DK145175B - Suspensionsmedium til anvendelse ved fremstilling af en stabiliseret poliomyelitisvaccine samt fremgangsmaade til fremstilling af dette medium - Google Patents

Description

nÉn dø) DANMARK \Ra/

|j| (12) FREMLÆGGELSESSKRIFT αυ 1451 75 B

DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning nr. 5264/77 (51) lnt.CI.* A 51 K 47./00 (22) Indleveringsdag 28. nov. 1977 A 61 K 39/13 (24) Løbedag 28. nov. 1977 (41) Aim. tilgængelig 50« maj 1978 (44) Fremlagt 27· S ep. 1982 (86) International ansøgning nr. - (86) International indleveringsdag - (85) Videreførelsesdag - (62) Stamansøgning nr. -

(30) Prioritet 29. nov. 1976, 266768, CA

(71) Ansøger CONNAUGHT LABORATORIES LIMITED, Willowdale, CA. „ (72) Opfinder Adolf von £>eefried, CA: Joong Hwan _Chun, CA: Hllde= garde M. G. Macmorine, CA.

(74) Fuldmægtig Dansk Patent Kontor ApS. . , (54) Suspens Ions medium til anvendelse , _ .

ved fremstilling af en stabi= liseret poliomyelitisvaccine samt fremgangsmåde til frerra= stilling af dette medium.

Den foreliggende opfindelse angår et hidtil ukendt suspensionsmedium til anvendelse ved fremstilling af en stabiliseret poliomyelitisvac-cine indeholdende et virus valgt blandt et levende, svækket poliomyelitis virus af type 1, 2 og 3 eller blandinger deraf suspenderet i et vandigt stabiliserende medium indeholdende cystin samt en fremgangs^ 2 måde til fremstilling af dette medium. Suspensionsmediet ifølge.op- j findelsen forøger vaccinernes levedygtighed og stabilitet under til beredningen og opbevaringen og er endvidere nyttigt til præservering. ·.

) af prøver, der afventer analyse for påvisning af poliovirus.

I-

Beskyttelse af mennesker og dyrearter mod virussygdomme opnås ofte jj ved vaccination med inaktiverede antigener eller levende svækkede virusstammer. I begge tilfælde må virusantigenernes egenskaber bibe.-holdes i vaccinerne. Ved anvendelse af levende svækkede virusstam- 2 145175 mer afhænger vaccinernes effektivitet fuldstændigt af virusets levedygtighed efter tilberedningen, transporten og opbevaringen.

For at opnå en vis stabilitet må nogle vacciner distribueres i ned-frosset tilstand, lyofiliseres eller tilsættes stoffer til formindskelse eller eliminering af vaccinevirusets ustabilitet. Nogle af de materialet, der kan tilsættes, er f.eks. calciumlactobionat (jvf. USnpatentskrift nr. 3.186.908), dextran (jvf. CA-patentskrift nr.

943.4$1)* phosphatpuffere (jvf. CA-patentskrift nr. 952.429) eller MgCljj (jvf. US-patentskrift nr. 3.128.229). Kulhydrater, såsom sorbitol og mannitol, anvendes undertiden, især som kryoprotektivt middel under frysning og tørring. Saccharose ogmagnesiumchlorid har været anvendt som stabilisatorer, især for Sabins levende poliovirus-vaccine/ det indgives oralt. Deres anvendelse har imidlertid visse ulemper. Saccharoseopløsningers høje viskositet vanskeliggør fremstillingen og fordelingen af dette produkt. Magnesiumchlorid har en ubehagelig smag og giver vanskeligheder ved administrationen ved vaccination af børn.

Det er endvidere kendt, at L-cystin har stabiliserende virkning på varmeinaktiveringen af poliovirus. Ifølge Pohjanpelto, Virology, 15, 225-23Q (1961) har det vist sig, at cystinvirkningens hurtig hed, dvs. den nødvendige tid for cystinet til at gå i forbindelse med viruset til beskyttelse af dette mod varmeinaktivering, afhænger af da forskellige enterovirustyper og -stammer. Ikegami et al.

(jap. J. M, Sc. & Biol., 16, 325-342 (1963) , og Jap. J. M. Sc. &

Biol,, jL7, 13-22 (1964)) fandt, at denne virkning er et genetisk stabilt karakteristikum og cystins virkning en funktion af stabiliseringen af virusets proteinstruktur. Formålet med disse tidligere undersøgelser var ikke at udvikle et stabiliserende medium for denne art vims* men derimod at undersøge genetiske mærker. De ovennævnte forfattere anvendte L-cystin, der var opløst i 1 N saltsyre. Ikegami (1963)(1964) fremstillede sin cystin-forrådsopløsning ved hjælp af 0,05-¾ tris-puffer som fortyndingsmiddel. Tris-puffer som fortyndingsmiddel er almindeligt anvendt indenfor biokemien. Forsøg har imidlertid vist, at den lavkoncentrerede tris-puffer ikke har tilstrækkelig stabiliserende virkning på poliovirus. Pohjanpelto (Virology, 15,, 225-230 (1961)) neutraliserede sin L-cystin-forrådsopløs-ning med natriumhydroxid. Det har vist sig, at tilstedeværelsen af natriumioner uundgåeligt påvirker poliovirusets stabilitet under 3 145175 lagring ved 25°C og derunder.

I betragtning af, at de hidtil tilgængelige poliovirusvacciner har en halveringstid på kun 7 dage ved 25°C, forekommer det yderst ønskeligt at tilvejebringe vacciner med længere lagringstid, især i de lande, hvor sundhedsregulativerne foreskriver, at produktet ved et fald i titer på mere end 50% må fjernes fra handelen.

Det har nu vist sig, at der ved anvendelse af et vandigt medium bestående af en ca. 0,3 til ca. 1,0 M tris(hydroxymethyl)aminomethan-opløsning indeholdende ca. 100 yg L-cystin pr. ml medium opnås en overraskende god stabilisering og præservering af en prøve ved stuetemperatur, medens den afventer analyse for tilstedeværelse eller fraværelse af poliovirus.

Det har endvidere vist sig, at en vandig blanding fremstillet af fra 0,3 til 1,0 M tris(hydroxymethyl)aminomethan-opløsning og ca. 100 yg L-cystin pr. ml blanding er særlig nyttig til stabilisering af orale poliovirus-vacciner i et tidsrum på op til 4 uger ved stuetemperatur, dvs. 25°C, således at man undgår nødvendigheden af på én gang at anvende al vaccinen i en ampul, der opbevares ved stuetemperatur, eller bortkaste en eventuel tiloversblivende del, når der kun anvendes noget af vaccinen.

Det har også overraskende vist sig, at stabiliteten af poliovirusvacciner kan forøges ved lagring ved temperaturer på fra -70 til 4°C, når sådanne vacciner kombineres med et stabiliserende vandigt medium fremstillet af en ca. 0,3 til ca. 1,0 M tris(hydroxymethyl)-aminomethanopløsning indeholdende ca. 100 yg L-cystin og ca. 0,8 mg syrehydrolyseret gelatine pr. ml vaccine.

I overensstemmelse hermed er suspensionsmediet ifølge opfindelsen ejendommeligt ved, at mediet består af en ca. 0,3 til ca. 1,0 M tris(hydroxymethyl)aminomethan-opløsning indeholdende ca. 100 yg/ml L-cystin.

Den uventede forøgelse i stabilitet skyldes den særlige måde, på hvilken L-cystin opløses. Ifølge den kendte teknik udføres opløsningen ved hjælp af saltsyre og en efterfølgende neutralisering ved 4 145175 hjælp af natriumhydroxid. Et sådant fremstillet medium bevirker imidlertid et væsentligt aktivitetstab, især ved lagring ved 25°C og derunder. Det har vist sig, at når L-cystinet opløses i destilleret vand under opvarmning til ca. 105°C under ringe overtryk og tris(hydroxymethyl)aminomethan tilsættes^ opnås de ovennævnte fordele. I overensstemmelse hermed er fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af suspensionsmediet ejendommelig ved, at man i destilleret vand opløser ca. 100 yg L-cystin pr. ml vand ved opvarmning til ca. 105°C under ringe overtryk og tilsætter tris(hydroxymethyl) aminomethan svarende til fra ca. 0,3 til ca. 1,0 M.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan gennemføres på den måde, at L-cystinet opløses i destilleret vand under opvarmning og et ringe overtryk ved 105°C. Efter at L-cystinet er blevet opløst, afkøles opløsningen til 60°C, og der tilsættes trispuffer som et pulver og eventuelt syrehydrolyseret gelatine (10%'s opløsning). Opløsningen afkøles og steriliseres ved hjælp af filtrering gennem et 0,22 μ membranfilter.

Det er kendt, at L-cystin er praktisk taget uopløseligt i vand, medens det er godt opløseligt i vandige opløsninger med en pH-værdi mindre end 2 og i basiske opløsninger med en pH-værdi større end 8. Disse ekstreme pH-niveauer er imidlertid ikke egnede for virusprøver, der afventer analyse, eller til poliovirusvacciner. Det stabiliserende medium fremstilles derfor som beskrevet ovenfor, og pH-værdien indstilles ved hjælp af den organiske ikke-toksiske puffer tris. Prøver eller vacciner kan derefter, om nødvendigt opbevares ved stuetemperatur. Indenfor et tidsrum på 14-21 dage vil højst 50% af det oprindelige virus gå tabt. Når det derimod er ønskeligt at opbevare vaccinen over længere tidsrum ved en temperatur på fra -70 til ca. 4°C, tilsættes syrehydrolyseret gelatine til det suspenderende medium af L-cystin og tris(hydroxymethyl) aminomethan.

Det stabiliserende suspensionsmedium indstilles til en pH-værdi på fra 6,5 til 8,5. Et foretrukket pH-område ligger mellem 7,0 og 7,5.

Som eksempel på poliovirusvacciner, der kan stabiliseres med suspensionsmediet ifølge den foreliggende opfindelse, kan nævnes levende svækkede Sabin-poliovirusvacciner afledt af følgende stammer: 5 145175 LSc, 2 ab (type 1), P 712, CH, 2 ab (type 2) og Leon a2b (type 3). Cellekulturer og virusvaccinevæsker fremstilledes efter i og for sig kendte metoder efter følgende retningslinier: Abenyre- eller menne- skediploidcellekulturer (WI-38) dyrkes i et celledyrkningsmedium @ ......

CMRL-1969 tilsat bovinserum. Dyrkningsmediet fjernes ved optimal vækst (monolag) og erstattes med viruspodestoffet og Earles lactal-buminhydrolysatmedium, der tilsættes til opretholdelse af cellekulturen. De inficerede cellekulturer dyrkes, indtil ca. 50% af cellerne viser virale cytopatiske virkninger. Virusvæskerne opsamles og behandles yderligere ved filtrering under anvendelse af et 0,45 y membranfilter og tilsætning af det omhandlede stabiliserende medium efterfulgt af fortynding. Suspensionen fyldes derefter i glasampuller, der oplagres. Under alle trin i fremstillingen af vaccinen tages der forholdsregler for at sikre, at der ikke sker tilsætning af supplerende midler og giftige stoffer. Virusvæskerne undersøges for sikkerhed, styrke og effektivitet under fremstillingens forskellige trin.

Opfindelsen forklares nærmere nedenfor i forbindelse med de følgende eksempler.

Eksempel I.

Sabin-poliovirusvæsker fortyndedes 1 forholdet 1:10 i 1 M tris-puffer, og man bestemte virkningen af tilsætningen af 100 yg/ml L-cystin på virusstabiliteten. Virusindholdet i de forskellige suspensioner af hver af de tre typer poliovirus bestemtes til at begynde med og med fire ugentlige intervaller under lagringen ved 25°C. Resultaterne viste, at forøget levedygtighed kunne gives alle tre Sabin-poliovirus ved tilsætning af L-cystin. Ved et lignende forsøg vistes det, at L-cystein ligeledes forøgede stabiliteten, men denne forbindelse havde en ubehagelig lugt og er ikke et egnet tilsætningsstof i en oral vaccine. Resultaterne er vist i tabel I.

Tabel I.

Den stabiliserende virkning af eystin^^ på Sabin-poliovirus^^ ved., lagring ved 25°C.

6 145175

Poliovirus- Tilsat Procentuel overlevelse ved Halveringstid'^^ type I-cystin 25°C (uger)__ (dage) ___O I 2 4___ 100 19 5 10 1 ---;----- + 100 59 25 17 100 20 5 10 2------- . + 100 55 17 16 100 45 6 11 3 -------- + 100 72 16 19 (1) 100 pg/ntl 1-cystin (2) Portyndet med 1,0 M tris-puffer (3) Antal dage indtil 50$ af viruset er inaktiveret.

Eksempel II.

Sabin-poliovirus type 1-virusvæske suspenderedes ill tris-puffer indeholdende 100 pg/ml L-cystin. Efter indstilling til pH 6,4, 7,4 og 8,4 undersøgtes virusstabiliteten ved de tre pH-niveauer ved 4°C over et tidsrum på fire måneder. Forsøget bekræftede de tidligere resultater, at inaktiveringshastigheden for Sabin-poliovirus ikke påvirkes af pH over et pH-område på 6,4-8,5. Resultaterne er vist i tabel II.

Tabel II.

Virkningen af pH på stabiliteten af Sabin-poliovirus type 1 under lagring ved 4°C under anvendelse af 1 1 tris-puffer plus 100 pg/ml I-cystin som stabilisator.

pH Procentuel overlevelse ved 4°C (mdr.) ϋ Ϊ 2 4 6.4 100 79 74 47 7.4 100 89 - 66 8.5 100 83 74 25 7 145175

Eksempel III.

Over et tidsrum på fire uger udførtes et lagringsforsøg ved 25°C med hver af de tre poliovirus suspenderet i forskellige koncentrationer tris-puffer plus 100 pg/ml L-cystin. Det vistes, at en 0,1 M trispuffer ikke har en tilstrækkelig stærk koncentration, men at egnet virusstabilitet først opnås ved tris-pufferkoncentrationer på mellem 0,3 og 1,0 M. Da 1 M tris-puffer smager svagt bittert, valgtes den lavere koncentration til standardtilberedning af stabilisatorblandingen. Det kan imidlertid under visse betingelser være fordelagtigt at anvende den højere tris-pufferkoncentration. Resultaterne er vist i tabel III.

label III.

Virkningen af forskellige koncentrationer af tris-puffer plus 100 pg/ml L-cystin på stabiliteten af Sabin-poliovirus under lagring ved 25°C.

Poliovirus Tris-puffer Procentuel overlevelse ved 25°C (uger) type (molær) -^^--γ " " 0,1 100 40 3 1 0,3 100 32 16 1,0 100 40 23 — - —.......— —...... - i 0,1 100 36 6 2 0,3 100 58 45 1,0 100 40 32 0,1 100 70 7 3 0,3 100 100 56 1,0 100 79 50 0 145175

O

Eksempel IV.

Hvert af de tre Sabin-oral-poliovirus suspenderedes i et stabiliserende medium fremstillet af 0,3 M tris-opløsning og 100 μg/ml L—cystin. Til Halvdelen af dette præparat sattes derefter 0,8 mg/ml syrestabiliseret gelatine. Begge prøver lagredes ved -20°C, og virusstabiliteten bestemtes efter 4 og 6 måneder. Resultaterne er vist i tabel IV. Det ses, at efter 6 måneders lagring var overlevelsesforholdet lOOfo for vacciner indeholdende tris, L-cystin og syrehydrolyseret gelatine.

Tabel IV.

Virkningen af gelatinetilsætning på stabiliteten af Sabin-poliovirus O/·, i tns-puffer og cystin under lagring ved -20 C.

Poliovirus- Tilsætning^^ af Procentuel overlevelse ved -20°C type 0,089¾ gelatine (mdr.) 0 4 6 100 56 89 1----- + 100 - 100 - 100 56 63 2---- + 100 - 100 100 40 40 3---- + 100 - 100 UJ Fortyndingsmi adel: 0,3 M Tris-puffer plus 100 pg/ml L-cystin.

Eksempel V,

Hvert af de tre Sabin-oral-poliovirus suspenderedes i et stabiliserende medium fremstillet af 0,3 I tris-opløsning, 100 pg/ml L-cystin og 0,8 mg/ ml syrehydrolyseret gelatine, og tilsvarende mængder af de tre Sabin-oral-poliovirus suspenderedes desuden i destilleret vand.

Begge prøver lagredes ved 25°C, og stabilitetsforsøg udførtes hver uge i et tidsrum på fire uger. De i tabel V gengivne resultater viser den høje stabiliserende virkning af det omhandlede medium.

9 145175

Tabel V. " ' -------- "..... ................... ~

Sammenligning af virkningen af stabilisator^ ..og destilleret vand på overlevelsen af poliovirus under lagring ved 25°C.

Poliovirus- Fortyndingsmiddel .. Procentuel overlevelse..ued......2.5.?.C, type (uger) 0 1 2 3 4

HqO ' 100 "' 71 ” ” 24.....17 ..... “5" 1 -------—------

Stabilisator 100 69 47 20 13

Hp 0 100 · 54 37 13 10 2 --—------!------:------

Stabilisator 100 72 72 36 23

HpO 100 ' ' ‘ 74 30 22 7 3 -i--------:-—

Stabilisator 100 100 69 32 44 (l) stabilisator =100 ^g/ml tr-cystiri,' 0,08$ gelatine,' 0,3 M trfS- puffer, pH 7,4. ' ' : : — - - . Eksempel VI.......... .......... ______________

Hvert af de tre Sabin-oral-poliovirus suspenderedes i et stabiliserende medium fremstillet af 0,3 M tris-opløsning, 100 pgAnl L-cystin og 0,8 mg/ml syrehydrolyseret gelatine. De stabiliserede poliovirusvac-ciner lagredes ved 4°C og undersøgtes hver måned for stabilitet i et tidsrum på 6 måneder. De i tabel VI gengivne resultater viser, at tabet var mindre end 50$.

'Tabel VI.

Virkningen af stabilisatoren på overlevelsen af Sabin-poliovirus under lagring ved 4°C.

145175 .....10 —!*"ί ' I —'1' -I ! II li I I.II'. MIM ..mum Ι.ιι.'ι I. . .11. ' mil Ι'Ι'.ΙΙ.ΊΠΙ ^" "i " '1,........V I—« ' I' » '' » ' i n-.

Poliovirus-......... Procentuel overlevelse ved 4°Q (mdr,) type -—' " ή ' " iu1 ' i 1 ' -—y i '—"——-— ' ί . — Ο 1 2 4 6 T I11 * ί ί » I- I L tl. «Ι1-* ·ΜΓ'"*Ι| Ι·Μ·. 'Ill ** n miw - I 1 '1 'V II ............ . ^ ........ I. 1.11,1,11,,1. n μ j<· 1 ·. 100 100 100 74 53 — U IPU -1 I, II·.! «· -?H ·η* 1 IIU»H1»«»T>·· |M n Vlf lii'iipyi I ' ΊΙ"'Ι"^"Ι··Ι 1' IJI ' I ' |IIP|I"IMBHI«III I III I I^WI^IHI I ^1.1 I, [H [111 ,, , 2, . ______________.... . 100 100 100 83 74 ΊΙί" II- II " ". -,|l.|l in'HI I'll—.T- —— ' I ' 1 "I » " III I ΊΙΙΙΙ I .........-,,,,..1,1) ,, I .. , , ,, . 3 100 100 -r 100 50 Τ^-Ιί (I I- HI. Ill -I.MMIHI <|.1·| in»nn. ...... 111 ill' I li'H'il'l' I I III. I M nil »I mm ...........I ' 1 ' I I rm ,

Eksempel Vll.

Prøver af orale polidvirusvacciner fremstillet ifølge eksempel VI ud* sattes for en rakke nedfrysninger og optøninger. Titerbestemmelsen viste, at der ikke tabtes nogen styrke. Dette fremgår af tabel VII.

label VII,

Virkningen af stabilisatoren på overlevelsen af poliovirus efter frystning og optøning, ...· <1 I ! i|> ......»I· ................ II. I . U.ffl'· IWP—MM · i I .. ..... 1·|1·1 II III. fil i ...........

Poliovirus- .... Procentuel overlevelse type --LI, I......... „Ml, , . . .1, I ,. .1./,1.— h) 0 5 10 cycler'· 1 I· I I Ί.,- I|l'('i)"li|'· ' i ,\''.v ,11!" [1-1 U1111 ' .......null.....,,,,.. ι ι·ιιιι,— i— — 1 100 100 100 2 100 100 100 3 100 100 100 .. I ' "|! I-'T-I IH.1 I I li. I , 1 ' ' 11 - 11 * 11 , -I ' " »II 1 I . IN, I I·..', Μ I J , r (l) Antal nedfrysnings- og optøningscycler under anvendelse af tøris med acetone og et 25°C varmt vandbad,

Eksempel VIII,

En prøve, 5abin~polioyirusvaccine type 1 stabiliseredes med et medium indeholdende '100 pg/ml L-cystin opløst i den nødvendige mængde NaOH og HC1, medens en anden prøve stabiliseredes i 100 p^ml I-cystin opløst i kogende, vand* Begge prøver lagredes ved 25°C og titreredes efter to og fire uger. Resultaterne er gengivet i tabel VIII.