DK141534B - Fremgangsmåde og apparat til aerob dyrkning af mikroorganismer i et flydende næringsmedium. - Google Patents

Description

(11) FREMLÆGGELSESSKRIFT 14153*1 DANMARK (*i) mt ci.3 c 12 m i/oe «(21) Ansøgning nr. 2139/75 (22) Indleveret den 15- maj I975 (23) Løbedag 15· maj 1975 (44) Ansøgningen fremlagt og .

fremlaggelsesskriftet offentliggjort den ' ^ · apr . 1980

DIREKTORATET FOR

PATENT-OG VAREMÆRKEVÆSENET (30) Prioritet beg«** fra den

28. maj 1974, 7249/74, CH

<71> SOCIETE D' ASSISTANCE TECHNIQUE POUR PRODUITS NESTLE S.A., Place de la Gare 4, Case Postale 1009, 1000 Lausanne, CH.

(72) Opfinder: Vladimir Kalina, Chemin du Devin 94, 1000 Lausanne, CH.

(74) Fuldmasgtig under sagens behamMng:

Internationalt Patent-Bureau.

(64) Fremgangsmåde og apparat til aerob dyrkning af mikroorganismer i et flydende næringsmedium. -

Opfindelsen vedrører en fremgangsmåde til aerob dyrkning af mikroorganismer i et flydende næringsmedium indeholdende i det mindste in for den pågældende mikroorganisme assimilerbar carbonkilde, ved hvilken et dyrkningsmedium bestående af det flydende næringsmedium og af en cellemasse af mikroorganismen cirkuleres i et lukket kredsløb mellem et øvre niveau og et nedre niveau, idet dyrkningsmediet omrøres ved bunden af kredsløbets opstigningszone.

Dyrkning af aerobe mikroorganismer under opnåelse af stort udbytte, mere specielt på petroleurasfrektioner eller på substrater, der er afledt fra petroleum, og som kun indeholder en meget lille mængde oxygen, kræver ekstremt stor hastighed for oxygenoverførelsen, som ikke effektivt kan opnås i industriel målestok i de sædvanlige omrørte gæringstanke eller i de med cirkulation forsynede 2 1415 3 Λ gæringstårne. I nærværende beskrivelse betegner en dyrkning med højt udbytte en dyrkning, ved hvilken det er muligt at danne fra 10-20 g bakterier eller gær pr. liter kulturmedium pr. time, hvilket, når det f.eks. drejer sig om substrater svarende til formlen GnH2n+2 e*-^er GnH2n+l^9 kræver en oxygenoverførelseshastighed væsentligt større end 500 mmol 0£ pr. liter pr. time. Store oxygenoverførelseshastigheder nødvendiggør store hastigheder for carbondioxidoverførelsen. Imidlertid må omfanget af disse to overførelser ikke bevirke nogen hæmmende effekt, der kan tilbageføres til for store partialtryk af oxygen og carbondioxid i gassen, der bringes i kontakt med eller cirkulerer i kulturmediet.

Selv om det er muligt at forøge oxygenoverførelseshastigheden i en almindelig gæringstank ved at anvende luft, der er beriget med oxygen, kan forøgelse af hastigheden for fjernelse af den ved gæringen dannede carbondioxid kun opnås ved en betydelig forøgelse af luftningen. Imidlertid er det ikke muligt til stadighed at forøge den gennemledte luftmænge i en konventionel omrørt gæringstank, idet der hurtigt nås en grænse, hvorefter skumdannelsen ikke længere kan holdes tilstrækkeligt begrænset. I denne henseende er situationen mere gunstig, når det drejer sig om en gæringsbeholder af cirkulationstårntypen forsynet med et effektivt separeringssystem, der er forbundet til tårnets top, medens i det mindste delvis afgasset væske tilbageføres gennem tårnets bund. Hvis det i dette tilfælde er ønsket at forøge luftningen til opnåelse af den oxygenoverførelseshastighed, der kræves til dyrkning med stort udbytte, støder man igen på en grænse, der skyldes dannelse af foretrukne baner, der følges af gasboblerne i et utilstrækkeligt omrørt medium. Som følge heraf vil forøgelsen i den relative gennemstrømningshastighed for gassen i forhold til kulturmediet ikke give sig udslag i den nødvendige forbedring af oxygenoverførelseshastigheden, men i stedet medføre en hæmmende virkning, der kan føres tilbage til de således tilvejebragte gradienter, hvorfor der alt i alt blot sker et energitab. Det er muligt at forbedre situationen ved at anvende hindringer, såsom skærme, i den bane, der følges af den opadstigende gas, men dette kan kun gøres, hvis de pågældende hindringer ikke medfører udvikling af for store gradienter for oxygenpartialtrykket, hvilket kan skabe en hæmmende trykzone i tårnets nedre del.

Dyrkning af mikroorganismer under opnåelse af stort udbytte på oxygenfattige substrater medfører også alvorlige varmeoverførelsesproblemer. F.eks. vil ved en fremgangsmåde, ved hvilken fermentationsvarmen overstiger 8000 kg kalorier pr. kg dannede celler, en produktionshastighed på 15 g pr. liter pr. time, medføre , at mediets temperatur vil stige 2°G pr. minut, hvis der ikke anvendes køling.

3 141534

Sora følge heraf er det vigtigt at anvende et effektivt kølesystem. Et kølesystem, der omfatter varmeveksling inde i fermenteringszonen, er ikke anbefalelses-værdigt ved dyrkning med stort udbytte, som følge af de uønskede hindringer, som, køle overfladerne, der kraves for at opretholde en fermenteringstemperaturstørrelsesorden af 30-40°C, ville udgøre. Af denne grund må kølesystemet anbringes uden for fermenteringszonen. Uheldigvis kraver opretholdelse af en lav temperaturgra-dient ved hjælp af et system af denne art en hurtig cirkulatlonshastighed for væsken. Det er imidlertid kun muligt at opnå en stor cirkulationshastighed i en konventionel fermentør med cirkulationstårn, på bekostning af en formindskelse af oxygenoverførelsen, hvilket modvirker den tilsigtede opnåelse af en maksimal vades thastighed.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at dyrkningsmediet i en gæringszone, der strækker sig langs en opstigningsside af kredsløbet fra det nedre niveau, og som ender under det øvre niveau, udsættes for den kombinerede indvirkning af friktionskræfter fra bobler af en oxygenholdig gas eller af oxygen, som frigøres under tryk i mediet ved den nedre ende af gæringszonen, en mekanisk omrøring og blanding i det mindste et par steder langs opstigningssiden, og et modtryk udøvet på mediet ved toppen af gæringszonen. Mediet køles fortrinsvis uden for fermenteringszonen.

Dyrkningen kan med fordel foretages kontinuerligt, og det er muligt langs en nedstigningsside af kredsløbet forbundet med opstighingssiden ved de højere og lavere niveauer, i det mindste delvis at afgasse mediet, at afkøle det og at fjerne i det mindste en del af den cellemasse, der er til stede heri, samtidig med at man beriger mediet, der tilbageføres til fermenteringszonen med næringsstoffer.

De fordele, der opnås med fremgangsmåden ifølge opfindelsen, omfatter en ensartet fordeling af gassen i væsken ved en stor luftningshastighed, homogenitet af dyrkningsmediet langs fermenteringszonen uden fremkomst af hæmmende gradienter, maksimal udstrækning af fermenteringszonen i det rizn, der står til rådighed for dette formål, og en effektiv varme overføre Ise ved en stor cirkulationshastighed af væsken. Det er også muligt ved fremgangsæåden ifølge opfindelsen at formindske den totale mængde energi, der kræves til at overføre en given mængde oxygen pr. volumenenhed af den luftede væske i forhold til den mængde, der anvendes ved en konventionel proces. Endelig er en yderligere fordel ved fremgangsmåden Ifølge opfindelsen,dens fleksibilitet, der muliggør, at den kan tilpasses efter 141534 4 egenskaberne af et stort udvalg af dyrkningsmedier, med hensyn til væksthastigheden af mikroorganismerne og med hensyn til mængden af varme, der afgives under dyrkningen eller med hensyn til niveauet af oxygen- eller carbondioxidpartial-trykkene.

Det er fordelagtigt, at man ved det øvre af en fermenteringszone,som slutter under det øverste niveau, opretholder et tryk, der er større, end det, der hersker i det øverste niveau. Det er muligt på denne måde at forene fordelene ved fremgangsmåden både med hensyn til dens fleksibilitet og med hensyn til omfanget af oxygenoverførelsen, som følge af at den part af kredsløbet, der ligger mellem det øverste af fermenteringszonen og det øverste niveau,kan anvendes til ekspansion af gasserne, der indblasses og frigøres under tryk, medens tryktabet fra bunden til det øverste af fermenteringszonen hensigtsmæssigt kan begrænses til tilnærmelsesvis det, som skyldes højden af søjlen af dyrkningsmediet.

Opfindelsen angår også et apparat til kontinuerlig aerob dyrkning af mikroorganismer omfattende et kredsløb med en opadstigende side og en nedadstrømmende side, som er i forbindelse med hinanden ved et øvre niveau og et nedre niveau, og som har et omrøringsorgan ved bunden af opstigningszonen, hvilket apparat er ejendommeligt ved, at den opadstigende side omfatter et kammer, som danner en gæringszone, som strækker sig fra det nedre niveau og når til et niveau under det øvre niveau, hvilket kammer omfatter organer til indblæsning af en oxygenholdig gas eller oxygen under tryk ved dets nedre ende, organer til mekanisk at drive dyrkningsmediet i opadgående retning og til mekanisk at blande mediet, samt en modtryksventil i toppen af gæringszonen.

Det er fordelagtigt i den nedadstigende side at inkorporere organer til at afgasse mediet og organer til at afkøle mediet. Som det vil være klart for fagmanden, er apparatet som følge af dets konstruktion navnlig beregnet til kontinuerlig behandling af store mængder medium. Således kan volumenet af fermente- 3 3 ringskammeret være mere end 50 m og endda mere end 100 m , medens man med en opholdstid for mediet i kammeret af størrelsesordenen 1 minut kan have gennemfø- 3 relsesmængder, der andrager op til mellem 50 og 100 m pr. minut. For under disse omstændigheder at begramse dimensionerne af kølesystemet og mængderne af den nødvendige mængde kølefluidum er det hensigtsmæssigt at anvende en varmeveksler anbragt mellem en kompressor og en kondensator for kølefluidumet, dvs. en fordampningsveksler. Med kølere af denne art, der kan arbejde med gennemføreIses-mamgder på fra 10-20 ton kølefluidum pr. time, idet kølefluidumet f.eks. kan være freon, er det muligt at formindske størrelsen af udvekslingsoverfladerne og således at reducere tryktabet, samtidig med at man drager fordel af temperaturdifferensen, der er gunstig for varme overføre Isen. Med hensyn til afgasningsmid-lerne, dvs. midlerne til at fjerne den fra luften stammende nitrogen (i de tilfælde, hvor der indblæses luft i gæringskammeret), carbondioxidet, der frigøres ved gæringen, og ikke anvendt oxygen, er det muligt i toppen af den nedadstigende U1534 5 side at inkorporere en separator baseret på overfladeeffekt eller en hydrocyklon.

Organer til udvinding af cellemateriale fra mediet kan være forbundet med nedstigningssiden , medens et tilførselsrør for næringsstoffer kan være forbundet til gæringskammerets nedre del. Udvindingsorganerne kan bestå af et forgrenet rør, hvorigennem en del af det afgassede medium kan passere til,organer til separering af cellemasse fra mediet, idet mediet, der således befries for- : cellemasse tilbageføres gennem et tilbageførselsrør til nedstigningssiden eller til gæringskammeret. 1 denne forbindelse kan man gå ud fra, at ved udøvelse af processen ifølge opfindelsen vil mængden af medium, der behandles pr. time med henblik på adskillelse af cellemasse herfra, være af samme størrelsesorden, som den mængde medium, der pr. minut indføres i gæringskammeret· Næringsstofferne, der indpumpes gennem tilførselsrøret til gæringskaomeret til erstatning af stoffer, der forbruges af en passende mikroorganisme, som dyrkes i kammeret, kan f,eks. være et carbonhydrid, en alkohol eller en sukkerart som carbonkiide og ammoniak eller urinstof som nitrogenkilde.

Organerne til mekanisk at fremdrive mediet i gæringskammeret kan bestå af i det mindste en propel, der roterer i et horisontalt plan,og som er i stand til at tvinge mediet opad og således forstærke den opadstigende virkning af friktionen fra boblerne af luft eller oxygen,som frigøres under tryk ved kammerets bund. Organerne til mekanisk blanding af mediet i kammeret kan bestå af et antal roterende bladsæt eller rørarme anbragt med indbyrdes afstand og oven på hinanden. Disse sæt af rørorganer kan være monteret på en fælles vertikal roterende aksel, der drives af en motor. Da en sekundær effekt af den mediumblandende virkning af disse bladsæt er at skabe turbulente strømme, der giver en vis modstand mod mediets opadstignlng i kammeret, kan det være hensigtsmæssigt at forsyne bladene eller rørarmene eller i de mindste nogle af disse med en hældning i forhold til det horisontale plan eller med en sådan udformning, at i det mindste ét af disse sæt har form af en propel og er i stand til at tvinge mediet opad.

En foretrukken udførelsesform for apparatet er i overensstemmelse hermed ejendommeligt ved det i krav 3's kendetegnende del anførte.

Selvsagt kan enhver kombination af fremdrivende og blandende organer anvendes.

Gæringskammeret strækker sig ikke over den totale højde mellem det øvre niveau og det nedre niveau. Der anvendes i stedet en forsnævret passage med en modtryksventil i det øvre af forgæringezonen, der når til det øvre niveau, hvor den udmunder i den øverste ende af nedstigningssiden. Det er således muligt på ethvert niveau i kammeret, hvis højde kan være af størrelsesordenen 8-10 meter, at opretholde et tryk, der er praktisk taget det samme som det tryk, hvorunder luft eller oxygen Indblæses i bunden af kammeret, bortset fra det hydrostatiske tryk af søjlen af luftet medium, der findes mellem kammerets bund og det pågældende niveau. Hvis man for at opnå en stor oæygenoverførelseshastighed i gæringskammeret, f.eks. på mere end 500 mmol eller endda på mere end 900 mmol 141534 6 C>2 pr. liter pr. time, nødvendigvis må have et tryk på i det mindste 3-3,5 atmosfæres absolutte tryk i et medium, der i dispersion indeholder luft i en mængde på ca. 40 volumenX, er det således muligt at udnytte overskydende energi af tilførselsgassen ved kammerets afgangsende ved at lade røret, der leder fra den begrænsede passage til det øvre niveau, hvor der hersker et tryk i nærheden af atmosfærens, virke som luftpumpe.

Fordelen ved denne adskillelse mellem oxygenoverføreIsen og ekspansionen af den tilledte gas er, at det er muligt fuldstændigt at eliminere tryktab, specielt de tryktab, der skyldes kølesystemet, og at opnå cirkulation af mediet gennem apparatet samtidig med, at man i hele gæringszonen opretholder et tryk, der er tilstrækkeligt højt og ensartet til opnåelse af de krævede oxygenoverførelseshastigheder. Det er muligt at tilvejebringe en begrænset passage i form af en forsnævring, et diafragma eller en række skærme, der delvis overlapper hinanden langs en passage, der fører fra det øverste af kammeret til det rør, der leder til det øvre niveau.

En udføreIsesform for apparatet, der anvendes til udøvelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen beskrives som eksempel i det følgende under henvisning til tegningen, der skematisk viser et vertikalt snit gennem· denne udførelsesform.

Et vertikalt langstrakt metalkammer 1 danner en gæringszone 2. En roterende aksel 3 når op gennem hele gæringszonen, med andre ord fra apparatets nedre niveau 4 til kammerets top 5. Akslen 3 drives af en elektromotor anbragt neden for kammeret. Grupper af blade eller skovle 7, 8, 9 og 10 er anbragt med regelmæssige mellemrum på akslen 3. Hver gruppe, f.eks. gruppen 8 består af 4 flade skovle 11. Skovlene hælder i samme retning i forhold til det vertikale plan, der defineres af dens frie ende og af akslen 3 , så ledes at hver gruppe kan anvendes både til at blande dyrkningsmediet under gæringen i zonen 2 og til at drive mediet opad. Gasindblæsningsorganer 12 findes ved bunden af kammeret, og de består af et sæt horisontale rør, hvori er boret små huller. Et tilførselsrør 13 for gas, hvis strømningshastighed reguleres med en gastilførselsventil 14 , tjener til at forsyne rørene 12 med den gas, der skal frigøres under det krævede tryk i bunden af kammeret 1. En modtryksventil 15 ved toppen af kammeret 1 forbinder den øvre ende af gæringszonen 2 med et ekspansionsrør 16 , der fører til det øvre niveau 17 af apparatet. Denne ventil 15 udgør en begrænset passage for det luftede medium og tjener således til at hindre ethvert tryktab, som ikke skyldes formindskelse af højden af søjlen af det luftede medium i kammeret. Ekspansionsrøret 16 danner således den øvre del af apparatets opstigningsside. Dets højde er en sådan, at den samtidig muliggør kompensation for tryktabene i nedstigningssiden, 7 141534 overvindelse af den modstand, der ikke er fuldt ud kompenseret i gæringskammeret af den fremaddrivende kraft af bladene med propelform, og opretholdelse af den nødvendige cirkulationshastighed af mediet i det lukkede kredsløb, som dannes af opstigningssiden og nedstigningssiden i apparatet, hvilke sider er i indbyrdes forbindelse ved det øvre niveau 17 og det nedre niveau 4. Et gasfraskil-lende organ 18, i nærværende tilfælde en cyklon, udgør første komponent af nedstigningssiden. Et afgangstør 28 for den gas, der enten er frigjort ved gæringen eller ikke forbrugt under denne, er forbundet med den øvre del af cyklonen 18 og står i forbindelse med atmosfæren gennem en afgangsventil 19 , der tjener til regulering af trykgradienterne i apparatet.Den nedre del af cyklonen 18 , hvori mediet modtages i det mindste delvis befriet for gasser, er forbundet til et returrør 20. 1 røret 20 har mediet en forholdsvis stor massefyl de, hvilket sikrer, at røret 16, hvori det luftede og gærede medium cirkulerer i form af en dispersion, der tilføres under tryk gennem modtryksventilen 15 , virker som luftpumpe. Et rør til udtagning af cellemateriale, der medføres af det i det mindste delvis afgassede medium, eller et forgreningsrør 21 er forbundet med returrøret 20. Mængden af medium, der skal behandles til separering af cellemateriale heri reguleres ved hjælp af en ventil 22 indskudt i røret 21. Røret 21 fører til ét organ til udvinding af cellemateriale, f.eks. en centrifuge (ikke vist). Et køleorgan 23, i nærværende tilfælde en varmeveksler af fordampningstypen, er forbundet i serie med returrøret 20, hvori mediet strøkmaer, medens kølemedium 24 strømmer mellem en kompressor og en kondensator (ikke vist). Den sidste del af returrøret 20 fører fra køleorganet til bunden af gæringskammeret 1 via en ventil 25 til kontrol af cirkulationshastigheden af mediet i apparatet. Endelig betegner tallet 26 et tilførselsrør for næringsstoffer forbundet til den nedre del af gæringskammeret.

Røret 26 passerer gennem en ventil 27 til regulering af strømningshastigheden for en næringsvæske, der leveres af et blandeapparat (ikke vist). Et rør til tilbageførelse af medium fjernet via røret 21 og derpå separeret fra cellematerialet kan forbindes til blanderen for næringsstoffer. Således er, hvad der kan betegnes et sekundært lukket kredsløb, hvori den del af mediet, hvorfra cellematerialet kontinuerligt er fjernet, cirkulerer,forenet med det lukkede kredsløb, hvori hele mængden eller tilnærmelsesvis -hele mængden af medium cirkulerer.

Fremgangsmåden og apparatet ifølge opfindelsen er særligt anvendelig til dyrkning af mikroorganismer med henblik på fremstilling af intracellulære og ekstrace 1lulære stoffer, såsom proteiner og aminosyrer.