FI58160B - Enzymatiskt analysfoerfarande - Google Patents

Description

r_, KUULUTUSjULKAISU r a 4 / λ

Ma W (11) utläggningsskrift 5 81 60 C Patentti myönnetty 10 12 1720 (1$) Patent neddolat >S^r^ (SI) K».ik.3/i«.a.3 G 12 Q 1/32, G 01 F 33/48 SUOMI—FINLAND (21) p«un«n»iwiw«-p«t*nt«Mdi(iui»i Τ50βγ4 (22) H*k*ml*pilrt— An*6knlng*d«( 07.03.75 (23) AlkupAlvi—GlMghtcidag 07.03.75 (41) Tullut Julktoukfl — Bllvtt ofr«nelij 15 .09.73

Patentti- la rekisterihnllitiit ......_....... . ,. 1L_, _ * . (44) NlhtivIk*lp*non ja ku<iL|ulkaiauii pvm. — _ . n

Patent- och registerstyrelsen Antokin utkgd oeh utLskrHtwi publtcurud 29.08.8o “ (32)(33)(31) fyy4*tty «tuoik«i>—Buglrd priortm 14.03.7^

Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) P 2^1235^ er (71) Boehringer Mannheim GmbH., Sandhofer Strasse 112-132, D-6800 Mannheim-Waldhof, Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) (72) SigmarKlose, Weilheim/0bb. , August Wilhelm Wahle f eld, Weilheim/Obb., Alexander Hagen, Tutzing/Obb., Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepub-liken Tyskland(DE) (7*+) Berggren Oy Ab (5^) Entsymaattinen analyysimenetelmä - Enzymatiskt analysförfarande

Keksintö koskee analyysimenetelmää, jonka avulla voidaan määrittää entsymaattisesti substraatteja biologisissa nesteissä, varsinkin ruumiinnesteissä kuten seerumissa.

Analytiikassa määritetään biologisissa nesteissä olevia aineosia usein seuraavan yleisen reaktiokaavan mukaan:

S + ATP v spe..^— i-naasl, S-fosfaatti + ADP

ADP + PEP ^i ATP + pyruvaatti

pyruvaatti + NADH —k L-laktaatti + NAD

Edellä olevissa yhtälöissä merkitsee S' määritettävää substraattia tai siitä aikaisemmin suoritetun entsymaattisen reaktion avulla saatua reaktiotuotetta, ATP tarkoittaa adenosiinitrifosfaattia, S-fosfaatti fosforyloitua substraattia tai reaktiotuotetta, ADP adenosiinidi-fosfaattia, PEP fosfoenolipyruvaattia, PK pyruvaattikinaasia, NADH

2 581 60 pelkistettyä nikotiiniamidi-adeniini-dinukleotidiä, LDH laktaatti-dehydrogenaasia ja NAD hapetettua nikotiiniamidi-adeniini-dinukleo-tidiä.

Edellä olevassa reaktiosarjassa on ensimmäisessä reaktiossa syntyneen ADP:n määrä suoraan verrannollinen S:n tuntemattomaan määrään. Mitta-ussuureena on NADHrn kulutus, joka mitataan rutiininomaisesti määrittämällä absoprtion aleneminen aallonpituudella 3^0 nm, Hg 365 tai Hg 335. Edellä oleva reaktiosysteemi on yleisesti käyttökelpoinen sellaisten aineiden määrityksessä, jotka voidaan fosforyloida spesifisen kinaasin avulla ATPrllä, jolloin muodostuu ADP:tä, tai sei- — laisten aineiden määrityksessä, joista voidaan saada vastaavasti fosforyloituvia reaktiotuotteita.

Edellä esitettyä reaktiokaavaa käytetään erityisen suuressa määrin kliinis-kemiallisessa laboratoriossa erilaisten substraattien määritykseen, jolloin spesifisyys määrätylle substraatille saavutetaan kulloinkin spesifisen kinaasin avulla. Systeemissä on kuitenkin se varjopuoli, että biologisissa nesteissä kuten ruumiinnesteissä ja varsinkin seerumissa on säännöllisesti olemassa muita aineita, jotka myös aiheuttavat NADH:ta kuluttavan reaktion. Tämä koskee erityisesti endogeenistä pyruvaattia. Toinen syy, minkä vuoksi on otettava huomioon näytteen nollakokeen arvo, on biologisten ja ruumiinnesteiden erilainen ominaisabsorptio mainituilla aallonpituuksilla, esimerkiksi niiden bilirubiinipitoisuudesta johtuen. Tällaisia määrityksiä on sen vuoksi suoritettu tähän asti ottamalla huomioon näytteen nollakokeen arvo, josta puuttuu spesifinen kinaasi, siis — fosforyloiva entsyymi. Määritettävän aineen määrä saadaan sitten vähennyslaskun avulla kummastakin rinnakkaismäärityksestä saaduista tuloksista. Varjopuolena on tällöin, että tarvitaan kaksinker- _ täinen määrä itsessään hyvin kalliita entsyymireagensseja kuin pelkkään määritykseen tarvittaisiin ja reaktion kustannukset tulevat käytännöllisesti katsoen kaksinkertaisiksi. Epäedullista on myöskin se, että menetelmän suorittaminen kulloinkin käytettävällä ana-lyysiautomaatilla on mahdollista vain, jos käytettävissä on kaksi mittauskanavaa.

Endogoonisten aineiden aikaansaaman virheen poistamiseksi on olemassa myös toinenkin mahdollisuus, nimittäin että poistetaan endogeeniset aineen reaktion avulla ennen spesifisen kinaasin lisäämistä ja suoritetaan NADH-kulutuksen ensimmäinen määritys, sen jälkeen lisätään 5 58160 spesifinen kinaasi ja määritetään uudestaan NADH-ku1utus. Tämä menetelmä tulee kalliiksi ja sillä on se erikoisen suuri haitta siinä, että sitä ei yleensä voida lainkaan suorittaa tunnetuilla automaattisilla analyysilaitteilla.

Keksinnön perustana on sen vuoksi vaatimus saada aikaan menetelmä, joka on edellä kuvatun kaltainen ja jossa suoritetaan vain yksi ainoa määritys ja entsyymien kulutus on siis pienempi. Sen lisäksi on tavanmukaisten analyysiautomaattien sovelluttava menetelmän suoritukseen.

Nämä vaatimukset tulevat keksinnön mukaisesti toteutetuiksi analyysimenetelmässä, jossa määritetään entsymaattisesti substraatteja biologisissa nesteissä, varsinkin seerumissa, fosforyloimalla substraatti _ tai siitä entsymaattisesti saatu reaktiotuote ATP:llä spesifisen ki- naasin läsnäollessa, jolloin vapautuu ADP:tä, antamalla jälkimmäisen sitten reagoida fosfoenolipyruvaatin kanssa pyruvaattikinaasin läsnäollessa, jolloin muodostuu pyruvaattia, hydraamalla pyruvaatti NADH:n avulla laktaattidehydrogenaasin läsnäollessa ja mittaamalla NADH:n kulutus, ja menetelmä on tunnettu siitä, että nestenäytteen annetaan reagoida ilman spesifistä kinaasia, mutta NADH:ta regeneroivan entsymaattisen systeemin ollessa läsnä liuoksessa, reaktion kulkua varten tarvittavien reagenssien kanssa, jonka jälkeen erotetaan entsyymit puoliläpäisevän kalvon läpi reaktioliuoksesta ja lisätään suodokseen spesifinen kinaasi, pyruvaattikinaasi ja laktaat-fidehydrogenaasi ja suoritetaan mittaus.

Keksinnön mukainen menetelmä soveltuu periaattessa kaikkiin entsy-maattisiin analyysimenetelmiin, joissa joko määritettävä substraatti itse tai jonkin etukäteen suoritetun entsymaattisen reaktion tuote _ reagoi ATP:n ja vastaavan spesifisen kinaasin kanssa ja muodostuu ADPrtä. Esimerkkinä sellaisista menetelmistä mainittakoon vapaan glyserolin määritys (Klin.Wschr.4_0, 362 (1962), neutraalirasvan määritys (Klin.Wschr._44, 262 (1966), kreatiniinin määritys (Scand.

J.Clin.Lab.Invest.^9, Suppl, 126 (1972), glukoosin määritys (Bio-chem.Z. 328, 499 (1957).

Jos määritetään itse spesifisen kinaasin substraatti, esimerkiksi siinä tapauksessa, että mitataan vapaa glyseroli, niin lisätään vain tässä tapauksessa spesifistä kinaasia, siis esimerkkitapauksessa glyse-rolikinaasia. Jos kinaasi fosforyloi varsinaisesti määritettävästä substraatista entsymaattisesti saatua reaktiotuotetta, tarvitaan vie- 4 58160 entsymaattinen reaktiosysteemi reaktiotuotteen saamiseksi substraatista menetelmän ensimmäisessä vaiheessa.

Esimerkkinä tästä mainittakoon neutraalirasvan määritys (triglyseridi-määritys), jossa rasvojen annetaan reagoida lipaasin ja mahdollisesti esteraasin kanssa, jolloin muodostuu glyserolia ja rasvahappoa ja muodostunut glyseroli jälleen fosforyloidaan ATP:llä jaglyserolikinaasilla.

Reaktionkululle tarpeellisia reagensseja ovat paitsi jo mainitut entsyy" mit ATP, PEP ja NADH myös apuaineet kuten puskuriaineet , epäorgaani- _ set suolat, esimerkiksi magnesiumsulfaatti, mahdollisesti pinta-aktii-viset aineet ym. Kaikki nämä aineet ovat asiantuntijalle suoritettavan reaktion yhteydessä tuttuja, eikä niitä ole tarpeen tässä selostaa yksityiskohtaisesti.

NADH:ta regeneroiva entsymaattinen systeemi muodostuu olennaisesti NADH-spesifisestä dehydrogenaasista samoin kuin tämän dehydrogenaasin substraatista. Keksinnön puitteissa pidetään parhaana sellaista systeemiä, joka sisältää alkoholidehydrogenaasia ja substraattina alkoholia. Muita NADH-spesifisiä dehydrogenaaseja ja näiden substraatteja voidaan kuitenkin käyttää samalla lailla.

Puoliläpäisevänä kalvona käytetään keksinnön puitteissa kalvoa, joka pidättää valkuaisaineet, mutta päästää lävitseen pienempimolekyyliset aineet. Esimerkkeinä sopivista kalvoista mainittakoon dialyysikalvot, ultrasuodatuskalvot, käänteisosmoosissa käytettävät kalvot yms. _

Kun keksinnön mukaista menetelmää suoritetaan kaupasta saatavilla analyysiautomaateilla, voidaan puoliläpäisevänä kalvona proteiinien eristämiseksi käyttää tällaisissa laitteissa säännöllisesti varusteena olevaa dialyysilaitetta. Sen vuoksi on mahdollista suorittaa keksinnön mukainen menetelmä tällaisilla automaateilla tarvitsematta muuttaa näitä laitteita ja ilman että tarvittaisiin toista mittaus-kanavaa. Keksinnön tässä toteuttamismuodossa käytetään siis hyväksi periaatteessa reaktioiden suorittamista eri osastoissa, niin että entsy-maattiset reaktiot, paitsi fosforyloiminen ATP:n kanssa (spesifisen kinaasin puutteen vuoksi), tapahtuvat ensimmäisessä osastossa, ja sen jälkeen pienempimolekyyliset aineosat siirtyvät puoliläpäisevän kalvon läpi toiseen osastoon, ilman että tarvittaisiin minkäänlaisia mittauk- f 5 581 60 siä, toisessa osastossa lisätään sitten spesifinen kinaasi, PK ja LDH, ja NADH:n kulutus mitataan fotometrisesti. Puoliläpäisevä kalvo estää myös NADH:ta regenei*oivan systeemin toimimasta, koska tähän tarvittava dehydi-oge-naasi erottuu pois, tällöin vastaa mitattu NADH-kulutus yksinomaan fosfory-loidun substraatin määrää, sillä häiritsevät reaktiot on suljettu pois. Näin vältettyjen häiritsevien reaktioiden merkitys tulee selvästi näkyviin, jos esimerkiksi verrataan seerumissa tavallisesti esiintyviä pyruvaattikonsentraatioita erilaisten, seerumissa normaalisti esiintyvien ja edellä selostetun menetelmän mukaan määritettävien aineiden konsentraatioihin:

Seerumissa esiintyvä Konsentraatio Pyruvaatin pitoisuus aineosa normaalialue prosenteissa laskettuna ^ (inM) substraatista

Pyruvaatti 0,05-0,07 ---

Triglyseridit 0,8 -1,94 3-10 % vapaa glyseroli 0,03-0,145' 30-200 % kreatiniini 0,07-0,13 40-100 %

Edellä olevasta taulukosta käy ilmi, että yksinomaan pyruvaatin aiheuttama häiriö saattaa olla moninkertaisesti suurempi kuin substraatin mittausarvo. Lisäksi on otettava huomioon, että biologisissa nesteissä esiintyy useissa tapauksissa myös muita häiritseviä aineita kuten bili-rubiinia, joiden vaikutus voidaan samoin poistaa keksinnön mukaisen menetelmän avulla. Tämän seikan todistamiseksi liuotettiin seerumiin lisääntyviä määriä (aina 10 mg/100 ml kohti) bilirubiinia. Glyseroli-pitoisuuden määritys antoi sellaista reagenssiseosta käyttäen sekä bilirubiinin kanssa että ilman bilirubiinia samat arvot. Kun jätettiin pois NADH:ta regeneroiva systeemi, saatiin noin 10 % korkeampia mittaus-arvoja, jotka johtuivat endogeenisesta pyruvaattipitoisuudesta, mutta olivat yllättäen käytännöllisesti katsoen riippumattomia bilirubiini-konsentraatiosta. Keksinnön mukaisen menetelmän avulla poistetaan sen vuoksi myös häiriöitä, jotka johtuvat biologisen nesteen omasta värisävystä. Ei tiedetä, mihin tämä efekti perustuu.

Kuri näytteen nollakokeen aivon määrittäminen ei ole enää pakollista, alenee kalliiden entsyymien käyttö jopa 50 % ja samalla voidaan säilyttää menetelmän automaattinen suoritustapa ja sen lisäksi on vielä mahdollista työskennellä sellaisilla analyysiautomaateilla, joissa on ainoastaan yksi mittauskanava. Analyysiautomaateissa, joissa on kaksi mittaus-kanavaa, voidaan toinen mittauskanava pitää vapaana toisille määrityk- 6 58160 sille ja sen lisäksi käsittely tulee helpommaksi ja yksinkertaisemmaksi, koska säästytään ajalliselta, elektroniselta ja optiselta kahden analyysiautomaattikanavan tasaukselta.

Keksinnön avulla voidaan poistaa myös häiriöt, jotka aiheutuvat suuri-molekyylisten proteiinien pitoisuudesta, jotka hajoittavat voimakkaasti valoa ja antavat tällä tavoin vääriä valoabsorption arvoja, esimerkiksi voimakkaasti lipeemisissä seerumeissa.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä on saatu erikoisen hyviä tuloksia käytettäessä etanolia ja alkoholidehydrogenaasia NADH:ta regeneroivana systeeminä, kun etanolikonsentraatio oli vähintäin 2 g/100 ml puskuria ja ADH-konsentraatio vähintäin 180 IU/ml. Tässä tapauksessa osoittautui sopivaksi erityisesti trietanoliamiini-puskuri 0,05-0,2 M, pH 7-8.

Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä lähemmin.

Esimerkki 1 Glyserolin määritys Määrityksessä käytettiin vesipitoista näytettä, glyserolikonsentraa-tio 30 mg/100 ml. Tutkittiin pyruvaatin vaikutusta lisäämällä 2, 4, 6, 8 ja 10 mg pyruvaattia/100 ml näytettä. Määritys suoritettiin toisen polven autoanalysaattorilla, amerikkalaisen firman Techniconin valmistamalla analyysiautomaatilla. Tämä laite työskentelee käyttäen jatkuvaa virtaussysteemiä ja sen vuoksi yksityisten reagenssien annostus ilmoitetaan dimensiolla ml/min. Entsyymien erottamiseen käytettiin kaupasta saatavaa dialyysikammiota, valmistaja Technicon-firma, Yhdysvallat. Näyte laimennettiin (0,05 ml/minuutissa) liuoksella, joka sisälsi trietanoliamiini-puskuria, 0,1 M, pH = 7,6, NADH (0,025 mM), ATP (0,13 mM), PEP (0,04 mM), magnesiumsulfaattia (1,0 mM), etanolia (2 g/100 ml), ja entsyymejä LDH (1,6 IU/ml), PK (0,3 IU/ml) samoin kuin ADH (l80 IU/ml) virtausnopeudella 0,8 ml/min. Dialysoidaan liuosta vastaan, joka sisältää trietanoliamiinipuskuria, 0,1 M, pH 7,6, NADH (0,1 mM), ATP (0,53 mM), PEP (0,l8 mM), magnesiumsulfaattia (1,0 mM), LDH (6,4 IU/ml), PK (1 IU/ml), virtausnopeuden ollessa 0,6 ml/min.

Dialysaattiin sekoitettiin glyserokinaasin liuos (2 IU/ml) 7,5 mM:ssa magnesiumsulfaattia) virtausnopeus 0,1 ml/min. Mitattiin ekstinktion pieneneminen ilmoitettuna asteikonosina 7,5 minuutin inkubaatioajan jälkeen lämpötilassa 37°C. Tulokset on koottu taulukkoon 1.

. < 7 58160

ΚΛ \Ω CO CD

λ η η *ι %$. σ\ O O O O co •h ctv ο Ο ο ο

-Ρ ι—I ι—I ι—I ι—I

en φ en •Η

Cd 4-3 m λ; cd 3 co φ £ ο

X

cd c c m mm

Sh :ο ο *» « «

Cede 4si ι—I OJ OJ OJ OJ rH

CD CO c ·Η C— C— 13— I>— c— r— Φ ·Η Φ

CO CO -P

d* CO

>5 Φ < -P ini

•H

HH

:cd cd :<d -r^ £ Oj o

_ c > cd -H

H Sh cd -P

r- cd > rH oo m co -=r to Ο φ·η ^¾ OOr-tr-lc\jK3 Φ

Sh OO <—If—li—I'—1'—1'—I Td φ 4s; e ä co cd φ cd

>3 — C

!— l~ Φ bO O bC cd

C φ CO

CO Sh 4-) CO

3 C Cd

-P OJ ·Η cd CO rH

3 S 4-3 o mmm £ Φ 3 " « Λ Λ

•Hds!C31 C moOiHVOiHv^ O

cd cd φ q :cd o n n oo co m σ\ O

> e φ < -h ^ —ι cd co 2 £ *h ι—I C CO Φ Φ •H e C Φ 44) cd O 44) Cd cd -P CO ·Η ϋ J) E geo < f-4

^ d H H >! O

e > -H ·Η CO Sh f—I 3 Φ e C [h- en

Cd SH I *) *

E-hCh 0 | O O C\J O Ή o H

O 44)%¾ O O O O O O bO

·Η ι—li—li—li—li—I rH

—h 0 cd e bO

ι—I ^ cd »> *H ^11 £ O co cd ·Η

Φ C co K -p O

X e cd e cd o

Sh -H X C m cd s o m —- W3C dsi -P «* :cö

Sh O •Hcdojoj-^rojmoj :cd:ed

Φ > d)IO NSSNNN -P-P

Φ Sh -P O rH 44) co cd co xd Φ < CO >

•H

co cd 3 ι—I 44) I rH 44) -p £ Φ cd

>5 Cd -p rH

44) cd O >5 CO

44) > O :cti Ή :cd3iH I c\j 4T vo co O 244)

co Sh cd rH

• H Ch · H bO

J αρ ε

rH

φ Φ +4 J4> = r e = r >j >i :cd :cd 2 2 8 58160

Taulukosta 1 käy ilmi, että vain keksinnön mukainen menetelmä (sarake 3), jossa käytetään yhtä mittauskanavaa, antaa yhtäpitäviä arvoja oikeana pidetyn 2-kanavamenetelmän kanssa, jossa otetaan näytteen nollakoe-arvo huomioon (sarake 1).

Esimerkki 2

Neutraalirasvan määritys ihmisen seerumista.

Otettiin ihmisen seerumia näytteiksi ja lisättiin niihin pyruvaattia 2, 4, 6, 8 ja 10 mg/100 ml. Työskenneltiin kuten esimerkissä 1 on selostettu laitteiden suhteen. Liuoksissa on seuraavia aineosia ja niitä pumpattiin seuraavalla virtausnopeudella: Näyte: 0,05 ml/min. ^

Liuos 1: 0,1 M trietanoliamiini-puskuria, pH = 7,8, nopeudella 0,8 ml/min, sisältäen: 0,025 mM NADH, 0,13 mM ATP, 0,04 mM PEP, 1,0 mM magnesium-sulfaattia, 2 g/100 ml etanolia, 1,6 IU LDH/ml, 0,26 IU PK/ml, 180 IU ADH/ml, 11 IU esteraasi/ml, 400 IU lipaasi/ml, 0,1 mg Na-dodekyyli-sulfaattia/ml.

Liuos 2 (dialysaatti): 0,1 M trietanoliamiini-puskuria, pH = 7,6 nopeudella 0,6 ml/min, sisältäen: 0,1 mM NADH, 0,53 mM ATP, 0,18 mM PEP, 1,0 mM magnesium-sulfaattia, 6,4 IU LDH/ml, 1,0 IU PK/ml.

Liuos 3: 7,5 mM magnesiumsulfaattia, nopeudella 0,1 ml/min, sisältäen: 2 IU glyserokinaasia/ml.

Inkubaatioaika 7,5 min lämpötilassa 37°C.

Mittausarvot on esitetty taulukossa 2.

9 58160

•H

-P O O CM O O O oooooo 0 %% oooooo oooooo

<D i—I t—I f—I f—I rH f—f <—! (—( t—H i—I i—I i—I

CO

•H

cd

C X

0) 3 φ g

00 C

^ λ; c o

>3 0:0 ^ lA\ O O O

P m C ·η p ·'·'*'« •H 0 C 0 0 CJN C71 CT\ CT\ C0i CT\ CT\ CT\ CT\ U\ CT\ o\

C 00 -H Pen CM CM CM CM CM CM iH rH i—I rH r—I rH

:0 0 CO O

:0 di < ε <d di e — cd > cd CO ’"~3 P d 5 M r) Cd Ή > >

f—l C ·>—I

cd Co — cd ^ o φ co p cd id *>

3 r- 0) I0> CM MO K\ OO HT ΙΌ rH O OO CM

0 ·— bD fes. O cm γό lt\ uo oo rHcoiOMdicrNr-H

id id 0 rH I—I rH I—t I—I I—I i—I i—I rH !—I i—I CM

*“ e 0 CM e 3 ·Η cd p 0 ε p 2 di 3 ·· ϋ 0 C ffi •H C 0 Q :cd

0 0 O < -H C

> OQ co SE O

0 di P en IA in LO LH LO A IA

CMC CCO-HCd « *» *» x x x xx

•h cdcdP0co rH uo ολ -=r σ\ ro r-ι p oo cm mo O

OP g £ 0 P O rO |Λ |C\ 0 0 IA CM CM CM P P P" di 0 Γ0 rH >3 0 dx; 0 -H ·Η 0 < 0 > rH 0 0 e

0 >3 I

Eh en I p o Ή O O O t— D— C"—

i< 0 0 O O O CTi ΟΊ ON

0 ϊ> ·Η i—t i—ti—!

i—I ' 0 0 *H

“CO 0 P

0 P 0

"" di C

0 0 0 0

h *H Cd O

cd ε

00 3 e -HP

Ci o 00 σ» 0 σι ra ® ®

0> P0 CM CM CM CM CM CM

_ 0 C 0 O

0 0 <

1 i—t E

>3 0

P 0 O P > O

:0 3rH lojnrvocoo i cm vo co o

0 C 0 * i—I i—I

•H >3·η 60 o αρ ε

faO t Q i S

r-l = -H O ru -HO

^ rH rH 0 tXJ M H rH 0 _ 0·^. ·η . ε 0 ·0

0 0cx)0cd0E0 co 0 0 E

p p P 0 0 0 3 PX3-C003

>3 >3 rH P > 0 C >,rHP>0G

Cd -Cd 3 0 · · 0 -0 rH 3 0 · · 0 2 2 ,| 0 0 H 0 2 0 0 rH 0 2 z" 0 0 0 0-3 II 0 0 ε 0 58160 10

Esimerkki 3

Muiden värillisten aineiden aiheuttamien interferenssien poistaminen Näyte, josta oli määritettävä neutraalirasva, sekoitettiin näytteen kanssa, jonka bilirubiinipitoisuus on korkea. (Bilirubiini on ruumiille ominainen veren väriaineen hajoamistuote ja se osoittaa aallonpituuksilla 340 tai 366 nm raja-absorption, maksimi on aallonpituudella 450 nm). Muuten o1 ivat koeolosuhteet samat kuin esimerkissä 2 sillä erolla, että kontrollin vuoksi mitattiin koesarjassa, sarake 3 ilman kinaasia (glyserokinaasia).

Tulokset ovat taulukossa 3· .--1 * * i 58160 11 Λ •H 3

-Ρ·Η sä O OOOO O

0 m 0 Λ cO ci •H C PO CO ·Η ^ 2 0 3 M B 3 ci co S., 3 s CO co rH 3 CO CH o

3 X -P

•rt cö -HCÖO OOOO O

co -P ^ 0 to

2 P 2 -PO

0 3 0 0 m X S,'-' < _ 3 P 3

X i CO

*0j 0 ^ CD C > rf^-vc io lo lo lo lo ^ 3 |Z 3 " o q 33 0 co <j\ σ\ σ\ a\ ro Ό 3 w c •rt OJ 0 O 3 CO 60 3 0 *rt ·Η 0 H 2! £ CO 3

3 cO 3 cO

3 3 cO cO

3 cO 0 3 -P :c0 0 0 0 3 ·Η ·· ·Η 3 -p tort E o x x x x x co Q0,\;p t— c-- d- r- ro •h 3cd3<o-rt3X ·'·>"'< « — 3 C 3 2 -P 0 0 Ή i—irHHH Ή — E > E CO -P O 3 •rt rrt 3 i—! 3 0 *rt

ΓΛ h ·Η S Ή 'Π CO < -P

:: j -P

O > 3

Jx! 3 <1. > 3 0 0 3 ΗΌ X 3 3 3 -rt 3 3 I c— OJ >s

Cd 3 ^ > -P ΐτ«. n n CX

Crt S*, r~j · rt · rt O O O OJ C^— C3 3 03 330 O O O CO O :3

3 0 5* *rt i—li—li—li—I i I P

3 0 CO 3 -rt 0 rrt-rt 3 3 ^ K -p <n <m <m -rt £ 0 3 3 e — 0 3 bOPC 0 0 3*! 3 0 3 0

3 0 3 3 -rt bO

3 0 · rt rrt O

3 0 3 £ rrt 3 Ί3 CO P 0 0 O 3 3 0 ·· CT O ϋ -P LO LO LO 0 3 0 W -P >5 -rt 3 " " « —' £>Q0:3 00 Ή oocooot—r— :3 H C 4 >ι·Ρ PO H i—li li—I < I ro :3

• H 3 IS 0 -— 0 P

< P> •rt 0 0

•rt rH O

•rt £ > >>£} 3 •P 3 O 3

-P 3 O O O cm CO O O

:3 *rt rrt rrt :cO

m rl (fl o £ •rt -rt ·rt 60 ;3

J B 3 E H

w X

i—i cm ro 0 0 0 0

P -P P -P

C>5 C>5 · · · t>S

:3 :3 :3 :3 2 2 2 2

Claims (6)

12 581 60 Sarakkeessa 3 oleva havaittu määrä 0 % todistaa, ettei bilirubii- r.in vaikutusta ole mitattavissa.

1. Analyysimenetelmä, jonka avulla voidaan määrittää entsymaattisesti substraatteja biologisissa nesteissä, varsinkin seerumissa fosforyloimalla substraatti tai siitä entsymaattisesti saatu reaktiotuote ATPrllä spesifisen kinaasin läsnäollessa, jolloin vapautuu ADP:ta, antamalla jälkimmäisen reagoida fosfoenolipyruvaatin kanssa pyruvaattikinaasin läsnäollessa, jolloin muodostuu pyruvaat- tia, hydraamalla pyruvaatti NADH:n avulla laktaattidehydrogenaasin " läsnäollessa ja mittaamalla NADHrn kulutus, tunnettu siitä, että annetaan nestenäytteen reagoida ilman spesifistä kinaasia, mutta NADH:ta regeneroivan entsymaattisen systeemin ollessa läsnä liuoksessa reaktion kululle tarpeellisten reagenssien kanssa, jonka jälkeen erotetaan entsyymit puoliläpäisevän kalvon läpi reaktio-liuoksesta, lisätään spesifinen kinaasi, pyruvaattikinaasi ja lak-taattidehydrogenaasi suodokseen ja suoritetaan mittaus.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään NADK:ta regeneroivaa systeemiä, joka sisältää NADH-spesifisen dehydrogenaasin ja sen substraatin.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään alkoholidehydrogenaasia ja sen substraattina alkoholia.

4. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsyymit eristetään dialyysin, ult-rasuodatuksen, käänteisosmoosin tai sentrifugoinnin avulla. ~

1. Analysförfarande för enzymatisk bestämning av substrat i biologiska vätskor, speciellt serum, genom att fosforylera subst-ratet eller en därur enzymatiskt erhällen reaktionsprodukt med ATP i närvaro av ett specifikt kinas, varvid ADP frigörs, ocb att läta det sistnämnda reagera med fosfoenolpyruvat i närvaro av pyruvatkin^s, varvid pyruvat bildas, och att hydrera pyruvatet med NADH i närvaro av laktatdehydrogenas och att mätä NADH-för-brukningen, kännetecknat av att vätskeprovet fär rea-