DE69924128T2 - Verfahren zur erkennung von verbindungen,die die wechselwirkung von rna und rna-bindungsproteinen beinflussen - Google Patents

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung liegt auf dem Gebiet von Screening-Assays zum Identifizieren von Verbindungen, die eine Gen-Expression beeinflussen können und insbesondere zum Identifizieren von Verbindungen, die die Wechselwirkung zwischen RNA und RNA-Bindungsproteinen beeinflussen.
  • Die Regulation der Protein-Expression kann auf einer Vielzahl von Stufen stattfinden: transkriptionell, post-transkriptionell oder post-translational. Die Modulation der Protein-Expression ist für die Behandlung einer Krankheit oft kritisch. Kürzliche Arbeiten zur Modulation von Proteinspiegeln durch eine Veränderung der transkriptionellen Aktivität führte zu etablierten prä-klinischen Forschungsprogrammen und eingegangenen Lizenzvereinbarungen. Zum Beispiel ist Ligand Pharmaceuticals, Inc. (San Diego, CA) mehreren Programmen zur Arzneimittelfindung beigetreten, zusammen mit großen pharmazeutischen Unternehmen, basierend auf deren Signal-Transducer- und Transkriptionsaktivator-Technologie zur Verwendung als Anti-Entzündungs-, Anti-Krebs- und Hormonersatz-Therapien. Zusätzlich benutzt Oncogene Science, Inc. (Uniondale, NY) deren eigene Gen-Transkriptionstechnologien, um biopharmazeutische Produkte zur Behandlung von Krebs zu entwickeln. Andere Unternehmen, wie Signal Pharmaceuticals, Inc. (San Diego, CA) und Tularik, Inc. (San Francisco, CA) entwickeln kleine Moleküle, die Transkriptionsfaktoren regulieren. Während dieser Ansatz als vielversprechend anzusehen ist, haben es bis jetzt keine Verbindungen bis zur klinischen Prüfung geschafft. Die fehlende Spezifität von Transkriptionsfaktoren und das Erfordernis einer Kernlokalisation stellen hinsichtlich dieser Technologie zwei Bedenken dar. Im ersten Fall kann ein Arzneimittel, das die Bindung eines Transkriptionsfaktors beeinflusst, die Transkription von vielen anderen Genen als das Ziel-Gen beeinflussen. Im zweiten Falle ist es schwierig ein Arzneimittel zu entwerfen, das sowohl eine richtige Interaktion mit einem an das Ziel gerichteten Transkriptionsfaktor aufweist und auch in den Kern transportiert wird, wo dessen Wirkung zum Tragen kommt. Eine Inhibition der Protein-Expression, indem RNA an das Ziel geführt wird, stellt einen alternativen Ansatz dar, der die Antisinn-Technologie beinhaltet. Die Antisinn-Technologie hat auch großes Interesse bei mehreren Produkten in klinischen Prüfungen hervorgerufen (ISIS2105, ISIS2922 und ISIS2302). Allerdings liegen die Hauptnachteile bei diesem Ansatz in den Kosten für die Oligonukleotide, der Fähigkeit, die Oligonukleotide in die Zellen abzugeben und deren fehlenden Fähigkeit Proteinspiegel zu erhöhen.
  • Ein Hauptgebiet der post-transkriptionellen Regulation in eukaryontischen Zellen beinhaltet die spezifische Interaktion von Proteinen mit RNA. Diese RNA-Bindeproteine (RBP) scheinen die Verarbeitung von prä-mRNAs, den Transport von mRNA von dem Zellkern in das Cytoplasma, die mRNA-Stabilisierung, die translationale Wirksamkeit von mRNA und die Sequestration einiger mRNAs zu vermitteln. Kürzliche Untersuchungen führten zur Identifizierung von mehreren RNA-Bindemotiven in einer Vielfalt von RBPs. Die am meisten vorkommenden RNA-Bindeprotein-Motive sind das RNP-Motiv, das Arg-reiche Motiv, die RGG-Box, das KH-Motiv und das doppelsträngige RNA-Bindemotiv (zur Übersicht siehe Burd und Dreyfuss, Science 265: 615–621 (1994)). Diese Motive erkennen sowohl Sequenz- als auch Strukturabhängige RNA-Elemente. Im Fall von dem doppelsträngigen RNA-Bindemotiv ist eine Sequenzerkennung unwesentlich. Jedoch kann zusätzlich zu der doppelsträngigen Struktur eine ortsbedingte Wirkung der doppelsträngigen RNA eine Rolle bei der Erkennung spielen (Bass, Nucleid Acids Symposium 33: 13–15 (1995)) und einige dieser Proteine können auch die Bindung an Z-DNA vor deren Aktivität auf die doppelsträngige RNA erfordern (Herbert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7550–7554 (1995)). Zusätzlich binden andere RNA-Bindeproteine wie AUBF (Malter, Science 246: 664–666 (1989)) vermutlich auf eine Struktur-unabhängige Weise.
  • Aufgrund der klaren Bedeutung von RNA/RBP-Interaktionen bei der Regulation der Gen-Expression werden diese Interaktionen als ein attraktives Ziel für Arzneimittel, die diese zur Modulation von Proteinspiegeln in Krankheitszuständen beeinflussen, angesehen. Um diese Interaktionen als therapeutische Ziele vollständig zu verwerten, wird jedoch ein klares Verständnis darüber benötigt, wie diese Interaktionen die Expression beeinflussen, welche RBP bei der Regulation der RNAs von Interesse beteiligt sind und die Fähigkeit zur Untersuchung der Modulation der Wirkungen von potentiellen Arzneimitteln auf die RNA/RBP-Interaktionen benötigt. Um solche Interaktionen vollständig zu verwerten, wird auch die Identifizierung von Bindestellen für RBPs in RNA-Molekülen von Interesse benötigt.
  • Frühere Versuche, um Bindestellen für RBPs in RNA-Molekülen von Interesse zu identifizieren, sind in der WO 98/37422 und WO 98/04923 beschrieben. WO 98/37422 beschreibt Verfahren zur Identifizierung von möglichen Bindestellen für RNA-Bindeproteine unter Verwendung der 5'-nicht-translatierten Region (UTR) von Glukose-Transporter-mRNA der Ratte (Glut1), der 5'-UTR von humaner 3-Hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA-Reduktase (HMG-CoA-Red), der 5'-UTR der humanen C4b-Bindeprotein-alpha-Kette und der 5'-UTR von humanem CD45. Insbesondere beschreibt WO 98/37422 eine Interaktion zwischen einem CD45-Nukleinsäuremolekül und einem C4b-Bindeprotein.
  • WO 98/04923 beschreibt Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die RNA/RBP-Interaktionen modulieren, wie beispielsweise zwischen einer Tumor-Nekrosefaktor-Alpha (TNF-α) 3'-UTR und einem RNA-Bindeprotein.
  • Viele Forscher haben Mobilitätsverschiebungs-Assays verwendet, um RNA/Protein-Interaktionen nachzuweisen. Allerdings können unter den in einem Labor etablierten Bedingungen oft keine Interaktionen von unterschiedlichen Molekülen nachgewiesen werden. Darüber hinaus führte die Vielfalt von RNA-Strukturen und Bindemotiven in dem Protein viele Forscher zu der Schlussfolgerung, dass es mit einem einzelnen Satz von Bedingungen unmöglich sei, einen Nachweis von mehreren unterschiedlichen Interaktionen festzustellen. Wenn weitere Gene identifiziert werden, die post-transkriptionell reguliert werden, würde ein universeller Satz von Bedingungen die Detektion und Charakterisierung der in diesen Wechselwirkungen beteiligten Molekülen ermöglichen und würde Ziele bereitstellen, für die Therapeutika entwickelt werden könnten. Solche universellen Assay-Bedingungen wurden in der PCT-Anmeldung WO 98/04923 beschrieben.
  • Es ist daher eine Aufgabe der Erfindung ein Assay für die Identifizierung von Verbindungen, die die Interaktion von Bindestellen für RNA-Bindeproteine beeinflussen, bereitzustellen.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung Nukleinsäuresequenzen, die mit RNA-Bindeproteinen interagieren, bereitzustellen.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Es ist die Verwendung von RNA-Molekülen, die die 3'-UTR von erb-B2 (SEQ ID NO: 5) enthalten, in Assays offenbart, um Verbindungen zu identifizieren, die die Interaktion von RNA, welche die Nukleinsäuresequenz enthält, beeinflussen. Es ist auch ein Assay zur Identifizierung von Verbindungen, welche die Interaktion eines RNA-Moleküls, das die 3'-UTR von erb-B2 (SEQ ID NO: 5) enthält und RNA-Bindeproteinen beeinflussen, offenbart. Der Assay beinhaltet den Nachweis von Interaktionen zwischen RNA-Bindeproteinen und dem RNA-Molekül in der Gegenwart einer Testverbindung und in der Abwesenheit der Testverbindung. Ein Unterschied bei der nachgewiesenen Interaktion in der Gegenwart und in der Abwesenheit der Testverbindung deutet darauf hin, dass die Verbindung die Interaktion beeinflusst. Beispielsweise kann der Assay durchgeführt werden, indem eine Testlösung und eine Kontrolllösung, die jeweils ein RNA-Molekül umfassen, das die 3'-UTR von erb-B2 (SEQ ID NO: 5) enthält, gebildet wird, die Testlösung und die Kontrolllösung erhitzt wird, um das RNA-Molekül zu denaturieren, die Testlösung und die Kontaktlösung abgekühlt wird, die Testverbindung zu der Testlösung zugegeben wird, ein RNA-Bindeprotein zu der Testlösung und der Kontrolllösung zugegeben wird und die Interaktionen zwischen dem RNA-Molekül und dem RNA-Bindeprotein in der Testlösung und der Kontrolllösung nachgewiesen werden. Eine Testverbindung wird als eine Verbindung mit einer Wirkung auf die Interaktion zwischen dem RNA-Molekül und dem RNA-Bindeprotein angesehen, wenn sich die in der Kontrolllösung nachgewiesenen Interaktionen und die in der Testlösung, die die Testverbindung enthält, nachgewiesenen Interaktionen, unterscheiden. Die nachgewiesenen Verbindungen können verwendet werden, um die Interaktion von RNA-Bindeproteinen mit mRNA, die die 3'-UTR von erb-B2 (SEQ ID NO: 5) enthält, zu beeinflussen. Dies kann die Expression der mRNA verändern, da ein Hauptgebiet der Regulation der Gen-Expression die regulatorische Wirkung von RNA-Bindeproteinen, die mit RNA-Molekülen interagieren, beinhaltet. Interaktion zwischen RNA-Molekülen und RNA-Bindeproteinen sind dafür bekannt, dass sie bei der RNA-Stabilisierung, der translationalen Wirksamkeit, der RNA-Lokalisierung, der RNA-Transkription, dem RNA-Editing, und dem RNA-Splicing beteiligt sind und die nachgewiesenen Verbindungen können verwendet werden, um diese Prozesse zu beeinflussen.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 ist ein Diagramm der Menge von radioaktiv-markierter RNA (in Zähler pro Minute), die auf einem Filter nach dem Beladen von verschiedenen Bindelösungen zurückgehalten worden ist. Alle Bindelösungen enthielten radioaktiv-markierte APP-RNA, entweder allein oder einschließlich verschiedener anderer Verbindungen. T1 zeigt, dass die Bindelösung mit RNAse T1 vor dem Beladen behandelt worden ist. Die ersten zwei Säulen stellen Bindelösungen ohne RNA-Bindeprotein dar. Die verbleibenden Säulen stellen eine Bindelösung dar, die RNA-Bindeprotein enthält. WT zeigt, dass die Bindelösung die gezeigte Menge von nicht-markierter Wildtyp-RNA als Kompetitor eingeschlossen hat. MUT zeigt, dass die Bindelösung die gezeigte Menge von nicht-markierter Mutanten-RNA als einen Kompetitor eingeschlossen hat.
  • 2 ist ein Diagramm der Menge von radiaktiv-markierter RNA, die auf einem Filter nach dem Beladen von verschiedenen Bindelösungen zurückgehalten worden ist (ausgedrückt in Prozent der RNA-Menge, die auf einem Filter in einer Referenz-Bindelösung zurückgehalten worden ist. Alle Bindelösungen enthielten radioaktiv-markierte U1-RNA, entweder allein oder einschließlich verschiedener anderer Bestandteile. Die ersten beiden Säulen stellen Bindelösungen ohne RNA-Bindeprotein dar. Die verbleibenden Säulen stellen eine Bindelösung, die RNA-Bindeprotein enthält (K562-Extrakt), dar. WT zeigt, dass die Bindelösung die angegebene Menge von nicht-markierter Wildtyp-RNA als einen Kompetitor eingeschlossen hat. MUT zeigt, dass die Bindelösung die angegebene Menge von nicht-markierter Mutanten-RNA als einen Kompetitor eingeschlossen hat. In diesem Fall interagiert die U1-Mutante mit einer geringeren Affinität als es für die Wildtyp-Sequenz der Fall ist.
  • 3 ist ein Diagramm der Menge von radioaktiv-markierter RNA, die auf einem Filter nach dem Beladen von verschiedenen Bindelösungen zurückgehalten worden ist (ausgedrückt in Prozent der RNA-Menge, die auf einem Filter in einer Referenz-Bindelösung zurückgehalten worden ist). Alle Bindelösungen enthielten radioaktiv-markierte IRE-RNA, entweder allein oder einschließlich verschiedener anderer Bestandteile. Die erste Säule stellt eine Bindelösung ohne RNA-Bindeprotein dar. Die verbleibenden Säulen stellen eine Bindelösung, die RNA-Bindeprotein enthält (K562-Extrakt), dar. Hemin zeigt, dass die Bindelösung die angegebene Menge von Hemin als eine Testverbindung eingeschlossen hat. Des zeigt, dass die Bindelösung die angegebene Menge von Desferroxiamin als eine Testverbindung eingeschlossen hat.
  • 4 ist ein Diagramm der Menge von radioaktiv-markierter RNA, die auf einem Filter nach dem Beladen von verschiedenen Bindelösungen zurückgehalten worden ist (ausgedrückt in Prozent der RNA-Menge, die auf einem Filter in einer Referenz bindelösung zurückgehalten worden ist). Alle Bindelösungen enthielten radioaktiv-markierte AUUUA-RNA, entweder allein oder einschließlich verschiedener anderer Bestandteile. Die erste Säule stellt eine Bindelösung ohne RNA-Bindeprotein dar. Die verbleibenden Säulen stelle eine Bindelösung, die RNA-Bindeprotein enthält (K562-Extrakt), dar. Säulen 3 bis 8 entsprechen den Bindelösungen, welche die angegebene Testverbindung einschließen.
  • 5 ist ein Diagramm der Menge von radioaktiv-markierter RNA, die auf einem Filter nach dem Beladen von verschiedenen Bindelösungen zurückgehalten worden ist (ausgedrückt in Prozent der RNA-Menge, die auf einem Filter in einer Referenzbindelösung zurückgehalten worden ist). Die unterschiedlichen Säulen entsprechen Bindelösungen, die radioaktiv-markierte AUUUA-RNA oder IRE-RNA enthalten, entweder allein oder einschließlich verschiedener anderer Bestandteile. Die ersten zwei Säulen stellen Bindelösungen ohne RNA-Bindeprotein dar. Die verbleibenden Säulen stellen eine Bindelösung, die RNA-Bindeprotein enthalten (K562-Extrakt), dar. Die Säulen 5 bis 40 entsprechen Bindelösungen, welche die angegebene Menge der angegebenen Testverbindung einschließen.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Es ist die Verwendung von RNA-Molekülen, die die 3'-UTR von erb-B2 (SEQ ID NO: 5) enthalten, die an RNA-Bindeproteine bindet, wenn sie in einem RNA-Molekül vorhanden ist, offenbart. Die RNA-Moleküle können in Assays verwendet werden, um Verbindungen zu identifizieren, die die Interaktion von RNA, welche die Nukleinsäuresequenz und RNA-Bindeproteine enthält, beeinflussen.
  • Es ist auch ein Assay zur Identifizierung von Verbindungen, welche die Interaktion eines RNA-Moleküls, das die 3'-UTR von erb-B2 (SEQ ID NO: 5) enthält, und RNA-Bindeproteine beeinflussen, offenbart. Der Assay beinhaltet den Nachweis von Interaktionen zwischen RNA-Bindeproteinen und einem RNA-Molekül in der Gegenwart einer Testverbindung und in der Abwesenheit der Testverbindung. Ein Unterschied bei der nachgewiesenen Interaktion in der Gegenwart und in der Abwesenheit der Testverbindung deutet darauf hin, dass die Verbindung die Interaktion beeinflusst. Beispielsweise kann der Assay durchgeführt werden, indem eine Testlösung und eine Kontrolllösung, die jeweils ein RNA-Molekül umfassen, das die 3'-UTR von erb-B2 (SEQ ID NO: 5) enthält, gebildet wird, die Testlösung und die Kontrolllösung erhitzt wird, um das RNA-Molekül zu denaturieren, die Testlösung und die Kontrolllösung abgekühlt wird, die Testverbindung zu der Testlösung zugegeben wird, ein RNA-Bindeprotein zu der Testlösung und der Kontrolllösung zugegeben wird und die Interaktionen zwischen dem RNA-Molekül und dem RNA-Bindeprotein in der Testlösung und der Kontrolllösung nachgewiesen werden. Eine Testverbindung wird als eine Verbindung mit einer Wirkung auf die Interaktionen zwischen dem RNA-Molekül und dem RNA-Bindeprotein angesehen, wenn sich die in der Kontrolllösung nachgewiesenen Interaktionen und die in der Testlösung, die die Testverbindung enthält, nachgewiesenen Interaktionen unterscheiden.
  • Die nachgewiesenen Verbindungen können verwendet werden, um die Interaktion von RNA-Bindeproteinen mit mRNA, die die 3'-UTR von erb-B2 (SEQ ID NO: 5) enthält, zu beeinflussen. Dies kann die Expression der mRNA verändern, da ein Hauptgebiet der Regulation der Gen-Expression die regulatorische Wirkung von RNA-Bindeproteinen, die mit RNA-Molekülen interagieren, beinhaltet. Interaktionen zwischen RNA-Molekülen und RNA-Bindeproteinen sind dafür bekannt, dass sie in den folgenden Prozessen beteiligt sind, wobei deren Modulation die aufgeführten Wirkung auf die kodierten Proteine ausübt.
    RNA-Stabilisierung → Proteinkonzentration
    RNA-Destabilisierung → Proteinkonzentration
    Translationale Wirksamkeit → Proteinkonzentration
    RNA-Lokalisierung → Proteinkonzentration/-funktion
    RNA-Transkription → Proteinkonzentration (viral)
    RNA-Editing → Proteinfunktion
    RNA-Splicing → Proteinfunktion
  • I. VERBINDUNGEN
  • A. RNA-Bindeproteine
  • Die in dem offenbarten Verfahren verwendeten RNA-Bindeproteine können Teil eines zellulären oder nuklearen Rohextraktes sein, der teilweise aufgereinigt oder stark aufgereinigt ist. RNA-Bindeproteine können entweder getrennt oder in Kombination mit einem oder mehreren anderen RNA-Bindeproteinen verwendet werden. RNA-Bindeproteine können unter Verwendung von bekannten Verfahren zur Herstellung von zellulären Extrakten und zur Aufreinigung von Proteinen hergestellt werden. Verfahren zur Herstellung von Extrakten, die RNA-Bindeproteine enthalten, und zur Aufreinigung von bekannten RNA-Bindeproteinen sind beispielsweise beschrieben in Ashley et al., Science 262: 563–566 (1993), Rouault et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5768–5772 (1989), Neupert et al., Nucleic Acids Research 18: 51–55 (1990), Zhang et al., Molecular and Cellular Biology 13: 7652–7665 (1993) und den Literaturstellen, die in Burd und Dreyfuss, Science 265: 615–621 (1994) beschrieben worden sind. Einzelne RNA-Bindeproteine können auch rekombinant hergestellt werden, indem bekannte Techniken eingesetzt werden. DNA-kodierende RNA-Bindeproteine können von bekannten Klonen erhalten werden, indem ein DNA-Molekül synthetisiert wird, das für ein RNA-Bindeprotein mit einer bekannten Aminosäuresequenz kodiert oder indem das Gen, das für das RNA-Bindeprotein kodiert, kloniert wird. Techniken zur rekombinanten Expression von Proteinen und Verfahren zur Klonierung von Genen, die für bekannte Proteine kodieren, sind beispielsweise beschrieben von Sambrook et al., Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989).
  • Der Nachweis von Interaktion zwischen RNA-Bindeproteinen und RNA-Molekülen kann erreicht werden, indem eine detektierbare Markierung an das RNA-Bindeprotein angeheftet wird. Im Allgemeinen können Markierungen, die dafür bekannt sind, dass sie für Proteine verwendet werden können, zur Markierung von RNA-Bindeproteinen verwendet werden. Bevorzugte Markierungen für RNA-Bindeproteine sind 125I, 3H und 35S. Wenn das RNA-Bindeprotein rekombinant hergestellt wird, kann es durch Einbau von markierten Aminosäuren markiert werden. Techniken zur Markierung und Detektion von markierten Proteinen sind bekannt und beispielsweise beschrieben in Sambrook et al. und Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc., 1996). Der Nachweis von RNA-Bindeproteinen kann auch mit Antikörpern erfolgen, die für das RNA-Bindeprotein spezifisch sind. Die Herstellung und die Verwendung von Antikörpern zu diesem Zweck sind bekannt und sind beispielsweise beschrieben in Johnstone and Thorpe, Immunochemistry in Practise (Blackwell Scientific Publications, 1987).
  • B. RNA-Molelküle
  • RNA-Moleküle, die eine der offenbarten Sequenzen enthalten, können unter Verwendung bekannter Techniken rekombinant hergestellt werden, z.B. durch in vitro-Transkription und durch direkte Synthese. Zur rekombinanten und in vitro-Transkription können DNA-kodierende RNA-Moleküle von bekannten Klonen erhalten werden, z.B. durch Synthese eines DNA-Moleküls, das für ein RNA-Molekül kodiert oder durch Klonierung des Gens, das für das RNA-Molekül kodiert. Techniken zur in vitro-Transkription von RNA-Molekülen und Verfahren zur Klonierung von Genen, die für bekannte RNA-Moleküle kodieren, sind beispielsweise in Sambrook et al. beschrieben.
  • Der Nachweis von Interaktionen zwischen RNA-Bindeproteinen und RNA-Molekülen kann durchgeführt werden, indem eine detektierbare Markierung an das RNA-Molekül angeheftet wird. Im Allgemeinen können Markierungen, die dafür bekannt sind, dass sie für Nukleinsäuren verwendet werden können, zur Markierung von RNA-Molekülen verwendet werden. Beispiele von geeigneten Markierungen umfassen radioaktive Isotope, wie 33P, 32P und 35S, fluoreszierende Markierungen wie Fluorescein (FITC), 5,6-Carboxymethylfluorescein, Texas-Rot, Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl (NBD), Cumarin, Dansylchlorid, Rhodamin, 4'-6-Diamidino-2-phenylinodol (DAPI), und die Cyaninfarbstoffe Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5 und Cy7 und Biotin.
  • Markierte Nukleotide sind die bevorzugte Markierungsform, da sie direkt in die RNA-Moleküle während der Synthese eingebaut werden können. Beispiele von Detektionsmarkierungen, die in amplifizierte RNA eingebaut werden können, umfassen Nukleotid-Analoga wie BrdUrd (Hoy und Schimke, Mutation Research 290: 217-230 (1993)), BrUTP (Wansick et al., J. Cell Biology 122: 283–293 (1993)) und Nukleotide, die mit Biotin (Langer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 6633 (1981)) oder mit geeigneten Haptenen wie Digoxygenin (Kerkhof, Anal. Biochem. 205: 359–364 (1992)) modifiziert sind. Geeignete Fluoreszenz-markierte Nukleotide sind Fluorescein-isothiocyanat-dUTP, Cyanin-3-dUTP und Cyanin-5-dUTP (Yu et al., Nucleic Acids Res. 22: 3226–3232 (1994)). Eine bevorzugte Nukleotid-Analog-Markierung für RNA-Moleküle ist Biotin-14-cytidin-5'-triphosphat. Fluorescein, Cy3 und Cy5 können an dUTP zur direkten Markierung gebunden werden. Cy3.5 und Cy7 sind als Avidin- oder Anti-Digoxygenin-Konjugate zur sekundären Detektion von Biotion- oder Digoxygenin-markierten Sonden verfügbar.
  • Markierungen, die in RNA-Moleküle eingebaut werden, wie Biotin, können anschließend unter Verwendung von empfindlichen auf dem Gebiet bekannten Verfahren nachgewiesen werden. Zum Beispiel kann Biotin unter Verwendung eines Streptavidin-alkalinephosphatase-Konjugats (Tropix, Inc.), das an das Biotin gebunden ist, nachgewiesen werden und anschließend mittels Chemilumineszenz von geeigneten Substraten nachgewiesen werden (z.B. chemilumineszierendes Substrat CSPD: Dinatrium, 3-(4-Methoxyspiro-[1,2,-dioxetan-3-2'-(5'-chlor)tricyclo[3.3.1.13,7]decan]-4-yl)phenylphosphat; Tropix, Inc.).
  • C. Nukleinsäuresequenzen, die RNA-Bindeprotein-Bindestellen repräsentieren
  • Nukleinsäuresegmente, bei denen gefunden wurde, dass sie RNA-Bindeprotein-Bindestellen besitzen, können für verschiedene Zwecke verwendet werden. Es kann ein RNA-Molekül, das die Nukleotidsequenz des gefundenen Nukleinsäuresegments einschließt, in einem Assay verwendet werden, um Verbindungen zu identifizieren, die die Interaktion des RNA-Moleküls und den RNA-Bindeproteinen modulieren. Das gefundene Segment kann auch in ein rekombinantes Konstrukt eingebaut werden, sodass die Expression des Konstrukts durch das Nukleinsäuresegment kontrolliert wird. Zum Beispiel kann eine nicht-translatierte Region einer mRNA, bei der gefunden wurde, dass sie mit einem RNA-Bindeprotein interagiert, vollständig oder als Teil der nicht-translatierten Region einer heterologen RNA verwendet werden. Es wird erwartet, dass solche rekombinanten RNA-Moleküle mit dem verwandten RNA-Bindeprotein der heterologen nicht-translatierten Region interagieren werden und die Expression der RNA durch diese Interaktion beeinflusst werden wird. Dies entspricht analog der Rekombination von Promotoren mit heterologen kodierenden Regionen, um die Expression der kodierenden Region zu verändern oder zu kontrollieren. Es ist bevorzugt, dass rekombinante Konstrukte, die RNA-Bindeprotein-Bindestellen einschließen, in Expressionsvektoren eingeschlossen werden, so dass ein rekombinantes RNA-Transkript hergestellt werden kann, das eine RBP-Bindestelle und heterologe Sequenzen einschließt. Von einer gefundenen RBP-Bindestelle wird angenommen, dass sie operativ an heterologe Sequenzen gebunden ist, wenn sie in einem RNA-Molekül, das sowohl eine Bindestelle als auch die heterologen Sequenzen einschließt oder in einem Konstrukt, in dem ein RNA-Transkript hergestellt werden kann, das sowohl eine Bindestelle als auch die heterologen Sequenzen einschließt, vorhanden ist. Wie hier verwendet, sind heterologe Sequenzen Nukleotidsequenzen, die naturgemäß nicht in dem selben Nukleotidmolekül vorkommen, zusammen mit einer Referenzsequenz, wie einer RBP-Bindestelle.
  • Eine RNA-Bindeprotein-Bindestelle wurde unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren gefunden und bestätigt. Dieses Segment wurde anfangs als Teil eines biologisch bedeutenden Gens in DNA gefunden. 5'- und 3'-UTRs der Gen-Sequenzen wurden in Datenbanken gefunden und aus zellulärer DNA durch PCR amplifiziert. Solche Sequenzen könnten auch unter Verwendung einer PCR-Klonierung oder einer traditionellen Hybridisierungsklonierung aus einer Bibliothek heraus kloniert worden sein. Nach der Klonierung wird die UTR unter Kontrolle eines Promotors zur in vitro-Transkription, wie einem SP6- oder T7-Promotor, platziert und es wird radioaktiv-markierte RNA hergestellt. Die RNA wird dann mit einem Proteinextrakt von geeigneten Zellen oder einer geeigneten Zelllinie vermischt und die Bindung wird unter Verwendung der offenbarten Verfahren untersucht. Die Spezifität der Bindung wird bestimmt, indem der Assay in der Gegenwart oder in der Ab wesenheit von nicht-markierter RNA, die identisch zu der Test-RNA ist (spezifische Kompetitor-RNA) und in der Gegenwart von nicht-markierter RNA, die sich von der Test-RNA unterscheidet (nicht-spezifische Kompetitor-RNA) durchgeführt wird. Wenn eine spezifische Bindestelle in einer UTR gefunden wurde, wird eine genauere Lokalisierung der Bindestelle durch Standard-Restriktionskartierung und einem erneuten Testen von RNA, die von Fragmenten der UTR transkribiert wurde, ermöglicht.
  • Ein gefundenes Segment (SEQ ID NO: 5) ist die 3'-UTR von erb-B2-mRNA. Das gefundene Segment ist ein Teil der GenBank-Zugangsnummer X03363.
  • Proteinextrakte zur Verwendung in dem offenbarten Verfahren können im Allgemeinen wie folgt hergestellt werden. Ungefähr 108 Zellen können in Puffer, der 25 mM Tris, pH 7,9, 0,5 mM EDTA, 0,1 mM PMFS, 2 mM NaF und 2 mM NaPPi enthält, mittels zwei Auftau-/Gefrierzyklen lysiert werden. Die Extrakte werden dann zweimal bei 16000 g für 15 Minuten bei 4°C zentrifugiert, aliquotiert, auf Trockeneis schockgefroren und bei –80°C bis zur Verwendung gelagert.
  • Für erb-B2 (SEQ ID NO: 5) wurde ein K652-Proteinextrakt als ein repräsentativer zellulärer Extrakt verwendet, um das Vorliegen einer bestimmten regulatorischen Stelle zu zeigen.
  • Eine Form einer gefundenen RBP-Bindestelle ist ein Nukleinsäuremolekül, das einem RNA-Molekül entspricht oder das in ein RNA-Molekül transkribiert werden kann, wobei das RNA-Molekül kein Protein enthält, das für eine Nukleotidsequenz kodiert, an die die RBP-Bindestelle normalerweise gebunden ist (d.h. in der Natur gebunden ist). Das bedeutet, dass in solchen Nukleinsäuremolekülen die gefundene RBP-Bindestelle von der Protein-kodierenden Sequenz, an die sie normalerweise gebunden ist, getrennt worden ist.
  • Wie hier verwendet, bezeichnet ein Nukleinsäuremolekül oder ein Nukleinsäuresegment, das eine Nukleotidsequenz aufweisen soll, ein Nukleinsäuremolekül oder Segment mit der Nukleotidbasensequenz in ihren jeweils korrespondierenden Formen. Zum Beispiel ist es im Falle einer RNA-Nukleotidsequenz (wie SEQ ID NO: 5) spezifisch beabsichtigt, soweit nicht anders angegeben, dass Nukleotidmoleküle oder Segmente, die eine RNA-Nukleotidsequenz aufweisen, beispielsweise Nukleotidmoleküle oder Segmente mit der korrespondierenden DNA-Nukleotidsequenz ein schließen (in der U durch T ersetzt ist). In gleicher Weise ist es im Falle einer DNA-Nukleotidsequenz spezifisch beabsichtigt, soweit nicht anders angegeben, dass Nukleotidmoleküle oder Segmente, die eine solche DNA-Nukleotidsequenz aufweisen, beispielsweise Nukleotidmoleküle oder Segmente mit der korrespondierenden RNA-Nukleotidsequenz einschließen (in der T durch U ersetzt ist).
  • Die offenbarten Nukleinsäuresequenzen können entweder durch Klonierung oder direkte Synthese in RNA eingebaut sein und die RNA kann dann in einem Screening-Assay verwendet werden, um Verbindungen zu identifizieren, die die Interaktion von RNA-Bindeproteinen mit den RNA-Molekülen modulieren. Die identifizierten Verbindungen können auf eine Wirkung auf die Expression eines korrespondierenden RNA-Moleküls in einer Zelle getestet werden. Es ist bevorzugt, dass dieser Modus der Identifizierung von Bindestellen spezifisch auf eine Suche von Nukleinsäuresequenzen von Genen, die dafür bekannt sind oder in Verdacht stehen in Krankheitszuständen beteiligt zu sein, gerichtet ist.
  • D. Assay-Bedingungen zum Nachweis von RNA/RNA-Bindeprotein-Interaktionen
  • Interaktionen zwischen RNA, die die 3'-UTR von erb-B2 (SEQ ID NO: 5) enthält, und RNA-Bindeproteinen können unter Verwendung eines beliebigen geeigneten Assays nachgewiesen werden. Es sind Bedingungen bevorzugt, die einen Nachweis von Interaktionen zwischen RNA-Bindeproteinen und RNA im Allgemeinen ermöglichen. Das offenbarte Verfahren wird durchgeführt, indem ein einzelner Satz von Bedingungen verwendet wird, der einen Nachweis von nahezu jeder Interaktion zwischen RNA-Bindeproteinen und RNA-Molekülen ermöglicht. Diese Bedingungen ermöglichen die Bildung von detektierbaren Komplexen zwischen RNA-Bindeproteinen und RNA-Molekülen. Wie hier verwendet, sollen Interaktionen zwischen RNA-Bindeproteinen und RNA-Molekülen, die als "möglich" bezeichnet werden, solche Interaktionen bezeichnen, die spezifisch sind und die mindestens unter einem Satz Bedingungen vorkommen (z.B. in vivo- oder optimierte Bindungs-Assay-Bedingungen). Diese Bedingungen ermöglichen einen Nachweis einer Mehrzahl der möglichen Interaktionen zwischen RNA-Bindeproteinen und RNA-Molekülen. Unter der Bedeutung des Ausdruckes "spezifische Interaktion" wird im Allgemeinen Interaktionen verstanden, die auf spezifischen Eigenschaften der interagierenden Moleküle basieren und nicht auf allgemeinen Eigenschaften. Zum Beispiel erkennen und binden RNA-Bindeproteine spezifisch an Stellen in RNA-Molekülen mit der Nukleotidsequenz AUUUA. Dies ist eine spezifische Interaktion. Andererseits binden einige Pro teine allgemein RNA-Moleküle (d.h. nicht-spezifisch) basierend auf den allgemeinen chemischen Eigenschaften von allen RNA-Molekülen. Im Allgemeinen kann eine In- teraktion als eine nicht-spezifische Interaktion identifiziert werden, indem bestimmt wird, dass die Interaktion durch das Vorliegen eines nicht-spezifischen Kompetitors verhindert werden kann.
  • Interaktionen zwischen RNA-Bindeproteinen und RNA-Molekülen werden in einer Bindelösung ermöglicht. Die Bindelösung enthält ein oder mehrere RNA-Moleküle und Pufferbestandteile. Die Pufferbestandteile umfassen einen Puffer, ein einwertiges Kation, ein zweiwertiges Kation, ein Reduktionsmittel und ein Dichtemittel. Es ist bevorzugt, dass der Puffer Bis-Tris-Propan ist, bei einem pH von ungefähr 8,5 und bei einer Konzentration von ungefähr 7,5 mM, das einwertige Kation K+ ist, bei einer Konzentration von ungefähr 50 mM, das zweiwertige Kation Mg++ ist, bei einer Konzentration von ungefähr 1 mM, das Reduktionsmittel Dithiothreitol ist, bei einer Konzentration von ungefähr 0,2 mM und das Dichtemittel Glycerol ist, bei einer Konzentration von ungefähr 10% (v/v).
  • Diese Bedingungen sind optimiert worden, um auf universelle Weise einsetzbar zu sein. Es ist am meisten bevorzugt, dass die optimalen Bedingungen verwendet werden. Jedoch können ein oder weniger, vorzugsweise zwei, der Pufferbestandteile in einer Weise variiert werden, wie sie unten offenbart ist. Für variierende bestimmte Pufferbestandteile ist es bevorzugt, dass (1) der Puffer HEPES, Tris oder Bis-Tris-Propan ist, der pH jeweils zwischen ungefähr 8 und 10 ist und die Konzentration zwischen ungefähr 5 und ungefähr 100 mM beträgt, (2) das einwertige Kation K+, Na+ oder NH4 + ist, jeweils bei einer Konzentration zwischen 0 und ungefähr 100 mM, (3) das zweiwertige Kation Mg++, Ca++ oder Fe++, jeweils bei einer Konzentration zwischen 0 und ungefähr 5 mM, (4) das Reduktionsmittel Dithiothreitol oder Mercaptoethanol ist, bei einer Konzentration zwischen 0 und ungefähr 1 mM und das Dichtemittel Glycerol oder Poylethylenglykol ist, bei einer Konzentration zwischen 0 und ungefähr 20% (v/v).
  • Für die meisten RNA-Moleküle erscheint das Reduktionsmittel nicht kritisch zu sein, obwohl es eine Tendenz zu einer besseren Bindung in der Gegenwart eines Reduktionsmittels, vorzugsweise DTT, gibt. Jedoch macht in einigen Fällen das Reduktionsmittel einen signifikanten Unterschied bei der Detektion von Interaktionen aus. Demzufolge ist die Verwendung eines Reduktionsmittels bevorzugt. Ein Dichtemittel erscheint nicht zur Detektion der Interaktion zwischen RNA-Molekülen und RNA-Bindeproteinen erforderlich zu sein. Sollten jedoch Interaktionen durch einen Gel-Mobilitäts-Shift analysiert werden, erhöht das Vorliegen eines Dichtemittels die Qualität der Banden. Demgemäß ist die Verwendung eines Dichtemittels bevorzugt.
  • Die Bindelösung kann andere Bestandteile einschließen, die zur Bildung von spezifischen Interaktionen beitragen. Zum Beispiel kann ein Kompetitor von nichtspezifischen RNA/Proteininteraktionen zugesetzt werden, um den Hintergrund von nicht-spezifischen Interaktionen zu reduzieren. Poly r(G), tRNA und Heparin sind bevorzugte Kompetitoren für nicht-spezifische RNA/Proteininteraktionen.
  • Es ist beabsichtigt, dass ein Konzentrationsbereich, der zwischen 0 und einer ungefähr angegebenen spezifischen Konzentration liegt, nicht eine Konzentration von 0 umfasst, aber die spezifische Konzentration umfasst und Konzentrationen, die bis zu ungefähr 10% oberhalb der spezifischen Konzentration liegen. Es ist auch beabsichtigt, dass ein Konzentrationsbereich, der zwischen einer ungefähren ersten spezifischen Konzentration und einer ungefähren zweiten spezifischen Konzentration angegeben ist, die erste spezifische Konzentration, Konzentrationen bis zu ungefähr 10% unterhalb der ersten spezifischen Konzentration, Konzentrationen zwischen den ersten und zweiten spezifischen Konzentrationen, die zweite spezifische Konzentration und Konzentrationen bis zu ungefähr 10% oberhalb der zweiten spezifischen Konzentration umfasst. Es ist beabsichtigt, dass ein Konzentrationsbereich, der von einer ersten spezifischen Konzentration bis zu einer zweiten spezifischen Konzentration angegeben ist, die erste spezifische Konzentration, Konzentrationen zwischen den ersten und zweiten spezifischen Konzentrationen und die zweite spezifische Konzentration umfasst. Es ist auch beabsichtigt, dass ein Konzentrationsbereich, der von 0 bis zu einer spezifischen Konzentration angegeben ist, eine Konzentration von 0, Konzentrationen zwischen 0 und der spezifischen Konzentration und die spezifische Konzentration umfasst.
  • Soweit nicht anders angegeben, sollen alle Konzentrationen von Pufferbestandteilen die Endkonzentration dieser Bestandteile in einer vollständig gebildeten Bindelösungen darstellen. Der Bindepuffer kann durch eine beliebige Kombination von Bestandteilen, die die beabsichtigte Endkonzentration ergibt, gebildet werden. Zum Beispiel kann eine Bindelösung gebildet werden, indem eine einzelne Stammlösung von Pufferbestandteilen, getrennte Stammlösungen von Pufferbestandteilen oder getrennte Stammlösungen von Kombinationen einiger der Pufferbestandteile zusammen mit anderen Bestandteilen der Bindelösung miteinander gemischt werden.
  • Es ist auch beabsichtigt, dass die Endkonzentration von Pufferbestandteilen erreicht werden kann, indem verschiedene Lösungen, die jeweils einen Teil der Gesamtmenge eines gegebenen Bestandteils enthalten, gemischt werden. Zum Beispiel kann ein Teil des zweiwertigen Kations als Teil einer Stammlösung zugesetzt werden und ein Teil kann mit der RNA zugesetzt werden.
  • Es ist bevorzugt, dass die Konzentration von fremden Verbindungen in Bindelösungen minimal gehalten wird. Es wird jedoch so verstanden, dass Proben von RNA-Bindeproteinen und RNA-Molekülen zusätzliche Verbindungen enthalten können. Die Konzentration in der Bindelösung von solchen Verbindungen kann beispielsweise verringert werden, indem die Probe zu dem am meisten möglichen Grad verdünnt wird, wenn die Bindelösung gebildet wird.
  • II. Verfahren
  • Das Grundverfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die RNA/RNA-Bindeprotein-Interaktionen beeinflussen, beinhaltet den Nachweis solcher Interaktionen in der Gegenwart und in der Abwesenheit einer Testverbindung.
  • A. Nachweis von RNA/RBP-Interaktionen
  • Der Nachweis einer Interaktion zwischen einem RNA-Bindeprotein und einer vermeintlichen Bindestelle kann unter Verwendung der offenbarten Assays durchgeführt werden. Solche Assays können auch verwendet werden, um Verbindungen zu durchmustern, welche die Interaktion zwischen RNA und RNA-Bindeproteinen beeinflussen. Das Grundverfahren zum Nachweis von Interaktionen zwischen RNA-Molekülen und RNA-Bindeproteinen beinhaltet die Bildung einer Bindelösung, die die RNA-Moleküle und 1X-Bindepuffer enthält, das Erhitzen der Bindelösung, um die RNA-Moleküle zu denaturieren, das Abkühlen der Bindelösung auf die Reaktionstemperatur, das Zusetzen der RNA-Bindeproteine zu der Bindelösung und der Nachweis der Interaktionen zwischen den RNA-Molekülen und den RNA-Bindeproteinen. Verbindungen, die bezüglich ihrer Wirkung auf RNA/RNA-Bindeprotein-Interaktionen getestet werden sollen, können bei einer beliebigen Stufe des Assays zugegeben werden. Zum Beispiel kann die Verbindung vor oder zusammen mit der RNA, vor oder zusammen mit dem RNA-Bindeprotein oder nach dem Zusatz des RNA-Bindeproteins zugegeben werden.
  • 1. Bildung der Bindelösung
  • Die Bindelösung enthält ein oder mehrere RNA-Moleküle, Pufferbestandteile und nicht-spezifische Kompetitoren. Die Pufferbestandteile umfassen einen Puffer, ein einwertiges Kation, ein zweiwertiges Kation, ein Reduktionsmittel und ein Dichtemittel. Die Bindelösung wird gebildet, indem die Bestandteile der Bindelösung auf eine Weise kombiniert und/oder miteinander vermischt werden, dass eine Bindelösung mit der erforderlichen Zusammensetzung entsteht. Der Bindepuffer kann durch eine beliebige Kombination der Bestandteile gebildet werden, die zu der beabsichtigten Endkonzentration führt. Zum Beispiel kann eine Bindelösung gebildet werden, indem eine einzelne Stammlösung von Pufferbestandteilen, getrennte Stammlösungen von Pufferbestandteilen oder getrennte Stammlösungen von Kombinationen einiger der Pufferbestandteile mit anderen Bestandteilen der Bindelösung zusammengemischt werden. Es ist auch beabsichtigt, dass die Endkonzentration der Pufferbestandteile erreicht werden kann, indem verschiedene Lösungen, die jeweils einen Teil der gesamten Menge eines gegebenen Bestandteils enthalten, gemischt werden. Zum Beispiel kann ein Teil des zweiwertigen Kations als Teil einer Stammlösung zugegeben werden und ein Teil kann mit der RNA zugegeben werden. Daher ist die Art und Weise, in der die Endzusammensetzung der Bindelösung erreicht wird, nicht kritisch. Es ist beabsichtigt, dass eine beliebige Kombination von Lösungen und Bestandteilen, die dieses Ergebnis erzielen, durch diesen Schritt umfasst sein sollen.
  • 2. Erhitzen und Abkühlen der Bindelösung
  • Gebildete Bindelösung wird in 1X-Bindepuffer erhitzt und abgekühlt, um Strukturen höherer Ordnung in den RNA-Molekülen zu denaturieren. Solche Strukturen können die RNA-Moleküle weniger zugänglich für die RNA-Bindeproteine machen. Wenn RNA-Moleküle verwendet werden, die aus natürlichen Quellen aufgereinigt worden sind, ist es auch möglich, dass andere Moleküle an die RNA gebunden bleiben können. Der Erhitzungsschritt kann dazu dienen, solche Moleküle freizusetzen. Der Erhitzungs- und Abkühlungsschritt beinhaltet das Aussetzen der Bindelösung gegenüber einer Hitzequelle, bis sie eine ausreichende Temperatur erreicht und das anschließende Abkühlen der Lösung auf die Reaktionstemperatur. Die Temperatur, auf die die Bindelösung erhitzt wird, kann eine beliebige Temperatur sein, welche die RNA-Moleküle, die in der Bindelösung vorliegen, im Wesentlichen denaturiert. Es wird so verstanden, dass unterschiedliche Temperaturen für unterschiedliche RNA-Moleküle ausreichend sind. Zum Beispiel werden kürzere RNA-Moleküle und RNA-Moleküle mit einem niedrigen GC-Gehalt im Allgemeinen bei niedrigeren Tem peraturen im Wesentlichen denaturiert werden. Jedoch ist es bevorzugt, dass eine einzelne Temperatur für den Erhitzungsschritt verwendet wird. In diesem Fall ist es bevorzugt, dass eine Temperatur verwendet wird, die ausreicht, um allgemein RNA-Moleküle im Wesentlichen zu denaturieren. Eine bevorzugte Temperatur ist 85°C. Nachdem es der Lösung ermöglicht wurde, auf die Reaktionstemperatur abzukühlen, wird das RNA-Bindeprotein zu der Bindelösung vor der Inkubation bei der zweckmäßigen Temperatur zur RNA-Proteinbindung, vorzugsweise 37°C, zugegeben.
  • 3. Nachweis von Interaktionen
  • Interaktionen zwischen RNA-Bindeproteinen und RNA-Molekülen können unter Verwendung eines beliebigen Verfahrens nachgewiesen werden. Es ist bevorzugt, dass eine Detektion die Auftrennung von interagierenden RNA-Molekülen und RNA-Bindeproteinen beinhaltet. Dies kann beispielsweise dadurch erreicht werden, indem Bestandteile in der Bindelösung auf der Basis ihrer Größe oder physikalischen Eigenschaften aufgetrennt werden. Zwei bevorzugte Verfahren zur Auftrennung und Detektion von interagierenden RNA-Molekülen und RNA-Bindeproteinen sind die Filterbindung und der Gel-Mobilitäts-Shift.
  • a. Filterbindung. Die Filterbindung beinhaltet das Einfangen von interagierenden Molekülen auf einem Filter, während nicht-interagierende Moleküle durch den Filter durchgehen. Dieses Verfahren ist für den Fachmann auf dem Gebiet bekannt. Beispielsweise werden vorgefeuchtete Nitrocellulosefilter in 1X-Bindepuffer äquilibriert. Die Bindereaktion wird dann auf den Filter durch Vakuumfiltration durchgeführt, um nicht-gebundene RNA zu entfernen. Der Filter wird in 1X-Bindepuffer gewaschen, ein Scintillations-Cocktail wird zugegeben und die Menge von Proteingebundener DNA wird durch Scintillationszählung bestimmt.
  • Bei Assays, die eine Filterbindung beinhalten, ist es auch bevorzugt, dass ein nicht-interagierender Kontroll-Assay durchgeführt wird. Eine solche Kontrolle wird verwendet, um das detektierbare Signal, das in der Abwesenheit einer spezifischen RNA RNA-Bindeprotein-Interaktion zurückgehalten wird, zu bestimmen. Vorzugsweise wird ein solcher nicht-interagierender Kontroll-Assay durchgeführt, indem ein Mutanten-RNA-Molekül – eines, das nicht mit dem RNA-Bindeprotein spezifisch interagiert – anstelle des RNA-Moleküls, das in den entsprechenden Binde-Assays verwendet wird, eingesetzt wird. Die Menge an detektierbarem Signal, das an den Filter in der nicht-interagierenden Kontrolle gebunden ist, beschreibt die Verteilung des Hintergrunds- oder nicht-spezifischen Signals, das in der Menge des detektierbaren Signals, das für die Binde-Assays gemessen wurde, vorliegt. In dem Screening-Assay mit hohem Durchsatz dient die nicht-interagierende Kontrolle auch als eine Kontrolle für die Kontroll-Assays (d.h. Assays, die keine Testverbindung enthalten). Es wird auch erwartet, dass der Spiegel des Hintergrundsignals reduziert sein kann, indem eine niedrige Konzentration von Detergenz in dem Waschpuffer eingeschlossen ist. Bevorzugte Detergenzien für diesen Zweck sind Tween-20 und Triton-N-101. Bei einem gegebenen Satz von Testreaktionen kann ein nicht-interagierender Kontroll-Assay verwendet werden, um die Wirksamkeit der Waschschritte zu bestimmen.
  • Es ist bevorzugt, dass die Konzentration von RNA-Bindeprotein in den offenbarten Assays mindestens 0,5 μg/μl oder zwischen 0,5 μg/μl und 1,0 μg/μl beträgt. Für Assays, die eine Filterbindung verwenden, besteht der Filter vorzugsweise entweder aus reiner Nitrocellulose oder einem gemischten Celluloseester (MCA). Bei dem offenbarten Assay haben die Filter aus gemischten Celluloseester mehr Zähleinheiten gebunden als reine Nitrocellulose. Bei den Filtern ist eine Porengröße von 0,2 μm (8000 Dalton MW-Durchlassgrenze) am meisten bevorzugt, obwohl MCA-Filterplatten mit einer Porengröße von 0,45 μm (20000 Dalton MW-Durchlassgröße) auch bevorzugt sind. Die Durchlassgröße für niedriges Molekulargewicht ermöglicht einen Nachweis von Bindeinteraktionen zwischen RNA und Proteinen mit kleinem Molekulargewicht. Für den Screening-Assay mit hohem Durchsatz ist es bevorzugt, dass die Bindereaktionen in v-bödigen Platten mit 96 Vertiefungen bei einem Endvolumen von 10 μl durchgeführt werden. Dazu werden die Proben auf einer Millipore-Filterplatte mit 96 Vertiefungen geladen.
  • Bei Assays, die eine Filterbindung verwenden, ist es auch bevorzugt, dass nach einer Inkubation und vor dem Beladen auf dem Filter die Reaktionen auf ein größeres Volumen gebracht werden, am meisten bevorzugt auf ein Endvolumen von 110 μl, indem eine Lösung, die als Verdünnungslösung bezeichnet wird, zugegeben wird. Bevorzugte Verdünnungslösungen umfassen 1X-Bis-Tris-Propan (BTP)-Bindepuffer mit Glycerol, 1X-BTP ohne Glycerol, TE, Phosphat-gepufferte Saline (PBS) und Trichloressigsäure (TCA), wobei 1X-BTP ohne Glycerol am meisten bevorzugt ist. Es ist am meisten bevorzugt, dass die Verdünnungslösung die selben Pufferbestandteile aufweist (vorzugsweise bei der selben Endkonzentration) wie sie in der Bindelösung verwendet werden, außer dass das Dichtemittel fehlt. Diese Verdünnung ermöglicht ein gleichmäßigeres Beladen der Probe auf die Filterplatte. Dabei soll in Erwägung gezogen werden, dass sich das bevorzugte verwendete Endvolumen in Abhängigkeit von der Filterfläche, auf die die Assay-Lösung aufgetragen werden soll, unterscheiden sollte. Daher werden Assays, in denen große Filterflächen verwendet werden, vorzugsweise auf ein Endvolumen von mehr als 110 μl gebracht und Assays, in denen kleinere Filterflächen verwendet werden, werden vorzugsweise auf ein Endvolumen von weniger als 110 μl gebracht.
  • Es ist bevorzugt, dass die Assay-Lösung auf dem Filter unter Vakuum beladen wird. Nach dem Beladen ist es bevorzugt, dass die Filter gewaschen werden, vorzugsweise zweimal. Bevorzugte Waschpuffer (auch als die Waschlösung bezeichnet) umfassen 1X-BTP-Bindepuffer mit Glycerol, 1X-BTP ohne Glycerol, TE, PBS und TCA, wobei 1X-BTP ohne Glycerol am meisten bevorzugt ist. Es ist am meisten bevorzugt, dass der Waschpuffer die selben Pufferbestandteile aufweist (vorzugsweise bei der selben Endkonzentration) wie sie in der Bindelösung verwendet werden, außer dass das Dichtemittel fehlt. Es ist auch bevorzugt, dass der Waschpuffer kalt ist (d.h. unterhalb der Raumtemperatur).
  • b. Gel-Mobilitäts-Shift. Der Gel-Mobilitäts-Shift beinhaltet das Auflösen von interagierenden und nicht-interagierenden RNA-Molekülen und RNA-Bindeproteinen auf einem Gel durch Elektrophorese und das Sichtbarmachen der Position und der Menge der Bestandteile, die verschieden stark migrieren. Interagierende RNA-Moleküle und RNA-Bindeproteine tendieren dazu, aufgrund ihrer größeren Masse weniger stark in dem Gel zu migrieren als nicht-interagierende Moleküle. Gel-Mobilitäts-Shift-Assays können wie folgt durchgeführt werden. Nach der Inkubation der Bindereaktion wird 6X-Ladepuffer (30% Glycerol, 0,25% Xylencyanol, 0,25% Bromphenolblau) zu einer Endkonzentration von 1X zugegeben. Die Reaktion wird dann in die Vertiefungen eines Polyacrylamidgels (im Allgemeinen 4 bis 8%), hergestellt in Tris-Borat-EDTA (TBE)-Puffer (90 mM Tris-Borat, 2 mM EDTA, pH 8), geladen. Die Protein-gebundene RNA wird von der nicht-gebundenen RNA abgetrennt, indem eine konstante Spannung (150 bis 175 V) an das Gel angelegt wird und es dem Gel ermöglicht wird, solange zu laufen, bis das Bromphenolblau das Ende des Gels erreicht hat. Das Gel wird im Vakuum bei 80°C getrocknet. Die nicht-gebundene RNA und die Protein-gebundene RNA wird dann durch Autoradiographie sichtbar gemacht. In Fällen, in denen es wünschenswert ist, das Molekulargewicht des RNA-Proteinkomplex zu wissen, wird die Bindereaktion einem ultravioletten Licht ausgesetzt, um den Komplex kovalent kreuzzuvernetzen. 6X-Ladepuffer (3,75 M Tris, 30% βME, 13,8% Natriumdodecylsulfat (SDS), 30% Glycerol, pH 6,8) wird zu der kreuzvernetzten Reaktion bei einer Endkonzentration von 1X zugegeben und das Gemisch wird auf ein SDS-Polyacrylamidgel (im Allgemeinen 8 bis 12%) geladen. Das Gel wird in einem Tris-Glycin-Puffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 0,1% SDS) bei 30 mA laufen gelassen, bis die Molekulargewichtsmarker ausreichend voneinander getrennt sind. Das Gel wird getrocknet und der RNA-Proteinkomplex wird durch Autoradiographie sichtbar gemacht.
  • c. Ribonuklease-Verdau. Für einige Assays kann es wünschenswert sein, solche RNA-Moleküle oder solche Bereiche eines RNA-Moleküls zu eliminieren, die nicht bei der Interaktion zwischen RNA-Bindeproteinen beteiligt sind. Zum Beispiel könnte die Bindung eines RNA-Bindeproteins bei Verwendung eines großen RNA-Moleküls in dem Assay einen RNA/Proteinkomplex hervorbringen, der nur weniger größer ist als das RNA-Molekül allein. Wenn ein solcher Komplex durch einen Gel-Mobilitäts-Shift nachgewiesen wird, könnte der entstehende Shift nicht leicht nachweisbar sein. Wenn ein solcher Komplex durch Filterbindung nachgewiesen wird, kann das RNA-Molekül alleine ausreichend groß sein, um durch den Filter zurückgehalten zu werden. Solche möglichen Probleme können umgangen werden, indem RNA, die nicht bei den Interaktionen beteiligt ist, verdaut wird. Dies kann leicht dadurch erreicht werden, dass die Bindelösung einem Ribonuklease-Verdau ausgesetzt wird. Es wird nur die nicht-gebundene oder nicht-interagierende RNA verdaut werden. Die Bereiche der RNA, die durch RNA-Bindeproteine gebunden werden, werden von einem Verdau durch das Protein geschützt.
  • B. Durchmustern von Verbindungen, die die Interaktion von RNA-Molekülen und RNA-Bindeproteinen modulieren
  • Die Identifizierung von Verbindungen, welche die Interaktion von RNA-Molekülen und RNA-Bindeproteinen modulieren, kann erreicht werden, indem eine oder mehrere Testverbindungen in der Bindelösung, welche die RNA-Moleküle von Interesse, die RNA-Bindeproteine von Interesse und die Pufferbestandteile umfasst, eingeschlossen werden und die Interaktion zwischen den RNA-Molekülen und den RNA-Bindeproteinen nachgewiesen wird. Testverbindungen, die die Interaktion zwischen den RNA-Molekülen und den RNA-Bindeproteinen modulieren oder beeinflussen, können gefunden werden, indem die Interaktionen in der Bindelösung, die keine Testverbindung enthält, mit den Interaktionen in der Bindelösung, die die Testverbindungen enthält, verglichen werden. Bindelösungen, die eine oder mehrere Testverbindungen einschließen, werden hier als Testlösungen bezeichnet. Bindelösungen, die keine Testverbindung einschließen, werden hier als Kontrolllösungen be zeichnet. Verbindungen, die die Interaktion modulieren, werden gefunden werden, wenn sich die Interaktion in den beiden Lösungen unterscheiden. Es kann ein Assay dieses Typs verwendet werden, um Verbindungen zu finden, die die Interaktion durch Bindung an die RNA-Moleküle oder durch Bindung an die RNA-Bindeproteine in einer gegebenen Probe modulieren oder beeinflussen. Indem eine gefundene Verbindung an eine Zelle, in der ein RNA-Molekül von Interesse oder ein verwandtes RNA-Molekül exprimiert wird, abgegeben wird, kann die Funktion oder die Wirkung des RNA-Moleküls in der Zelle aufgrund der Modulation oder der Wirkung, welche die Verbindung auf die Interaktion des RNA-Moleküls und den RNA-Bindeproteinen hat, beeinflusst werden. Beispielsweise kann in Fällen, in denen eine Interaktion zwischen einem mRNA-Molekül und einem RNA-Bindeprotein die Translation der mRNA kontrolliert, eine Verbindung, bei der gefunden wurde, dass sie die Interaktion in dem offenbarten Assay beeinflusst, verwendet werden, um die Translation der mRNA über deren Wirkung auf die Interaktion zu beeinflussen. Es können gefundene Verbindungen verwendet werden, um die Funktion oder Expression eines RNA-Moleküls in einer Zelle in vivo, ex vivo oder in vitro zu beeinflussen. Die Identifizierung von solchen Verbindungen kann auch zu der Entwicklung von Therapien führen, um eine Vielzahl von Krankheiten zu behandeln. Solche Verbindungen können auch als Forschungs-Tools zur Untersuchung der Signifikanz, Art oder Mechanismus einer RNA-Funktion oder Expression in einer Zelle verwendet werden.
  • a. Screening-Assay mit hohem Durchsatz. Obwohl es nicht erforderlich ist, können die offenbarten universellen Assay-Bedingungen in einem Screening-Assay verwendet werden, um Verbindungen zu identifizieren, die eine RNA/RNA-Bindeprotein-Interaktion von Interesse beeinflussen. Solche Screening-Assays können entworfen werden, um eine gleichzeitige Einschätzung der Wirkung von zahlreichen Testverbindungen auf die Interaktion von Interesse zu ermöglichen. Zu diesem Zweck ist es bevorzugt, dass die Interaktionen durch Filterbindung nachgewiesen werden. Gleichzeitige Filterbindungs-Assays werden vorzugsweise durch gleichzeitiges Filtern von Bindelösungen in einem Apparat mit getrennten Vertiefungen, Löchern, Taschen oder anderen Abtrennungen, die getrennte Bindelösungen aufnehmen können, durchgeführt. Eine bevorzugte Form eines Filterbinde-Apparates mit mehreren Vertiefungen ist die MultiScreen-Filterplatte von Millipore. Es soll auch bedacht werden, dass mehrere Assays mit mehreren Vertiefungen oder mehreren Proben gleichzeitig durchgeführt werden können.
  • Im Allgemeinen kann ein Screening mit hohem Durchsatz wie folgt durchgeführt werden. Als erstes wird ein Satz von einer oder mehreren Testlösungen gebildet, wobei jede Testlösung ein oder mehrere RNA-Moleküle und Pufferbestandteile einschließt. Die Testverbindungen werden dann für eine Zeit und auf eine Temperatur erhitzt, die ausreichen, um die RNA-Moleküle) zu denaturieren, und langsam abgekühlt. Als nächstes werden ein oder mehrere RNA-Bindeproteine zu den Testlösungen zugegeben und die Interaktionen zwischen den RNA-Molekülen) und den RNA-Bindeprotein(en) in den Testlösungen werden nachgewiesen. Eine der Testverbindungen ist in der Testlösung eingeschlossen. Zur Bestimmung, ob die Testverbindungen eine Wirkung auf die Interaktionen zwischen den RNA-Molekülen) und den RNA-Bindeproteinen) besitzen, wird eine Kontrolllösung gebildet, erhitzt und wie die Testlösungen abgekühlt, außer dass keine Testverbindung in der Kontrolllösung vorhanden ist. Die RNA-Bindeproteine) werden zu der Kontrolllösung zugegeben und die Interaktionen zwischen den RNA-Molekülen) und den RNA-Bindeprotein(en) in der Kontrolllösung werden nachgewiesen. Durch einen Vergleich der Interaktionen, die in den Testlösungen nachgewiesen werden und solchen, die in der Kontrolllösung nachgewiesen werden, kann bestimmt werden, ob eine gegebene Testverbindung eine Wirkung auf die Interaktionen hat. Eine Testverbindung wird als eine Verbindung mit einer Wirkung auf die Interaktionen zwischen den RNA-Molekül(en) und den RNA-Bindeproteinen) identifiziert, wenn die Interaktionen, die in der Kontrolllösung nachgewiesen werden und die Interaktionen, die in der Testlösung nachgewiesen werden, die die Testverbindung enthalten, unterschiedlich sind.
  • Die Testverbindung kann zu der Testlösung zu einem beliebigen Zeitpunkt zugegeben werden, zum Beispiel während der Bildung der Testlösung, vor dem Erhitzungsschritt, vor dem Zusatz des RNA-Bindeproteins oder zusammen mit dem RNA-Bindeprotein. Es ist bevorzugt, dass die Testverbindung entweder mit dem RNA-Molekül oder dem RNA-Bindeprotein vor deren Zusatz zu der Testlösung gemischt werden.
  • Der Assay, der die Kontrolllösung verwendet, kann unabhängig oder zusammen mit den Assays der Testlösungen durchgeführt werden. Bei einer getrennten Durchführung kann der Kontrolllösungs-Assay entweder vor, nach oder gleichzeitig mit den Testlösungs-Assays durchgeführt werden. Es ist bevorzugt, dass der Kontrolllösungs-Assay zusammen und gleichzeitig mit den Testlösungs-Assays durchgeführt wird.
  • Wie hier verwendet, bezeichnet ein Satz von Testlösungen eine oder mehrere Testlösungen, die miteinander verwandt sind, wobei sie die selben RNA-Bindeprotein(e), RNA-Moleküle) und Pufferbestandteile enthalten. Die Testlösungen unterscheiden sich innerhalb eines Satzes von Testlösungen vorzugsweise von der Testverbindung voneinander, die in der Testlösung vorliegt. Es ist vorgesehen und bevorzugt, dass eine einzelne Kontrolllösung oder eine einzelne Form einer Kontrolllösung zum Vergleich von Interaktionen in einem vollständigen Satz von Testlösungen nachgewiesen werden, verwendet werden sollen. Zu diesem Zweck ist es bevorzugt, dass die Kontrolllösung die selben RNA-Bindeprotein(e), RNA-Moleküle) und Pufferbestandteile wie die Testlösungen in dem Satz aufweisen. Mehrere Sätze von Testlösungen und eine Kontrolllösung von jedem Satz kann auch zusammen in einem Assay mit hohem Durchsatz untersucht werden. Zu diesem Zweck ist es bevorzugt, dass entweder eines oder beide der RNA-Bindeproteine) oder der RNA-Moleküle) sich von jedem Satz der Testlösungen unterscheiden. In Assays, bei denen solche multiplen Sätze von Testlösungen eingesetzt werden, ist es bevorzugt, dass jeder Satz von Testlösungen den selben Satz von Testverbindungen verwendet.
  • Bevorzugte Beziehungen zwischen Testlösungen, Sätzen von Testlösungen und Kontrolllösungen, wie oben beschrieben, können anhand der folgenden schematischen Beispiele veranschaulicht werden. In den folgenden Beispielen werden verschiedene RNA-Moleküle oder Sätze von RNA-Molekülen (eine gegebene Lösung kann ein einzelnes RNA-Molekül oder mehrere RNA-Moleküle enthalten) als R1, R2, R3, etc. bezeichnet. Verschiedene RNA-Bindeproteine werden als P1, P2, P3 etc. bezeichnet. Testverbindungen werden als C1, C2, C3 etc. bezeichnet. Pufferbestandteile, als eine Gruppe von Bestandteilen in einer gegebenen Lösung werden als B1, B2, B3 etc. bezeichnet.
  • Drei Sätze von Testlösungen, die als Satz 1, Satz 2 und Satz 3 bezeichnet werden, werden unter Verwendung der folgenden Bestandteile angesetzt:
  • Figure 00230001
  • Für jeden Satz wird eine unterschiedliche Kontrolllösung unter Verwendung der selben Bestandteile angesetzt. Daher ist jeder Satz so entworfen, um die Wirkung der Testverbindungen auf eine unterschiedliche RNA/RNA-Bindeprotein-Interaktion (oder Gruppe von Interaktionen) festzustellen. Eine unterschiedliche Testverbindung kann in jeder Testlösung in jedem Satz wie folgt eingeschlossen sein:
  • Figure 00240001
  • Es wird keine Testverbindung zu den Kontrolllösungen zugegeben. Wie aus diesem Beispiel hervorgeht, wird die selbe Bank von 95 Testverbindungen auf eine Wirkung auf jede der drei RNA/RNA-Bindeprotein-Interaktionen getestet. Es könnten ähnliche Gruppen von Assays unter Verwendung eines unterschiedlichen Satzes von Testverbindungen oder einem teilweise überlappenden Satz von Verbindungen durchgeführt werden. Es kann die gesamte Gruppe von Assays, die oben beschrieben wurden, gleichzeitig und vorzugsweise automatisch durchgeführt werden. Die Anzahl von Assays in einem beliebigen Satz von Test-Assays kann erhöht werden, um so viele Testverbindungen wie erwünscht aufzunehmen. In solchen Fällen ist es natürlich bevorzugt, dass der Satz von Test-Assays in überschaubare Gruppen aufgeteilt wird, beispielsweise basierend auf der Anzahl von Vertiefungen in einem Filterapparat mit mehreren Vertiefungen. Es ist vorgesehen, dass das offenbarte Verfahren unter Verwendung von Vorrichtungen und Apparaten durchgeführt werden kann, die konzipiert sind eine große Anzahl von Test-Assays aufzunehmen.
  • b. Bevorzugte Modi zur Identifizierung von Verbindungen. Es ist bevorzugt, dass Interaktionen auf eine automatisierte Weise, beispielsweise unter Verwendung einer automatisierten Detektion und Vergleich von Interaktionssignalen nachgewiesen werden. In Fällen, in denen die RNA-Moleküle) oder die RNA-Bindeproteine) mit einer detektierbaren Gruppe markiert sind, ist es bevorzugt, dass Interaktionen unter Verwendung einer automatisierten quantitativen detektierbaren Gruppe nachgewiesen werden. Zu diesem Zweck ist es bevorzugt, dass die detektierbare Gruppe einen Bestandteil einschließt, der entweder direkt oder indirekt ein quantifizierbares Signal erzeugt. Bevorzugte Bestandteile dieser Art sind radioaktive Isotope. Reagenzien und Verfahren zur Verwendung und Detektion von radioaktiven Markierungen sind bekannt.
  • Gleichzeitige Gel-Shift-Assays werden vorzugsweise durchgeführt, indem mehrere Bindelösungen einer Elektrophorese in einem einzelnen Gel mit mehreren Bahnen und in mehreren Gelen mit jeweils mehreren Bahnen ausgesetzt werden. Der Nachweis und der Vergleich von mehreren Proben kann beispielsweise durch eine automatisierte Detektion und Lokalisierung von interagierenden Komplexen in den Gel-Bahnen durchgeführt werden.
  • Es ist bevorzugt, dass die Testverbindungen entweder vor, während oder nach der Bildung der Bindelösung entweder mit dem RNA-Molekül oder dem RNA-Bindeprotein vor dem Zusatz der Bindelösung gemischt werden. Zu diesem Zweck ist es bevorzugt, dass die Testverbindung entweder mit dem RNA-Molekül oder dem RNA-Bindeprotein gemischt wird, was abhängig davon ist, welche von diesen Bestandteilen erwünscht sind oder mit welchen die Testverbindung vermutlich interagieren wird. Wenn zum Beispiel Verbindungen, welche die Interaktion einer RNA und eines RNA-Bindeproteins über eine Interaktion mit der RNA beeinflussen, erwünscht sind (oder erwartet werden aufgrund der Art der Testverbindungen), dann sollte die Testverbindung zu der RNA zugegeben werden. Umgekehrt, wenn Verbindungen, welche die Interaktion einer RNA und eines RNA-Bindeproteins über eine Interaktion mit dem RNA-Bindeprotein beeinflussen, erwünscht sind oder erwartet werden, aufgrund der Art der Testverbindung), dann sollte die Testverbindung zu dem RNA-Bindeprotein zugegeben werden. Es ist am meisten bevorzugt, dass die Testverbindung zu der Bindelösung nach dem Erhitzen und Abkühlen und vor dem Zusatz des RNA-Bindeproteins zugegeben wird. Es ist auch bevorzugt, dass in allen Testlösungen in einem gegebenen Satz von Testlösungen die Testverbindung auf die gleiche Weise und bei dem selben Schritt bei allen Assays gemischt wird.
  • c. Identifizierte Verbindungen. Verbindungen, bei denen festgestellt wurde, dass sie eine Wirkung auf die Interaktionen zwischen RNA-Molekülen und RNA-Bindeproteinen besitzen, können verwendet werden, um solche Interaktionen in Zellen zu beeinflussen. In dem Fall, bei dem die Interaktion zwischen einem RNA-Molekül und einem RNA-Bindeprotein die Funktion oder Expression des RNA-Moleküls beeinflusst, wird eine Verbindung mit einer Wirkung auf die Interaktion vermutlich eine Wirkung auf die Funktion oder Expression des RNA-Moleküls besitzen. Es ist daher vorgesehen, dass Verbindungen, bei denen eine Wirkung auf die Interaktion eines RNA-Moleküls und eines RNA-Bindeproteins festgestellt wurde, zur Beeinflussung der Funktion oder Expression des RNA-Moleküls in einer Zelle verwendbar sein werden. Solche Verbindungen können an Zellen auf eine Weise abgegeben werden, die es der Verbindung ermöglicht, die gewünschte Wirkung zu erzielen. Viele solcher Abgabemodi sind auf dem Gebiet bekannt. Eine bevorzugte Form der Abgabe für in vivo-Anwendungen sind Zusammensetzungen, in denen eine identifizierte Verbindung und ein pharmazeutisch annehmbarer Träger kombiniert werden. Zu diesem Zweck kann das offenbarte Verfahren einen Schritt zur Herstellung einer solchen Zusammensetzung einschließen. Für in vitro- und ex vivo-Applikationen kann eine identifizierte Verbindung zu dem Kulturmedium zugegeben werden. Die Verbindung kann auch mit einem beliebigen Abgabesystem oder Zusammensetzung kombiniert werden, die das Einschleusen der Verbindung in die Zelle verstärken kann und/oder die Abgabe der Verbindung an bestimmte Zellen verstärken kann.
  • Geeignete pharmazeutische Vehikel zur Verabreichung an einen Patienten sind für den Fachmann bekannt. Zur parenteralen Verabreichung kann die Verbindung in sterilem Wasser oder Saline gelöst oder suspendiert werden. Zur enteralen Verabreichung kann die Verbindung in einen inerten Träger in Tabletten-, Flüssig- oder Kapselform eingeschlossen werden. Geeignete Träger können Stärke oder Zucker sein und umfassen Gleitmittel, Duftstoffe, Bindemittel und andere Stoffe der selben Art. Die Verbindung kann auch an eine gewünschte Stelle durch eine topische Verabreichung einer Lösung oder einer Creme lokal verabreicht werden.
  • Alternativ kann die Verbindung in bzw. als Teil von Liposomen oder Mikrosphären (oder Mikropartikeln) verabreicht werden. Verfahren zur Herstellung von Liposomen und Mikrosphären zur Verabreichung an einen Patienten sind für den Fachmann bekannt. US-Patent Nr. 4,789,734 beschreibt Verfahren zur Einkapselung von biologischen Materialien in Liposomen. Das Material wird im Wesentlichen in einer wässrigen Lösung gelöst, die entsprechenden Phospholipide und Lipide werden, falls erforderlich, zusammen mit oberflächenaktiven Substanzen zugegeben und das Material wird, wenn notwendig, dialysiert oder sonifiziert. Eine gute Übersicht über bekannte Verfahren ist zu finden in G. Gregoriadis, Kapitel 14 in "Liposomes", Seiten 287–341 (Academic Press, 1979). Mikrosphären, die aus Polymeren oder Proteinen gebildet werden, sind für den Fachmann bekannt und können für eine Passage durch den Magen-Darm-Trakt unmittelbar in den Blutstrom zugeschnitten werden. Alternativ kann die Verbindung eingebaut werden und die Mikrosphären oder die Bestandteile von Mikrosphären können zur langsamen Freisetzung über einen Zeitraum im Bereich von Tagen bis Monaten implantiert werden. Siehe z.B. US-Patent Nr. 4,906,474, 4,925,673 und 3,625,214.
  • Die Kriterien zur Bewertung einer Antwort auf therapeutische Modalitäten, die eine identifizierte Verbindung einsetzen, wird durch den spezifischen Zustand vorgegeben und wird im Allgemeinen den Standardpraktiken in der Medizin folgen. Im Allgemeinen kann die Wirkung einer Verabreichung von einer Verbindung festgestellt werden, indem zumindest bestimmt wird, ob die RNA/RNA-Bindeprotein-Interaktion, bei der bestimmt wurde, dass sie durch die Verbindung beeinflusst wird, tatsächlich in den Zellen, zu denen die Verbindung verabreicht oder abgegeben worden ist, beeinflusst wird. Eine solche Untersuchung kann auch gemacht werden, indem bestimmt wird, ob es eine Wirkung auf ein Surrogat für die Interaktion, wie eine Expression einer RNA, Herstellung eines Proteins oder eines resultierenden physiologischen Effekts gibt. In Fällen, in denen die RNA/RNA-Bindeprotein-Interaktion, die durch das Protein beeinflusst wird, dafür bekannt ist oder in Verdacht steht, die Funktion oder Expression einer mRNA, die in einem Krankheitszustand beteiligt ist, einzubeziehen, kann die Wirksamkeit der Verabreichung der Verbindung festgestellt werden, indem Veränderungen bei den Eigenschaften des Krankheitszustandes gemessen werden.
  • C. Identifizierung von RNA-Molekülen und RNA-Bindemolekülen, die mit spezifischen RNA-Bindeproteinen und RNA-Molekülen interagieren
  • Die Identifizierung von RNA-Molekülen, die mit einem spezifischen RNA-Bindeprotein interagieren, kann durchgeführt werden, indem eine Bindelösung, die ein oder mehrere RNA-Moleküle und Pufferbestandteile, die einen Puffer, ein einwertiges Kation, ein zweiwertiges Kation, ein Reduktionsmittel und ein Dichtemittel umfassen, gebildet wird, das spezifische RNA-Bindeprotein zugegeben wird und die Interaktionen zwischen einem oder mehreren RNA-Molekülen und dem RNA-Bindeprotein nachgewiesen werden. Solche RNA-Moleküle, die interagieren, können durch spezifische Sequenzanalyse identifiziert werden. Auf diese Weise wurden die offenbarten RNA-Bindeprotein-Bindestellen identifiziert. Ein Assay von diesem Typ kann verwendet werden, um alle solche RNA-Moleküle in einer gegebenen Probe zu iden tifizieren, die spezifisch für ein RNA-Bindeprotein von Interesse sind. Die Identifizierung von solchen RNA-Molekülen kann zu der Identifizierung von Genen führen, die für RNA-Moleküle kodieren, die durch die RNA-Bindemoleküle von Interesse reguliert sind.
  • Auf gleiche Weise können RNA-Bindeproteine, die mit einem spezifischen RNA-Molekül interagieren, identifiziert werden, indem eine Bindelösung gebildet wird, die das RNA-Molekül von Interesse und die Puffer-Bestandteile umfasst, ein oder mehrere RNA-Bindeproteine zugegeben werden und die Interaktionen zwischen dem einen oder mehreren RNA-Bindeproteinen und dem RNA-Molekül nachgewiesen werden.
  • D. Identifizierung von Regionen in RNA-Molekülen, die mit RNA-Bindeproteinen interagieren
  • Regionen in RNA-Molekülen, die mit RNA-Bindeproteinen interagieren, können identifiziert werden, indem eine Bindelösung gebildet wird, umfassend (1) ein RNA-Molekül von einer Untergruppe von RNA-Molekülen, die aus sukzessiv kleineren Fragmenten eines größeren RNA-Moleküls bestehen, bei dem zuvor festgestellt wurde, dass es in einer RNA-Proteininteraktion beteiligt ist oder (2) einem RNA-Molekül, das eine oder mehrere Mutationen oder Deletionen in einem zuvor identifizierten RNA-Molekül, das bei einer RNA-Proteininteraktion beteiligt ist, Pufferbestandteile, die einen Puffer, ein einwertiges Kation, ein zweiwertiges Kation, ein Reduktionsmittel und ein Dichtemittel und nicht-spezifische Kompetitoren umfassen, enthalten, ein oder mehrere RNA-Bindeproteine zugegeben werden und die Interaktion zwischen dem RNA-Molekül und den RNA-Bindeproteinen nachgewiesen wird. Durch einen Vergleich, welche RNA-Moleküle mit den Bindeproteinen interagieren und solchen, mit denen sie nicht reagieren, kann die Region des RNA-Moleküls, die bei der Interaktion beteiligt ist, herausgefunden werden. Ein Assay von diesem Typ kann in alle Regionen in einem RNA-Molekül, die bei einer Interaktion mit einem RNA-Bindeprotein beteiligt sind, identifizieren und die spezifischen Nukleotide, die mit dem RNA-Bindeprotein interagieren, identifizieren. Dieser Assay kann mit den offenbarten Sequenzen verwendet werden, um die Bindestellen zu verfeinern oder zu identifizieren.
  • BEISPIELE
  • BEISPIEL 1: Assays, die universelle Bedingungen verwenden.
  • Mehrere Assays zur Detektion von Interaktionen zwischen RNA-Molekülen und RNA-Bindeproteinen wurden durchgeführt durch (1) Bildung einer Bindelösung, die RNA-Moleküle, BTP bei einem pH von 8,5 50 mM KCl, 1 mM MgCL2, 0,2 mM DTT und 10% Glycerol einschließt, (2) Erhitzen der Bindelösung, um die RNA-Moleküle zu denaturieren, (3) Abkühlen der Bindelösung, (4) Zugeben der RNA-Bindeproteine zu der Bindelösung und (5) Nachweis der Interaktionen zwischen den RNA-Molekülen und den RNA-Bindeproteinen. In dem ersten Assay wurden Interaktionen von mehreren RNA-Molekülen (radioaktiv markiert) mit verschiedenen Erkennungsmerkmalen mit SH-SY5Y- oder CHL/260-Proteinextrakt inkubiert. Der SH-SY5Y-Extrakt wurde wie folgt hergestellt. Ungefähr 108 SH-SY5Y-Zellen wurden in Puffer, der 25 mM Tris, pH 7,9, 0,5 mM EDTA, 0,1 mM PMSF, 2 mM NaF und 2 mM NaPPi enthält, durch zwei Gefrier-/Auftau-Zyklen lysiert. Die Extrakte wurden zweimal bei 16000 g für 15 Minuten bei 4°C zentrifugiert, aliquotiert, auf Trockeneis schockgefroren und bei –80°C bis zur Verwendung gelagert. Die RNA-Moleküle wurden ausgewählt, um eine Detektion von Interaktionen in Abhängigkeit von der RNA-Sequenz (AUUUA-RNA), der Sequenz und RNA-Struktur (Histon-RNA) oder RNA-Struktur allein (doppelsträngige RNA) hervorzuheben. AUUUA-RNA hat die Sequenz AUUUAUUUAUUUAUUUAUUUA (SEQ ID NO: 8). Doppelsträngige RNA hat die Sequenz GGAGCGUACGCGAGC UACAGGCUCGCGUACGCUCC (SEQ ID NO: 9). Neben diesen kleinen RNA-Molekülen (kleiner als 30 Nukleotide) wurde die 210 Nukleotid umfassende 5'-nichttranslatierte Region von Glucosetransporter Typ 1 (Glut1) ebenfalls getestet (SEQ ID NO: 7). Der SH-SY5Y-Proteinextrakt wurde mit AUUUA-RNA verwendet und der CHL/260-Proteinextrakt wurde mit den verbleibenden RNA-Molekülen verwendet. Das Gel enthielt mehrere langsam migrierende Banden in jeder Bahn. Dies zeigt, dass die universellen Assay-Bedingungen die Detektion von Interaktionen zwischen RNA-Molekülen und RNA-Bindeproteinen über das Spektrum von Interaktionstypen ermöglicht.
  • Bei einem weiteren Assay wurden die Interaktionen von mehreren RNA-Molekülen, die Ziele für unterschiedliche Bindungsmotive darstellen, mit SH-SY5Y- oder CHL/260-Proteinextrakt oder rekombinanten Rev-Protein inkubiert. Die RNA-Moleküle wurden ausgewählt, um eine Detektion von Interaktionen, bei denen RNA-Bindeproteine beteiligt sind, die doppelsträngige RNA-Bindemotive enthalten (IRE-BF; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5768–5772 (1989)), die RGG-Box (APP-BF; J. Biological Chem. 270: 17292–17298 (1995)), Arg-reiche Motive (RRE-BF; Biochemistry 33: 14579–14585 (1994)) und RNP-Motive (U1-BF; J. Mol. Biol. 180: 947–960 (19984)) hervorzuheben. Der SH-SY5Y-Proteinextrakt wurde in dem APP-BF-Assay verwendet, der CHL/260-Proteinextrakt wurde bei den IRE-BF- und U1-BF-Assays verwendet und das rekombinante Rev-Protein wurde bei dem RRE-BF-Assay verwendet. Das Gel enthielt mehrere langsam migrierende Banden in jeder Spur. Dies zeigt, dass die universellen Assay-Bedingungen eine Detektion von Interaktionen zwischen RNA-Molekülen und RNA-Bindeproteinen über das Spektrum von Interaktionstypen ermöglicht.
  • Bei einem weiteren Assay wurde die Spezifität der nachzuweisenden Interaktion bestätigt. Radioaktiv markierte IRE-RNA wurde in der Gegenwart oder Abwesenheit von K562-Proteinextrakt inkubiert. K562 wurde wie oben beschrieben hergestellt. Um zu testen, ob die nachgewiesenen Interaktionen spezifisch waren oder nicht, wurde IRE auch in einigen der Assays eingeschlossen. Diese RNA kompetitiert mit der markierten IRE-RNA bezüglich der Interaktion mit RNA-bindenden Proteinen. Als eine Kontrolle wurde nicht-markierte Mutanten-IRE (die keine Bindung ermöglicht) in einigen Assays eingeschlossen. Wenn die Interaktion spezifisch ist, sollte diese RNA nicht mit der markierten IRE-RNA bezüglich den RNA-Bindeproteinen kompetitieren. In Gel-Spuren bei Assays, in denen kein Proteinextrakt eingeschlossen war, war kein Mobilitäts-Shift sichtbar, wie erwartet. In Gel-Spuren bei Assays, in denen Proteinextrakt eingeschlossen war, war ein klarer Mobilitäts-Shift sichtbar. In Assays, in denen steigende Konzentrationen (100X, 1000X bzw. 10000X) der nicht-markierten IRE-RNA eingeschlossen waren, kompetitiert die nicht-markierte RNA in effektiver Weise mit der markierten RNA bezüglich der Interaktion mit den RNA-Bindeproteinen bei den Konzentrationen 1000X und 10000X. In Assays, in denen steigenden Konzentrationen (100X, 1000X bzw. 10000X) der Mutanten-IRE-RNA eingeschlossen waren, war die nicht-markierte RNA nicht in der Lage, mit der markierten RNA bezüglich einer Interaktion mit den RNA-Bindeproteinen zu kompetitieren. Dies zeigt klar, dass die kompetitive Wirkung von nicht-markierter IRE-RNA nicht auf nicht-spezifische Interaktionen zwischen den RNA-Molekülen und den RNA-Bindeproteinen zurückzuführen ist.
  • BEISPIEL 2: Screening-Assay mit hohem Durchsatz.
  • Die folgenden Assays veranschaulichen die Modi und die Wirksamkeit des offenbarten Screening-Assays mit hohem Durchsatz. Alle Bindereaktionen wurden in vbödigen Platten mit 96 Vertiefungen bei einem Endvolumen von 10 μ durchgeführt. Die Assays wurden wie unten beschrieben angesetzt und durchgeführt. Insbeson dere wurden die Assays durchgeführt durch (1) Bildung einer Bindungslösung einschließlich RNA-Molekülen, 7,5 mM BTP bei pH 8,5, 10 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0,2 mM DTT und 10% Glycerol, (2) Erhitzen der Bindelösung, um die RNA-Moleküle zu denaturieren, (3) Abkühlen der Bindelösung, (4) Zusetzen der RNA-Bindeproteine zu der Bindelösung, (5) Beladen der Bindelösung auf einen Filter und (6) Nachweis der RNA-Menge, die auf dem Filter zurückbleibt.
  • Die Nitrocellulose-Filterplatte wurde mit Kälberserumalbumin (BSA), Polyvinylpyrrolidon (PVP), polyG, poylI, poylC, poylU oder tRNA als Blockierungsmittel vor dem Beladen der Assay-Lösungen vorbeschichtet. Unabhängig davon, ob die Vertiefung unbehandelt war oder mit einem Blockierungsmittel vorbeschichtet war, betrugen die cpms der freien RNA (das ist die RNA, die auf dem Filter in der Abwesenheit von RNA-Bindeproteinen zurückgeblieben ist und die in radioaktiven Zähler pro Minute (cpm) gemessen wurde) 7 bis 12% der Protein-gebundenen cpms. Dies zeigt, dass eine Blockierung nicht erforderlich oder bevorzugt ist.
  • Kompetitions-Assays
  • Um die Fähigkeit des Filter-Assays zu testen, Veränderungen bei der Bindeaktivität nachzuweisen (d.h. eine verminderte Interaktion zwischen RNA und RNA-Bindeproteinen) wurden Kompetitions-Assays mit IRE-RNA und K562-Proteinextrakt durchgeführt (siehe 1). Die Kompetitionsexperimente wurden durchgeführt, indem steigende Konzentrationen (100 bis 10000X) nicht-markierter Wild-Typ- oder Mutanten-IRE-RNA zu der Bindereaktion zugegeben wurden. 1 veranschaulicht die Ergebnisse. Es wurde eine konzentrationsabhängige Inhibition der Bindung in den Assays beobachtet, in denen die nicht-markierte Wildtyp-RNA zugegeben worden ist, wohingegen keine Kompetition in Assays beobachtet wurde, in denen nicht-markierte Mutanten-RNA zugegeben worden ist.
  • Um den Filter-Assay vollständiger zu testen, wurden Kompetitionen mit U1- und His-RNA ebenfalls durchgeführt. U1-RNA hat die Sequenz AAUCCAUUGCAC UCCGGAUUU (SEQ ID NO: 10; M14587). His-RNA hat die Sequenz AAAAAGGCUCUUUUCAGAGCCACCCA (SEQ ID NO: 11; X57138). Sowohl U1- als auch His-Wildtyp-RNAs zeigten eine konzentrationsabhängige Inhibition der Bindung (siehe 2). Jedoch inhibierten die Mutanten-RNAs auch eine Bindung in einer konzentrationsabhängigen Weise, obgleich bei einer ungefähr 10fach höheren Konzentration. 2 veranschaulicht diese Ergebnisse für die U1-Kompetition. Im Gegensatz zu dem IRE-Assay wurde in diesen Kompetitions-Assays gezeigt, dass die verwendete Mutanten-RNA das RNA-Bindeprotein bindet, obgleich mit einer geringeren Affinität als die Wildtyp-RNA. Diese Ergebnisse der U1- und His-Filter-Assay-Kompetitionen spiegeln die Fähigkeit des Assays wider, sowohl Binde-Interaktionen mit geringer Affinität als auch mit hoher Affinität nachzuweisen.
  • Modulation der Bindeinteraktion durch kleine Moleküle
  • Es wurden Binde-Assays mit Wildtyp-IRE-RNA und K562-Proteinextrakt in der Gegenwart von Eisenquellen oder Eisen-Chelatoren durchgeführt, um die Fähigkeit des Filter-Assays zu bestimmen, die Modulation von Binde-Interaktion durch kleine Moleküle nachzuweisen. Es wurden steigende Konzentrationen der Eisenquellen Hemin (1 bis 100 μM) und FeCl3 (1 μM bis 1 mM) oder des Eisen-Chelators Desferroxiamin (1 μM bis 1 mM) zu den Bindereaktionen zugegeben (siehe 3). Hemin und FeCl3 erzeugten eine konzentrationsabhängige Inhibition der Bindung. Desferroxiamin veränderte nicht die Menge des gebildeten IRE/Proteinkomplexes, vermutlich, weil nicht genug Eisen in dem Zellextrakt vorhanden ist, um eine nachweisbare Veränderung nach dem Zusatz von Desferroxiamin zu erzeugen. Die Reaktionen wurden durch Gel-Shifts analysiert, um die Ergebnisse des Filter-Assays sichtbar zu machen.
  • Screen einer Forschungsbibliothek
  • Eine Forschungsbibliothek von Verbindungen mit 96 Mitgliedern, die CNI-1493 enthielt, einer Verbindung, von der kürzlich gezeigt wurde, dass sie die TNF-α-Produktion post-transkriptionell inhibiert, wurde erzeugt. Die Bibliothek wurde anfangs bei 10 μM gegen 32P-markierter AUUUA-RNA durchmustert. Es wurden mehrere Verfahren zum Einführen der Verbindungen in die Bindereaktion getestet. Anfangs wurden die Verbindungen mit der RNA und dem Protein ko-inkubiert, was die schwächsten Ergebnisse hervorbrachte. Als nächstes wurde eine Präinkubation entweder mit dem Proteinextrakt oder der RNA versucht, was zu verbesserten Ergebnissen führte.
  • Es wurden siebzehn Verbindungen zur weiteren Analyse bei 100 μM, 1 μM und 10 μM unter Verwendung sowohl von AUUUA- als auch IRE-RNAs basierend auf den Ergebnissen von diesen Screening-Arbeiten ausgewählt (Experimente 29–31). Tabelle 1 fasst die Ergebnisse von diesen Verbindungen bei 10 μM zusammen. Die Ergebnisse sind auch grafisch in 4 gezeigt. Die Verbindung C1 war durchgehend der am meisten aktive Inhibitor, was zu einer nahezu 50%igen Reduktion bei den Zählern führte (p = 0,001), während A5 der am meisten aktive Enhancer war, der die Zähler bis zu 38% über den Kontrollen erhöhte ( p< 0,001). Die Verbindung G10, CNI-1493, erzeugte einen wesentlichen Anstieg bei den Zählern in drei der vier Experimente. Die Verbindungen D9 und H2, die als Negativ-Kontrollen von dem anfänglichen Screening ausgewählt worden sind, zeigten durchgehend keine Wirkung in dem Dosis-abhängigen Screen (Experiment 33) und wurden als Vehikel-Kontrollen identifiziert. Wenn die 17 Verbindungen gegen IRE-RNA durchmustert wurden, wurde eine differentielle Wirkung bei der Verbindung A5 beobachtet (siehe 5). Dieser am meisten effiziente Enhancer der AUUUA-Bindung konnte keine Wirkung auf IRE zeigen.
  • Tabelle 1
    Figure 00340001
  • Analysen
  • Die Kompetitionsuntersuchungen wurden unter Verwendung des Filter-Assays durchgeführt, indem nicht-markierte Wildtyp- oder Mutanten-RNA zu der Reaktion bei einer 100- bis 10000-mal höheren Konzentration von 32P-RNA zugegeben wurde, um gegenüber der Proteinbindung der radioaktiv-markierten RNA zu kompetitieren. Es wurde gezeigt, dass der Assay mit hohem Durchsatz für diese Art von Untersuchung unter Verwendung einer Vielzahl von RNA-Molekülen, einschließlich IRE, AUUUA, APP, U1 und His wirksam verwendet werden kann. Unter Verwendung von IRE wurde eine konzentrationsabhängige Inhibition der Bindung durch nichtmarkierte Wildtyp-RNA gezeigt, während keine Wirkung durch nicht-markierte Mutanten-RNA gezeigt worden ist, außer bei der höchsten Konzentration. Diese Ergebnisse wurden durch Gel-Shift-Analysen bestätigt. Weiter kann der offenbarte Assay verwendet werden, um feinere Unterschiede bei der Fähigkeit von verschiedenen RNA-Molekülen zur Bindung von Protein nachzuweisen, wie dies durch die Ergebnisse der U1- und His-Experimente gezeigt worden ist. In diesem Fall weist die Mutanten-RNA eine schwache Bindungsaffinität für das RNA-Bindeprotein auf. Wenn nicht-markierte Mutanten-RNA zu der Bindereaktion zugegeben wird, wird eine leichte konzentrationsabhängige Inhibition nachgewiesen, wobei eine maximale Inhibition von 50 bis 70% auftritt, bei einer 10000-mal höheren 32P-RNA-Konzentration. Auf diese Weise kann die Bindeaffinität von verschiedenen geänderten Formen der Bindestelle eines RNA-Bindeproteins verglichen werden.
  • Es wurde eine Zufallsbibliothek von Verbindungen mit 96 Mitgliedern mit dem offenbarten Assay mit hohem Durchsatz durchmustert. Die Verbindungen wurden anfangs bei 10 μM gegen 32P-markierter AUUUA-RNA durchmustert. Bei einer Verbindung wurde gefunden, dass sie einen signifikanten Anstieg bei den detektierbaren Zählern erzeugt, während bei zwei anderen Verbindungen gefunden wurde, dass sie einen signifikanten Abfall bei den Zählern erzeugen. Siebzehn Verbindungen wurden zur weiteren Analyse bei 100 nM, 1 μM und 10 μM unter Verwendung sowohl von AUUUA- als auch IRE-RNA-Molekülen ausgewählt, um zu bestimmen, ob eine Selektivität der Verbindungen nachgewiesen werden konnte. Wenn die siebzehn Verbindungen gegen IRE-RNA durchmustert wurden, konnte eine differentielle Wirkung mit der verstärkenden Verbindung beobachtet werden. Der am meisten wirksame Enhancer der AUUUA-Bindung zeigte keine Wirkung auf IRE. Gel-Shifts von diesen Verbindungen unter Verwendung von AUUUA-RNA bestätigten die Aktivität der Inhibitoren.
  • BEISPIEL 3: Identifizierung von RNA-Bindeprotein-Bindestellen.
  • Das folgende Beispiel veranschaulicht die Art und Weise zur Identifizierung von vermeintlichen Bindestellen für RNA-Bindeproteine, die in einer Nukleotidsequenz-Datenbank vorliegen und den Nachweis, dass einige identifizierte Nukleotidsequenzen mit RNA-Bindeproteinen interagieren.
  • Die GenBank Nukleotidsequenz-Datenbank wurde auf das Vorliegen der Sequenz von erb-B2 durchsucht. Die menschliche Sequenz mit der Zugangsnummer X03363 enthielt die Sequenz der 3'-UTR mit voller Länge. Die Nukleotidsequenz dieser UTR ist in SEQ ID NO: 5 gezeigt.
  • Es wurde ein Primerpaar entworfen, bei dem ein Sinn-Primer verwendet wurde, der bei Nukleotid 4203 begann und einen Antisinn-Primer, der bei Nukleotid 4473 begann. Zusätzlich enthielt der Sinnprimer 24 Nukleotide, die für den T7-Promotor am 5'-Ende kodieren. Klone, welche die oben genannten Sequenzen enthalten, wurden durch RT-PCR von Gesamt-RNA, die von der K562-Lymphoplastom-Zelllinie erhalten wurde, erzeugt. Die Klone wurden einer Restriktionskartierung unterzogen und durch Gel-Elektrophorese analysiert, um deren Identität zu bestimmen.
  • PCR-Produkte, die eine einzelne Bande erzeugten (in den nicht-verdauten Spuren), wurden dann für eine in vitro-Transkription von markierter RNA unter Verwendung des Promega RiboProbe-Kit verwendet. Die markierten Transkripte wurden in dem RNA-Bindeprotein-Detektions-Assay wie oben beschrieben verwendet. Die Bindelösungen, welche die markierte RNA enthielten, wurden mit 0,5 μg Protein, das aus der selben Zelle isoliert worden ist, aus der das RT-PCR-Produkt erzeugt wurde, inkubiert und die Produkte wurden auf einem nicht-denaturierenden Gel aufgelöst. Markierte UTRs, die eine Bindeaktivität zeigen, wurden dann in einem zweiten Experiment verwendet, in dem ein 10-, ein 100- und 1000-facher molarer Überschuss von nicht-markierter identischer RNA oder der selbe Überschuss von unterschiedlicher RNA zu den Bindereaktionen zugegeben wurde. Es wurde eine konzentrationsabhängige Inhibition der Komplexbildung mit einem spezifischen Kompetitor beobachtet, während keine Kompetition beobachtet wurde, wenn die Mutanten-RNA in Überschuss zugegeben worden ist.
  • Der Fachmann wird viele Äquivalente zu den spezifischen Ausführungsformen der hier beschriebenen Erfindung erkennen und feststellen, wobei hierzu nicht mehr als Routineexperimente notwendig sind. Solche Äquivalente sollen von den folgen den Patentansprüchen umfasst sein.
  • SEQUENZ-PROTOKOLL
    Figure 00380001
  • Figure 00390001
  • Figure 00400001
  • Figure 00410001
  • Figure 00420001

Claims (3)

  1. Verfahren zur Verwendung einer Nukieinsäuresequenz zum Identifizieren von Verbindungen, die eine Wirkung auf die Interaktionen zwischen einem RNA-bindenden Protein und einem die Nukleinsäuresequenz umfassendes RNA-Molekül hat, durch: Nachweis von Interaktionen zwischen dem RNA-bindenden Protein und dem RNA-Molekül in der Gegenwart einer Testverbindung und in der Abwesenheit der Testverbindung, wobei die Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 5 ist.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verfahren umfasst: (a) Herstellen einer oder mehrerer Testlösungen, wobei jede Testlösung das RNA-Molekül und Pufferbestandteile umfasst, wobei die Pufferbestandteile einen Puffer, ein monovalentes Kation, ein divalentes Kation, ein reduzierendes Agenz und ein Dichteagenz umfasst, (b) Erhitzen der Testlösungen für eine Zeit und auf eine Temperatur die ausreichend sind, um das RNA-Molekül zu denaturieren, (c) Abkühlen der Testlösungen, (d) Hinzufügen des RNA-bindenden Proteins zu den Testlösungen, (e) Nachweis der Interaktionen zwischen dem RNA-Molekül und dem RNA-bindenden Protein in den Testlösungen, wobei eine der Testverbindungen zu jeder Testlösung während oder nach einem der Schritte (a) bis (d) zugeführt wird, wobei das Verfahren weiter vorher, gleichzeitig oder danach die Schritte (a) bis (e) umfasst, (f) Herstellen einer Kontrolllösung, umfassend das RNA-Molekül und die Pufferbestandteilee, wobei die Kontrolllösung keine der Testverbindungen enthält, (g) Erhitzen der Kontrolllösung für eine Zeit und auf eine Temperatur die ausreichend sind, um das RNA-Molekül zu denaturieren, (h) Abkühlen der Kontrolllösung, (i) Hinzufügen des RNA-bindenden Proteins zu der Kontrolllösung und (j) Nachweisen der Interaktionen zwischen dem RNA-bindenden Protein und dem RNA-Molekül in der Kontrolllösung, wobei eine Testverbindung eine Verbindung darstellt, welche eine Wirkung auf die Interaktionen zwischen dem RNA-Molekül und dem RNA-bindenden Protein hat, wenn sich die Interaktionen, die in der Kontrolllösung nachgewiesen werden und die Interaktionen, die in der Testlösung, welche die Testverbindung enthält, nachgewiesen werden, sich voneinander unterscheiden.
  3. Nukleinsäuremolekül, wobei das Nukleinsäuremolekül aus der Nikleotidsequenz SEQ ID NO: 5 besteht.
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