DK145021B - Antibiotikum af bleomycingruppen til anvendelse af plantebeskyttelse - Google Patents

Description

145021

Den foreliggende opfindelse angår et hidtil ukendt antibiotikum af bleomycingruppen til anvendelse ved plantebeskyttelse, hvilket antibiotikum er ejendommeligt ved det i krav 1¾ kendetegnende del anførte.

Det hidtil ukendte antibiotikum ifølge den foreliggende opfindelse er komplekset kaldet Bu-2231 eller dets bestanddele Bu-2231 A og B i kobberkomplekse former eller kobberfrie former eller syreadditionssalte deraf. Komplekset og hver af de nævnte bestanddele har en hæmmende virkning på væksten af microbielle organismer, både bakterier og fungi, som er patogene for planter, og forbindelserne er derfor nyttige til hindring eller undertrykkelse af plantepatogene organismer som fremkalder sygdomme hos ris, ærter, hvede eller andre planter.

På tegningen viser:

Fig. 1 det infrarøde absorptionsspektrum af Bu-2231 A i form af dets i kaliumbromid pelletterede kobberfrie hydro-chloridsalt.

2 145021

Fig. 2 det protonmagnetiske resonansspektrum af Bu-2231 A som det i D^O opløste kobberfrie hydrochloridsalt under anvendelse af 2,2-dimethyl-2-silapentan-5-sulfonat (DSS) som indre standard ved bestemmelse med et JEOL 60 MHz NMR spektrometer (TNM-C-60 HL-type),

Fig. 3 det infrarøde absorptionsspektrum af Bu-2231 B i form af dets i kaliumbromid pelleterede kobberfrie formiatsalt,

Fig. 4 det protonmagnetiske resonansspektrum af Bu-2231 B som det i D20 opløste kobberfrie formiatsalt under anvendelse af 2,2-dimethyl-2-silapentan-5-sulfonat (DSS) som indre standard ved bestemmelse med et JEOL 60 MHz NMR spektrometer (TNM-C-60 HL-type).

Komplekset Bu-2231 kan fremstilles ved dyrkningen af en stamme af Streptoalloteichus hindustanus, fortrinsvis stammen Streptoalloteichus E465-94, A.T.C.C. 31158 under submerse aero-biske betingelser i et vandigt næringsmedium. Denne organisme er en Actinomycetesbakterie, som isoleredes fra en indisk jordprøve. En kultur af organismen er blevet deponeret i The American Type Culture Collection, Washington, D. C., og indføj et i dens permanente samling af microorganismer som A.T.C.C.

31158.

De morfologiske, dyrkningsmæssige og fysiologiske egenskaber af stamme E465-94, A.T.C.C. 31158 er sammenfattet herunder:

Stamme E465-94 danner klase og sclerotium i luftmyceliet på de fleste agarmedier. Klasen er en fremherskende sporedannende struktur, og dannelsen af sclerotier er noget ustadig. Klasen består af buede eller L-formede korte sporekæder med mange forgreninger og udvikler sig ofte i en tyk masse. Nogle sporekæder stikker ud fra klasestrukturen og danner ofte åbne spiraler.

3 165021

Sclerotiumsformen er oval og lejlighedsvis uregelmæssig. Opdeling af vegetativt mycelium fremkommer ikke. Der dannes ikke krans.

Stamme E465-94 danner kraftige luftmycelier på de fleste af de afprøvede agarmedier. Det modne luftmycelium er lysegulligt beige eller bleglyserødligt gult. Diffusibel pigment dannes ikke. Tyrosinasereaktion er negativ. Stammen kan modstå varme og vokser kraftigt ved 50 °C.

De dyrkningsmæssige og fysiologiske egenskaber og carbon-hydratudnyttelsen af stamme E465-94 er vist i tabellerne I, II og III.

TABEL I.

Dyrkningsmæssige egenskaber af stamme E465-94.

Gærekstrakt-maltekstraktagar G: Kraftig (ISP nr. 2 medium) R: Bleggulligt brun til

Pridham, et al., 1956-57 lysebrun A: Tykt, fløjlsagtigt, lyse gulligt beige eller bleglyserødligt beige D: Intet

Havremelsagar G: Moderat (ISP nr. 3 medium) R: Farveløs, delvist bleg-

Kuster, 1959 gulligt brun A: Letsmuldrende til fløjls agtig, lejlighedsvis med pletter, bleglyserødligt beige D: Intet

Uorganiske salte-stivelses- G: Moderat agar R: Farveløs til bleggulligt (ISP nr. 4 medium) brun

Kuster, 1959 A: letsmuldrende til fløjls agtig, bleglyserødligt gul Dj Intet

Glycerol-asparaginagar G: Begrænset (ISP nr. 5 medium) R: Farveløs til blegt ollven-

Pridham and Lyons, 1961 grønligt gul A: Letsmuldrende med pletter,

Hvidligt til bleggulligt beige D: Intet.

4 145021

Pepton-gærekstrakt-jernagar G: Sparsomt (ISP nr. 6 medium) R: Brun

Tresner og Danga, 1958 A: Sparsomt, hvidt D: Lysebrun

Tyrosinagar G: Moderat (ISP nr. 7 medium) R: Lysegul til bleggrønligt

Shinobu, 1958 gul A: Fløjlsagtigt til dunet, hvidt senere let lyserødligt gul D: Intet

Bennett's agar G: Moderat R: Blegt olivengrønligt gul til lysebrun A: Fløjlsagtigt, lysegulligt beige D: Intet Næringssubstratagar G: Begrænset

Rr Blegbrunligt gul A: Sparsomt, hvidt D: Bleggul

Jordekstraktagar G: Moderat R: Farveløs A: Tyndt, bleggulligt beige, pletter D: Intet

Tomatmas s e-havremelsagar G: Moderat R: Lysegulligt brun A: Fløjlsagtigt, bleglyse rødligt gul Dr Intet.

Forkortelser: G = vækst; R = bagsidefarve; A = luftmycelium; D = diffusibelt pigment.

TABEL II.

Fysiologiske egenskaber af stamme E465-94.

Gelatincsmeltning Positiv, hurtig smeltning

Stivelseshydrolyse Positiv Mælk Bemærkelsesværdig koagule ring og svag peptonisering. pH bliver alkalisk. Gullig ringvækst.

5 145021

Melanin fra L-tyrosin Negativ tyrosinaseprøve

Nitrit fra nitrat Positiv Væksttemperatur Kraftig vækst ved 32-50 °C, moderat ved 25-30 °C, begrænset ved 23 °C og 52 °C, sparsom ved 20 °C og 54 °C, ingen vækst ved 12 °C og 56 c.

Fluorescentlys Ingen klar inhibering af luft myceliumsdannelse under 15W-fluorescentlampe i 14 dage

NaCl-tolerance Begrænset vækst og luftmyceliums- dannelse i Leudemann's agarsubstrat ved 5% NaCl. Ingen vækst ved 7%

NaCl

Kartoffelprop- Normal vækst og luftmyceliums- surhedstolerance dannelse på Leudemann's kartoffel- propprøve

Katalase-reaktion Positiv

Oxidase Negativ

Dannede antibiotica Bu-2231-kompleks og nebraraycin- faktorer.

TABEL III.

Carbonhydratudnyttelse af stamme E465-94.

D{-)-arabinose - D(+)-melibiose L(+)-arabinose - trehalose ++ D-xylose - raffinose D-ribose + D{+)-melezitose L-rhamnose - opløselig stivelse ++ D-glucose ++ cellulose D.(+)-galactose ++ glycerol ++ D-fructose ++ inositol D-mannose ++ D-mannitol 0 L(-)-sorbose - D-sorbitol saccharose ++ dulcitol lactose ++ salicin cellobiose 145021 6

Basalsubstrat: Pridham-Gottlieb saltsubstrat, suppleret med 0,1% Difco gærekstrakt.

Inkuberingstemperatur: 37 °C.

Cellevægpræparatfremstilling udførtes efter den af T. Yama-guchi i J. Bacteriol. 8£: 444-453 (1965) beskrevne metode. Amino-syreanalysefremgangsmåden var som følger: Renset cellevæg (10 mg) hydrolyseredes i 1 ml 6N HC1 i et forseglet rør ved 120 °C i 18 timer. Hydrolysatet fortyndedes med et lige så stort volumen destilleret vand, filtreredes og inddampedes derpå i vakuum til tørhed. Halvdelen af slutproduktet genopløstes i 0,1 ml destilleret vand og undersøgtes ved to-dimensional TLC. Den anden halvdel opløstes i 2 ml citratpuffer (pH 2,2) og analyseredes ved væske-chromatografi. En 5 yl portion af hydrolysatet anbragtes på en silicagel-TLC plade (6OF254, E. Merck AG, Tyskland) og oparbejdedes med phenol-vand (4:1) i en retning og dernæst med n-butanol-eddikesyre-vand (3:1:1) vinkelret på den første udfoldelsesretning. Pletterne synliggjordes ved en påsprøjtning af 0,2% ethanolsk ninhydrinreagens, efterfulgt af opvarmning af pladen i 5 minutter ved 110 °C. Til adskillelse af meso og/ eller DD-DAP fra LL-DAP anbragtes 5 yl af hydrolysatet på en cellulosepulver-TLC plade. Pladen oparbejdedes med opløsningsmiddelsystemet methanol-vand-10N HCl-pyridin (80:17,5:2,5:10) i 24 timer og oversprøjtedes derpå med 0,2% ninhydrinreagens.

I dette TLC-system bevægede LL-DAP sig hurtigere end den som referencestandard anvendte meso-DAP. Aminosyrer i cellevæg-præparatet bestemtes også ved aminosyreanalyser. Aminosyre-analysen af cellevægpræparatet af stamme E465-94 viste tilstedeværelsen af meso-a, ε-diaminopimelinsyre (meso-DAP), alanin og glutaminsyre (tabel IV). Carbonhydrater i cellevæggen bestemtes som følger: En 50 mg prøve af den rå cellevæg opløstes i 3 ml 2N H2S04 °9 hydrolyseredes i et forseglet rør ved 120 °C i 2 timer. Hydrolysatet neutraliseredes med mættet BafOH^ opløsning, det udfældede BaSO^ fjernedes ved centrifugering og det ovenstående fluidum lyofiliseredes. Det således opnåede materiale 7 145021 trimethylsilyleredes, og produktet underkastedes gas-chromato-grafi og sammenlignedes med forskellige referencesukkerarter. Carbonhydratanalysen af cellevæggen af E465-94 viste nærværelsen af rhamnose, mannose, galactose og glucosamin (tabel V).

TABEL IV.

Cellevæg-aminosyresammensætning.

PAP (isomer) glycin glutaminsyre asparaginsyre alanin ++ (meso) - ++ spor +++ TABEL V.

Cellevæg-carbonhydratsammensætning.

arabinose rhamnose mannose galactose glucose glucosamin + ++ +++ - ++

Stamme E465-94 producerer et hidtil ukendt biocidt kompleks Bu-2231, hvilket antages at være sammensat af biocider af bleomycintype. Sammenligning udførtes derfor med adskillige Actinoraycetes stammer, der har vist sig at producere bleomycin eller bleomycinbeslægtede biocider. Resultaterne er sammenfattede i tabel VI. Stamme E465-94 skelnes klart fra enhver af disse microorganismer.

8 145021 TABEL VI.

Sammenligning af stamme E465-94 med 6 Actino-mycetesstammer, der producerer bleomycin-gruppe biocider.

Mikroorganismens Dannet Hovedforskel fra navn_ biocid_ stamme E465-94

Streptomyces Phleomyeiner Kransdannelse.

verticillus Positiv udnyttelse af 1 1) inositol, mannitol, nr. 84j-i raffinose og rhamnose.

Negativ udnyttelse af galactose.

Streptomyces Bleomyciner Kransdannelse.

verticillus Negativ udnyttelse af B80-Z2 galactose, lactose og saccharose.

Streptomyces Zorbamyciner Luftvækst grå til grålig bikiniensis gul. Sporophor lige.

. Udnyttelse ++: D-xylose, var.zorbonensis ' L-arabinose, rhamnose, cellobiose.

Udnyttelse +: Raffinose, du1ci to1, D-mannito1, D-sorbitol og inositol.

Streptomyces YA-56 kompleks Luftmycelium: lysebrunligt humidus gråt og hygroskopisk.

... . Positiv udnyttelse af var. an i umons arabinose, xylose, rhamnose, MCRL-0387 mannitol og inositol.

Streptosporangium Victomycin Dannelse af kugleformet violåceochromogenes sporangium.

Luftmycelium: skal-lyserødt.

MK-49 ' Positiv udnyttelse af xylose.

. Negativ udnyttelse af lactose.

Streptosporangium Platomyciner Dannelse af kugleformet violåceochromogenes sporangium.

. Luftmycelium: hvidt til MK-78 6 lyserødligt hvidt.

Positiv udnyttelse af xylose.

Negativ udnyttelse af lactose og glycerol.

145021 9 1) K. Maeda, et al. (Institute Microbial Chemistry):

Japan. Japansk patentskrift nr. 34-2598.

2) H. Umezawa, et al: New antibiotics, bleomycin A

and B. J.Antibiotics 19: 200-209, 1966.

3) The Upjohn Company: Britisk patentskrift nr. 1.277.150.

4) T. Furumai, et al.: The antibiotic YA-56 complex:

Taxonomy and production of the producing strain.

J. Antibiotics 26: 70-76, 1973.

5) I. Kawamoto, et al.: A new antibiotic victomycin (XK 49-1-B-2). J. Antibiotics 28: 358-371, 1975.

6) T. Nara, et al. (kyowa-Hakko Kogyo Co., Ltd.):

Japan. Kokai, 49-108292, October 15, 1974.

Actinomycetesstammen E465-94 dannede på agarmedier en klase og et sclerotium i luftmyceliet, hvilken morfologi typisk findes hos nogle arter af Streptomyces eller Chainia.

Imidlertid var aminosyre- og sukker-sammensætningen i celle-vægpræparatet af stamme E465-94 helt forskellig fra sammensætningen i enhver art i familien Streptomycetaceae. Cellevægpræparatet indeholdt meso-a,ε-diaminopimelinsyre (meso-DAP) i stedet for LL-DAP, som har vist sig at være en specifik cellevægbestanddel i slægterne Streptomyces og Chainia. Ydermere var hovedsukker-bestanddelene i stammen galactose, mannose og rhamnose, hvilke er helt forskellige fra de for Streptomyces eller Chainia beskrevne. Under hensyn til de ovennævnte fakta antages det, at en hidtil ukendt slægt Streptoalloteichus (strepto- en streptomyceslignende organisme, allo-ændret og teichos-væg, dvs. en Streptomyceslignende organisme med usædvanlig cellevægsammensætning) må udnavnes under familien Streptomycetaceae til udskillelse af Actinomycetesstammer, som ligner Streptomyces i morfologi, men har cellevægsammensætningen af stamme E465-94-type; meso-DAP, alanin og glutaminsyre som hovedaminosyrer og galactose, mannose og rhamnose som diagnostisk neutrale sukkerarter. Således er 145021 ίο

Streptoalloteichus en blandt slægterne af familien Streptomy-qetaceae enestående slægt, som indeholder meso-DAP i stedet for LL-DAF i cellevægsammensætningen. Det foreslås også, at stamme E465-94 kan betegnes Streptoalloteichus hindustanus gen. nov. og sp. nov., fordi organismen isoleredes fra Nordindien.

Stamme E465-94 ser klart forskellig ud fra microorganismerne, som har vist sig at danne bleomyciner og bleomycinbeslægtede antibiotica.

Til fremstillingen af antibiotiket ifølge den foreliggende opfindelse kan anvendes stammer, som kan henføres til arten Streptoalloteichus hindustanus, d.v.s. hvis egenskaber ikke afviger væsentligt fra de her anførte egenskaber.

Organismen dyrkes i et næringsmedium, som indeholder en assimilerbar carbonkilde, f.eks. et assimilerbart car-bonhydrat. Eksempler på passende carbonkilder er glucose, ribose, galactose, fructose, mannose, saccharose, lactose, opløselig stivelse og glycerol. Næringsmediet bør også indeholde en assimilerbar nitrogenkilde, såsom f.eks. fiskemel, soyabønnemel, majsstøbevand, peptoner, kødekstrakt, jord-nøddemel, gærekstrakt eller ammoniumsalte. Uorganiske salte, såsom natriumchlorid, kaliumchlorid, magnesiumsulfat, kalcium-carbonat, phosphater etc. tilsættes om nødvendigt. Sporelementer, såsom kobber, mangan, jern, zink etc. tilsættes om ønsket mediet eller kan tilføres som urenheder i andre af mediernes bestanddele.

Inkuberingstemperaturen kan være enhver temperatur, hvorved en Bu-2231-dannende stamme er i stand til at vokse, f.eks. 20-54 °C, men det foretrækkes, at fermenteringen udføresved 25-35 °C, især ved 27-32 °C. En neutral eller nær neutral begyndelses pH-værdi, f.eks. pH svarende til 6-7, anvendes fortrinsvis i mediet, og fremstillingen af antibioticum udføres sædvanligvis i en tidsperiode på fra omkring 2 til 7 dage. Sædvanligvis opnås optimal fremstilling på 3 til 5 dage. Til fremstilling af forholdsvis små mængder kan rystekolber og overfladedyrkning anvendes, men til fremstillingen af store mængder foretrækkes submers aerobisk dyrkning i sterile tanke. Når tankfermentering skal udføres, er det ønskeligt, at man danner et vegetativt inoculum i et næringssubstrat ved inoculering af substratkulturen med en spore fra 11 145021 organismen og overføring, når et ungt aktivt vegetativt inoculum er blevet opnået, af dette inoculum aseptisk til fermenterings-tanksubstratet. Beluftning i tanke og kolber kan tilvejebringes ved presning af steril luft gennem eller på det gærende mediums overflade. Yderligere bevægelse i tankene tilvejebringes ved hjælp af en mekanisk omrører. Et antiskummiddel, såsom olie fra svinefedt, kan om nødvendigt tilsættes.

Dannelsen af Bu-2231 i fermenteringsmediet kan let følges under fermenteringen ved hjælp af papirplade-agardiffusions-metoden under anvendelse af Bacillus subtilis PCI-219 og Mycobacterium 607 stamme M6-3 som testorganismer. Bu-2231 A og B er begge, såvel som de antageligt samtidigt dannede nebramycin-faktorer aktive mod B. subtilis PCI-219, men kun Bu-2231 A og B bestanddelene viste aktivitet mod M. 607 M6-3. I rystekolbe-fermenteringen dannede stamme E465-94 50-100 yg/ml Bu-2231 kompleks efter 3-5 dages forløb.

Efter opnåelse af optimal substratstyrke (f.eks. bestemt ved den ovennævnte prøvefremgangsmåde) skilles myceliet og uop-løste rester fra fermenteringssubstratet efter konventionelle metoder, såsom filtrering eller centrifugering. Den mikrobicide aktivitet indeholdes i filtratet og kan udvindes derfra under anvendelse af konventionelle adsorptionsteknikker. Adsorptionsmidlerne, som mest formålstjenligt anvendes ved udvindingen, er cation-bytter-harpikserne, f.eks. de harpikser af IRC-50-typen, som er kommercielt tilgængelige fra Rohm and Haas Company under varemærket "Amberlite IRC-50". Filtratet, som om nødvendigt neutraliseres til pH-værdi 7, sendes gennem en søjle, der er pakket med en cation-bytter-harpiks, såsom "Amberlite IRC-50" i ammoniumform. Harpiksen udvaskes dernæst med vand. Tillige med Bu-2231 komplekset danner organismen E465-94 samtidigt også et af nebra-mycinfaktorer bestående antibiotisk aminoglycosidkompleks.

Denne aminoglycosidurenhed kan adskilles fra Bu-2231 komplekset ifølge den foreliggende opfindelse ved eluering med en fortyndet base, f.eks. 0,25 N ammoniumhydroxid. Det ønskede Bu-2231 kompleks, 12 145021 som forbliver adsorberet på harpiksen, kan derpå elueres med en mineralsyreopløsning, f.eks. saltsyre med pH-værdi 2, og eluatets Bu-2231 fraktioner kan opsamles og kombineres.

Partiel rensning af komplekset kan udføres ved chromatografi af de kombinerede Bu-2231 fraktioner over et passende adsorptionsmiddel, såsom aktiveret carbon, og eluering med f.eks. vandig butanol med sur pH-værdi. Butanallaget skilles fra, og det vandige lag lyofiliseres eller koncentreres i vakuum til ydelse af det faste Bu-2231 kompleks. Komplekset kan yderligere underkastes chromatografi og/eller gelfiltrering til dannelse af det rensede kobberholdige faste kompleks.

Glycopeptidbestanddelene Bu-2231 A og B kan adskilles fra komplekset ved gradient-eluerings-chromatografi over en modificeret dextranderivat-cationbytter, f.eks. en modificeret poly-sacchariddextran af den kommercielt under varemærket "CM-Sephadex C-25" solgte type. En vandig opløsning af Bu-2231 komplekset, fortrinsvis renset som ovenfor beskrevet, sættes til en søjle, som indeholder den modificere.de dextran-ionbytter. Som i tilfældet med bleomycinerne (J. Antibiotics, 19, 210-215 (1966)) er det lettere at adskille komponenterne efter denne fremgangsmåde, hvis komplekset er tilstrækkeligt chelateret nied kobber. Således omfatter den foretrukne adskillelsesfremgangsmåde opløsning af komplekset i en cuprichloridopløsning til sikring af, at det er en tilstrækkeligt kobber-chelateret form, og dernæst tilføring af denne opløsning til søjlen. Bestanddelene elueres derpå på en trinvis måde med vandig ammoniumformiatopløsning af fra 1 til 7% varierende koncentrationer. Bu-2231 B fremkommer i eluatets tidlige fraktioner, medens senere fraktioner indeholder Bu-2231 A. De fraktioner, som indeholder de samme bestanddele, forenes, afsaltes ved gelfiltrering, koncentreres og lyofiliseres til dannelse af de rensede Bu-2231 A og B bestanddele i deres kobberkompleksformer.

Anvendelse af ammoniumformiat som elueringsmiddel i den ovenfor beskrevne chromatografiske adskillelsesfremgangsmåde resulterer i udvinding af de lyofiliserede bestanddele i form af formiatsalte. For fagmanden kendte standardfremgangsmåder « 145021 kan anvendes til omdannelse af formiatsaltene til deres respektive frie baser og/eller til omdannelse af formiatsaltene eller de frie baser til andre ønskede syreadditionssalte, f.eks. hydrochloridsaltene.

Glycopeptidbestanddele Bu-2231 A og B har den egenskab, at de chelaterer med kobber ligesom bleomycinerne gør det, og således kan bestanddelene og deres syreadditionssalte forefindes enten i den kobberkomplekse form eller i den kobberfrie form.

De kobberfrie former af Bu-2231 A og B kan fremstilles ud fra de kobberkomplekse former ved anvendelse af HgS i methanol som beskrevet i USA Patentskrift nr. 3.646.197.

De to microbicide glycopeptidbestanddele kan skelnes fra hverandre og de beslægtede bleomyciner og phleomyciner enten i deres kobberkomplekse eller kobberfrie form ved hjælp af TLC-systemérne S-102 og S-123 som nedenfor vist i Tabel VII.

145021 14 TABEL VII.

Rf-værdier.

S-102 S-123

Cu-A 0,22 0,05

Cu-B 0,41 0,11

Fri A 0,16 0,04

Fri B 0,31 0,09

Bleomyciner 0,34; 0,44; 0,69 0,21; 0,50; 0,79

Phlemyciner 0,37; 0,54; 0,72 0,22; 0,41; 0,59 S-102; Si02-plade, CH3OH-10% CH3COONH4 (1:1) S-123: Si02-plade, CH.jOH-10% CH3COONH4-10% NH^OH (10:9:1).

De microbicide stoffer Bu-2231 A og B er begge amorfe baser, som i den kobberkomplekse form fremtræder som blå faststoffer og i den kobberfrie form som hvide faststoffer. Begge stoffer er opløselige i vand og methanol, tungt opløselige i ethanol og praktisk taget uopløselige i andre organiske opløsningsmidler.

Bu-2231 A og B er i stand til at danne salte med syrer. Eksempler på velegnede syreadditionssalte omfatter salte med organiske og uorganiske syrer, såsom f.eks. saltsyre, svovlsyre, phosphorsyre, eddikesyre, myresyre, stearinsyre, pro-pionsyre, vinsyre, maleinsyre, benzoesyre, ravsyre og lignende.

Grundstofanalyserne af kobberkompleks og kobberfri Bu-2231 Ά og B var, som følger: 145021 15

Bu-2231 A (Cu-kompleks):

Beregnet for: C^H^N^Og^Cu: C 42,68} H 6,27} N 15,56} S 3,56 fundet: C 42,66} H 6,16; N 15,31; S 3,14.

Bu-2231 A (Cu-fri):

Beregnet for: C^H^N^O^: C 44,23; H 6,50} N 16,12} S 3,69 fundet: C 45,10; H 6,51; N 16,05; S 3,55.

Bu-2231 B (Cu-kompleks):

Beregnet for: C58HiqoN18°31S2Cu: C 41,63; H 6,02; N 15,07; S 3,83 fundet: C 40,96; H 5,61; N 14,78} S 3,39.

Bu-2231 B (Cu-fri):

Beregnet for: C^H^N^C^S,,: C 43,27; H 6,26} N 15,66; S 3,98 fundet: C 43,01; H 6,22; N 14,81; S 3,61.

Kobberindholdet i en kombineret prøve af Bu-2231 A og B bestemtes til omkring 3% ved atomabsorptionsspektrometri.

Bestanddelenes ultraviolette absorptionsmaxima og optiske rotation er som følger: 23 16 145021

UV absorption [a]D

Forbindelse λ i my (E^) (c 9,5; Η,,Ο)

Bu-2231 A (Cu-kompleks) 243(125),291 (98) +50°

Bu-2231 A (Cu-fri) 235(sk)*,290 (67) - 21°

Bu-2231 B (Cu-kompleks) 243(134),291 (109) + 76°

Bu-2231 B (Cu-fri) 235(sk)*,289,5 (77) - 199

Bleomycin A2 (Cu-kompleks) 242(149),291 (121)

Phleomycin (Cu-kompleks) 244(138),301 (49) + 84,5° (litteratur reference) # = skulder.

Forholdet mellem de specifikke UV ekstinktioner ved de to absorptionsmaxima for Bu-2231 (forholdsmæssig- specifik ekstinktion ved 240 my og 290 my: 1,2 - 1,3) antyder det hidtil ukendte kompleks' lighed .ned bleomycingruppen af antibiotica snarere end phleomycingruppen.

De infrarøde og kernemagnetiske resonansspektre for det kobberfrie hydrochloridsalt af Bu-2231 A og det kobberfrie formiatsalt af Bu-2231 B er vist på tegningen i fig. 1 til 4.

Begge mikrobicide.· bestanddele giver positive reaktioner med ninhydrinreagens.

Bu-2231 A's og B's nære strukturelle lighed med bleomycin antydedes ved de ovenfor beskrevne fysisk-kemiske egenskaber.

De kobberfrie præparater af de to bestanddele sammen med bleomycin A2 hydrolyseredes i et forseglet rør med 6N HC1 i 20 timer ved 1Q5 °C. Ethvert af hydrolysaterne undersøgtes sammenligningsvis ved højspændings-papirelektroforese. Lokaliteten af amino-syrerne påvistes ved hjælp af ninhydrinreagens og tillige ved UV lys.

145021

Som vist i Tabel VIII identificeredes enhver af de 6 aminosyrer (I til VI) og 1 amindel (VII) af bleomycin Ahvilken er beskrevet i litteraturen (J. Antibiotics 21: 79, 1968) ved hjælp af papirelektroforese. Hydrolyseprodukterne af Bu-2231 A og B udviste ninhydrin-positive zoner svarende til aminosyrerne I, II, IV og V fra bleomycin og påvisningen af, at enhver af de 4 fra Bu-2231 A og B isolerede aminosyrer var identiske med aminosyrerne I, II, IV og V fra bleomycin A£ udførtes ved kemiske og spektrale metoder. Aminosyre III (zone ved 13,5 cm) fra bleomycin A^ var ikke til stede i Bu-2231 A og B, hvilke i stedet udviste en yderligere ninhydrin-positiv zone ved 14,8 cm (betegnet som aminosyre VIII). Strukturen af aminosyre VIII er blevet bestemt som 4-amino-3-hydroxy-n-valerianesyre, som er en desraethylanalog af aminosyre III.

Aminosyre VI (zone ved 8,5 cm, UV absorptionsmaksimum ved 290 my) fra bleomycin A2 var ikke til stede i Bu-2231 A og B.

Imidlertid isoleredes en sur forbindelse (IX) med et UV absorp- 1% tionsmaksimum ved 283 my (ΕΊ _ = 280) som et bundfald fra I cm syrehydrolysatet af Bu-2231 A og B.

Den endestillede amindel (VII i Tabel VIII) i bleomycin A2 fremkom ved zone 31,5 cm. Bu-2231 A og B gav den samme zone som amin VII i bleomycin A2, men adskillige amindele i bleomycin-kompleks viser lignende bevægelighed i denne papirelektroforese-metode. Yderligere analyse viser faktisk, at den endestillede amindel i Bu-2231 A og B er spermidin (X), amindelen i bleomycin Aj.: Bu-2231 A gav en yderligere ninhydrin-positiv zone ved 23,0 cm. (XI i Tabel VIII), hvilken ikke var til stede i bleomycin A2 og Bu-2231 B. Forbindelse XI identificeredes som β- lys in.

Strukturerne af de ovenfor beskrevne aminosyrer og amindele er vist herunder: 145021 18

Aminosyre- og aminbestanddele i bleomycin A2 og Bu-2231 A og B.

I CH,-CH-CH-COOH

3 I I

OH NH2 L-threonin.

II H2NV-N

H3G\ VcH-CH2-COOH HOOC/^ »®2 p-amino-p-(4-amino-6-carboxy-5-methyl-pyrimidin-2-yl)-propionsyre

III CH -CH —CH-CH-COOH

3 I II

nh2 oh ch3 4-amino-3-hydroxy-2-methyl-n-valerianesyre.

IV N .....CH-CH-COOH

)1 I OH il·,

^ t\T H

β-hydroxyhistidin.

V NH.-CII„-CH-COOH

2 2 , ™2 L-p-aminoalanin.

145021 19

VI N-π—COOH

»-AT

Il s »h2-ch2-ch2—!^βχ!Ι 2'-(2-aminoethy1)-2,4'-bithiazol-4- carboxylsyre.

vil nh2-(ch2)3-s+(ch3)2,x" 3- aminopropyldimethylsulfoniumsalt.

VIII CH..-CH— CH-CH„-COOH

3 I I 2 NH2 oh 4- amino-3-hydroxy-n-valerianesyre.

IX Struktur ukendt (ACH3°H= 283 my).

IU3KS

X NH2-(CH2)3-NH-(CH2)4-NH2 (spe rinid in) .

XI NH2-(CII2)3-CH-CH2-COOH (β-lysin) .

nh2

Sukkerbestanddelen i Bu-2231 A og B undersøgtes også i sammenligning med bleomycin. En blanding af bestanddelene A og B opvarmedes under tilbagesvaling i methanol med en stærkt sur harpiks (Amberlyst 15) i 20 timer. Basiske fragmenter fra hydrolysen adsorberedes på harpiksen, og i opløsningen frigjorte produkter koncentreredes i vakuum til en klæbrig sirup. Dette materiale trimethylsilyleredes og underkastedes derefter gaskromatografisk analyse. Bleomycin gav toppe, som kan henføres til gulose og mannose, og Bu-2231 bestanddelene viste omtrent det samme elueringsmønster som bleomycin, hvilket antyder den 20 145021 samme struktur af carbonhydratdelen i antibiotikaene.

TABEL· VIII.

Papirelektroforese af syrehydrolyseprodukter.

Lokalitet af ninhydrin-positiv zone _(afstand fra ordinataksen) **

Aminosyrer og amin * Bleomycin A^ Bu-2231 A Bu-2231 B VI 8,5 cm I 9,7 9,7 9,7 II 12,0 12,0 12,0 III 13,5 VIII - 14,8 14,8 IV 16,0 16,0 16,0 V 18,5 18,5 18,5 XI - 23,0 VII (X) 31,5 31,5 31,5 * Strukturen af aminosyren- og aminbestanddelene er vist i teksten.

** "Toyo"-filterpapir nr. 51, pufferopløsning: Myresyre-eddikesyre-vand (25:75:900).

De minimale inhiberingskoncentrationer (MIC) af Bu-2231 A og B bestemtes mod mange forskellige bakterier og fungi ved dobbelt-agar fortyndingsmetoden. Mueller-Hinton agarmedium anvendtes til bestemmelsen af bakterielle MIC'er (gram-positive og gram-negative), medium nr. 1001 [glycerol (3%) , Na-glutaminat (0,3%), pepton (0,2%), Na2HP04 (0,31%), KH2P04 (0,1%), ammoniumcitrat (0,005%), MgS04.7H20 (0,001%), agar (1,5%)] til syrefaste 21 145021 bakterier og Sabouraud's agar til fungi. Resultaterne er vist i tabellerne IX og X i sammenligning med bleomycin og pleo-mycin. De baktericide og fungicide aktiviteter af Bu-2231 A og B er meget højere end de samme af reference-antibiotikaene. Bu-2231 A viste noget højere baktericid aktivitet end Bu-2231 B, men var mindre kraftig end den sidstnævnte i fungicid aktivitet.

22 145021 TABEL IX.

Baktericide spektre af Bu-2231 A og B.

Bu-2231 A Bu-2231 B Bleomycin Phleomycin

Testorganisme Cu-fri Cu-kompl. Cu-fri Cu-kompl. N1HJ__nr. 616 gram-negative E. coli NIHJ 0,025 0,025 0,2 0,1 0,8 0,8 " Juhl A15119 0,1 0,1 0,2 0,2 1,6 1,6 " K-12 A9632 0,05 0,05 0,1 0,2 0,8 1,6 " A20665 0,05 0,05 0,05 0,25 0,2 0,4 " A20683 6,3 25 12,5 50 >100 >100 " A20732 0,05 0,05 0,2 0,1 1,6 1,6 E.cloacae A21006 1,6 1,6 6,3 12,5 >100 50 K.pneumoniae Dll <0,0063 0,0125 0,025 <0,0063 0,2 0,4 A9678 0,2 0,4 0,4 0,4 6,3 12,5 " A20680 6,3 50 25 100 >100 >100 " A20328 0,8 0,8 1,6 1,6 25 >100 P.vulgaris A9436 0,2 0,4 0,2 0,2 6,3 0,8 P.morganii A9553 0,4 0,4 1,6 1,6 >100 6,3 P.mirabilis A9554 0,1 0,1 0,2 0,2 50 1,6 P.rettgeri A15167 0,4 0,4 0,8 0,8 >100 3,1 P.stuartii A20854 0,4 0,4 0,4 0,8 3,1 0,8 " A20734 0,4 0,4 0,8 0,8 >100 1,6 S.marcescens A20019 0,4 0,4 0,8 0,8 >100 0,8 " A20460 0,4 0,4 0,8 0,8 >100 0,8 " A20333 0,2 0,2 0,8 0,4 >100 0,8 " A21235 0,2 0,4 1,6 1,6 100 0,8 P.aeruginosa A9923 50 100 >100 >100 >100 >100 " A9930 0,4 0,4 0,8 1,6 >100 3,1 " H9,D113 >100 >100 >100 >100 >100 >100 " A20741 0,2 0,2 0,2 0,2 12,5 6,3 gram-positive S.aureus 209P 0,1 0,2 0,4 0,4 6,3 0,2 " Smith A9537 0,1 0,1 0,05 0,05 3,1 0,1 " nr. 193 0,1 0,2 0,4 0,4 12,5 0,2 " 209P,R4 0,4 0,4 0,8 0,8 12,5 0,4 "· A20239 0,2 0,2 0,8 0,8 12,5 0,4 " BX-1633,A9606 0,2 0,2 0,8 0,2 6,3 0,4 S.lutea PCI-1001 0,2 0,2 0,4 0,8 100 0,4 M.flavus D12 0,2 0,2 0,4 0,8 50 0,2 B.mycoides "0" 0,2 0,1 0,2 0,2 12,5 0,2 B.sphaericus nr. 122 <0,0063 <0,0063 0,2 0,2 6,3 0,4 B.cereus ATCC 10702Λ 0,2 0,2. 0,2 0,1 1,6 0,2 B.subtilis PCI-219 <0,0063 <0,0063 <0,0063 <0,0063 <0,0063 <0,0063 B.anthracis 115 0,05 0,05 0,1 0,2 12,5 0,4 syrefaste

Mycobacterium 607,087 0,2 0,1 0,1 0,05 0,8 0,4 " 607,D46 0,1 0,1 0,1 0,05 0,2 0,2 607,D47 0,1 0,1 0,05 0,025 0,4 0,2 " phlei,D88 0,05 0,05 0,05 0,025 0,2 0,1 " ranae,ATCC110 0,1 0,1 0,1 0,05 0,8 0,4 23 145021 • c •Η jin η vo n oo æ ^ooai'i toffliftmriinvf^i/iinrin § 10 ro h vo O O rovoooooo OONvororMOonrjvoroio

φ · Η Η H

r-f M Λ fi Ah c* £ m m m η ίο is u> co rr ^ co co πη η &3 cm cm ο cm η 04ΟΗΗΟΟΟ οοοωηοοοοοοο §g. * Η Ο Η ΗΟ Ο Η Η Η Η Η, 3 g Ζ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ i—! m r—l &

0 C0CDHCNCN ο (0 Η Η ri ri Μ Ν Ν ® Η Η CO Ν 05 η 10 10 ID

(jj'f q q ro Ο Ο OOOOOOO ΟαΗΓΟΓΟΟΟΟΦΗΗΗ Η 3 Γ0 . (Μ m <ν ι η m'd m CO in ^ if COCONMNriM'fMHIOHCOlNOMeaffl W W (n *******************

< I OO^OO OOOOOOO OOfOHmOOH^OOO

d

r-4 U

Γ0

CM

CM

2

CQ i-H

&

.¾ I 10 10 03 CO CO lOUJNNNNNffMrlflflONOiniti lO.lO

‘ ^ 5 «.»·.**·.* •h***·.*»*·»··**·

H0 Cl HHlOOOHHOOOOOOOCOOOOOHCVjHHH

3 3 H

J M HU H +J ro η ιϊ οι 15 ω cm M a ι W OlfflrIOCO Offl'f’fif^PItlllSHHMOlilllllliHHrl

Jj W ^ •.•.«.«.•.Η.·.*'.*·.»

Ό I ο Ο ΓΟ Ο O OOOOOOO OOCirovDOOH CMrOiOfO

t s S o

w in H

< ° S

in 03 m Η n cm m (¾ H N t' f< M1 U) O' CN *rt

in) m m h r* o o < , „ H

co d >< oHin κι οι o fl ci ., cm ω ι co ·π m Μ1 N »i τρ e ui H 2 o fl CO 4J Ο σι Η H H « ·& N SmSm

^ 5 s 5 3 S a S S S ? * · · · § s ; J

ni W ijr H Jg » tø tø <D 8 U Π (d til ΙΛ H

1 „ las s $ n g μ |a, & i a ϊ (lj 0 <U Η 0 > )1 ΒβΉΗΟιΗΐΗΪΙίρΐ *3 9 & s a &Ι^ΰ*ΰΜ·8§ΰ^ίΐ|ι g 3 .¾ a s s 11 p a a & 8111 s I t

in * h 0 to U

m · · · « · . · Ο Μ ί .......

4J Us s Us UsUswsCCWWis-SfcUOi&HEHEHS

• u d HU) H CM ΜΓ H CM ΗΊΡΗίΜΗΟΜΗΗΗι-ΙΗί-ΙΗΗΗΗΗΗΗ s! bhhkhiibekkkk'kkkkkkisitbskk 24 f45021

De følgende eksempler tjener til belysning af fremstillingen af de omhandlede forbindelser. "CM-Sephadex C-25" er et varemærke for et tørt opløseligt pulver (fremstillet af Pharmacia Fine Chemicals Inc.), hvilket er sammensat af mikroskopiske korn, som er syntetiske organiske forbindelser, der indeholder carboxymethyl-funktionelle grupper, og som udvindes fra polysaccharid-dextran. "Amberlyst 15" er et varemærke for en ionbytter-harpiks, som fremstilles af Rohm and Haas Company. "Amberlite XAD-2" er et varemærke for en adsorberende harpiks, som består af styrendivinylbenzen-copolymer og fremstilles af Rohm and Haas Company.

Eksempel 1.

Fermentering af kompleks.

En veludviklet agar~skråglaskultur af den Bu-2231 producerende organisme E465-94 anvendtes til inokulering af flydende vegetativt medium indeholdende de følgende bestanddele: 1,5% glucose, 0,5% polypepton, 0,2% gærekstrakt, 0,05% ^HPO^ og 0,05% MgSO^.TH^O. Podekulturen inkuberedes ved 28 °C i 2 dage på en rotationsryster (250 omdr./minut), og 2 ml af væksten overførtes til 100 ml af fermenteringsmediet i en 500 ml Erlen-meyer kolbe, hvilket medium havde en sammensætning af 2% glycerol, 1% pharmamedier, 1% majsstøbe vand, 0,3% (NH^^SO^, 0,003% ZnSO^.TH^O og 0,4% CaCO^. Antibioticumproduktion nåede et maksimum efter 3 til 5 dages omrystning ved 28 °C.

Eksempel 2.

Ekstraktion og oprensning.

Det i overensstemmelse med Eksempel 1 fremstillede udvindingssubstrat (ca. 10 1, 50 yg/ml) filtreredes, og bioaktiviteten i filtratet adsorberedes ved pH-værdi 7 af "Amberlite IRC-50" (NH^ form, 900 ml). Harpiksen udvaskedes med vand, (5 1) og derefter med 0,25N NH^OH opløsning (4 1) til eluering af nebramycinfaktorer. Bu-2231 kompleks elueredes derefter fra harpiksen med HCl-opløsning (11x3) ved pH-værdi 2. Bu-2231 fraktionerne kombineredes, adsorberedes af carbon (30 g) og elueredes med vandig butanol (11x3) ved pH-værdi 2. Butanol- 25 145021 laget fraskiltes, og det vandige lag koncentreredes i vakuum til tørhed. Det således opnåede rå faststof (1,2 g) oprensedes ved "Amberlite XAD-2"-chromatografi og derefter ved "Sephadex LH-20"-chromatografi til dannelse af et svagt grønligt pulver af Bu-2231 kompleks (150 mg, kobberkompleksform).

Eksempel 3.

Adskillelse af bestanddele.

Til adskillelsen i hver-komponent opløstes Bu-2231 kompleks (140 mg) i 3 ml 0,7% cuprichloridopløsning og anbragtes på en O!-sephadex C^S'-søjle (85 ml), som elueredes gradvist med vandig ammoniumformiatopløsning på 1 til 7%. Bu-2231 B elueredes med 3% ammoniumformiatopløsning og Bu-2231A ved 5% koncentration. Hver fraktion afsaltedes ved'Sephadex LH-20tt-chromatografi, koncentreredes i vakuum og lyofiliseredes til dannelse af de respektive formiatsalte af Bu-2231 A (84 mg) og B (21 mg) (kobberkomplekse fermer). De kobberfrie formiatsaltpræparater opnåedes ved behandling af de kobberkomplekse former med i methanol i overensstemmelse med den almene fremgangsmåde i Eksempel li USA Patentskrift nr. 3.646.197.

Eksempel 4.

Bu-2231 A, hydrochloridsalt.

En opløsning af kobberfrit Bu-2231 A formiat (750 mg) i 100 ml methanol indstilledes til pH-værdi 2,0 ved en tilsætning af 2N methanolsk saltsyreopløsning. Opløsningen sattes derpå dråbevis til 300 ml acetone under omrøring. Det dannede bundfald fraskiltes ved filtrering og tørredes i vakuum til dannelse af det rå Bu-2231 A hydrochloridsalt som et hvidt pulver (673 mg). En portion af dette pulver (140 mg) overførtes til en søjle indeholdende 70 ml 'Sephadex LH-20"(varemærke for en modificeret alkyleret dextran-gel, som markedsføres af Pharmacia Fine Chemicals inc.), som er pakket i 98% methanol. Søjlen udvikledes med 98% methanol, og de bioaktive fraktioner samledes derpå, koncentreredes i vakuum og lyofiliseredes til dannelse af det kobberfrie hydrøchlorid af Bu-2231 A (105 mg).

Claims (2)

1. 26 145021
2. 1. Antibiotikum af bleomycingruppen til anvendelse ved plantebeskyttelse kendetegnet ved, at det er komplekset kaldet Bu-2231 eller dets bestanddele Bu-2231 A og B i kobberkomplekse former eller kobberfrie former eller syreadditionssalte deraf, hvor den ene bestanddel Bu-2231 A er en base, som er i stand til at eksistere i både en kob-berkompleks form og en kobberfri form, at den ved udsættelse for syrehydrolyse giver aminosyrerne L-threonin, 3-amino-3~(4-amino- 6-carboxy-5-methylpyrimidin-2-yl)propionsyre, 3-hydroxyhistidin, L-3-aminoalanin, 4-amino-3-hydroxy-n-valerianesyre, 3-lysin og en aminosyre, som udviser et ultraviolet absorptionsmaksimum 1¾ på 283 my(E:r m = 280), den endestillede amin spermidin og carbon-1 cm hydraterne mannose og gulose, at den i den. kobberkomplekse form Cl) er et blåligt amorft faststof, som er opløseligt i vand og methanol, tungopløseligt. i ethanol og praktisk taget uopløseligti andre organiske opløsningsmidler, (2) giver en positiv reaktion med ninhydrin, (3) har den følgende grundstofanalyse (procent): C 42,66; H 6,16; N 15,31 og S 3,14, (4) viser ultraviolet absorption XH2? = 243 og 291 my (E^%_ =125 indues i cm ο η _ og 98), (5) har en specifik rotation på [a]^ = +50° (c 0,5, H20j, og (6) udviser et Rf på 0,22 i tyndtlagschromatografi ved anvendelse "af silicagel og methanol-10% ammoniumacetat (1:1) og et Rf på 0,05 ved anvendelse af silicagel og methanol-10% ammonium-acetat-10% ammoniumhydroxid (10:9:1), at. den i den kobberfrie form (1) er et hvidt amorft faststof, (2) har en specifik rotation på [a]^= -21° (c 0,5, H20) , (3) har den følgende grundstofanalyse (procent): C 45,10; H 6,51; N 16,05 og S 3,55, (4) viser ultraviolet absorption A^2^s=235 og 290 my 1% (Ei cm=s5cu^er 09 67), og (5) udviser et Rf på 0,16 i tyndtlagschromatografi ved anvendelse af silicagel og methanol-10% ammonium-formiat (1:1) og et Rf på 0,04 ved anvendelse af silicagel og methanol-10% ammoniumacetat-10%ammoniumhydroxid (10:9:1), at det antibiotiske stof som det kobberfrie hydrochloridsalt ved pellet 145021 tering i kaliumbromid har et infrarødt spektrum i det væsentlige som vist i fig. 1 og ved opløsning i deuteriumoxid ved en koncentration på 10% giver et NMR spektrum i det væsentlige som vist i figur 2, og den anden bestanddel Bu-2231 B er en base, som er i stand til at eksistere i både en kobberkompleks form og en kobberfri form, at den ved udsættélse for syrehydrolyse giver aminosyrerne L-threonin, β-amino-Ø-(4-amino- 6-carboxy-5-methylpyrimidin-2-yl)propionsyre, β-hydroxyhistidin, L-B-aminoalanin, 4-amino-3-hydroxy-n-valerianesyre, β-lysin og en aminosyre, som udviser et ultraviolet absorptionsmaksimum e 1% på 283 my (E^ = 280), den endestillede amin spermidin og carbon- hydraterne mannose og gulose, at den i den kobberkomplekse form (1) er et blåligt amorft faststof, som er opløseligt i vand og methanol, tungtopløseligt i ethanol og praktisk taget uopløseligti andre organiske opløsningsmidler, (2) giver en positiv reaktion med ninhydrin, (3) har den følgende grundstofanalyse (procent): C 40,96; H 5,61; N 14,78 og S 3,39, (4) viser ultraviolet absorption og 291 ^Ei%cm=134 og 109), (5) har en specifik rotation på [a]^3= +76° (c 0,5, H^O), og (6) udviser et Rf på 0,41 i tyndtlagschromatografi ved anvendelse af silicagel og methanol-10% ammoniumacetat (1:1) og et Rf på 0,11 ved anvendelse af silicagel og methanol-10% ammonium-acetat-10% ammoniumhydroxid (10:9:1), at <^en i den kobberfrie form (1) er et hvidt amorft faststof, (2) har en specifik rotation på [a]^ = -19° (c 0,5, H20), (3) har den følgende grundstofanalyse (procent): C 43,01; H 6,22; N 14,81 og S 3,61, (4) viser ultraviolet absorption ^2^=235 og 289,5 my (E^%cm=s^ul^er °9 77) og (5) udviser et Rf på 0,31 i tyndtlagschromatografi ved anvendelse af silicagel og methanol-10% ammonium-formiat (1:1) og et Rf på 0,09 ved anvendelse af silicagel og methanol-10% ammoniumacetat-10%ammoniumhydroxid (10:9:1), at den **--eom det kobberfrie formiatsalt ved pellettering i kaliumbromid har et infrarødt spektrum i det væsentlige som vist i fig. 3 og ved opløsning i deuteriumoxid ved en koncentration på 10% giver et NMR spektrum i det væsentlige som vist i fig. 4.