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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung,
die ein schnelles Scannen großer
Proben bereitstellt, um Positionen von Objekten mit spezifischen
Eigenschaften zu erfassen und zu bestimmen. Die Vorrichtung ist
weiterhin dazu angepasst Informationen zu speichern, die mit den
Positionen der erfassten Objekte assoziiert sind und ist ebenfalls
dazu angepasst die Objekte zu identifizieren. Die Positionen der
Objekte und/oder deren Identitäten
können
in einer selbstlöschenden
oder einer permanenten Speichereinrichtung gespeichert werden. Die
Probe kann zum Scannen auf einem festen Träger, wie beispielsweise einer
ringförmigen
Scheibe angebracht sein. Die Objekte können Zellen oder Mikroorganismen
eines besonders seltenen Typs sein, d.h. sie können in einer sehr geringen
Dichte in der Probe vorhanden sein.
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In
der US-5,374,989 wird eine Vorrichtung zum Identifizieren eines
Objekts mit einer nicht spezifischen äußeren Abgrenzung offenbart.
Die Vorrichtung umfasst eine Verfolgungseinrichtung zum Verfolgen
einer Position des in zwei Dimensionen zu identifizierenden Objekts
und eine Identifizierungseinrichtung zum Identifizieren des verfolgten
Objekts. Die zu identifizierenden Objekte können gefärbt sein, so dass sie durch
unterschiedliches Durchlassvermögen
bei einem bestimmten Wellenlängenbereich von
anderen Objekten unterschieden werden können. Die Objektidentifizierungseinrichtung
umfasst eine kohärente
Lichtquelle, die einen Bereich der Probe beleuchtet und eine Detektionseinrichtung
mit mehreren ringförmigen
koaxialen Abschnitten, die die Intensitätsverteilung einer Fouriertransformation von
Licht erfasst, das durch die Objekte der Probe fortgeleitet wurde.
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Die
US-5,663,057 offenbart eine Vorrichtung und ein Verfahren zum schnellen
Zählen
fluoreszierender Mikroorganismen in einer Probe. Ein fester Träger, wie
beispielsweise ein Filter, der die fluoreszierenden Mikroorganismen
hält, wird
zeilenweise mit einem Laserstrahl gescannt, der einen ringförmigen Brennpunktbereich
mit einem Durchmesser zwischen 4 und 14 μm an dem Filter aufweist. Die
emittierte Fluoreszenz wird bei einer oder mehreren bestimmten Wellenlängen erfasst.
Die Scan-Linien auf dem Filter werden in einem überlappenden Muster erstellt
und Merkmale werden zeilenweise gleichzeitig verglichen, um nicht
korrelierte Ereignisse, wie Zufallsrauschen, etc. zu beseitigen. Über eine
digitale Signalbearbeitungsschaltung wird ein Satz bestimmter mathematischer
Algorithmen angewendet, um die fluoreszierenden Lichtsignale zu
erhalten, so dass ein Erfassen falsch positiver Antworten und falsch negative
Antworten vermieden oder minimiert wird.
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Die
WO 96/09548 offenbart ein System zum Fortleiten einer optischen
Inspektion bzw. Überprüfung einer
biologischen, chemischen oder biochemischen Probe, worin das System
als ein gewöhnlicher CD-Spieler
funktioniert. Eine Scheide, die die Probe hält wird, während die Lichtquelle und der
Detektor über
die Scheibe bewegt werden, gedreht.
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Die
WO 98/25131 offenbart eine Waferüberprüfungsvorrichtung,
worin die Überprüfungsstation stationär gehalten
wird, wohingegen der zu überprüfende Wafer
durch Dreh- und
verschiebende Bewegung des Wafers gescannt wird. Eine Lichtquelle emittiert
P-polarisiertes
Licht auf die Oberfläche
des Wafers, um Pickel und Teilchen auf dem Wafer zu erfassen und
sie zu unterscheiden. Ein Lichtkanaldetektor ist zum Sammeln reflektierten
Lichts angeordnet und drei Dunkelkanaldetektoren zum Sammeln von
Komponenten gestreuten bzw. gebeugten Lichts bei jeweils verschiedenen
bestimmten Winkeln von der Oberfläche des Wafers. Der Lichtweg
bzw. -pfad für
das von der Lichtquelle zu dem Wafer emittierte Licht weist keinen
gemeinsamen Teil mit den Lichtwegen des von dem Wafer reflektierten
oder gestreuten Lichts auf.
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Die
vorstehend erwähnten
Typen der Vorrichtungen des Standes der Technik verwenden ein Kartesisches
(x, y) Scan- und Verfolgungsverfahren, wodurch die Probe zeilenweise
gescannt wird und die bestimmten Objekttypen entweder durch Erfassen
des von den Objekten emittierten Lichts oder durch Erfassen charakteristischer
Parameter einer optischen Fouriertransformation eines durch die
Objekte fortgeleiteten Lichts erkannt werden.
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Jene
Verfahren des Standes der Technik zum Probenscannen sind aus praktischen
Gründen zum
Lokalisieren der Objekte zu langsam, wenn der bestimmte Typ von
Objekten oder Zielobjekten in der Probe sehr selten vorkommt, d.h.
dass sie eine Dichte von 1E-6 oder weniger aufweisen können. Das langsame
Scannen beruht auf dem kartesischen Scannen der Probe und dem kleinen
Brennpunktbereich der verwendeten Laserstrahlen, kombiniert mit der
großen
Anzahl von Objekten, die bevor es möglich ist ein Zielobjekt zu
lokalisieren und zu identifizieren, analysiert werden müssen. Weiterhin
kann es aufgrund der beschränkten
Abmessungen der Probe, die durch jene Verfahren des Standes der
Technik bereitgestellt werden vorkommen, dass sie kein Zielobjekt
beinhaltet.
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Demgemäß besteht
eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, ein Verfahren und
eine Vorrichtung bereitzustellen, die große Probenbereiche bzw. großflächige Proben
schnell Scannen und gleichzeitig innerhalb der Probe die Positionen
der Zielobjekte erfassen können.
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Ebenfalls
besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin eine Vorrichtung
bereitzustellen, die die Positionen der erfassten Zielobjekte in einer
selbstlöschenden
oder einer permanenten Speichereinrichtung speichern kann. Die Positionen der
erfassten Zielobjekte werden anschließend von der Speichereinrichtung
abgefragt und die Objekte werden einer gründlichen Analyse unterzogen,
um deren Identität
zu ermitteln.
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Eine
erfindungsgemäße Vorrichtung
kann einen festen Träger
bereitstellen, der dazu angepasst ist die Probe aufzunehmen und
zu halten, wobei eine Fläche
bzw. ein Bereich verwendet wird, der mindestens zwanzigmal größer ist
als die allenfalls im Stand der Technik bereitgestellten 400 mm2.
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Die
Vorrichtung kann ebenfalls dazu angepasst sein ein schnelles Scannen
der Proben bereitzustellen, die auf allgemein bei der Mikroskopie
im medizinischen Gebiet verwendeten Objektträgern von Standardgrößen bereitgestellt
sind.
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Der
große
Probenbereich, die durch die erfindungsgemäße Vorrichtung gescannt werden
kann, weist, insbesondere bei Anwendungen, die ein Erfassen sehr
seltener Zielobjekte umfassen, einen bedeutenden Vorteil auf, da
wahrscheinlich eine wesentlich größere Anzahl von Zielobjekten
in der Probe vorkommt als die Zielobjektanzahl in den durch die
vom Stand der Technik bereitgestellten Vorrichtungen.
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Ein
weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass
sie eine Lichtquelle nutzen kann, die einen Brennpunktbereich auf
die Probe strahlen kann, der wesentlich größer ist als die Brennpunktbereiche,
die durch die Stand der Technik Vorrichtungen bereitgestellt werden.
Der große Brennpunktbereich,
der durch eine erfindungsgemäße Ausführungsform
der Vorrichtung bereitgestellt werden kann, ermöglicht ein schnelles Scannen
von sogar sehr großen
Proben.
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Gemäß einer
ersten Ausführungsform
der Erfindung wird eine Vorrichtung zum Erfassen einer Eigenschaft
eines Objekts bereitgestellt, das sich gemäß Anspruch 1 in einer Probe
befindet.
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Das
Teil kann weiterhin zum Drehen um eine Achse an dem Rahmen angebracht
sein und die Scan-Mittel umfassen Mittel, um das Teil um die Achse
zu drehen.
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Die
Scan-Steuermittel können
dazu angepasst sein die Scan-Mittel zu steuern, um die Probe entlang
einer bestimmten Kurve, wie beispielsweise einer im Wesentlichen
ringförmigen
Kurve, zu scannen.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform der
Erfindung umfasst die Vorrichtung ebenfalls Mittel zum Abtasten
bzw. Prüfen
und Digitalisieren des Detektorsignals und des (der) entsprechenden
Positionssignals(-signale).
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Die
Vorrichtung kann weiterhin Signalbearbeitungsmittel umfassen, die
mit dem Detektor operativ verbunden und dazu angepasst sind das
Detektorsignal zu empfangen und zu bearbeiten, um eine Anwesenheit
eines Objekts oder eines bestimmten Typs eines Zielobjekts oder
von Objekten zu erfassen. Das/Die mit irgendwelchen erfassten Objekten assoziierten
entsprechende(n) Positionssignal(e) können anschließend in
dem/den Speichermittel(n) gespeichert werden.
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Die
Vorrichtung ist vorzugsweise dazu angepasst Proben mit einer größeren Fläche als
500 mm2 oder vorzugsweise größer als
2000 mm2, oder sogar noch bevorzugter größer als
8000 mm2 scannen zu können.
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In
einer Ausführungsform
der Erfindung werden die Zielobjekte mit einem Fluoreszenzmarker
gefärbt.
Eine Lichtquelle wird ebenfalls zur Emission eines Lichtstrahls
auf die Probe bereitgestellt. Weiterhin wird ein lichtempfindlicher
Detektor zum Erfassen von Licht bereitgestellt, das während des
Scannens der Probe von dem Zielobjekt oder den Objekten nach Interaktion
mit dem Lichtstrahl emittiert wird.
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Erfindungsgemäß wird das
Teil an dem Rahmen der Vorrichtung angebracht. Die Lichtquelle emittiert
einen Lichtstrahl auf die Probe, die vorzugsweise auf einer Scheibe
bereitgestellt wird und das Scan-Mittel ist dazu angepasst den Lichtstrahl über der
Probe entlang der nicht-linearen Kurve zu scannen. Der Detektor
ist dazu angepasst während
des Scannens der Probe das von den Objekten emittierte Licht, die
in der Probe enthalten sind, nach Interaktion mit dem Lichtstrahl
zu erfassen. Das Teil ist weiterhin so angebracht, um um eine Achse
des Vorrichtungsrahmens gedreht zu werden. Das Scan-Mittel kann
einen DC-Motor und eine Welle umfassen, die mit dem DC-Motor starr
verbunden ist. Die Welle kann weiterhin mit dem Teil verbunden sein,
das eine im Wesentlichen die Probe haltende, ringförmige Scheibe
sein kann, so dass die Probe um die Achse des Vorrichtungsrahmens
gedreht werden kann.
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Das
Scan-Mittel umfasst ebenfalls Ablenkungs- bzw. Beugungsmittel, die
einen Servomotor oder einen Schrittmotor bzw. Drehstromschrittmotor umfassen,
der mit dem die Probe haltenden Teil verbunden ist und dadurch dazu
angepasst ist den Lichtstrahl entlang eines Radius der ringförmigen Bewegung
der die Probe haltenden Scheibe zu scannen.
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In
der vorliegenden Beschreibung und den vorliegenden Ansprüche bezeichnet "eine nicht-lineare
Kurve" eine Kurve,
die nicht durch irgendeine endliche Anzahl von Geraden erzeugt werden
kann. Vorzugsweise ist die nicht-lineare Kurve eine archimedische
Spiral-Kurve oder
eine Kurve, die durch eine Anzahl von im Wesentlichen konzentrisch
ringförmigen
Kurven gebildet wird.
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Das
Zielobjekt oder die Objekte können
ein bestimmter Typ einer biologischen Zelle bzw. biologischer Zellen,
Bakterien, Mikroorganismen, etc. sein, die gewöhnlich auf dem medizinischen
Gebiet von Bedeutung sind. Auf dem medizinischen Gebiet können jene
Zielobjekte oder Zielmikroorganismen in Proben gefunden werden,
die ebenfalls eine große Anzahl ähnlicher
Zellen oder Mikroorganismen umfassen. Diese ähnlichen Zellen oder Mikroorganismen
können
den Hauptinhalt bzw. -bestandteil der Probe ausmachen, wodurch sie
in einer sehr viel größeren Dichte
als die Dichte der Zielzellen vorliegen.
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Die
Unterscheidung zwischen dem(n) Zielobjekt(en) und den Objekten des
Hauptinhalts kann auf unterschiedlichen morphologischen, magnetischen
oder optischen Eigenschaften von Objekten basieren.
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Die
Zielobjekte werden vorzugsweise durch Verwendung von mit Fluoreszenzmarkern
konjugierten Sonden gefärbt,
um sie mit dem erforderlichen Unterschied zu den Objekten des Hauptinhalts
bereitzustellen bzw. auszustatten und um damit als Basis für die Unterscheidung
zu dienen. Antikörpersonden
mit Fluoreszenzmarkern sind heute im Handel erhältlich.
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Die
Objekte können
weiterhin in einer Lösung
bereitgestellt werden und die Lösung
kann auf einer im Wesentlichen ringförmigen Scheibe hinterlegt bzw.
abgeschieden werden werden, welche den zum Halten der Probe angepassten
festen Träger
bilden kann.
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Bevor
die Probe einem Scannen unterworfen wird, kann eine anfängliche
Anreicherung der die Objekte umfassenden Lösung, bereitgestellt werden. Diese
anfängliche
Anreicherung kann den Schritt eines Sortierens der Zielobjekte von
den Objekten des Hauptinhalts und/oder den Schritt umfassen, die
Zielobjekte sich vermehren zu lassen (durch Reproduktion), wodurch
die Dichte der Zielobjekte in der Probe vor einem Scannen vergrößert wird.
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Wenn
eine Scheibe als fester Träger
zum Halten der Probe verwendet wird, dann gibt es prinzipiell nur
wenige Beschränkungen
für die
Scheibengröße. Vorzugsweise
wird ein Scheibendurchmesser von ungefähr 120 mm verwendet, der dem
Durchmesser einer CD gleicht. Dies hat etliche bzw. mehrere bedeutende
Vorteile, wobei ein Vorteil darin besteht, dass die wirksame Fläche einer
CD-Scheibengröße mindestens
zwanzigmal größer ist
als die in den Vorrichtungen des Standes der Technik gewöhnlich verwendeten
festen Trägerbereich.
Ein anderer Vorteil besteht darin, dass aufgrund der weit verbreiteten
Verwendung von CD basierenden Medien bereits im Handel erhältliche,
geeignete mechanische und optische Teile für die erfindungsgemäße Vorrichtung
zu sehr geringen Kosten gefunden werden können. Die Scheibe kann aus
einem transparenten Material, wie beispielsweise Polycarbonat, Glas,
etc. hergestellt werden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird die Erfassung der Zielobjekte durch Scannen eines Lichtstrahls
entlang einer nicht-linearen Kurve über der Probe bereitgestellt.
Dieser Lichtstrahl stellt auf der Probe einen Lichtpunkt bzw. -fleck
bereit, der die Objekte des Hauptinhalts zusammen mit irgendwelchen
vorhandenen Zielobjekten bestrahlt. Der Lichtstrahl kann durch eine
monochromatische kohärente Lichtquelle,
wie beispielsweise einem Halbleiterlaser, Gaslaser, Festkörperlaser,
etc. bereitgestellt werden. Alternativ könnte die Lichtquelle von einem
Typ sein, der Breitbandlicht emittiert. Ein optischer Filter kann in
den optischen Pfad zwischen der Lichtquelle und der Probe eingefügt werden,
so dass ein im Wesentlichen monochromatischer Lichtstrahl auf die
Probe emittiert wird. Die Verwendung einer Breitbandlichtquelle
kann teure Lasereinrichtungen überflüssig machen
und immer noch einen im Wesentlichen monochromatischen Lichtstrahl
zum Beleuchten der Probe bereitstellen.
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Der
Lichtstrahl kann Licht mit spektralen Komponenten mit mehr als einer
im Wesentlichen einzigen Wellenlänge
umfassen. Ein derartiger Lichtstrahl kann durch eine Laserquelle
bereitgestellt werden, die Lichtkomponenten von mindestens zwei
unterschiedlichen Wellenlängen
gleichzeitig erzeugen kann. Alternativ kann durch eine Breitbandlichtquelle kombiniert
mit einer Anzahl in den optischen Pfad zwischen der Quelle und der
Probe eingefügter
optischer Bestandteile ein "Mehrfach-Wellenlängen"-Lichtstrahl erzeugt
werden. Diese letzte Lösung kann
jedoch bei praktischer Anwendung zu kompliziert werden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung wird der Lichtstrahl durch einen 488 nm Argon-Ionen
Gaslaser erzeugt. Die Zielobjekte in der Probe werden weiterhin
mit mindestens einem Fluoreszenzmarker gefärbt, um sie von den Objekten
des Hauptinhalts zu unterscheiden. Die Probe wird vorzugsweise auf
einer Scheibenoberfläche
mit einem Durchmesser von ungefähr
120 mm dispergiert. Der Laserstrahl wird während des Scannens in einem ringförmigen Punkt
auf der Probe fokussiert. Der Punktdurchmesser beträgt vorzugsweise
zwischen 20-150 μm,
mehr bevorzugt zwischen 20-80 μm
und sogar noch mehr bevorzugt zwischen 30-60 μm. Vorzugsweise ist der Punktdurchmesser
für eine
bestimmte Anwendung angepasst, so dass ein optimales Signal-Rauschverhältnis in
dem Detektorsignal bereitgestellt wird, wodurch die Unterscheidung
zwischen Zielobjekten und falsch positiven Signalen erhöht wird.
Jene falsch positiven Signale können
vom Zufallsrauschen in dem Detektor und dessen assoziierter elektronischen
Schaltung stammen, oder sie können
von die Probe verunreinigenden autofluoreszenten Objekten und Teilchen
stammen.
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Es
kann wünschenswert
sein den möglichst größten Punktdurchmesser
in der vorliegenden Vorrichtung zu verwenden, um die Scann-Zeit
der Probe zu minimieren. Es können
jedoch bei bestimmten Anwendungen etliche praktische Beschränkungen
den maximal möglichen
Punktdurchmesser begrenzen. Eine Beschränkung bei Anwendungen, die
die Detektion fluoreszenter Zielobjekte einbeziehen, kann darin
bestehen, dass ein großer
Punktdurchmesser ebenfalls dazu tendiert eine große Anzahl
fluoreszenter verunreinigender Objekte und Teilchen zu beleuchten.
Diese Objekte und Teilchen können
eine Lichtintensität
emittieren, die größer ist
als die durch ein beleuchtetes Zielobjekt bereitgestellte Intensität, wodurch
die Unterscheidung zwischen Zielobjekten und anderen Objekten der
Probe gestört
oder die Erfassung eines Zielobjekts sogar vollständig verhindert
wird.
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Die
von der Lichtquelle verfügbare
maximale Lichtleistung kann eine andere Beschränkung für die maximale Punktgröße, die
verwendet werden kann, bereitstellen. In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform
der Vorrichtung, die eine Laserlichtquelle verwendet, stellte diese
mögliche
Beschränkung
noch keine ernsthafte Sorge dar.
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Somit
kann eine erfindungsgemäße Vorrichtung
dazu angepasst sein etliche Objekttypen bei verschiedenen Anwendungen
mit einer optimalen Geschwindigkeit und Zuverlässigkeit zu identifizieren.
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Fluoreszenzlicht
kann während
des Scannens von den Zielobjekten emittiert werden, wenn der Lichtstrahl
die Zielobjekte und deren Umgebungen bestrahlt. Das durch die Interaktion
zwischen den Objekten der Probe und dem Lichtstrahl erzeugte resultierende
Licht, kann eine emittierte fluoreszente Lichtkomponente von den
Zielobjekten und eine von dem Lichtstrahl stammende Komponente umfassen. Das
resultierende Licht kann entweder durch die Scheibenoberfläche fortgeleitet,
von der Scheibenoberfläche
reflektiert oder gleichzeitig reflektiert und fortgeleitet werden.
Demgemäß kann das
resultierende Licht entweder oberhalb der Scheibenoberfläche oder
unterhalb der Scheibenoberfläche
erfasst werden, wenn die Scheibe in einem transparenten Material
bereitgestellt wird.
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Der
Detektor wird selbstverständlich
so ausgewählt,
dass er empfindlich gegenüber
der Unterscheidungseigenschaft zwischen den Zielobjekten und den
Objekten des Hauptinhalts ist, wobei die Unterscheidungseigenschaft
morphologischen, magnetischen, optischen Charakter aufweist.
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Abhängig von
den Erfordernissen einer bestimmten Anwendung können etliche Detektortypen, wie
beispielsweise CCD Einrichtungen, Phototransistoren, Photovervielfacher,
etc., verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung wird ein Photovervielfacher als ein Lichtdetektor
verwendet. Dieser Detektortyp kann ein elektrisches Ausgabesignal
erzeugen, das im Wesentlichen zu der auf ihn auftreffenden Lichtintensität proportional ist.
Das elektrische Ausgabesignal des Detektors wird Speichermitteln
bereitgestellt, die angepasst sind das Detektorsignal zusammen mit
einem oder mehreren entsprechenden Positionssignalen zu speichern,
die durch das Scan-Steuermittel bereitgestellt werden.
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Mittel
können
weiterhin zum Abtasten, Digitalisieren und Speichern eines oder
mehrerer elektrischer Signale bereitgestellt werden, die durch den mindestens
einen Detektor, wie beispielsweise einen Photovervielfacher, erzeugt
werden können
und wobei das/die entsprechende(n) Positionssignal(e) durch das
Scan-Steuermittel bereitgestellt wird/werden. Demgemäß kann,
wenn jedes Mal ein Objekt erfasst wird ein entsprechender kohärenter Datensatz in
dem Speichermittel gespeichert werden und jeder der kohärenten Datensätze kann
so angesehen werden, als ob es ein einziges Signal"ereignis" darstellt.
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Die
kohärenten
Datensätze
können
somit eine Anzahl digitalisierter Detektor- und Positionssignale
darstellen, wobei die Anzahl abhängig
ist von der Anzahl der verwendeten Detektoren und der durch das
Scan-Steuermittel bereitgestellten Anzahl Signale. Jedes von jenen
digitalisierten Detektor- und Positionssignale wird vorzugsweise
durch eine Reihe digitaler Abtastwerte dargestellt, die durch einen
oder mehrere A/D-Konverter erzeugt werden. Dadurch kann jedes während des
Scannens der Probe erfasste einzelne Signal"ereignis" und welches von einem Zielobjekt stammen
oder nicht stammen kann, durch einen gespeicherten kohärenten Datensatz
dargestellt werden. Signal"ereignisse", die nicht von Zielobjekten
stammen, können
vom Zufallsrauschen in dem Detektor und dessen assoziierter elektronischer Schaltung,
oder von autofluoreszenten Objekten und Teilchen stammen, die die
Probe, wie vorstehend erklärt,
verunreinigt haben können.
Jene zuletzt erwähnten
Signal"ereignisse" werden im Folgenden falsch
positive Signale genannt.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung wird ein im Wesentlichen rechteckiger Spalt in einer
(nicht-transparenten) Maske gebildet, die in dem optischen Pfad
von der Probe zu dem Photovervielfacher eingefügt ist. Der Photovervielfacher "sieht" dementsprechend
den bestrahlten Teil der Probe durch eine rechteckige Öffnung.
Der Spalt oder die Öffnung
kann mit dessen/deren längsten Seite
(der Länge)
mit einem Radius des die Probe haltenden ringförmigen festen Trägers, parallel
angeordnet sein.
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Die
Abmessungen der Öffnung
sind vorzugsweise auf die Abmessungen der zu erfassenden Zielobjekte
angepasst und in einer derartigen Weise angeordnet, dass die Weite
bzw. Breite der Öffnung
ungefähr
den Abmessungen der Zielobjekte gleich ist und die Länge ungefähr den 3-5-fachen
Abmessungen der Zielobjekte, wie sie auf der Probe abgebildet sind,
gleich ist. Somit bedeutet abbilden, dass die Abmessungen der Öffnung für jegliche Vergrößerung/Verkleinerung,
die in dem optischen Pfad zwischen der Probe und der Öffnung bereitgestellt
wird, angepasst sein sollten.
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Weiterhin
wird der die Probe bestrahlende Laserpunkt vorzugsweise mit einem
Durchmesser bereitgestellt, der ungefähr der Öffnungslänge gleicht.
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In
einer Ausführungsform
der Erfindung, in der die Zielobjekte Abmessungen von ungefähr 10 μm aufweisen,
kann beispielsweise eine Öffnungslänge von
30-50 μm
und eine Öffnungsweite
zwischen 7,5-15 μm
gewählt
werden.
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Ein
Vorteil bei Anbringen der Öffnung
in den optischen Pfad besteht darin, dass bspw. fluoreszente Zielobjekte,
die bei dem Detektor innerhalb der Öffnungsgrenzen "erscheinen" und durch den Lichtstrahl
bestrahlt werden, lediglich während
dieses kurzen Zeitmoments, zu dem sich das Zielobjekt vollständig innerhalb
der Grenzen der Öffnung
befindet, ein maximales Signalniveau in dem Ausgabesignal des Detektors
erzeugen werden. Folglich besteht die Möglichkeit einen sehr genauen
Wert für
die Winkelkoordinate des Zielobjekts zu erfassen, da das Detektorsignal
durch das Zielobjekt, das sich entlang eines gestreckten Beleuchtungspfads
bewegt, nicht verschmiert wird.
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Ein
anderer Vorteil besteht darin, dass die Öffnung die erreichbare Unterscheidung
zwischen Zielobjekten und Objekten erhöht, die aufgrund eines Unterschieds
in der Größe zwischen
jenen Objektgruppen falsch positive Signale erzeugen. Ein "großes" Objekt, d.h. ein
Objekt mit Abmessungen, die größer sind
als die Öffnungsweite
und somit nicht zu der Gruppe von Zielobjekten gehören können, können irrtümlicherweise
mit einem Fluoreszenzmarker gefärbt
worden sein und daher wenn sie durch den Lichtstrahl bestrahl werden,
Licht emittieren. Ein derartig großes Objekt wird jedoch aufgrund
einer längeren "Sichtbarkeits"-Zeit oder Auftretens
innerhalb der Grenzen der Öffnung
während
eines längeren
Zeitintervalls als die der Zielobjekte eine maximale Signalstärke erzeugen.
Dieser Unterschied in der Signaldauer, die von dem Größenunterschied
zwischen erfassten Objekten der unterschiedlichen Gruppen stammt,
kann als eine Basis zur Unterscheidung zwischen Zielobjekten und
anderen Objekten in der Probe verwendet werden und somit die Erfassung
von Zielobjekten erhöhen.
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Weiterhin
kann die Probe entlang eines Radius der die Probe haltenden Scheibe
gescannt werden, indem die Position der Öffnung und die Position des
Lichtpunkts relativ zu der Probe mit gleich großen Schritten angenähert werden,
d.h. einander verfolgen. Vorzugs weise weisen die Schritte eine 0,5-1,5-fache
Größe der Abmessungen
der Zielobjekte auf. Durch Scannen des Lichtstrahls über der Probe,
gemäß dieses
Verfahrens, wird auf der Probe ein Muster sich teilweise überlappender
konzentrischer ringförmiger
Kurven erzeugt. Die Überlappung der
Scann-Kurven führt
dazu, dass ein bestimmtes Zielobjekt an dem Photovervielfacher bei
einer konstanten rechtwinkligen Koordinate mindestens 2-3-fach "erscheint", jedoch mit geringfügig unterschiedlichen
Radialkoordinaten der Öffnung.
Dadurch werden 2-3
entsprechende kohärente
Datensätze
erhalten, wobei jeder Satz elektrischen Signalen von dem Photovervielfacher
und dem Scan-Steuermittel entspricht.
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Signalbearbeitungsmittel
können
anschließend
jene entsprechenden kohärenten
Datensätze abrufen
und verwenden, um die Unterscheidung zwischen den von Zielobjekten
und falsch positiven Signalen stammenden Signale zu erhöhen. Diese
Unterscheidung kann durch eine Korrelationsanalyse zwischen Datensätzen erreicht
werden, die von identischen Winkelkoordinaten, jedoch von benachbarten Radialkoordinaten
der Öffnung
stammen.
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Wird
die rechteckige Öffnung
verwendet, dann kann eine elliptische Lichtpunktform auf der Probe
vorzugsweise die gesamte Länge
der Öffnung bedecken.
Die elliptische Punktform kann vorteilhaft sein, da sie eine größere Lichtleistung
als ein ringförmiger
Punkt mit einer fixierte/festen Lichtleistung, die durch die Quelle
abgestrahlt wird, innerhalb der Öffnungsgrenzen
bereitstellt.
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Die
Erfassung der Zielobjekte kann durch Einfügen einer oder mehrerer optischer
Filter in den Lichtpfad zwischen der Probe und dem Detektor erhöht werden,
um die Quellenlichtkomponente des resultierenden Lichts bevor es
zu dem Detektor fortgeleitet wird zu vermindern bzw. zu dämpfen. Vorzugsweise
wird mindestens ein optischer Filter, vorzugsweise ein dichromatischer
Filter in diesen Lichtpfad eingefügt.
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Die
Zielobjekte können
mit verschiedenen Typen von Fluoreszenzmarkern gefärbt werden.
Vorzugsweise kann ein Marker bzw. können Marker gemäß dessen/deren
optimaler Anregungslichtwellenlänge(n)
und/oder deren Quantenausbeuten ausgewählt werden. Da gewöhnlich lediglich
ein bestimmter Teil des Lichtspektrums zur Anregung eines bestimmten
Typs von Fluoreszenzmarker nützlich
ist, sollte eine Lichtquelle ausgewählt werden, die Licht einer
ausreichend hohen Intensität,
welche sich relativ nahe an der optimalen Anregungswellenlänge der Marker
befindet, bereitstellen kann.
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Weiterhin
können
die Zielobjekte mit zwei oder mehreren verschiedenen Fluoreszenz markern gefärbt werden,
so dass die Zielobjekte, wenn sie durch Quellenlicht geeigneter
spektraler Verteilung bestrahlt werden, Licht bei mehreren Wellenlängen emittieren
können.
Die Verteilung kann durch die Lichtquelle bereitgestellt werden,
so dass sie lediglich wesentliche Lichtintensität bei Wellenlängen bereitstellt,
die nahe an einer Anregungswellenlänge eines Markers gelegen ist.
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Werden
die Zielobjekte mit zwei oder mehreren Fluoreszenzmarkern gefärbt, dann
können
die Zielobjekte in der Probe durch Ausführen aufeinanderfolgender Scans
der Probe, eines hierbei als "Multiple
Pass Scan bzw. Mehrfach Durchgangs-Scan" bezeichneten Verfahrens, erfasst werden.
Die Lichtwellenlängen
der Quelle können
während
eines Scans dazu angepasst sein, um einen bestimmten Marker auf
den Objekten anzuregen. Die Bandbreite von in den Lichtpfad zwischen
der Probe und dem Detektor eingefügten optischen Filtern kann
ebenfalls dazu angepasst sein lediglich den Wellenlängenbereich
fortzuleiten, der durch den gegenwärtig durch die Lichtquelle
während
des Scannens angeregten bestimmten Fluoreszenzmarker emittiert wird.
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Die
Zielobjekte können
alternativ in einem "Einfach
Durchgangs-Scan" der
Probe erfasst werden, obwohl die Zielobjekte mit bspw. zwei verschiedenen
Markern bereitgestellt sind. Dies kann durch gleichzeitiges Anregen
beider Marker mit einem im Wesentlichen monochromatischen Lichtstrahl
erreicht werden, wenn die optimalen Anregungswellenlängen der
Marker ausreichend nahe in dem Lichtspektrum gelegen sind. Licht,
das von den Zielobjekten emittiert werden kann, umfasst dann eine
Lichtkomponente von jedem der Marker und die Komponente, die von
jedem Marker stammt, kann durch einen für jeden der Marker bereitgestellten,
getrennten bzw. einzelnen Detektor, erfasst werden. Es kann mindestens
ein optischer Filter in jeden optischen Pfad von der Probe zu dem
Detektor eingefügt
werden. Jeder Filter ist dazu angepasst, um lediglich von einem
bestimmten Marker emittiertes Licht zu dem Detektor fortzuleiten.
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Eine
Verwendung mehrerer Marker kann vorteilhaft sein, um einen bestimmten
Typ von Zielobjekten mit mehreren Eigenschaften zu lokalisieren und
wobei jede Eigenschaft den Zielobjekten die Fähigkeit verleiht an einen bestimmten
Typ eines Markers zu binden. Dieser Typ von Zielobjekten kann erfasst
und lokalisiert werden, indem während
eines ersten Scans der Probe eine erste Gruppe von Objekten, die
mit einem ersten Markertyp gefärbt
wurden, lokalisiert und anschließend während eines zweiten Scans eine
zweite Gruppe von Objekten, die mit einem zweiten Markertyp gefärbt wurden,
lokalisiert werden. Durch Bestimmen der Schnittmenge der zwei Gruppen,
können
bspw. durch Verwendung der Signalbearbeitungsmittel die Zielobjekte
identifiziert werden. Selbstverständlich können mehr als zwei Markertypen
verwendet werden, um die Zielobjekte, abhängig von der besonderen Anwendung
und der Anzahl von Eigenschaften der Zielobjekte, die die Fähigkeit
aufweisen an einen bestimmten Marken zu binden, zu färben.
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Ein
wichtiger Anwendungsbereich liegt auf dem medizinischen Gebiet,
der die Bedeutung der Bindung verschiedener Marken an unterschiedliche Objekteigenschaften
darstellt. Eine Erfassung und Analyse von fötalen Zellen aus dem mütterlichen
Blut stellt eine invasive Alternative mit sehr geringem Risiko gegenüber pränatalen
diagnostischen Verfahren, wie beispielsweise Amniozentese einer
Chorionbiopsie, bereit. Um diese Analyse bereitzustellen, muss mindestens
eine fötale
Zelle mit einem Kern in einer Probe lokalisiert werden.
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Die
Probe kann weiterhin sowohl mütterliche Zellen
als auch fötale
Zellen umfassen, und beide Typen können mit oder ohne einen Zellkern
vorkommen. Die Erfassung und Lokalisation fötaler Zellen mit Zellkernen
kann unter Verwendung eines ersten Fluoreszenzmarkers, der an eine
Sonde, wie beispielsweise ein Oligonukleotid konjugiert ist, das
in situ zumindest an einen Teil der fötalen Zelle an gamma-Globin
mRNA hybridisiert ist und eines zweiten Fluoreszenzmarkers, vorzugsweise
DAPI oder PI, das an alle Zellkerne bindet, erreicht werden.
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Wird
die Probe, um die mit dem ersten Fluoreszenzmarker gefärbten Zellen
zu lokalisieren und somit zu einer ersten Gruppe gehörend zum
ersten Mal gescannt und zum zweiten Mal, um die mit dem zweiten
Fluoreszenzmarker gefärbten
Zellen zu lokalisieren, dann wird die Schnittmenge der Zellgruppen die
Zielzelle(n), d.h. fötale
Zellen die ebenfalls einen Kern aufweisen, beinhalten.
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Die
Verwendung von mindestens zwei Markern kann ebenfalls vorteilhaft
sein, um die Unterscheidung zwischen falsch negativen Signalen und Signalen
zu erhöhen,
die von Zielobjekten während oder
nach dem Scannen einer Probe stammen. Die Unterscheidung kann in
einem "Mehrfach
Durchgangs-Scan" erhöht werden,
bei dem die Probe in einem ersten Durchgang mit Licht gescannt werden kann,
das dazu angepasst ist einen ersten Marken anzuregen. Während des
Scannens erhaltene kohärente
Datensätze,
die erfassten Objekten entsprechen können, werden in dem Speicher
gespeichert. Anschließend
kann die Probe ein zweites Mal mit Licht gescannt werden, das dazu
angepasst ist einen zweiten Marker anzuregen und die mit den erfassten Objekten
assoziierten, kohärenten
Datensätze
können
ebenfalls in dem Speicher gespeichert werden. Die Unterscheidung
kann anschließend
durch Vergleichen von Signalwerten des Detektors bereitgestellt
werden, die bei identischen Winkel- und Radialkoordinaten auf der
Probe in den zwei Datensätzen erhalten
wurden. Ein Kriterium, um ein Detektorsignal als von einem Zielobjekt
stammend zu akzeptieren, kann darin bestehen, dass lediglich Signalwerte in
beiden Datensätzen,
die größer als
ein bestimmter Schwellenwert sind als von einem Zielobjekt stammend
akzeptiert werden. Dementsprechend können Signalwerte oberhalb der
Schwelle in lediglich einem der zwei Datensätze als vom Rauschen, autofluoreszenten
Teilchen, etc. stammend verworfen werden und sind somit falsch positiv.
Selbstverständlich
können
identische Kriterien ebenfalls zur Unterscheidung zwischen falsch
positiven und "echten" Detektorsignalen
verwendet werden, die während
eines "Einfach Durchgangs-Scans" der Probe erhalten wurden.
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Ein
Fluoreszenzmarker sollte vorzugsweise einerseits eine große Quantenausbeute
und andererseits einen großen
Unterschied zwischen der optimalen Wellenlänge des Anregungslichts und
der optimalen Wellenlänge
des Emissionslichts aufweisen.
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Vorzugsweise
können
Fluorescein oder Fluoresceinderivate als ein Fluoreszenzmarker bzw. Fluoreszenzmarker
verwendet werden, da jene Substanzen wohl bekannt und leicht verfügbar sind
und große
Quantenausbeuten aufweisen. Weiterhin liegen für Fluorescein die optimalen
Wellenlängen
des Anregungslichts und des Emissionslichts bei 505 nm beziehungsweise
516 nm, wodurch ermöglicht
wird, dass diese Substanz mit einer bevorzugten Lichtquelle, einem
488 nm Argon-Ionen Gaslaser angeregt wird.
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Die
Speichermittel können
in einem Personalcomputer (PC) angeordnet sein, der mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung
operativ verbunden ist. Das Speichermittel kann magnetische, optische
oder elektrische Speichermittel, wie beispielsweise Hartdiskettenantriebe,
DAT-Bänder,
Floppy-Disketten, CD-ROM-Disketten, EEPROMs, etc. umfassen, die für permanente
Speicher der von dem Scannen der Probe(n) erhaltenen kohärenten Datensätze, verwendet
werden. Die Speichermittel können
ebenfalls selbstlöschende
Zwischenspeichermittel, vorzugsweise RAM umfassen, um kohärente Datensätze während des
Scannens zu speichern. Dies kann bei Anwendungen vorteilhaft sein,
bei denen die durch den/die A/D-Konverter
bereitgestellte Datengeschwindigkeit höher ist als die maximale Speichergeschwindigkeit,
die durch einen permanenten Speichereinrichtungstyp bereitgestellt
wird.
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Die
Speichermittel können
alternativ in einer erfindungsgemäßen Ausführungsform innerhalb des Rahmens
der Vorrichtung bereitgestellt werden, wodurch eine bequem tragbare "allein stehende" Vorrichtung bereitgestellt
wird.
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In
einigen Situationen kann es erwünscht sein
erfasste Zielobjekte zu identifizieren nachdem eine Probe gescannt
wurde. Erfindungsgemäß wird dies
durch Abfragen kohärenter
Datensätze,
die erfassten Zielobjekten entsprechen, aus der Speichereinrichtung
erreicht. Da diese kohärenten
Datensätze
Information beinhalten, die sich auf die Position(en) auf der Probe
(d.h. können
Winkel- und Radialkoordinaten sein) der gewählten Zielobjekte beziehen,
ist das Scan-Steuermittel dazu angepasst das Mikroskop, das vorzugsweise
ein automatisches Mikroskop ist, an jeder Position irgendeines Zielobjekts anzuordnen.
Dadurch kann ein Mediziner oder ein Labortechniker eine ausführliche
Untersuchung des Zielobjekts ausführen, um bspw. dessen Identität herzustellen.
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Gemäß einer
zweiten erfindungsgemäßen Ausführungsform
wird gemäß Anspruch
10 ein Verfahren zum Erfassen einer Eigenschaft eines in einer Probe
befindlichen Objekts bereitgestellt.
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Das
Verfahren umfasst weiterhin vorzugsweise die Schritte eines Abtastens
und Digitalisierens jener Detektor- und Positionssignale.
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1 zeigt
eine Vorrichtung einer erfindungsgemäßen Ausführungsform, einschließlich von in
einem optischen Pfad bereitgestellten Komponenten.
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1 zeigt
eine bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform,
die dazu angepasst ist eine große
Probe 14 zu scannen. Ein Teil 17, das an einem
Rahmen (nicht gezeigt) positioniert ist, hält eine im Wesentlichen ringförmige Scheibe 13 mit
einem Durchmesser von 120 mm, wobei die Scheibe eine Probe 14 bereitstellt,
die einem Scannen unterzogen wird.
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Die
Probe kann Material umfassen, das aus einer Blut- oder Gewebeprobe
einer schwangeren Frau stammt. Die Probe kann sowohl erwachsene Zellen
als auch fötale
Zellen umfassen, die als Teil eines pränatalen diagnostischen Verfahrens
analysiert werden. Demgemäß ist es
in der erfindungsgemäßen Ausführungsform
höchst
erwünscht
die Positionen fötaler
Zellen und insbesondere fötale
Zellen mit einem Zellkern zu erfassen und zu bestimmen, so dass eine
Analyse der in dem Zellkern befindlichen Chromosomen bereitgestellt
werden kann. Demgemäß sind Zielzellen
in der vorliegenden Anwendung solche fötalen Zellen, die einen Zellkern
umfassen.
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Es
wird jedoch heute in der medizinischen Gemeinschaft angenommen,
dass fötale
Zellen in einer so geringen Dichte wie 1E-9 – 1E-5 in der Probe vorliegen
und dass sie in so wenig wie 50 % der Population schwangerer Frauen
vorkommen. Wenn die fötalen
Zellen in einer vernünftigen
Zeitspanne lokalisiert werden sollen, erfordert diese sehr geringe Dichte,
dass ein schnelles Scannen der Probe durchgeführt wird.
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Um
die fötalen
Zielzellen in der Probe zu lokalisieren, werden sie vorzugsweise
mit Fluorescein oder von Fluorescein abgeleiteten Markern gefärbt.
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Vorzugsweise
wird ein kohärenter
Lichtstrahl 12 von einem 488 nm Argon-Ionen Gaslaser (nicht gezeigt)
auf die Probe 14 emittiert, wobei ein ungefähr 40 μm Durchmesser
umfassender Laserpunkt auf der Probe 14 erzeugt wird. Die
Probe 14 wird durch diesen Laserpunkt entlang einer nicht-linearen Kurve
unter Steuerung eines Scan-Mittels 18 gescannt, das einen
DC-Motor (nicht gezeigt) und Scan-Steuermittel (nicht gezeigt) umfasst.
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Der
DC-Motor, der mit dem Teil
17, das die Scheibe
13 durch
eine Welle
19 hält,
direkt verbunden sein kann, stellt einen Antriebsmechanismus bereit,
der die Scheibe
13 um eine Achse an dem Rahmen drehen kann.
Der DC-Motor umfasst weiterhin einen Winkelkodierer (nicht gezeigt),
der ein Signal bereitstellen kann, das sich auf die gegenwärtige Winkelkoordinate
des Teils
17 und der Scheibe
13 zu dem Scan-Steuermittel
bezieht. Die Winkelauflösung des
Winkelkodierers ist vorzugsweise
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Die
Rotationsgeschwindigkeit der Scheibe 13 ist vorzugsweise
so angepasst, dass sie innerhalb des Intervalls von 200 bis 1500
Upm liegt. Das Scan-Steuermittel kann Servomittel umfassen, die dazu
angepasst sind, um die Upm der Scheibe zu steuern, so dass eine
im Wesentlichen konstante lineare Geschwindigkeit des Laserpunkts
auf der Scheibenoberfläche,
ein Prinzip, das von CD-Spielern wohl bekannt ist, erzeugt wird.
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Ablenk-
bzw. Streumittel, die einen Teil des Scan-Mittels bilden und einen
Schrittmotor (nicht gezeigt) umfassen werden weiterhin bereitgestellt,
so dass die Scheibe 13 mit der Probe 14 entlang
eines Radius der Scheibe und deren ringförmigen Bewegung verschoben
bzw. versetzt werden kann. Dadurch wird ein Scan der gesamten Oberfläche der Scheibe 13 mit
der Probe 14 durch den Laserpunkt bereitgestellt. Wird
die Scheibe 13 mit der Probe durch das Streumittel entlang
des Radius bewegt, dann wird durch den Laserpunkt eine nicht-lineare Kurve
auf der Oberfläche
der Scheibe 13 gebildet, die eine Anzahl konzentrischer
sich teilweise überlappender
ringförmiger
Kurven umfasst.
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Das
optische System der Vorrichtung umfasst einen 488 nm Argon-Ionen
Gaslaser (nicht gezeigt), der als eine Lichtquelle verwendet wird.
Der von dem Laser emittierte Lichtstrahl 12 wird durch eine
Fokussierungslinse 10 und einen dichromatischen Filter 9 auf
einen dichromatischen Strahlenteiler 6 fortgeleitet. Dieser
Strahlenteiler 6 dient zwei Zwecken, erstens, um den Lichtstrahl 12 auf
die Probe 14 zu reflektieren und zweitens, um zu filtern
und das von der Probe emittierte resultierende Licht 15 auf
einen Photovervielfacher 1 zu richten. Das resultierende
Licht 15 kann eine Lichtkomponente, die von einem reflektierten
Anteil des Lichtstrahls 12 stammt und eine fluoreszente
Lichtkomponente umfassen, die von in der Probe 14 befindlichen
fluoreszierenden Zielobjekten (nicht gezeigt) emittiert wird. Sowohl
der dichromatische Strahlenteiler 6 als auch der dichromatische
Filter 4 tragen dazu bei die von der Laserquelle (nicht
gezeigt) stammende Lichtkomponente zu vermindern, wodurch das Signal-Rauschverhältnis des
zu dem Photovervielfacher 1 fortgeleiteten Lichts erhöht wird.
Das resultierende Licht 15, das durch den dichromatischen
Filter 4 geht, wird durch einen rechteckigen Spalt 16 fortgeleitet,
der in einer Maske 3 bereitgestellt wird, die in den optischen
Pfad des Photovervielfachers 1 eingefügt ist. Der Spalt 16 wird
vorzugsweise mit Abmessungen bereitgestellt, die zu abgebildeten
Abmessungen einer Länge
von 30 μm
beziehungsweise einer Weite von 15 μm auf dem Photovervielfacher 1 führen. Demgemäß erzeugt
der Spalt 16 eine Lichtpfadöffnung mit Abmessungen, die
kombiniert mit einer Vergrößerungslinse 11 und
dem die Linsen 2, 5 und 7 umfassenden
optischen System, die Abmessungen des bestrahlten Teils, der wie
durch den Photovervielfacher "gesehenen" Probe, festlegen,
d.h. die Abmessungen des bestrahlten Probenbereichs werden auf dem
Photovervielfacher 1 abgebildet.
