/elnen Rcagcn/ien werden dcshaib 111 u'li Dimension
im! mm I angegeben, /ur Abirenn 11 n·: der I n/v me
dieme eine handelsübliche Dm!;^c/cIIc der liinia
I echnicon. I.SA. Die Probe ■.'. urdc 10.05 ml mim in:i
einer Lösung, enihalleiid 1 riäihani-lamiii- l'uilei.
0.1 M.pll = 7.6. NADl! !U.H25 mMl.AI Piu.i lm\|i.
Pi P (0.04 inMi. Magnesiumsiiliat li.OniMi. ΑιΙκπηΊ
!2 g H)O ml), und den Ln/vmcn 1.1)1! π.('!Γηι1:.
PK 10.3 IL' mil sown. ADH ι !Μι !Γ πι! ι verdünnt mn
einer Iheügcselnv iiuliukeii von O.S ml nun Diahsiei;
wird gegen eine Losung, enthaltend I näihanoiamm-Puifer.
0.1 M. pH .-.=■ 7.',. mn NADlI Ki.i ni\li. A! I"
10.53 mVli. IM-. P(0.1 X mMl. \!a-neMLim-üi!an l.OmMi.
1.1)11 (6.4 Il mil. !'K Il !I nil
geschwindigkeit \on u.6 mi ιιπη.
Dem Diahsal wird die I.ösuii-.
geschwindigkeit \on u.6 mi ιιπη.
Dem Diahsal wird die I.ösuii-.
mn
der < ;lv C^ I ok;!U-.C
|2 Il ml m 7.5 mM Ma-jncMum^uiiai. /iuemisch'.
.ι :; u.i mi miii I )ie I Minklions-
abnahnie. ausgcdruAi m skaienieile. n.n.h emei Inku'i.aiUMis/eil
von ".5 Mmnieii iv. ;" <■ \M;d gemessen.
In labelle I -.nut die 1 ieehni^e /iisamnien-
/usat/c
!'\ ι u\al
!'\ ι u\al
\V ictlci lin^iuni.'
Sp.ille I
nnl Sei inn I cc!
' 'iiiiL Scr mn i ei.-; \'.ι.-11
olllK· N \l)ll-H-.L-C!K'n;-U!iii-
line KH) ml) i S k.: I c ι H C111- ί (",, S\ ιοο!οτ limi unv isk;ilenieilL-l ί".·ι
| Probe 1 | 2 | 72 | = 100 | 73 | 101 |
| Probe 1 | 4 | 72 | 100 | 7J.; | K)X |
| Probe 1 | 6 | 74 | 102.7 | K 1.5 | 113 |
| Probe I | χ | 72.5 | !00.6 | 86 | 1 19 |
| Probe 1 | IO | 73 | 101 | 91.5 | 127 |
| Probe ! | I emliiill Jd.n mi: ( | 72 | HK) | 4 ft. 5 | 134 |
| Probe | ilvecrin in KKI nil bide-.! | W..SNCI | |||
100
100.6
100.6
100
4 X. 6
100.6
100.6
100
4 X. 6
l-!s wird deutlich, daß nur das erl'mdiingsgemiil.V- 0.04 mM PhP. 1.OmM Magnesiumsulfat. 2 g 100 ml
Verfahren (Spalte 3| mil einem Mcükanaf überein- so ΛΊΙκιηοΙ. 1.6 11 LDII ml. Ό.26 IΓ PKmI. 1X0 11
stimmende Werte /u dem als richtig beurteilten AI)H ml. 1 I Il' hsierase ml. 400 H I .ipase ml.0.1 mg
2-K.anal-Verfaliren mit l'roben-l.eerwerl liefert (Spal- Na-Dodecvlsull'at ml.
te 11.
Beispie! 2
Bestimmung von Neuiralleli im I lumanserum
Bestimmung von Neuiralleli im I lumanserum
Als Probe wurden Humanseren genommen, denen
l'jruvat in den Konzentrationen 2. 4. 6. X und IO mg
100 ml zugesetzt wurden. Apparativ wurde wie im Beispiel I beschrieben gearbeitet. Die Lösungen haben
folgende Bestandteile und werden mit folgender Lheßgeschwindigkeit
gepumpt: Probe: 0.05 ml min.
Lösung 1
1 ösung 2 (Diahsal)
0.1 M Lnälhanolamin-Puffer. pH 7.6. mn 0.6 ml
min. enthaltend: 0.ImM NADH. 0.53 mM AIP.
0.1 X mM PL P. l.llinM Magnesiumsulfat. 6.4 Ul DH
ml. 1.0 IU PK ml.
0.1 ml min. enlhai-
6s 7.5 111M Magnesiumsulfat
!end: 2 11; Gheerokmase ml.
0.1 M Lriätlianolamin-Puffer. pll 7.X. mil 0.XmI Die liikiihalions/eil beträgt 7.5 Minuten bei 37 (".
min. enthaltend: 0.025 111M NADII. 0.13 mM Al P. Die Meßwerte sind in labelle 2 /usammenucstcllt.
a be! le 2
'robe
Spalle I Spallc .?
mil Seimii-1 eeiwen ohne Seiiitn-1 eciucil
/Usal/C
l'\ru\at
oline Γ
S\ sicm
S\ sicm
(mulOOmll (Skalenleüel I"« Wieilci- lSkalenieile) ΓΊι.ι
ΙίηιΙιιηιϋ
ercndes
Spalte ·
tSkalenlcilci Γ\ο
| 'robe 1 | 4 | 29 | 100 | 31 | !06.S | 29 | 100 |
| = 138 mg Neutralfett | 6 | 29 | 100 | 35.5 | I —_ | 2') | HK) |
| 00 ml Serum | 8 | 29 | 100 | 39.5 | 136 | 29.5 | 102 |
| 10 | 28 | 97 | 44.5 | 153 | 29.0 | 100 | |
| 28 | 97 | 49 | 16S | 29.0 | 100 | ||
| 2 | 28 | 97 | 53.5 | 1S4 | 29.0 | 100 | |
| 'robe 2 | 4 | 21.5 | 11 3 | 19 | 100 | ||
| = 114 mg Neutralfett | 6 | 25 | 131 | 19 | 100 | ||
| 100 ml Serum | 8 | 28.5 | 19 | 100 | |||
| 10 | 32 | 168 | 19 | 100 | |||
| 36.5 | 192 | 19 | 100 | ||||
| 40.5 | 2 Π | 19 | 10(1 | ||||
körpereigenes Abbauprodukl de< Blutfarbstoffs UiK
30 zeigt bei 340 oder 366 mn eine Grenzabsorption
... 1 , r \ „■ , ,r; .u,,- Maximum lieiit bei 450 mn.) Im iibriizen werdet
•\ussdia tune von nlerleren/en andeiei eelaibtei . - ,',
.. , , - experimentell deiche Bedinminüen eingehalten wie in
Substanzen .'..,, ^ . - ".,,'■■ „
Beispiel 2. mil der. Aufnahme, dal>
zur K^niioile 11
line Probe, in der Neuiralfelt bestimmt werden der Versuchsreihe Spalte 3 ohne kinavj (Glycero
soll, wird mit einer Probe vermischt, die eine hohe 35 kinasei gemessen wurde.
Bilirubin-Kon/entralion enthalt. (Bilirubin ist ein Die brgebmsse zeigt Tabelle
| Tabelle | 3 | /us.n/c Bilirubin |
Wicdcrliiuluni; Sp.iltc 1 |
| Probe | ohne Scriim-l cciwerl | ||
»■»!WC SlTUHI-I ClTW CIi
mn NAnH-icvcMH-riLiiTnicrn System ohne Kin.isc KiK) und NAl)H-(komplelt)
regenerierendes S\sien
imü HH) ml) (Sk.ilcntcilc) Γη W icdcrlindiinii) iSkalcnlcilcl ''M
Spjne λ
«ic bei I-rtinduni:. .iber
ohne Ismase KiK I
lSk.ilen;ei!el ("ι. ι
| Probe I | (I | 11 | = HH) | 1*1 | 9 | 0 | 0 |
| Probe 2 | 0 | 18 | = 100 | 1.7*) | 9.5 | 0 | 0 |
| Probe 2 | 18 | H)O | 1.7*1 | 9.5 | 0 | 0 | |
| Probe 2 | 18.5 | 102.7 | 1.7*) | 9.5 | 0 | 0 | |
| Probe 2 | 10 | 17.5 | 97.2 | 1.7*| | 9.5 | 0 | 0 |
| Probe 3 | 0 | 37.5 | = HK) | 1.3*) | 3.5 | 0 | 0 |
•| Dieser Weil repiascnlieil endogenes P\ni\.il
Die Wicderfindungsquolc von 0°ό in Spalte 3 beweist, daß kein F.infiuü von Bilirubin zu messen ist.
Claims (4)
- Patentansprüche·!. Ariaiysenverfahren zur enzymaiischen Bestimmung von Substraten in biologischen Flüssigkeilen, insbesondere im Serum, durch Phosphorylierung des Substrates oder eines daraus enzymatisch erhaltenen Umsetzungsproduktes mit AT P in Gegenwart einer spezifischen Kinase unter Freisetzung von ADP. Umsetzung des letzteren mit Phosphoenolpyruvat in Gegenwart von Pyruvatkinase unter Bildung von Pyruvat. Hydrierung des Pyruvats mittels NADH in Gegenwart von Lactatdehydrogenase und Messung des NADH-Verbrauchs, dadurch g e k e η nzeichnet, daß die Flüssigkeitsprobe in Abwesenheit der spezifischen Kinase und in Gegenwart eines NADH-regenerierenden enzymatisehen Systems mit den für die Reaktionsfolge benötigten Reagenzien umgesetzt wird, anschließend die F.n/yme durch eine semipermeable Membran aus der Reaklionslosung abgetrennt werden, dir spezifische Kinase. Pyruvatkmase und Lactaldehyurogcnase dem Filirat zugesetzt werden und die Messung durchgeführt wird.
- 2. Verfall ·η nach Anspruch 1. dadurch gekennzeichnet, daß ein NADH-regencrierendes System verwendet wird, welches eine NADH-spezilische Dehydrogenase und deren Substrat enthält.
- 3. Verfahren nach Anspruch 2. dadurch gekennzeichnet, daß Alkohoidehydrogenase mit Alkohol .ils Substrat verwendet wird.
- 4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Abtrennung der Fn/yme durch Dialyse. Liltralillration, umsiekehrte Osmose oder Zentrifuüieren eifolut.
Priority Applications (18)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19742412354 DE2412354C2 (de) | 1974-03-14 | Enzymatisches Analysenverfahren | |
| AT3675A AT339505B (de) | 1974-03-14 | 1975-01-03 | Enzymatisches analysenverfahren |
| CA217,843A CA1031678A (en) | 1974-03-14 | 1975-01-13 | Enzymatic determination of biological fluids |
| YU00187/75A YU18775A (en) | 1974-03-14 | 1975-01-28 | Process for the enzymatic determination of substrates in biological liquids |
| IT7519675A IT1041738B (it) | 1974-03-14 | 1975-01-28 | Reattivo per la determinazione enzimetica di substrati in liquidi biologici |
| IL46545A IL46545A (en) | 1974-03-14 | 1975-02-03 | Analytical process for enzymatic determination of substrates in biological Niger |
| ES434869A ES434869A1 (es) | 1974-03-14 | 1975-02-19 | Procedimiento de analisis para la determinacion por via en-zimatica de sustratos en liquidos biologicos. |
| AU78451/75A AU484963B2 (en) | 1974-03-14 | 1975-02-21 | Enzymatic analysis process |
| FR7506418A FR2264283B1 (de) | 1974-03-14 | 1975-02-28 | |
| BE154033A BE826324A (fr) | 1974-03-14 | 1975-03-05 | Procede d'analyse enzymatique |
| FI750674A FI58160C (fi) | 1974-03-14 | 1975-03-07 | Enzymatiskt analysfoerfarande |
| US05/556,961 US4019961A (en) | 1974-03-14 | 1975-03-10 | Analytical enzymatic determination |
| GB1003775A GB1446298A (en) | 1974-03-14 | 1975-03-11 | Enzymatic analysis process |
| CH306175A CH622555A5 (de) | 1974-03-14 | 1975-03-11 | |
| DK99975A DK145506C (da) | 1974-03-14 | 1975-03-12 | Analysefremgangsmaade til enzymatisk bestemmelse af substrateri biologiske vaesker |
| JP2996475A JPS5542636B2 (de) | 1974-03-14 | 1975-03-12 | |
| NLAANVRAGE7502922,A NL168943C (nl) | 1974-03-14 | 1975-03-12 | Werkwijze voor het langs enzymatische weg bepalen van een substraat in een biologische vloeistof, in het bijzonder een serum. |
| ZA00751556A ZA751556B (en) | 1974-03-14 | 1975-03-13 | Enzymatic analysis process |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19742412354 DE2412354C2 (de) | 1974-03-14 | Enzymatisches Analysenverfahren |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE2412354B1 DE2412354B1 (de) | 1975-06-19 |
| DE2412354C2 true DE2412354C2 (de) | 1976-01-29 |
Family
ID=
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