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Publication number: DEP0009417MA
Authority: DE

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

Tag der Anmeldung: 19. März 1953 Bekanntgemacht am 12. April 1956

PEUTSCHES PATENTAMT

Die Erfindung befaßt sich mit der Herstellung von in Wasser quellbaren oder kolloidal löslichen Mischpolymerisationsprodukten, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die polymeren Ketten durch hydrolysierbare Glieder miteinander vernetzt sind. Im besonderen betrifft die Erfindung die Herstellung einer Blutflüssigkeitsersatzlösung, bei der die kolloid-osmötisch wirksamen hochmolekularen Bestandteile im Organismus allmählich zu kleineren Teilstücken aufgespalten werden, welche dann u. a. durch die Niere ausgeschieden werden können.

Siedt längerem wird versucht, nach starkem Blutverlust oder bei anderen lebensgefährlichen KoI-läpserscheinungen den Kreislauf durch intravenöse Infusion von Flüssigkeit wieder aufzufüllen. Isotonische Lösungen . von Kristalloiden, wie z. B. physiologische Kochsalzlösung, haben bekanntlich nur eine vorübergehende Wirkung, da die Flüssig-'keit die Blutbähn innerhalb kurzer Zeit wieder verläßt, um in das Gewebe abzuwandern oder um durch die Niere ausgeschieden zu werden. Dagegen sind Lösungen von kolloidalen Substanzen, die infolge ihrer hochmolekularen Struktur nicht durch die semipermeablen Gefäßwände abwandern können, als Blutflüssigkeitsersatz wesentlich besser geeignet. Die Kolloide binden nämlich Wasser und halten dies somit in der Blutbahn, Die Molekülgröße dieser makromolekularen Substanzen darf

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eine gewisse minimale Größe nicht unterschreiten, da sonst auch diese Moleküle und damit die von ihnen gebundene Wassermenge mehr oder weniger

■ schnell ausgeschieden werden. .

Als solche kolloidalen Blutflüssigkeitsersatz-

■ lösung wurden bereits vorgeschlagen: Lösungen von Gummiarabikum, Pektin, Alginat, Dextran, Polyvinylalkohol oder Polyvinylpyrrolidon. Bekanntlich stellte sich bald heraus, daß diese körperfremden Substanzen vom Organismus praktisch nicht abgebaut werden können. Da die mittlere Molekulargröße dieser Kolloide im allgemeinen über der nierenfähigen Grenzgröße liegen soll, verbleiben diese Substanzen zum Teil im Organismus und werden, wie man aus Tierversuchen näher weiß, in den Organen, besonders in den Zellen des reticulo-endothelialen Systems—'-vor-allem'-in gewissen Zellen der Leber — abgelagert. Daher können nach mehrfacher oder größerer Infusion von solchen Lösungen irreversible Gewebsänderungen und auch unter Umständen gewisse Spätschäden auftreten. Versuche, an Stelle der obengenannten Substanzen solche Kolloide zu verwenden, die im Organismus relativ leicht abgebaut werden können, haben zu keinen befriedigenden Ergebnissen geführt. Stärke und ebenso normale, unveränderte Gelatine werden nämlich zu schnell im Organismus abgebaut. Bei Gelatine kommt außerdem noch hinzu, daß infolge ihrer linear-molekularen Struktür auch größere Moleküle schnell durch die Nieren ausgeschieden werden. Außerdem sind die Gelatinelösungen bei Zimmertemperatur geliert und werden erst bei Temperaturen über 25 bis 30⁰ flüssig. Andere Eiweißkörper kommen nicht in Frage, da sie zu starke allergische Reaktionen verursachen.

Somit stellt sich nun die Aufgabe, ein Blutersatzmittel herzustellen, das gut verträglich ist, eine Verweildauer von 3 bis 8 Tagen besitzt und danach, wenn durch Resynthese von Plasmäeiweiß der Blutverlust wieder ausgeglichen, ist, vom Organismus völlig ausgeschieden und somit nicht in den Geweben abgelagert wird.

Die Erfindung schlägt nun vor, durch Einbau von im Organismus hydrolisierbaren Brückengliedern zwischen den einzelnen Ketten eines Polymerisates ein Kolloid herzustellen, das im Organismus nach einiger Zeit hydrolytisch aufgespalten wird, worauf die zertrennten einzelnen polymeren Ketten, deren Molekulargewicht geringer als das des vernetzten Produktes ist, unter anderem durch die Nieren ausgeschieden werden. Erfindungsgemäß werden in Substanzen, die vom Organismus hydrolytisch gespalten werden können, zuerst einige oder mehrere polymerisierbar ungesättigte Grup-· pen, z.B. Vinylreste bzw. Reste von Vinylderiväten, eingebaut. Die Polymerisation wird dann zweckmäßigerweise nach Zugabe anderer polymerisierbarer monomerer Verbindungen, z. B. Vinylderivaten, durchgeführt, so daß man längere Ketten erhält, in die dann in gewissen Abständen, je nach Mengenverhältnis der monomeren Verbindung zu der substituierten hydrolysiefbaren . Substanz, als Verbindungsglieder diese Substanzen eingebaut sind.

Beispielsweise werden Polypeptide nrittleren. ■';· Molekulargewichts (MG =1000 bis 20000), die durch partielle Hydrolyse von Eiweiß erhalten wurden, mit z. B. Acrylsäoireanhydrid umgesetzt. Hierdurch werden, je nach den Bedingungen, einige oder mehrere reaktionsfähige polymerisierbare Acrylsäurereste an das Pdlypeptimolekül angehängt. Erfindungsgemäß können auch andere polymerisierbare Gruppen,¹ wie z. B. Methacrylsäurereste, Maleinsäurereste bzw. Allylgruppen oder Styrylgruppen angelagert werden. Sollen ungesättigte Säurereste eingebaut werden, so wird man z\veckmäßig das entsprechende Säuireanhydrid, Säurehalogenid oder eventuell Säureazid anwenden und die Substitution in wäßriger alkalischer. Lösung' bei niederer Temperatur, durchführen.
- Bei 'dieser ' Substitution 'werden die freien Aminogruppen des Polypeptides, ζ. B. die ε-Aminogruppen des Lysins und die freien Aminogruppen der endständigen Aminosäuren azyliert. Daneben können auch noch einige Hydroxylgruppen des^ Polypeptides, ζ. B. die Hydroxylgruppen von Serin, Oxyprolin usw., mit der ungesättigten Säure verestert werden.

Sollen Allylgruppen oder Styrolgruppen in das Polypeptidmolekül eingebaut werden, so läßt man z. B. Allylhalogenid oder Styrylhalogenid in alka- go lischer Lösung auf das Polypeptid einwirken. Hierbei werden die reaktionsfähigen Amino- uind Hydroxylgruppen in entsprechender Weise durch ungesättigte Alkylreste bzw. Aralkylreste substituiert. Natürlich kann man gegebenenfalls auch ,95 ungesättigte Säurereste und z. B. Allylreste an das Polypeptid anhängen.

Je nach zugefügter Menge oder je nach den Reaktionsbedingungen können wunschgemäß wenige oder viele ungesättigte polymerisierbare Reste in too das Polypeptidmolekül eingebaut werden. Durch Formoltitration oder durch Bestimmung der freien Aminogruppen nach VanSlyke kann man die Substitution, der Aminogruppen genaui bestimmen. Im allgemeinen sollen nicht zu viele Aminogruppen substituiert werden, da sonst die Gefahr besteht, daß das Polypeptid gegen jegliche fermentative Spaltung resistent geworden ist.

Hat man das Polypeptid mit z. B. Acrylsäureanhydrid reagieren lassen und polymerisiert dann anschließend direkt in der Reaktionslösung durch Zugabe eines geeigneten Polymerisationsinitators, wie Wasserstoffperoxyd oder Benzoylperoxyd, so werden die bei der Reaktion des Säureanhydrids mit dem Polypeptid frei gewordenen zweiten Acrylsäuren des Anhydrids in das Polymerisationsprodukt miteinpolymerisiert. Man kann auch noch andere reaktionsfähige Monomere zu der Lösung geben, wodurch ein Mischpolymerisationsprodukt erhalten wird, bei dem die polymeren Ketten durch Polypeptidbrücken netzartig miteinander verbunden sind. Je nach der Menge des zugefügten Monomeren und je nach Anzahl der ungesättigten Radikale erhält man mehr oder weniger stark vernetzte Makro- " moleküle, deren Wasserlöslichkeit von der Art und der Anzahl der monomeren Verbindungen, der. Art

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und der Anzahl der in das Polypeptid eingeführten Substituenten und dem Grad der Polymerisation abhängt. .

Führt man die. Mischpolymerisation in Gegenwart von Vinylazetat durch und spaltet anschließend, durch vorsichtige Hydrolyse die Acetylgruppen ab, so erhält man ein Polyvinylalkoholpräparat, das durch die Polypeptidbrücken teilweise vernetzt ist.

ίο Besonders geeignet für die erfindungsgemäße Mischpolymerisation mit den aktiven Polypeptidverbindungen ist N-Vinylpyrrolidon. Diese Mischpolymerisation, wird man vorzugsweise so steuern, ·■: daß die einzelnen Polyvinylpyrrolidonketten nicht allzulange werden, damit sie nach Aufspaltung der Brücken auch wirklich vom Organismus ausgeschieden werden. Vorzugsweise wird man die Mischpolymerisation mit einem vorher gereinigten substituierten Polypeptid durchführen und auch

ao das erhaltene Produkt durch fraktionierte Fällung, z. B. mit Aceton oder einem anderen mit Wasser mischbaren geeigneten organischen Lösungsmittel oder durch fraktionierte Salzfällung in bekannter Weise reinigen. Hierdurch erhält man bezüglich der Molekülgröße einheitliche Präparate.

Hat man bei der Polymerisation Polypeptide mit nur wenigen reaktionsfähigen polymerisierbaren Gruppen verwendet, so wird man ein Mischpolymerisationsprodukt erhalten, dessen Aufspaltang im Organismus wesentlich leichter erfolgen kann, als wenn man ein sehr stark mit aktiven Resten sustituiertes Polypeptid zusammen mit dem Vinylpyrrolidon hat polymerisieren lassen.

Als für das erfindungsgemäße Verfahren geeignete Polypeptide können Abbauprodukte von z. B. Haut- und Knochenkollagen, Casein, Serumalbumin usw. verwendet werden. Mehr oder weniger unveränderte Proteine, soweit sie nicht antigen wirken, sind nach Einführung geeigneter reaktionsfähiger Gruppen ebenfalls zur Herstellung solcher Mischpolymerisate verwendbar. Diese Produkte besitzen jedoch meist eine sehr hohe Viskosität, bzw. man . erhält gelierte, nicht mehr klar lösliche Reaktionsprodukte. So ist nach der USA.-Patentschrift

2 548 520 bekannt, daß man durch Mischpolymerisation von Acrylylgelatine mit Vinylacetat oder Methacrylsäuireanhydrid quellbare, in Wasser nicht mehr lösliche Produkte erhält, die in der Photoindustrie Anwendung gefunden haben.

An Stelle der bisher erwähnten Polypeptide eignen sich erfindumgsgemäß auch höhere Kohlehydrate, z. B. Polysaccharide wie Stärke, Dextrine, Mucine usw. als im Organismus hydrolysierbare Verbindungsglieder zwischen den Polymerisationsketten. In analoger Weise werden auch diese Substanzen mit ungesättigten polymerisierbaren Gruppen substituiert, z. B. werden, wie oben beim Polypeptid beschrieben, Acrylreste durch Reaktion mit Acrylsäureanhydrid oder Allylreste durch Reaktion mit Allylbromid in alkalischer Lösung eingebaut. Je nach Wunsch kann man das Verhältnis von Glucoserest zu aktiver Gruppe von z. B. 10 : 1 bis ι : ι variieren. Werden jedoch zu viele Gruppen eingebaut, d. h. sind zu viele der Glucosereste substituiert,, so wird das Mischpolymerisationsprodukt im Organismus zu schwer bzw. gar nicht mehr aufgespalten werden können, da dann den spezifischen hydrolysierenden Organfermenten die Möglichkeit ■■ der Wirksamkeit genommen wurde.

Ganz allgemein eignen sich erfindungsgemäß als Ausgangsprodukte für die Vernetzungsglieder alle im Organismus leicht hydrolysierbaren Substanzen, an die einige oder mehrere polymerisierbare Radikale angehängt werden können. In Einklang mit dem Erfindungsgedanken können bei der Polymerisation gleichzeitig verschiedene im Organismus spaltbare Substanzen als Brückenglieder bei der Mischpolymerisation einpolymerisiert werden. „ .'^: Diese Polymerisation, kann mit · nur einer monomeren Verbindung, wie z. B. Acrylsäure, Acrylsäureamid, N-Vinylpyrrolidon usw., oder ebenso mit mehreren eventuell ganz verschiedenen Monomeren durchgeführt werden, je nach den gewünschten Eigenschaften des Mischpolymerisates. Hat man außer dem vorzugsweise angewendeten Vinylpyrrolidon noch etwas Acrylsäure bei der Poly-. merisation zugegen, so erhält man ein Produkt mit mehr oder weniger saurem Charakter. Bei Gegenwart von basischen polymerisierbaren Verbindungen, z. B. Allylamin oder dessen Derivaten, erhält man ein auch basische Gruppen enthaltendes polymeres Produkt. Zu; achten ist natürlich darauf, daß man Monomere wählt, die gut verträgliche und bei Verwendung als Blutersatzmittel auch gut wasserlösliche polymere Produkte ergeben.

Beispiel 1

100 g SoVoige Acrylsäure ■ werden mit 500 ecm einer 25 g Na₂CO₃ enthaltenden Sodalösung langsam versetzt. Nach Beendigung der Kohlensäureentwicklung werden bei Zimmertemperatur 0,5 g 3°/oige Wasserstoffperoxydlösung zugefügt. Nach kurzer Zeit beginnt die Polymerisation der Acrylsäure, was sich durch leichtes Erwärmen der Mischung kundtut. Hierauf werden unter Rühren schnell 100 ecm 2o°/oige Lösung eines acrylierten Polypeptides hinzugefügt. Dieses mit polymerisierbaren Acrylresten substituierte Polypeptid wird durch Acrylierung von durch Papain fermentativ angespaltenem Casein in alkalischer Lösung bei Ph = 8,5 bis 9 in der hierbei üblichen Weise erhalten. Der Substitutionsgrad beträgt etwa 70% der vorhandenen Aminogruppen. Nach Beendigung der Zugabe des Acrylsäureanhydrids wird das Ganze auf p_H=4 gebracht und das Reaktionsprodukt mit der iofachen Volumenmenge Aceton ' ausgefällt, dann in destilliertem Wasser aufgenommen, neutralisiert und auf eine Konzentration von etwa 20% eingestellt. Nach beendeter Polymerisation wird die Reaktionsmischung mit Alkohol versetzt, wodurch das als Na-Verbindung vorliegende Polymerisationsprodukt ausgefällt wird.

Beispiel 2

Die entsprechend dem Beispiel 1 bereitete neutralisierte Acrylsäuirelösung wird mit einer

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acrylierten Polysaccharidlösung versetzt.. Dieses Polysaccharid wird durch hydrolytischen Abbau von Stärke mit Pankreatin bis·zum Verschwinden der blauen Jod-Stärke-Reaktion und anschließender Reaktion mit Acrylsäureanhydrid im alkalischen Milieu erhalten. Nach Einmischen der loo ecm 2ö°/oiger Acrylpolysaccharidlösung wird ι ecm 3 ⁰Zo H₂O₂ zugefügt und die Mischung dann, auf 6o° erwärmt. Nach 2 Stunden wird die Reaktipnsmischung in einem Dialysierschlauch gegen physiol. Kochsalzlösung, die mehrmals erneuert wird, diälysiert, wobei niedermolekulare Anteile, z. B.. nicht an der Reaktion beteiligte Acrylsäure, abgetrennt wird.

Claims

PATENTANSPRÜCHE:

i. Verfahren zur Herstellung eines Mischpolymerisationsproduktes, dadurch gekennzeichnet, daß man im Organismus hydrolysierbare : organische Substanzen, vorzugsweise Polypeptide oder Polysaccharide, mit reaktionsfähigen, polymerisierbaren Gruppen substituiert und die erhaltenen Produkte durch Polymerisation der ungesättigten Gruppen miteinander vernetzt.: ' . :..■: ' / ■
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Polymerisation in Gegenwart einer oder mehrerer vorzugsweise im Überschuß vorhandener, polymerisierbarer monomerer oder partiell polymerisierter Verbindungen durchführt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der Polymerisation eine oder mehrere hydrolysierbare Substanzen, die mit polymerisierbaren Gruppen einer oder mehrerer Arten substituiert sind, verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als polymerisierbare Gruppen ungesättigte Säurereste oder ungesättigte. Alkylreste, vorzugsweise Allylreste, in die hydrolysierbare Substanz eingebaut sind.