ES2239481T3 - Procedimiento para la identificacion de compuestos que afectan a las interacciones arn/proteinas de union de arn. - Google Patents
Procedimiento para la identificacion de compuestos que afectan a las interacciones arn/proteinas de union de arn.Info
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Abstract
Procedimiento de utilización de una secuencia de ácido nucleico para la identificación de compuestos que ejercen un efecto sobre las interacciones entre una proteína de unión de ARN y una molécula de ARN que comprende la secuencia de ácido nucleico mediante: la detección de las interacciones entre la proteína de unión de ARN y la molécula de ARN en presencia de un compuesto de ensayo y en ausencia del compuesto de ensayo, en el que la secuencia de nucleótidos es la SEC. ID. nº: 5.
Description
Procedimiento para la identificación de
compuestos que afectan a las interacciones ARN/proteínas de unión
de ARN.
La invención se refiere al campo de los análisis
de detección para la identificación de compuestos que pueden
afectar a la expresión génica y especialmente para la identificación
de compuestos que afectan a las interacciones entre el ARN y las
proteínas de unión de ARN.
La regulación de la expresión de las proteínas
puede tener lugar a diferentes niveles: de transcripción, tras la
transcripción o tras la traducción. La modulación de la expresión
proteica con frecuencia es crítica para el tratamiento de
enfermedades. Un trabajo reciente en la modulación de las
concentraciones de proteína alterando la actividad de la
transcripción ha producido programas de investigación preclínica
que están demostrados y acuerdos de autorización que están
introducidos en ellos. Por ejemplo, Ligand Pharmaceuticals, Inc.
(San Diego, CA) se ha introducido en múltiples programas de
descubrimiento de fármacos con grandes compañías farmacéuticas
basados en sus traductores de señal y activadores de tecnología de
transcripción para su utilización como terapias
anti-inflamatorias, anti-cancerosas
y de sustitución de hormonas. Además, Oncogene Science, Inc.
(Uniondale, NY) está utilizando sus tecnologías de transcripción
génica comerciales para desarrollar productos biofarmacéuticos para
el tratamiento del cáncer. Otras compañías, tales como Signal
Pharmaceuticals, Inc. (San Diego, CA) y Tularik, Inc. (San
Fracisco, CA) están desarrollando pequeñas moléculas que regulan
los factores de transcripción. Aunque este planteamiento es
prometedor, todavía no se ha sometido ningún compuesto a pruebas
clínicas. La falta de especificidad de los factores de
transcripción y el requisito para la localización nuclear son dos
asuntos de esta tecnología. En el primer caso, un fármaco que
afecta a la unión de un factor de transcripción puede afectar a la
transcripción de muchos genes aparte del gen diana. En el segundo
caso, es difícil diseñar un fármaco que posea la interacción propia
con un factor de transcripción dirigido y se transporte al núcleo
donde ejerza su efecto. La inhibición de la expresión de la
proteína mediante reconocimiento del ARN es un planteamiento
alternativo que implica la tecnología de la cadena complementaria.
La tecnología de la cadena complementaria ha generado también mucho
interés con varios productos en pruebas clínicas (ISIS2105,
ISIS2922 e ISIS2302). Sin embargo, los principales inconvenientes
con este planteamiento son el costo de los oligonucleótidos, la
capacidad para administrar los oligonucleótidos a las células y su
incapacidad para aumentar las concentraciones de proteínas.
Un área principal de regulación tras la
transcripción en las células eucarióticas implica la interacción
específica de las proteínas con el ARN. Estas proteínas de unión de
ARN (RBP) parece que median en el tratamiento de los
pre-ARNm, el transporte de ARNm desde las moléculas
al citoplasma, la estabilización del ARNm, la eficacia de la
transcripción del ARNm y el secuenciado de algunos ARNm. Estudios
recientes han identificado varios motivos de unión al ARN en
diversas RBP. Los motivos de la proteína de unión de ARN más
frecuentes son el motivo de RNP, el motivo rico en Arg, la caja de
RGG, el motivo de KH y el motivo de unión de ARN de doble cadena
(para su estudio véase Burd y Dreyfuss, Science
265:615-621 (1994)). Estos motivos reconocen los
elementos del ARN que dependen tanto de la secuencia como de la
estructura. En el caso del motivo de unión al ARN de doble cadena,
el reconocimiento de la secuencia no es importante. Sin embargo,
además de la estructura de doble cadena, un efecto de posición para
el ARN de doble cadena puede desempeñar una función en el
reconocimiento (Bass, Nucleic Acids Symposium
33:13-15 (1995)) y alguna de estas proteínas puede
también necesitar la unión al Z-ADN antes de su
actividad en el ARN de doble cadena (Herbert et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
92:7550-7554)(1995). Además, otras proteínas de
unión de ARN, tal como AUBF (Malter, Science
246:664-666 (1989)) se unen asimismo de manera
independiente de la estructura.
Debido a la importancia evidente de las
interacciones entre ARN y RBP en la regulación de la expresión
génica, estas interacciones serían una diana atractiva para los
fármacos que las afectan en la modulación de las concentraciones de
proteína en estados patológicos. Para explotar completamente estas
interacciones como dianas terapéuticas, sin embargo, se necesita
una comprensión clara de cómo estas interacciones afectan la
expresión, cuyas RBP están implicadas en la regulación de los ARN de
interés, y la capacidad para estudiar los efectos de modulación de
potenciales fármacos en las interacciones entre ARN y RBP. Para
explotar completamente dichas interacciones se necesita también la
identificación de los puntos de unión para las RBP en las moléculas
de ARN de interés.
Los intentos previos para identificar los puntos
de unión para las RBP en las moléculas de ARN de interés se
describen en los documentos nº WO 98/37422 y nº WO 98/04923. El
documento WO 98/37422 describe procedimientos para la identificación
de posibles puntos de unión para las proteínas de unión de ARN
utilizando la zona en 5' no traducida (UTR) del ARNm transportador
de glucosa de la rata (Glut1), la UTR en 5' de la
3-hidroxi-3-metil-glutaril
CoA reductasa humana (HMG CoA Red), la UTR en 5' de la cadena alfa
de la proteína que se une al C4b humano y la UTR en 5' del CD45
humano. En particular, el documento WO 98/37422 describe una
interacción entre la molécula de ácido nucleico de CD45 y la
proteína que se une a C4b.
El documento WO 98/04923 describe procedimientos
para la identificación de compuestos que modulan las interacciones
ARN/RBP, tales como entre un factor alfa de necrosis tumoral
(TNF-\alpha) UTR en 3' y una proteína de unión de
ARN.
Muchos investigadores han utilizado análisis de
desplazamiento por movilidad para detectar las interacciones entre
el ARN y la proteína. Sin embargo, las condiciones creadas en un
laboratorio a menudo fracasan para detectar las interacciones de
diferentes moléculas. Además, la diversidad de estructuras de ARN y
los motivos de unión en la proteína han conducido a numerosos
investigadores a concluir que un solo conjunto de condiciones sería
imposible para definir la detección de múltiples interacciones
diferentes. Identificando más genes que son regulados tras la
transcripción, un conjunto universal de condiciones para la unión
permitiría la detección y caracterización de las moléculas
implicadas en estas interacciones y finalmente proporcionaría
dianas para las cuales se podrían desarrollar productos
terapéuticos. Dichas condiciones de análisis universal han sido
descritas en la solicitud PCT WO 98/04923.
Por consiguiente, un objetivo de la invención
consiste en proporcionar un análisis para la identificación de
compuestos que afectan a la interacción de los puntos de unión de
las proteínas de unión de ARN.
Un objetivo adicional de la invención consiste en
proporcionar secuencias de ácido nucleico que interactúan con las
proteínas de unión de ARN.
Se da a conocer la utilización de moléculas de
ARN que contienen la UTR en 3' de erb-B2 (SEC. ID
nº: 5) en análisis para identificar los compuestos que afectan a la
interacción del ARN que contiene la secuencia del ácido
nucleico.
Asimismo se da a conocer un análisis para la
identificación de los compuestos que afectan a la interacción de
una molécula de ARN que contiene la UTR en 3' de
erb-B2 (SEC. ID nº: 5) y las proteínas de unión de
ARN. El análisis implica la detección de las interacciones entre
las proteínas de unión de ARN y la molécula de ARN en presencia de
un compuesto de ensayo y en ausencia del compuesto de ensayo. Una
diferencia en la interacción detectada en presencia y ausencia del
compuesto de ensayo indica que el compuesto afecta a la
interacción. El análisis se puede realizar, por ejemplo, formando
una solución de ensayo y una solución de referencia que cada una
incluye una molécula de ARN que contiene la UTR en 3' de
erb-B2 (SEC. ID nº: 5), calentando la solución de
ensayo y la solución de referencia para desnaturalizar la molécula
de ARN, enfriando la solución de ensayo y la solución de
referencia, añadiendo un compuesto de ensayo a la solución de
ensayo, añadiendo una proteína de unión de ARN a la solución de
ensayo y a la solución de referencia y detectando las interacciones
entre la molécula de ARN y la proteína de unión de ARN en la
solución de ensayo y en la solución de referencia. Se identifica un
compuesto de ensayo como un compuesto que ejerce un efecto sobre
las interacciones entre la molécula de ARN y la proteína de unión de
ARN si difieren las interacciones detectadas en la solución de
referencia y las interacciones detectadas en la solución de ensayo
que contiene el compuesto de ensayo.
Los compuestos identificados se pueden utilizar
para afectar la interacción del ARN, que se une a proteínas con
ARNm que contienen la UTR en 3' de erb-B2 (SEC. ID
nº: 5). Esto puede alterar la expresión del ARNm ya que un área
mayor de regulación de la expresión génica implica el efecto
regulador de las proteínas de unión de ARN que interactúan con las
moléculas de ARN. Las interacciones entre las moléculas de ARN y
las proteínas de unión de ARN se conocen porque están implicadas en
la estabilización y eficacia de la traducción del ARN. La
localización del ARN, la transcripción del ARN, la edición del ARN
y el corte y empalme del ARN y los compuestos identificados se
pueden utilizar para afectar a estos procesos.
La Figura 1 es un gráfico de la cantidad de ARN
marcado por radioactividad (en recuentos por minuto) retenida en un
filtro tras la carga de varias soluciones de enlace. Todas las
soluciones de enlace contenían ARN de APP marcado por radioactividad
solo o incluyendo varios otros componentes. T1 indica que la
solución de enlace se trató con T1 de ARNasa antes de la carga. Las
dos primeras columnas representan las soluciones de enlace sin
proteína de unión de ARN. Las columnas restantes representan la
solución de enlace que contiene la proteína de unión de ARN. WT
indica que la solución de enlace incluía la cantidad indicada de ARN
natural no marcado como competidor. MUT indica que la solución de
enlace incluía la cantidad indicada de ARN mutante no marcado como
competidor.
La Figura 2 es un gráfico de la cantidad de ARN
marcado por radioactividad retenida en un filtro (expresada en
porcentaje de la cantidad de ARN retenida en un filtro en una
solución de enlace de referencia) tras la carga de varias
soluciones de enlace. Todas las soluciones de enlace contenían ARN
de U1 marcado por radioactividad solo o incluyendo varios otros
componentes. Las dos primeras columnas representan las soluciones de
enlace sin proteína de unión de ARN. Las columnas restantes
representan la solución de enlace que contiene la proteína de unión
de ARN (extracto de K562). WT indica que la solución de enlace
incluía la cantidad indicada de ARN natural no marcado como
competidor. MUT indica que la solución de enlace incluía la cantidad
indicada de ARN mutante no marcado como competidor. En este caso, el
mutante U1 interactúa con menos afinidad que lo hace con la
secuencia natural.
La Figura 3 es un gráfico de la cantidad de ARN
marcado por radioactividad retenida en un filtro (expresada en
porcentaje de la cantidad de ARN retenida en un filtro en una
solución de enlace de referencia) tras la carga de varias
soluciones de enlace. Todas las soluciones de enlace contenían ARN
de IRE marcado por radioactividad solo o incluyendo varios otros
componentes. La primera columna representa una solución de enlace
sin proteína de unión de ARN. Las columnas restantes representan la
solución de enlace que contiene la proteína de unión de ARN
(extracto de K562). Hemin indica que la solución de enlace incluía
la cantidad indicada de hemin como compuesto de ensayo. Des indica
que la solución de enlace incluía la cantidad indicada de
desferroxiamina como compuesto de ensayo.
La Figura 4 es un gráfico de la cantidad de ARN
marcado por radioactividad retenida en un filtro (expresada en
porcentaje de la cantidad de ARN retenida en un filtro en una
solución de enlace de referencia) tras la carga de varias
soluciones de enlace. Todas las soluciones de enlace contenían ARN
con AUUUA marcado por radioactividad solo o incluyendo otros varios
componentes. La primera columna representa una solución de enlace
que contiene proteína de unión de ARN. Las columnas restantes
representan la solución de enlace que contiene la proteína de unión
de ARN (extracto de K562). Las columnas 3 a 8 corresponden a las
soluciones de enlace incluyendo el compuesto de ensayo indicado.
La Figura 5 es un gráfico de la cantidad de ARN
marcado por radioactividad retenida en un filtro (expresada en
porcentaje de la cantidad de ARN retenida en un filtro en una
solución de enlace de referencia) tras la carga de varias
soluciones de enlace. Las columnas alternas corresponden a las
soluciones de enlace que contienen ARN con AUUUA marcado por
radioactividad o ARN de IRE solo o incluyendo otros varios
componentes. Las dos primeras columnas representan las soluciones de
enlace sin proteína de unión de ARN. Las columnas restantes
representan la solución de enlace que contiene la proteína de unión
de ARN (extracto de K562). Las columnas 5 a 40 corresponden a las
soluciones de enlace incluyendo el compuesto de ensayo indicado.
Se da a conocer la utilización de moléculas de
ARN que contienen la UTR en 3' de erb-B2 (SEC. ID
nº: 5) que, cuando está presente en una molécula de ARN, se une a
las proteínas de unión de ARN. Las moléculas de ARN se pueden
utilizar en análisis para identificar los compuestos que afectan a
la interacción del ARN que contiene la secuencia del ácido nucleico
y las proteínas de unión de ARN.
Asimismo se da a conocer un análisis para la
identificación de los compuestos que afectan a la interacción del
ARN que contiene la UTR en 3' de erb-B2 (SEC. ID
nº: 5) y las proteínas de unión de ARN. El análisis implica la
detección de las interacciones entre las proteínas de unión de ARN
y la molécula de ARN que contiene la UTR en 3' de
erb-B2 en presencia de un compuesto de ensayo y en
ausencia del compuesto de ensayo. Una diferencia en la interacción
detectada en presencia y ausencia del compuesto de ensayo indica
que el compuesto afecta a la interacción. El análisis se puede
realizar, por ejemplo, formando una solución de ensayo y una
solución de referencia que cada una incluye una molécula de ARN que
contiene la UTR en 3' de erb-B2 (SEC. ID nº: 5),
calentando la solución de ensayo y la solución de referencia para
desnaturalizar la molécula de ARN, enfriando la solución de ensayo
y la solución de referencia, añadiendo un compuesto de ensayo a la
solución de ensayo, añadiendo una proteína de unión de ARN a la
solución de ensayo y a la solución de referencia y detectando las
interacciones entre la molécula de ARN y la proteína de unión de ARN
en la solución de ensayo y en la solución de referencia. Se
identifica un compuesto de ensayo como un compuesto que ejerce un
efecto sobre las interacciones entre la molécula de ARN y la
proteína de unión de ARN si difieren las interacciones detectadas
en la solución de referencia y las interacciones detectadas en la
solución de ensayo que contiene el compuesto de ensayo.
Los compuestos identificados se pueden utilizar
para afectar la interacción del ARN, que se une a proteínas con
ARNm que contienen la UTR en 3' de erb-B2 (SEC. ID
nº: 5). Esto puede alterar la expresión del ARNm ya que un área
mayor de regulación de la expresión génica implica el efecto
regulador de las proteínas de unión de ARN que interactúan con las
moléculas de ARN. Las interacciones entre las moléculas de ARN y
las proteínas de unión de ARN son conocidas porque están implicadas
en los siguientes procesos, cuya modulación posee el efecto
enumerado en las proteínas codificadas.
Estabilización del ARN - concentración de las
proteínas.
Desestabilización del ARN - concentración de las
proteínas.
Eficacia de la traducción - concentración de las
proteínas.
Localización del ARN - concentración/función de
las proteínas.
Transcripción del ARN - concentración de las
proteínas (víricas).
Edición del ARN - función de las proteínas.
Corte y empalme de ARN- función de las
proteínas.
Las proteínas de unión de ARN para su utilización
en el método expuesto pueden formar parte de un extracto celular o
nuclear en bruto, parcialmente purificado o extensamente
purificado. Las proteínas de unión de ARN se pueden utilizar para
el aislamiento o la combinación con una u otras más proteínas de
unión de ARN. Las proteínas de unión de ARN se pueden preparar
utilizando procedimientos conocidos para la preparación de
extractos celulares y para la purificación de proteínas. Los
procedimientos para la preparación de extractos que contienen
proteínas de unión de ARN y para la purificación de conocidas
proteínas de unión de ARN están descritos, por ejemplo, en Ashley
et al., Science 262:563-566 (1993),
Rouault et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
86:5768-5772 (1989), Neupert et al.,
Nucleic Acids Research 18:51-55 (1990),
Zhang et al., Molecular and Cellular Biology
13:7652-7665 (1993) y referencias citadas en Burd y
Dreyfuss, Science 265:615-621 (1994). Las
proteínas individuales de unión de ARN se pueden producir de forma
recombinante utilizando técnicas conocidas. Las proteínas de unión
de ARN que codifican el ADN se pueden obtener a partir de clones
conocidos, sintetizando una molécula de ADN que codifica una
proteína de unión de ARN con una secuencia de aminoácidos conocida
o ciclando el gen que codifica la proteína de unión de ARN. Las
técnicas para la expresión recombinante de las proteínas y los
procedimientos para la clonación de los genes que codifican
conocidas proteínas están descritas, por ejemplo, por Sambrook
et al., Molecular Cloning (Cold Spring Harbor
Laboratory, 1989).
La detección de las interacciones entre las
proteínas de unión de ARN y las moléculas de ARN se puede facilitar
adjuntando un marcador detectable a la proteína de unión de ARN.
Generalmente, se pueden utilizar marcadores conocidos que son
útiles para las proteínas para marcar proteínas de unión de ARN. Los
marcadores preferidos para las proteínas de unión de ARN son 125I,
3H y 35S. Cuando la proteína de unión de ARN se prepara de forma
recombinante, se puede marcar por incorporación de aminoácidos
marcados. Las técnicas para el marcado y la detección de proteínas
marcadas son bien conocidas y están descritas, por ejemplo, en
Sambrook et al., y Ausubel et al., Current
Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc.,
1996). La detección de las proteínas de unión de ARN se puede
también realizar con anticuerpos específicos para la proteína de
unión de ARN. La producción y utilización de anticuerpos con este
fin es bien conocida y se describe, por ejemplo, en Johnstone y
Thorpe, Immunochemistry in Practice (Blackwell Scientific
Publications, 1987).
Las moléculas de ARN que contienen una de las
secuencias expuestas se pueden producir de forma recombinante
utilizando técnicas conocidas, por transcripción in vitro y
por síntesis directa. Para la transcripción recombinante e in
vitro, el ADN que codifica las moléculas de ARN se puede
obtener a partir de clones conocidos, sintetizando una molécula de
ADN que codifica una molécula de ARN o clonando el gen que modifica
la molécula de ARN. Las técnicas para la transcripción in
vitro de las moléculas de ARN y los procedimientos para la
clonación de los genes que codifican moléculas conocidas de ARN
están descritos, por ejemplo, por Sambrook et al.
La detección de las interacciones entre el ARN
que se une a las proteínas y las moléculas de ARN se puede
facilitar adjuntando un marcador detectable a la molécula de ARN.
Generalmente los marcadores conocidos que son útiles para los ácidos
nucleicos se pueden utilizar para marcar moléculas de ARN. Ejemplos
de marcadores adecuados comprenden los isótopos radioactivos tales
como ^{33}P, ^{32}P y ^{35}S, marcadores fluorescentes tales
como fluoresceína (FITC), 5,6-carboximetil
fluoresceína, rojo de Texas,
nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-ilo
(NBD), cumarina, cloruro de dansilo, rodamina,
4'-6-diamino-2-fenilinodol
(DAPI) y los colorantes de cianina Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5,5 y Cy7 y
biotina.
Los nucleótidos marcados son la forma preferida
de marcador ya que se pueden incorporar directamente en las
moléculas de ARN durante la síntesis. Ejemplos de marcadores de
detección que se pueden incorporar en el ARN amplificado incluyen
los análogos de nucleótido tal como BrdUrd (Hoy y Schimke,
Mutation Research 290:217-230 (1993)), BrUTP
(Wansick et al., J. Cell Biology
122:283-293 (1993)) y nucleótidos modificados con
biotina (Langer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
78:6633 (1981)) o con haptenos tal como digoxigenina (Kerkhof,
Anal. Biochem. 205:359-364 (1992)). Los
nucleótidos marcados por fluorescencia adecuados son isocianato de
fluoresceína-UTP,
cianina-3-dUTP y
cianina-5-dUTP (Yu et al.,
Nucleic Acids Res. 22:3226-3232 (1994)). Un
marcador análogo de nucleótido preferido para las moléculas de ARN
es el 5'-trifosfato de
biotina-14-citidina. Fluoresceína,
Cy3 y Cy5 pueden estar unidos a dUTP para el marcado directo.
Cy3.5 y Cy7 están disponibles como conjugados de avidina o
anti-digoxigenina para la detección secundaria de
sondas marcadas con biotina o digoxigenina.
Los marcadores que se incorporan en las moléculas
de ARN, tal como biotina, se pueden detectar posteriormente
utilizando procedimientos sensibles bien conocidos en la técnica.
Por ejemplo, se puede detectar la biotina utilizando el conjugado de
estreptavidina y fosfatasa alcalina (Tropix, Inc.), que se une a la
biotina y se detecta posteriormente por quimioluminiscencia de los
sustratos adecuados (por ejemplo, sustrato quimioluminiscente CSPD:
3-(4-metoxiespiro-[1,2-dioxetano-3-2'-(5'-cloro)triciclo[3.3.1.13.7]decano]-4-
il) fenil fosfato disódico: Tropix, Inc.).
Los segmentos de ácido nucleico identificados
porque poseen puntos de unión de la proteína de unión de ARN se
pueden utilizar para varios fines. Una molécula de ARN que incluye
la secuencia de nucleótidos del segmento de ácido nucleico
identificado se puede utilizar en un análisis para identificar
compuestos que modulan la interacción de la molécula de ARN y del
ARN que se une a las proteínas. El segmento identificado se puede
incorporar también en una creación recombinante de modo que la
expresión de la creación esté controlada por el segmento del ácido
nucleico. Por ejemplo, una zona no traducida de una ARNm
identificado por interactuar con un ARN que se une a la proteína se
puede utilizar como toda o parte de la zona no traducida de un ARN
heterólogo. Es de esperar que dichas moléculas de ARN recombinante
interactúen con el ARN análogo que se une a la proteína de la zona
heteróloga no traducida y la expresión del ARN estará afectada por
esta interacción. Esto es análogo a los activadores recombinantes
con zonas de codificación heterólogas para alterar o controlar la
expresión de la zona de codificación. Es preferible que las
creaciones recombinantes que incluyen los puntos de unión de la
proteína de unión de ARN estén incluidas en los vectores de
expresión de modo que un pueda producirse transcrito de ARN
recombinante que incluya el punto de unión a la RBP y las
secuencias heterólogas. Se dice que un punto de unión a la RBP
identificado está operativamente unido a las secuencias heterólogas
cuando en una molécula de ARN que comprende tanto el punto de unión
como las secuencias heterólogas, o en una creación en la que se
puede preparar un transcrito de ARN que incluya tanto el punto de
unión como las secuencias heterólogas. Tal como se utiliza en la
presente memoria, secuencias heterólogas son las secuencias de
nucleótidos que no están asociadas de forma natural en la misma
molécula de nucleótido con una secuencia de referencia tal como un
punto de unión a la RBP.
Se ha identificado y confirmado un ARN que se une
al punto de unión de la proteína utilizando procedimientos descritos
en la presente memoria. Este segmento se identificó inicialmente
como parte de un gen biológicamente importante en el ADN. Se
identificaron en las bases de datos las UTR en 5' y 3' de las
secuencias del gen y se amplificaron a partir del ADN celular por
PCR. Dichas secuencias podrían también haber sido clonadas
utilizando clonación por PCR o clonación por hibridación
tradicional de un banco. Una vez clonada, se coloca la UTR bajo el
control de un activador para la transcripción in vitro, tal
como un activador SP6 o T7 y ARN producido marcado por
radioactividad. El ARN se mezcla a continuación con un extracto de
proteína de las células apropiadas o con una línea celular
apropiada y se evalúa el enlace utilizando los procedimientos
expuestos. La especificidad del enlace se determina realizando el
análisis en presencia y ausencia de ARN no marcado idéntico al ARN
del ensayo (ARN de competencia específica) y en presencia de ARN no
marcado diferente del ARN del ensayo (ARN de competencia no
específica). Una vez se ha identificado un punto de unión
específica en una UTR, se obtiene una localización más precisa del
punto de unión por cartografía de restricción normalizada y el
re-análisis del ARN transcrito a partir de
fragmentos de la UTR.
Un segmento identificado (SEC. ID nº: 5) es la
UTR en 3' del ARNm de erb-B2. El segmento
identificado es una parte del número de registro X03363 del
GenBank.
Los extractos de proteína para su utilización en
el procedimiento expuesto se pueden preparar generalmente de la
forma siguiente. Se pueden lisar aproximadamente 108 células en
tampón que contiene Tris 25 mM, pH 7,9, EDTA 0,5 mM, PMSF 0,1 mM,
NaF 2 mM, y NaPPi 2 mM mediante dos ciclos de
congelación/descongelación. Se centrifugan a continuación los
extractos dos veces a 16.000 \times g durante 15 minutos a 4ºC,
se dividen en alícuotas, se congelan rápidamente en nieve carbónica
y se almacenan a -80ºC hasta su utilización. Para
erb-B2 (SEC. ID nº: 5), se utilizó extracto de
proteína K652 como extracto celular representativo para demostrar la
presencia de un punto regulador específico.
Una forma de un punto de unión de RBP
identificado es una molécula de ácido nucleico que consiste en una
molécula de ARN o que se puede transcribir en una molécula de ARN,
donde la molécula de ARN no contiene una secuencia de nucleótidos
que codifican una proteína en la que el punto de unión a RBP está
unido de forma natural (esto es, unido en la naturaleza). Es decir,
en dichas moléculas de ácido nucleico, el punto de unión a la RBP
identificado se ha separado de la secuencia que codifica la
proteína a la que está unida normalmente.
Tal como se utiliza en la presente memoria, una
molécula de ácido nucleico o un segmento de ácido nucleico referido
al que posee una secuencia de ácido nucleico significa una molécula
o segmento de ácido nucleico que posee la secuencia de bases de
nucleótido referida en cualquiera de sus formas correspondientes.
Por ejemplo, en el caso de la secuencia de nucleótidos del ARN (tal
como la SEC. ID nº: 5), se pretende específicamente, a menos que se
indique de otra manera, que las moléculas o segmentos de nucleótido
referidas por poseer dicha secuencia de nucleótidos del ARN
comprenden, por ejemplo, moléculas o segmentos de nucleótido que
poseen la correspondiente secuencia de nucleótidos del ADN (en la
que T está sustituida por U). Asimismo, en el caso de una secuencia
de nucleótidos de ADN, se desea específicamente, a menos que se
indique de otra manera, que las moléculas o segmentos de nucleótidos
referidos por poseer dicha secuencia de nucleótidos del ADN
incluyen, por ejemplo, moléculas o segmentos de nucleótido que
poseen la correspondiente secuencia de nucleótidos del ARN (en la
que U está sustituida por T).
Las secuencias de ácidos nucleicos dadas a
conocer se pueden incorporar en el ARN por clonación o síntesis
directa y el ARN se puede utilizar a continuación en un análisis
de detección para identificar los compuestos que modulan la
interacción de las proteínas de unión de ARN con las moléculas de
ARN. Se puede probar en los compuestos identificados un efecto
sobre la expresión de una molécula de ARN correspondiente en una
célula. Es preferible que está identificación del punto de unión
esté dirigida específicamente a una búsqueda de las secuencias de
ácido nucleico de los genes conocida o sospechosa de estar
implicada en estados patológicos.
Las interacciones entre el ARN que contiene la
UTR en 3' de erb-B2 (SEC. ID nº: 5) y las proteínas
de unión de ARN se pueden detectar utilizando cualquier análisis
adecuado. Es preferible que las condiciones que permiten la
detección de interacciones entre las proteínas de unión de ARN y el
ARN en general. El procedimiento expuesto se facilita mediante la
utilización de un solo conjunto de condiciones que permiten la
detección de casi cada interacción de las proteínas de unión de ARN
y de las moléculas de ARN. Estas condiciones permiten la formación
de complejos detectables entre las proteínas de unión de ARN y las
moléculas de ARN. Tal como se utiliza en la presente memoria, las
interacciones entre las proteínas de unión de ARN y las moléculas
de ARN que se refieren como "posibles" significan aquellas
interacciones que son específicas y que tienen lugar por lo menos
bajo un conjunto de condiciones (p. ej., condiciones de análisis de
unión in vivo u optimizadas). Estas condiciones permiten la
detección de una mayoría de las interacciones entre las proteínas de
unión de ARN y las moléculas de ARN que son posibles. El
significado de la expresión "interacción específica" se
entiende generalmente que significa las interacciones que se basan
en características específicas de las moléculas de interacción no
en características generales. Por ejemplo, determinadas proteínas
de unión de ARN reconocen y se unen específicamente a los puntos en
las moléculas de ARN que presentan la secuencia de nucleótidos
AUUUA. Esta es una interacción específica. Por el contrario,
algunas proteínas se unen a moléculas de ARN en general (esto es,
no de manera específica) basándose en las características químicas
generales de todas las moléculas de ARN. En general, se puede
identificar una interacción como una interacción no específica
determinando que la interacción se puede evitar en presencia de un
competidor no específico.
Las interacciones entre las proteínas de unión de
ARN y las moléculas de ARN se facilitan en una solución de enlace.
La solución de enlace contiene una o más moléculas de ARN y
componentes del tampón. Los componentes del tampón incluyen un
tampón, un catión monovalente, un catión divalente, un agente
reductor y un agente de densidad. Es preferible que el tampón sea
Bis-Tris propano a un pH de aproximadamente 8,5 y a
una concentración de aproximadamente 7,5 mM, el catión monovalente
sea K^{+} a una concentración de aproximadamente 50 mM, el catión
divalente sea Mg^{++} a una concentración de aproximadamente 1
mM, el agente reductor sea ditiotreitol a una concentración de
aproximadamente 0,2 mM y el agente de densidad sea glicerol a una
concentración de aproximadamente 10 por ciento (v/v).
Estas condiciones se han optimizado para que sean
universalmente aplicables. Lo más preferible es que se utilicen
condiciones óptimas. Sin embargo, uno, o menos preferentemente dos,
de los componentes del tampón se pueden variar de la forma expuesta
a continuación. Para variar determinados componentes del tampón, es
preferible que (1) el tampón sea HEPES, Tris o
Bis-Tris propano, cada uno a un pH comprendido
aproximadamente entre 8 y 10 y a una concentración aproximadamente
entre 5 y aproximadamente 100 mM, (2) el catión monovalente sea
K^{+}, Na^{+} o NH_{4}^{+}, cada uno a una concentración
entre 0 y aproximadamente 100 mM, (3) el catión divalente sea
Mg^{++}, Ca^{++} o Fe^{++}, cada uno a una concentración
comprendida entre 0 y aproximadamente 5 mM, (4) el agente reductor
sea ditiotreitol o (-mercaptoetanol), a una concentración
comprendida entre 0 aproximadamente 1 mM y el agente de densidad sea
glicerol o polietilenglicol a una concentración comprendida entre 0
y aproximadamente 20 por ciento
(v/v).
(v/v).
Para la mayoría de las moléculas de ARN, el
agente reductor no parece ser crítico, aunque existe una tendencia
a unirse ligeramente mejor en presencia de un agente reductor,
preferentemente DTT. Sin embargo, en algunos casos el agente
reductor crea una diferencia significativa en la detección de las
interacciones. Por consiguiente, se prefiere la utilización de un
agente reductor. Un agente de densidad no parece que sea necesario
para detectar la interacción entre las moléculas de ARN y las
proteínas de unión de ARN. Sin embargo, cuando se analizan las
interacciones por desplazamiento por movilidad en gel, la presencia
de un agente de densidad no aumenta la calidad de las bandas. Por
consiguiente, se prefiere la utilización de un agente de
densidad.
La solución de enlace puede incluir otros
componentes que ayudan a la formación de interacciones específicas.
Por ejemplo, se puede añadir un competidor de las interacciones no
específicas entre el ARN y la proteína para reducir el fondo de las
interacciones no específicas. Poli r(G), ARNt y heparina, son
los competidores preferidos de las interacciones no específicas
entre el ARN y la proteína.
Se desea que un intervalo de concentración se
sitúe entre 0 y aproximadamente una concentración específica no
abarque una concentración de cero sino que abarque la concentración
específica y las concentraciones hasta aproximadamente el 10%
mayores que la concentración específica. Se desea asimismo que un
intervalo de concentración se manifieste entre aproximadamente una
primera concentración específica y aproximadamente una segunda
concentración específica abarque la primera concentración
específica, las concentraciones hasta aproximadamente un 10% menores
que la primera concentración específica, las concentraciones entre
la primera y segunda concentraciones específicas, la segunda
concentración específica y las concentraciones hasta aproximadamente
el 10% mayores que la segunda concentración específica. Se desea
que un intervalo de concentración manifestado desde una primera
concentración específica hasta una segunda concentración específica
abarque la primera concentración específica, las concentraciones
entre la primera y la segunda concentración específica y la segunda
concentración específica. Asimismo se desea que un intervalo de
concentración manifestado desde 0 a una concentración específica
abarque una concentración de cero, concentraciones entre cero y la
concentración específica, y la concentración
específica.
específica.
A menos que se indique de otra manera, todas las
concentraciones de los componentes del tampón se desea que sean la
concentración final de estos componentes en una solución de enlace
completamente formada. El tampón de enlace se puede formar mediante
cualquier combinación de componentes que produzca la concentración
final deseada. Por ejemplo, una solución de enlace se puede formar
mezclando conjuntamente, con otros componentes de la solución de
enlace, una sola solución madre de los componentes del tampón, las
soluciones madre por separado de los componentes del tampón o las
soluciones madre por separado de las combinaciones de algunos de
los componentes del tampón. Se desea también que la concentración
final de los componentes del tampón se pueda conseguir mezclando
diferentes soluciones que contienen cada una una parte de la
cantidad total de un componente dado. Por ejemplo, se puede añadir
parte del catión divalente como parte de una solución madre y parte
se puede añadir con el ARN.
Se prefiere que la concentración de compuestos
extraños se mantenga al mínimo en las soluciones de enlace. Se
entiende, sin embargo, que las muestras de las proteínas de unión
de ARN y de las moléculas de ARN pueden contener compuestos
adicionales. La concentración en la solución de enlace de dichos
componentes se puede reducir, por ejemplo, por dilución de la
muestra en la mayor extensión posible cuando se está formando la
solución de
enlace.
enlace.
El procedimiento básico para la identificación de
los compuestos que afectan las interacciones entre el ARN y la
proteína de unión de ARN implica la detección de dichas
interacciones en presencia o ausencia de un compuesto de ensayo.
La detección de una interacción entre una
proteína de unión de ARN y un punto de unión supuesto se pueden
llevar a cabo utilizando análisis como los expuestos. Dichos
análisis se pueden utilizar para identificar compuestos que afectan
la interacción entre el ARN y las proteínas de unión de ARN. El
procedimiento básico para la detección de las interacciones entre
las moléculas de ARN y las proteínas de unión de ARN implica la
formación de una solución de enlace que contiene las moléculas de
ARN y 1 \times tampón de enlace, el calentamiento de la solución
de enlace para desnaturalizar las moléculas de ARN, el enfriamiento
de la solución de enlace a la temperatura de reacción, la adición
de las proteínas de unión de ARN a la solución de enlace y la
detección de interacciones entre las moléculas de ARN y las
proteínas de unión de ARN. Los compuestos en los que se debe probar
su efecto sobre las interacciones entre el ARN y la proteína de
unión de ARN se pueden añadir en cualquier etapa del análisis. Por
ejemplo, el compuesto se puede añadir antes del ARN o con él, antes
la proteína de unión de ARN o con ella o después de añadir la
proteína de unión de ARN.
La solución de enlace contiene una o más
moléculas de ARN, componentes del tampón y competidores no
específicos. Los componentes del tampón incluyen un tampón, un
catión monovalente, un catión divalente, un agente reductor y un
agente de densidad. La solución de enlace se forma combinando y/o
mezclando conjuntamente los constituyentes de la solución de enlace
de cualquier manera que produzca una solución de enlace con la
composición requerida. El tampón de enlace se puede formar mediante
cualquier combinación de componentes que produzca la concentración
final deseada. Por ejemplo, una solución de enlace se puede formar
mezclando conjuntamente, con otros componentes de la solución de
enlace, una sola solución madre de los componentes del tampón,
soluciones madre por separado de los componentes del tampón o
soluciones madre por separado de las combinaciones de algunos de los
componentes del tampón. Se desea asimismo que la concentración
final de los componentes del tampón se pueda conseguir mezclando
diferentes soluciones que contienen cada una parte de la cantidad
total de un componente dado. Por ejemplo, se puede añadir parte del
catión divalente como parte de una solución madre y parte se puede
añadir con el ARN. De este modo, la forma en la que se consigue la
composición final de la solución de enlace no es crítica. Se desea
que cualquier combinación de soluciones y componentes que llegue a
este resultado esté comprendida en esta
etapa.
etapa.
La solución de enlace formada se calienta y se
enfría en 1 \times tampón de enlace para desnaturalizar cualquier
estructura de orden superior en las moléculas de ARN. Dichas
estructuras pueden hacer menos accesibles las moléculas de ARN a las
proteínas de unión de ARN. Cuando se utilizan moléculas de ARN
purificadas procedentes de fuentes naturales, también es posible que
otras moléculas puedan permanecer unidas al ARN. La etapa de
calentamiento puede servir para liberar dichas moléculas. La etapa
de calentamiento y enfriamiento implica someter la solución de
enlace a una fuente de calor hasta que se alcance una temperatura
suficiente y a continuación permitir que se enfríe la solución a la
temperatura de reacción. La temperatura a la que se calienta la
solución de enlace puede ser cualquier temperatura que desnaturalice
de forma sustancial las moléculas de ARN presentes en la solución
de enlace. Debe entenderse que diferentes temperaturas serán
suficientes para diferentes moléculas de ARN. Por ejemplo, las
moléculas de ARN más cortas y las moléculas de ARN con un contenido
bajo de GC, en general se desnaturalizarán sustancialmente a
temperaturas menores. Sin embargo, es preferible utilizar una sola
temperatura para la etapa de calentamiento. En este caso, es
preferible utilizar en general una temperatura suficiente para
desnaturalizar sustancialmente las moléculas de ARN. Una temperatura
preferida es 85ºC. Después de dejar enfriar la solución a la
temperatura de reacción, se añade la proteína de unión al ARN a la
solución de enlace antes de la incubación a la temperatura apropiada
para la unión ARN-proteína, preferentemente
37ºC.
Las interacciones entre las proteínas de unión de
ARN y las moléculas de ARN se pueden detectar utilizando cualquier
procedimiento adecuado. Es preferible que la detección implique la
separación de las moléculas de ARN que interactúan y de las
proteínas de unión de ARN. Esto se puede llevar a cabo, por ejemplo,
separando los componentes en la solución de enlace basándose en el
tamaño o en las propiedades físicas. Dos procedimientos de
separación y detección preferidos de las moléculas de ARN que
interactúan y de las proteínas de unión de ARN son la fijación en el
filtro y el desplazamiento por movilidad en gel.
- a.
- Fijación en el filtro. La fijación en el filtro implica atrapar las moléculas que interactúan en un filtro mientras que las moléculas que no interactúan pasan a través del filtro. Este procedimiento es conocido por los expertos en la materia. Por ejemplo, filtros de nitrocelulosa prehumedecidos se equilibran en 1 \times tampón de enlace. Se aplica a continuación la reacción de enlace al filtro por filtración al vacío para eliminar el ARN no unido. Se lava el filtro en tampón de enlace 1 \times, se añade mezcla de centelleo y se determina la cantidad de ARN unido a la proteína mediante recuento por centelleo.
- Para los análisis que implican fijación en el filtro, se prefiere también realizar un análisis de referencia no interactuante. Dicha referencia se utiliza para determinar la señal detectable retenida en ausencia de la interacción del ARN específico con la proteína de unión de ARN. Preferentemente, dicho análisis de referencia no interactuante se realiza sustituyendo una molécula de ARN mutante (la que no interactúa específicamente con la proteína de unión de ARN) para la molécula de ARN utilizada en el análisis de enlace correspondiente. El nivel de señal detectable unida al filtro en la referencia no interactuante indica la contribución del fondo, o la señal no específica presente en el nivel de señal detectable medido para los análisis de enlace. En el análisis de detección de alto rendimiento, la referencia no interactuante es también una referencia para el análisis de referencia (esto es, análisis que no contiene un compuesto de ensayo). Es de esperar que se pueda reducir el nivel de señal de fondo incluyendo una baja concentración de detergente en el tampón de lavado. Los detergentes preferidos para este objeto son Tween 20 y Triton N-101. Para un conjunto dado de reacciones de ensayo, se puede utilizar un análisis de control no interactuante para determinar la eficacia de los lavados.
- Es preferible que la concentración de proteína de unión de ARN en los análisis expuestos sea por lo menos 0,5 \mug/\mul o entre 0,5 \mug/\mul y 1,0 \mug/\mul. Para los análisis que utilizan la fijación en el filtro, el filtro es preferentemente nitrocelulosa pura o una mezcla de éster de celulosa (MCA). Para el análisis expuesto, los filtros mixtos de éster de celulosa fijaron más recuentos que la nitrocelulosa pura. Para los filtros, lo más preferido es un tamaño de poro de 0,2 \mum (corte en peso molecular de 8000 daltons), aunque las placas filtrantes de MCA con un tamaño de poro de 0,45 \mum (corte en peso molécula de 20.000 daltons) también se prefieren. El corte de peso molecular inferior permite la detección de las interacciones de enlace entre el ARN y las proteínas de pequeño peso molecular. Para el análisis de detección de alto rendimiento, se prefiere que las reacciones de enlace se realicen en placas de 96 pocillos con fondo en v en un volumen final de 10 \mul. Para esto, se cargan las muestras en una placa filtrante Millipore de 96 pocillos.
- Para los análisis que utilizan fijación en el filtro, es preferible que tras la incubación y antes de la carga en el filtro, las reacciones se lleven a un volumen final mayor, más preferentemente un volumen final de 110 \mul, mediante la adición de una solución denominada solución de dilución. Las soluciones de dilución preferidas incluyen 1 \times tampón de enlace Bis-Tris propano (BTP) con glicerol, 1 \times BTP sin glicerol, TE, solución salina tamponada con fosfato (PBS) y ácido tricloroacético (TCA), siendo la más preferida 1 \times BTP sin glicerol. Es más preferible que la solución de dilución tenga los mismos componentes de tampón (preferentemente a la misma concentración final) que los utilizados en la solución de enlace excepto que carezcan del agente de densidad. Esta dilución permite incluso más carga de muestra en la placa del filtro. Se contempla que el volumen final preferido utilizado debería diferenciarse dependiendo del área de filtrado al que se aplica la solución de análisis. De este modo, el análisis en el que se utilizan áreas de filtro mayores se llevan preferentemente a un volumen final mayor de 110 \mul y los análisis en los que se utilizan áreas de filtro más pequeñas se llevan preferentemente a un volumen final menor de 110 \mul.
- Es preferible que la solución de análisis se cargue en el filtro al vacío. Después de la carga, es preferible que los filtros se laven, preferentemente dos veces. Los tampones de lavado preferidos (denominados también solución de lavado) comprenden tampón de enlace 1 \times BTP con glicerol, 1 \times BTP sin glicerol, TE, PBS y TCA, siendo 1 \times BTP sin glicerol el más preferido. Lo más preferido es que el tampón de lavado tenga los mismos componentes del tampón (preferentemente en la misma concentración final) utilizados en la solución de enlace excepto que carezca de agente de densidad. Se prefiere también que el tampón de lavado esté frío (esto es a temperatura ambiente inferior).
- b.
- Desplazamiento por movilidad en gel. El desplazamiento por movilidad en gel implica la resolución de las moléculas de ARN que interactúan y que no interactúan y las proteínas de unión de ARN en un gel por electroforesis y la observación de la posición y de la cantidad de los componentes que migran en diferentes proporciones. Las moléculas de ARN que interactúan y las proteínas de unión de ARN tienden a migrar menos en el gel que las moléculas que no interactúan en virtud de su mayor masa. El análisis de desplazamiento por movilidad en gel se puede realizar de la forma siguiente. Después de la incubación de la reacción de enlace, se añade 6 \times tampón de carga (glicerol al 30%, xileno cianol al 0,25%, azul de bromofenol al 0,25%) hasta una concentración final de 1 \times. Se carga a continuación la reacción en los pocillos de un gel de poliacrilamida (generalmente 4 a 8%) preparado en tampón Tris-borato EDTA (TBE) (Tris-borato 90 mM, EDTA 2 mM, pH 8). El ARN unido a la proteína se separa del ARN no unido aplicando un voltaje constante (150 a 175 V) al gel y permitiendo que el gel fluya hasta que el azul de bromofenol haya alcanzado el fondo del gel. Se seca el gel al vacío a 80ºC. El ARN no unido y el ARN unido a la proteína se observan a continuación por autorradiografía. En los casos en los que se desee conocer el peso molecular del complejo ARN-proteína, la reacción de enlace se somete a luz ultravioleta para reticular covalentemente el complejo. Se añade 6 \times tampón de carga (Tris 3,75 M, 30% (\betaME, 13,8% de dodecilsulfato de sodio (SDS), glicerol al 30%, pH 6,8) a la reacción reticulada a una concentración final de 1 \times y se carga la mezcla en un gel de SDS-poliacrilamida (generalmente 8 a 12%). El gel fluye en un tampón Tris-glicina (Tris 25 mM, glicina 192 mM, SDS al 0,1%) a 30 mA hasta que se separan adecuadamente los marcadores por peso molecular. Se seca el gel y se observa por autorradiografía el complejo ARN-proteína.
- c.
- Digestión de ribonucleasa. Para algunos análisis puede ser deseable eliminar aquellas moléculas de ARN, u otras zonas de una molécula de ARN, que no están implicadas en una interacción con proteínas de unión de ARN. Por ejemplo, cuando se utiliza una molécula grande de ARN en el análisis, el enlace de una proteína de unión de ARN puede producir un complejo de ARN/proteína solo ligeramente mayor que la molécula de ARN sola. Cuando se detecta dicho complejo por desplazamiento por movilidad en gel, el desplazamiento resultante puede no ser fácilmente detectable. Cuando se detecta dicho complejo por fijación en el filtro, la molécula de ARN sola puede ser suficientemente grande para ser retenida por el filtro. Tales problemas potenciales se pueden mitigar digiriendo el ARN no implicado en interacciones. Esto se lleva a cabo fácilmente sometiendo la solución de enlace a digestión con ribonucleasa. Únicamente se digerirá el ARN no unido o no interactuante. Las zonas de ARN unido por proteínas de unión de ARN se protegerán de la digestión por la proteína.
La identificación de los compuestos que modulan
la interacción de las moléculas de ARN y de las proteínas de unión
de ARN se puede realizar incluyendo uno o más compuestos de ensayo
en la solución de enlace que comprende las moléculas de ARN de
interés, las proteínas de unión de ARN y los componentes del tampón
y detectando la interacción entre las moléculas de ARN y las
proteínas de unión de ARN. Los compuestos de ensayo que modulan o
afectan a la interacción entre las moléculas de ARN y las proteínas
de unión de ARN se pueden identificar comparando las interacciones
en la solución de enlace que no contienen el compuesto de ensayo con
las interacciones en la solución de enlace que contienen los
compuestos de ensayo. Las soluciones de enlace que incluyen uno o
más compuestos de ensayo se denominan en la presente memoria
soluciones de ensayo. Las soluciones de enlace que no incluyen un
compuesto de ensayo se denominan en la presente memoria soluciones
de referencia. Los compuestos que modulan la interacción se
identificarán si se diferencian las interacciones en las dos
soluciones. Un análisis de este tipo se puede utilizar para
identificar compuestos que modulan o afectan la interacción
uniéndose a las moléculas de ARN o uniéndose a las proteínas de
unión de ARN en una muestra dada. Administrando un compuesto
identificado a una célula en la que se expresa una molécula de ARN
de interés, o una molécula de ARN relacionada, la función o acción
de la molécula de ARN en la célula se puede afectar debido a la
modulación o efecto que el compuesto ejerce en la interacción de la
molécula de ARN y en las proteínas de unión de ARN. Por ejemplo,
cuando una interacción entre una molécula de ARNm y una proteína de
unión de ARN controla la traducción del ARNm, se puede utilizar un
compuesto identificado afectando esta interacción en el análisis
expuesto para afectar la traducción del ARNm mediante su efecto
sobre la interacción. Los compuestos identificados se pueden
utilizar para afectar la función o la expresión de una molécula de
ARN en una célula in vivo, ex vivo o in vitro.
La identificación de dichos compuestos puede conducir también al
desarrollo de terapias para tratar una variedad de enfermedades.
Dichos compuestos también se pueden utilizar como herramientas de
investigación para estudiar el significado, la naturaleza o
mecanismo de la función o la expresión del ARN en una célula.
- a.
- Análisis de detección de alto rendimiento. Aunque no se necesiten, se pueden utilizar las condiciones universales de análisis expuestas en un análisis de detección para identificar los compuestos que afectan a una interacción del ARN con la proteína de unión de ARN de interés. Dichos análisis de detección se pueden diseñar para permitir la evaluación simultánea del efecto de numerosos compuestos de ensayo en la interacción de interés. Con este fin, se prefiere que las interacciones se detecten por fijación en el filtro. Los análisis de fijación en el filtro simultáneos se llevan a cabo preferentemente mediante filtración simultánea de soluciones de enlace en un aparato con pocillos, orificios, aberturas u otros compartimentos separados que pueden contener soluciones de enlace separadas. Una forma preferida de un aparato de fijación en el filtro multi-pocillo es la placa filtrante MultiScreen de Millipore. Se contempla asimismo que se puedan realizar simultáneamente múltiples análisis multi-pocillo o multi-muestra.
- En general, la detección de alto rendimiento se puede realizar de la forma siguiente. En primer lugar, se forma un conjunto de una o más soluciones de ensayo, en el que cada solución de ensayo incluye una o más moléculas de ARN y componentes del tampón. Las soluciones de ensayo se calientan a continuación durante un tiempo y a una temperatura suficientes para desnaturalizar la(s) molécula(s) de ARN y se enfría lentamente. A continuación, se añaden una o más proteínas de unión de ARN a las soluciones de ensayo y se detectan las interacciones entre la(s) molécula(s) de ARN y la(s) proteína(s) que se une(n) al ARN en las soluciones de ensayo. Uno de los compuestos de ensayo se incluye en la solución de ensayo. Para determinar si los compuestos de ensayo tienen efecto sobre las interacciones entre la(s) molécula(s) de ARN y la(s) proteína(s) que se une(n) al ARN se forma una solución de referencia, se calienta y se enfría como con las soluciones de ensayo, excepto que no está presente ningún compuesto en la solución de referencia. Se añade(n) la(s) proteína(s) que se fija(n) al ARN a la solución de control y se detectan las interacciones entre la(s) molécula(s) de ARN y la(s) proteína(s) que se une(n) al ARN en la solución de referencia. Al comparar las interacciones detectadas en las soluciones de ensayo con las detectadas en la solución de referencia, se puede determinar si un compuesto de ensayo dado tiene un efecto sobre las interacciones. Se identifica un compuesto de ensayo como un compuesto que ejerce un efecto sobre las interacciones entre la(s) molécula(s) de ARN y la(s) proteína(s) que se une(n) al ARN si se diferencian las interacciones detectadas en la solución de referencia y las interacciones detectadas en la solución de ensayo que contiene el compuesto de ensayo.
- El compuesto de ensayo se puede añadir a la solución de ensayo en cualquier momento, por ejemplo, durante la formación de la solución de ensayo, antes de la etapa de calentamiento, antes de añadir la proteína de unión de ARN o con la proteína de unión de ARN. Es preferible que el compuesto de ensayo se mezcle con la molécula de ARN o con la proteína de unión de ARN antes de su adición a la solución de ensayo.
- El análisis que utiliza la solución de referencia se puede realizar por separado, o junto con, el análisis de las soluciones de ensayo. Cuando se realiza por separado, el análisis de la solución de referencia se puede realizar antes, después o simultáneamente con el análisis de la solución de ensayo. Es preferible que el análisis de la solución de referencia se realice junto y simultáneo con el análisis de la solución de ensayo.
- Tal como se utiliza en la presente memoria un conjunto de soluciones de ensayo se refiere a una o más soluciones de ensayo que están relacionadas entre sí por tener la(s) misma(s) proteína(s) que se une(n) al ARN, molécula(s) de ARN y componentes del tampón. Las soluciones de ensayo dentro de un conjunto de soluciones de ensayo se diferencian preferentemente entre sí en el compuesto de ensayo presente en la solución de ensayo. Se contempla y prefiere que se utilice una solución de referencia individual o una forma individual de solución de referencia, para la comparación de las interacciones detectadas en un conjunto completo de soluciones de ensayo. Con este fin se prefiere que la solución de referencia tenga la(s) misma(s) proteína(s) que se une(n) al ARN, la(s) molécula(s) de ARN y los componentes del tampón que las soluciones de ensayo en el conjunto. Los múltiples conjuntos de soluciones de ensayo y una solución de referencia para cada conjunto, también se pueden analizar conjuntamente en un análisis de alto rendimiento. Con este fin, se prefiere que una de las dos o ambas proteína(s) que se une(n) al ARN o a la(s) molécula(s) de ARN se diferencien entre cada conjunto de soluciones de ensayo. Para el análisis que implica a dichas múltiples conjuntos de soluciones de ensayo, es preferible que cada conjunto de soluciones de ensayo utilice el mismo conjunto de compuestos de ensayo.
- Las relaciones preferidas entre las soluciones de ensayo, los conjuntos de soluciones de ensayo y las soluciones de referencia, descritos anteriormente, pueden ser ilustrados mediante los ejemplos esquemáticos siguientes. En los ejemplos siguientes, las diferentes moléculas de ARN o conjuntos de moléculas de ARN (una solución dada puede contener una sola molécula de ARN o múltiples moléculas de ARN) se denominan R1, R2, R3, etc. Las diferentes proteínas de unión de ARN se denominan P1, P2, P3, etc. Los compuestos de ensayo se denominan C1, C2, C3, etc. Los componentes del tampón, como grupo de componentes en una solución dada, se denominan B1, B2, B3, etc.
- Tres conjuntos de soluciones de ensayo, denominadas conjunto 1, conjunto 2 y conjunto 3, se establecen utilizando los siguientes componentes:
\vskip1.000000\baselineskip
| Conjunto 1 | Conjunto 2 | Conjunto 3 | |
| ARN | R1 | R2 | R3 |
| Proteína | P1 | P2 | P3 |
| Tampón | B1 | B1 | B1 |
\vskip1.000000\baselineskip
- Para cada conjunto, se establece una solución de referencia diferente utilizando estos mismos componentes. De este modo, cada conjunto se diseña para evaluar el efecto de los compuestos de ensayo en una interacción (o grupo de interacciones) diferente entre el ARN y la proteína de unión de ARN. Se puede incluir un compuesto de ensayo diferente en cada solución de ensayo en cada conjunto de la forma siguiente:
\newpage
| Conjunto 1 | Conjunto 2 | Conjunto 3 | |
| Solución de ensayo | |||
| 1 | C1 | C1 | C1 |
| 2 | C2 | C2 | C2 |
| 3 | C3 | C3 | C3 |
| 4 | C4 | C4 | C4 |
| ... | ... | ... | ... |
| 92 | C92 | C92 | C92 |
| 93 | C93 | C93 | C93 |
| 94 | C94 | C94 | C94 |
| 95 | C95 | C95 | C95 |
- No se añade ningún compuesto de ensayo a las soluciones de referencia. Como se puede apreciar, en este ejemplo, el mismo banco de 95 compuestos de ensayo se analiza para un efecto en cada una de las tres interacciones entre ARN y la proteína de unión de ARN. Se podrían realizar grupos similares de análisis utilizando un conjunto diferente de compuestos de ensayo o un conjunto parcialmente solapado de compuestos. El grupo entero de análisis descrito anteriormente se puede realizar simultáneamente y, preferentemente está automatizado. El número de análisis en cualquier conjunto de análisis de ensayo se puede aumentar para acomodarse como muchos compuestos de ensayo como se desee. En tales casos, desde luego, es preferible que el conjunto de análisis de ensayo se divida en grupos manejables, basándose por ejemplo, en el número de pocillos en un aparato de filtro multi-pocillo. Se contempla que el procedimiento dado a conocer se pueda realizar utilizando dispositivos y aparatos diseñados para acomodarse a un gran número de análisis de ensayo.
- b.
- Modos preferidos de identificación de compuestos. Es preferible las interacciones se detecten de manera automática utilizando, por ejemplo, la detección automática y la comparación de señales de interacción. Cuando se marca(n) la(s) molécula(s) de ARN o la(s) proteína(s) que se une(n) al ARN con un grupo detectable, es preferible que las interacciones se detecten utilizando un grupo detectable cuantitativo automático. Con esta finalidad, se prefiere que el grupo detectable incluya un componente que produzca, directa o indirectamente, una señal cuantificable. Los componentes preferidos de este tipo son isótopos radioactivos. Los reactivos y procedimientos para la utilización y detección de marcadores radioactivos son muy conocidos.
- Los análisis simultáneos por desplazamiento en gel se realizan preferentemente sometiendo múltiples soluciones de enlace a electroforesis en un solo gel con múltiples bandas y en múltiples geles cada uno con múltiples bandas. La detección y comparación de muestras múltiples se puede realizar, por ejemplo, mediante detección automática y localización de los complejos que interactúan en las bandas de gel.
- Es preferible que los compuestos de ensayo se mezclen ya sea con la molécula de ARN, bien antes, durante o después de la formación de la solución de enlace o con la proteína de unión de ARN antes de la adición de la solución de enlace. Con este objeto, se prefiere que el compuesto de ensayo se mezcle con la molécula de ARN o con la proteína de unión de ARN dependiendo de con cuál de estos componentes se desea o se espera que interactúe el compuesto de ensayo. Por ejemplo, si se desean los compuestos que afectan a la interacción de un ARN y una proteína de unión de ARN por interacción con el ARN (o se espera, dada la naturaleza de los compuestos de ensayo), entonces el compuesto de ensayo debería añadirse al ARN. Por el contrario, si se desean los compuestos que afectan a la interacción de un ARN y una proteína de unión de ARN por interacción con el ARN (o se espera, dada la naturaleza de los compuestos de ensayo), entonces el compuesto de ensayo debería añadirse a la proteína de unión de ARN. Lo más preferible es que el compuesto de ensayo se añada a la solución de enlace después del calentamiento y del enfriamiento y antes de la adición de la proteína de unión de ARN. Se prefiere también que todas las soluciones de ensayo en un conjunto dado de soluciones de ensayo tengan mezclado el compuesto de ensayo de la misma manera y en la misma etapa de todos los análisis.
- c.
- Compuestos identificados. Se pueden utilizar compuestos identificados por tener un efecto sobre las interacciones entre las moléculas de ARN y las proteínas de unión de ARN que afectan a dichas interacciones en las células. En el caso en que la interacción entre la molécula de ARN y una proteína de unión de ARN afecte la función o expresión de la molécula de ARN, un compuesto que ejerce un efecto sobre la interacción es de esperar que presente un efecto sobre la función o expresión de la molécula de ARN. Por tanto, se contempla que los compuestos identificados que ejercen un efecto sobre la interacción de una molécula de ARN y una proteína de unión de ARN serán útiles para afectar la función o expresión de la molécula de ARN en una célula. Dichos compuestos se pueden administrar a las células de cualquier manera que permita al compuesto que presente el efecto deseado. Muchos de dichos modos de administración son conocidos en la técnica. Una forma preferida de administración para las aplicaciones in vivo son las composiciones que combinan un compuesto identificado y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Para este fin, el procedimiento expuesto puede incluir una etapa de formación de dicha composición. Para las aplicaciones in vitro y ex vivo, se puede añadir un compuesto identificado al medio de cultivo. El compuesto puede también combinarse con cualquier sistema o composición de administración que pueda aumentar la introducción del compuesto en la célula y/o aumentar la administración del compuesto a determinadas células.
Los vehículos farmacéuticos adecuados para
administración a un paciente son conocidos por los expertos en la
materia. Para la administración parenteral, el compuesto se puede
disolver o poner en suspensión en agua o solución salina
esterilizadas. Para la administración entérica, el compuesto se
puede incorporar en un excipiente inerte en forma de comprimido,
líquido o capsular. Los excipientes adecuados pueden ser almidones o
azúcares y comprenden lubricantes, potenciadores de sabor,
aglutinantes y otros materiales de la misma naturaleza. El compuesto
también se puede administrar localmente en un punto deseado
mediante aplicación tópica de una solución o crema.
Como alternativa, el compuesto se puede
administrar en, o como parte de, liposomas o microesferas (o
micropartículas). Los procedimientos para la preparación de
liposomas y microesferas para la administración a un paciente son
conocidos por los expertos en la materia. La patente U.S. nº
4.789.734 describe los procedimientos para la encapsulación de
materiales biológicos en liposomas. Esencialmente, el material se
disuelve en una solución acuosa, se añaden los fosfolípidos y
lípidos apropiados, junto con tensioactivos si se necesita y el
material se dializa o se somete a ultrasonidos, según se necesite.
Un buen estudio de procedimientos conocidos es el de G.
Gregoriadis, capítulo 14 en "Liposomes", páginas
287-341 (Academic Press, 1979). Las microesferas
formadas por polímeros o proteínas son bien conocidas por los
expertos en la materia y pueden ser adapatadas para el paso a
través del tubo digestivo directamente al torrente sanguíneo. Como
alternativa, se puede incorporar el compuesto y las microesferas, o
compuestos de microesferas, implantarse para la liberación lenta
durante un periodo de tiempo que oscila entre días y meses. Véase,
por ejemplo, las patentes U.S. nº 4.906.474, nº 4.925.673 y nº
3.625.214.
Los criterios de evaluación de la respuesta a
modalidades terapéuticas que emplean un compuesto identificado están
dictados por la enfermedad específica y generalmente seguirán las
prácticas médicas habituales. Generalmente, el efecto de la
administración de un compuesto se puede evaluar por lo menos
determinando si la interacción entre el ARN y la proteína de unión
de ARN determinada por estar afectada por el compuesto está de
hecho afectada en las células a las que se administra o suministra
el compuesto. Dicha evaluación se puede también realizar
determinando si existe un efecto sobre un sustituto para la
interacción, tal como la expresión de un ARN, la producción de una
proteína o el efecto fisiológico consiguiente. Cuando la
interacción entre el ARN y la proteína de unión de ARN afectada por
la proteína es conocida o se sospecha que implica la función o
expresión de un ARN implicado en un estado patológico, la eficacia
de la administración del compuesto se puede evaluar midiendo los
cambios de las características del estado patológico.
La identificación de las moléculas de ARN que
interactúan con una proteína específica de unión de ARN se puede
realizar formando una solución de enlace que comprenda una o más
moléculas de ARN y componentes del tampón que comprenden un tampón,
un catión monovalente, un catión divalente, un agente reductor y un
agente de densidad, añadiendo la proteína específica de unión de ARN
y detectando las interacciones entre una o más moléculas de ARN y la
proteína de unión de ARN. Aquellas moléculas de ARN que interactúan
se pueden identificar mediante análisis de la secuencia específica.
Así es cómo se identificaron los puntos de unión expuestos de la
proteína de unión de ARN. Un análisis de este tipo se puede utilizar
para identificar todas aquellas moléculas de ARN en una muestra
dada que son específicas para una proteína de unión de ARN de
interés. La identificación de dichas moléculas de ARN puede conducir
a la identificación de genes que codifican moléculas de ARN
reguladas por las moléculas de interés de unión de ARN.
De manera similar, se pueden identificar las
proteínas de unión de ARN que interactúan con una molécula de ARN
específica formando una solución de enlace que comprende la
molécula de ARN de interés, y los componentes del tampón, añadiendo
una o más proteínas de unión de ARN y detectando las interacciones
entre una o más proteínas de unión de ARN y la molécula de ARN.
Las zonas en las moléculas de ARN que interactúan
con las proteínas de unión de ARN se pueden identificar por la
formación de una solución de enlace que comprende (1) una molécula
de ARN procedente de un subconjunto de moléculas de ARN constituido
por fragmentos sucesivamente más pequeños de una molécula mayor de
ARN identificada previamente que está implicada en una interacción
del ARN con la proteína, o (2) una molécula de ARN que contiene una
o más mutaciones o deleciones en una molécula de ARN identificada
previamente implicada en una interacción entre el ARN y la
proteína, los componentes del tampón que comprenden un tampón, un
catión monovalente, un catión divalente, un agente reductor y un
agente de densidad y competidores no específicos, añadiendo una o
más proteínas de unión de ARN, y detectando la interacción entre la
molécula de ARN y las proteínas de unión de ARN. Al comparar qué
moléculas de ARN interactúan con las proteínas de unión con las que
no interactúan, se puede identificar la zona de la molécula de ARN
implicada en la interacción. Un análisis de este tipo puede
identificar todas las zonas en una molécula de ARN implicada en la
interacción con una proteína de unión de ARN así como identificar
los nucleótidos específicos que interactúan con la proteína de unión
de ARN. Este análisis se puede utilizar con las secuencias dadas a
conocer para purificar o identificar los puntos de enlace.
Se realizaron varios análisis para detectar las
interacciones entre moléculas de ARN y las proteínas de unión de
ARN (1) formando una solución de enlace que incluye moléculas de
ARN, BTP a pH 8,5, KCl 50 mM, MgCl_{2} 1 mM, DTT 0,2 mM y
glicerol al 10%, (2) calentando la solución de enlace para
desnaturalizar las moléculas de ARN, (3) enfriando la solución de
enlace, (4) añadiendo proteínas de unión de ARN a la solución de
enlace y (5) detectando las interacciones entre las moléculas de ARN
y las proteínas de unión de ARN. En el primer análisis, se
incubaron interacciones de varias moléculas de ARN (marcadas por
radioactividad) con diferentes características de reconocimiento con
extracto de proteína de SH-SY5Y o de CHL/260. El
extracto SH-SY5Y se preparó de la forma siguiente.
Se lisaron aproximadamente 108 células SH-SY5Y en
tampón que contenía Tris 25 mM, pH 7,9, EDTA 0,5 mM, PMSF 0,1 mM,
NaF 2 mM y NaPPi 2 mM durante dos ciclos de
congelación/descongelación. Se centrifugaron los extractos dos
veces a 16.000 \times g durante 15 minutos a 4ºC, se dividieron
en alícuotas, se congelaron rápidamente en nieve carbónica y se
almacenaron a -80ºC hasta su utilización. Se seleccionaron moléculas
de ARN para la detección destacable de las interacciones
dependientes de la secuencia de ARN (ARN de AUUUA), secuencia y
estructura de ADN (ARN de histona) o estructura de ARN sola (ARN de
doble cadena). El ARN de AUUUA posee la secuencia
AUUUAUUUAUUUAUUUAUUUA (SEC. ID nº: 8). El ARN de doble cadena posee
la secuencia GGAGCGUACGCGAGC UACAGGCUCGCGUACGCUCC (SEC. ID nº: 9).
Además de estas pequeñas moléculas de ARN (menos de 30 nucleótidos),
se probó también la zona 5' no traducida de 210 nucleótidos del
transportador de glucosa tipo 1 (Glut1) (SEC. ID nº: 7). Se utilizó
extracto de proteína SH-SY5Y con ARN de AUUUA y se
utilizó extracto de proteína CHL/260 con las moléculas de ARN
restantes. El gel contenía bandas de migración múltiples más lentas
en cada una de las bandas. Esto indica que las condiciones
universales de análisis permiten la detección de interacciones entre
las moléculas de ARN y las proteínas de unión de ARN a través del
espectro de tipos de interacción.
En otro análisis, se incubaron interacciones de
varias moléculas de ARN que representan dianas para diferentes
motivos de unión con extracto de proteína SH-SY5Y o
CHL/260 o proteína Rev recombinante. Se seleccionaron las moléculas
de ARN para la detección destacable de las interacciones que
implican a las proteínas de unión de ARN que contiene motivos de
unión al ARN de doble cadena (IRE-BF; Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 86:5768-5772 (1989)), caja de
RGG (APP-BF; J. Biological Chem.
270;17292-17298 (1995)), motivos ricos en Arg
(RRE-BF; Biochemistry
33:14579-14585 (1994)) y motivos de RNP
(U1-BF; J. Mol. Biol.
180:947-960 (1984)). Se utilizó extracto de
proteína de SH-SY5Y en el análisis de
APP-BF, se utilizó extracto de proteína de CHL/260
en el análisis de IRE-BF y U1-BF y
se utilizó proteína Rev recombinante en el análisis
RRE-BF. El gel contenía bandas de migración
múltiples más lentas en cada una de las bandas. Esto indica que las
condiciones universales de análisis permiten la detección de
interacciones entre las moléculas de ARN y las proteínas de unión
de ARN a través del espectro de tipos de interacción.
En otro análisis, se confirmó la especificidad de
la interacción que se estaba detectando. Se incubó ARN de IRE
marcado por radioactividad en presencia o ausencia de proteína
K562. Se preparó K562 como se describió anteriormente. Para probar
si las interacciones detectadas eran específicas o no, se incluyó
además IRE no marcado en algunos de los análisis. Este ARN compite
con el ARN de IRE marcado para la interacción con las proteínas de
unión de ARN. Como referencia, se incluyó IRE mutante no marcado
(que es defectuoso para la unión) en algunos ensayos. Si la
interacción es específica, este ARN no competiría con el ARN de IRE
marcado para las proteínas de unión de ARN. En las bandas de gel
para análisis en las que no se incluyó ningún extracto de proteína,
no es visible ningún desplazamiento con movilidad, como era de
esperar. En las bandas de gel para los análisis en las que se
incluyó extracto de proteína, es claramente visible un
desplazamiento con movilidad. En los análisis en los que se
incluyeron concentraciones crecientes (100 \times, 1.000 \times
y 10.000 \times, respectivamente) de ARN de IRE no marcado, el
ARN no marcado compite eficazmente con el ARN marcado para la
interacción con las proteínas de unión de ARN a las concentraciones
de 1.000 \times y 10.000 \times. En los análisis en los que se
incluyó concentraciones crecientes (100 \times, 1.000 \times y
10.000 \times, respectivamente) de ARN de IRE mutante, el ARN no
marcado no puede competir con el ARN marcado para la interacción con
las proteínas de unión de ARN. Esto indica claramente que el efecto
competitivo del ARN de IRE no marcado no se debe a las interacciones
no específicas entre las moléculas de ARN y las proteínas de unión
de ARN.
Los análisis siguientes demuestran los modos y la
eficacia del análisis de detección de alto rendimiento expuestos. Se
llevaron a cabo reacciones de enlace en placas de 96 pocillos con
fondo en v en un volumen final de 10 \mul. Los análisis se
constituyeron y realizaron como se describe a continuación.
Particularmente, los análisis se realizaron (1) formando una
solución de enlace que incluía moléculas de ARN, BTP 7,5 mM a pH
8,5, KCl 10 mM, MgCl_{2} 5 mM, DTT 0,2 mM y glicerol al 10%, (2)
calentando la solución de enlace para desnaturalizar las moléculas
de ARN, (3) enfriando la solución de enlace, (4) añadiendo
proteínas de unión de ARN a la solución de enlace, (5) cargando la
solución de unión en el filtro y (6) detectando la cantidad de ARN
retenida en el filtro.
Se recubrió previamente la placa filtrante de
nitrocelulosa con albúmina de suero bovino (BSA),
polivinilpirrolidona (PVP), poliG, polil, poliC, poliU o ARNt como
agente de bloqueo antes de cargar las soluciones de análisis.
Independientemente de si el pocillo estaba sin tratar o recubierto
previamente con un agente de bloqueo, las cpm de ARN libre (es
decir, el ARN retenido en el filtro en ausencia de proteína de
unión de ARN medido en recuentos radioactivos por minuto (cpm))
fueron 7 a 12% de las cpms unidas a la proteína. Esto indica que no
se requiere o prefiere bloqueo.
Para probar la capacidad del análisis en el
filtro para detectar los cambios en la actividad de enlace (esto
es, la disminución de interacción entre el ARN y las proteínas de
unión de ARN), se realizaron análisis por competencia con ARN de IRE
y extracto de proteína K562 (véase Figura 1). Se realizaron
experimentos por competencia añadiendo concentraciones crecientes
(100 a 10.000 \times) de ARN de IRE natural o mutante no marcados
a la reacción de enlace. La Figura 1 ilustra los resultados. Se
observó una inhibición de enlace dependiente de la concentración en
los análisis en los que se añadió ARN natural no marcado mientras
que no se observó competición en los análisis en los que se añadió
ARN mutante no marcado.
Para probar completamente el análisis con filtro,
se realizaron competencias con los ARN con U1 y también con His. El
ARN con U1 presenta la secuencia AAUCCAUUGCAC UCCGGAUUU (SEC. ID nº:
10; m14587). El ARN con His posee la secuencia
AAAAAGGCUCUUUUCAGAGCCACCCA (SEC. ID nº: 11; X57138). Los ARN
naturales tanto con U1 como con His presentaban una inhibición de
enlace dependiente de la concentración (véase Figura 2). Sin
embargo, los ARN mutantes inhibieron también el enlace en función
de la concentración, aunque aproximadamente a una concentración
mayor de 10 veces. La Figura 2 ilustra estos resultados para la
competencia de U1. En estos análisis de competencia,
independientemente del análisis de IRE, el ARN mutante utilizado ha
demostrado que se une a la proteína de unión de ARN, aunque con una
afinidad menor que el ARN natural. Los resultados de las
competencias del análisis con filtro de U1 e His reflejan la
capacidad del análisis para detectar interacciones de enlace de
baja afinidad así como de mayor afinidad.
Se realizaron análisis de enlace con ARN de IRE
natural y extracto de proteína K562 en presencia de fuentes de
hierro o de quelantes de hierro para determinar la capacidad del
ensayo con filtro para detectar la modulación de las interacciones
de enlace por pequeñas moléculas. Se añadieron concentraciones
crecientes de hemin de las fuentes de hierro (1 a 100 \muM) y
FeCl_{3} (1 \muM a 1 mM) o de quelante de hierro
desferroxiamina (1 \muM a 1 mM) a las reacciones de enlace (véase
Figura 3). Hemin y FeCl_{3} produjeron una inhibición de enlace
dependiente de la concentración. Desferroxiamina no cambió la
cantidad de complejo IRE/proteína formada, quizás porque no hay
suficiente hierro en el extracto celular para producir un cambio
destacable en la adición de desferroxiamina. Se analizaron las
reacciones por desplazamientos en el gel para observar los
resultados del análisis con filtro.
Se generó un banco exploratorio de compuestos de
96 elementos que contenía CNI-1493 y un compuesto
que demostró previamente que inhibe después de la transcripción la
producción de TNF-\alpha. Se identificó
inicialmente el banco a 10 \muM frente a ARN con AUUUA marcado
con ^{32}P. Se probaron varios procedimientos de introducción de
compuestos en la reacción de enlace. Inicialmente se incubaron
conjuntamente los compuestos con ARN y proteína, produciéndose
resultados modestos. A continuación, se probó la preincubación con
el extracto de proteína o el ARN con mejores resultados.
Se seleccionaron diecisiete compuestos para otro
análisis a 100 nM, 1 \muM y 10 \muM utilizando tanto ARN con
AUUUA como de IRE basándose en los resultados de tres intentos de
identificación (Exps. 29 a 31). La Tabla 1 resume los resultados de
estos compuestos a 10 \muM. Los resultados se presentan también
gráficamente en la Figura 4. El compuesto C1 fue regularmente el
inhibidor más activo resultante próximo a una reducción del 50% en
los recuentos (p = 0,001) mientras que A5 fue el potenciador más
activo aumentando los recuentos en el 38% en las referencias (p <
0,001). El compuesto G10, CNI-1493, produjo un
aumento sustancial en los recuentos en 3 de los 4 experimentos. Los
compuestos D9 y H2, seleccionados como controles negativos de la
detección inicial, continuaron sin ejercer ningún efecto en la
identificación dependiente de la dosis (Exp. 33) y se identificaron
como referencias del vehículo. Cuando se identificaron los
compuestos 17 frente al ARN de IRE, se observó un efecto
diferencial con el compuesto A5 (véase Figura 5). Este potenciador
más eficaz del enlace de AUUUA no pudo ejercer un efecto sobre
IRE.
Se han llevado a cabo estudios de competencia
utilizando el análisis con filtro en el que se añade ARN natural o
mutante a la reacción a 100 a 10.000 veces la concentración de ARN
con ^{32}P para competir con el enlace de la proteína del ARN
radiomarcado. Se ha demostrado que se puede utilizar con eficacia el
análisis de alto rendimiento para este tipo de estudio utilizando
una variedad de moléculas de ARN que comprenden IRE, AUUUA, APP, U1
y His. Utilizando IRE se ha demostrado una inhibición de enlace
dependiente de la concentración mediante ARN natural no marcado, sin
ningún efecto de presentación por el ARN mutante no marcado,
excepto a la concentración mayor. Estos resultados han sido
confirmados por análisis por desplazamiento en gel. Además, el
análisis expuesto se puede utilizar para detectar diferencias más
sutiles en la capacidad de varias moléculas de ARN para unir la
proteína como se demostró por los resultados de los experimentos con
U1 e His. En este caso, el ARN mutante presenta una afinidad de
enlace débil para la proteína de unión de ARN. Cuando se añade ARN
mutante no marcado a la reacción de enlace, se detecta una ligera
inhibición dependiente de la concentración produciéndose una
inhibición máxima del 50 al 70% a 10.000 veces la concentración de
ARN con ^{32}P. De esta forma, se puede comparar la afinidad de
enlace de varias formas alteradas del punto de unión de una
proteína de unión de ARN.
Se identificó un banco de compuestos aleatorio de
96 miembros con el análisis de alto rendimiento expuesto. Se
identificaron inicialmente los compuestos a 10 \muM frente a ARN
con AUUUA marcado con ^{32}P. Se observó que un compuesto produce
una cantidad significativa de recuentos detectables mientras que se
observaron que dos compuestos producen una disminución de recuentos
significativa. Se seleccionaron diecisiete compuestos para otro
análisis a 100 nM, 1 \muM y 10 \muM utilizando moléculas de ARN
tanto con AUUUA como de IRE para determinar si se podría detectar
alguna selectividad de los compuestos. Cuando se identificaban los
17 compuestos frente al ARN de IRE, se observó un efecto diferencial
con el compuesto potenciador. El potenciador más eficaz del enlace
de AUUUA no pudo ejercer efecto sobre IRE. Los desplazamientos en
gel de estos compuestos utilizando ARN con AUUUA confirmaron la
actividad de los inhibidores.
El ejemplo siguiente ilustra la manera de
identificar supuestos puntos de enlace para las proteínas de unión
de ARN presentes en una base de datos de la secuencia de
nucleótidos y la confirmación de que algunas secuencias de
nucleótidos identificadas interactúan con las proteínas de unión de
ARN.
Se investigó la presencia de la secuencia para
erb-B2 en la base en la base de datos de la
secuencia de nucleótidos del GenBank. La secuencia humana con número
de registro X03363 contenía la secuencia de la
3'-UTR completa. La secuencia de nucleótidos de esta
UTR se presenta en la SEC. ID nº: 5.
Se diseñó un par cebador que utilizó un cebador
con cadena transcrita comenzando en el nucleótido 4203 y un cebador
con cadena complementaria comenzando en el nucleótido 4473. Además,
el cebador transcrito contenía 24 nucleótidos que codifican al
activador T7 en el terminal 5'. Se generaron los clones que
contenían las secuencias anteriores por RT-PCR del
ARN total obtenido a partir de la línea celular de linfoblastoma de
K562. Se cartografiaron por restricción los clones y se analizaron
por electroforesis en gel para confirmar su identidad.
Se utilizaron a continuación los productos de PCR
que generan una sola banda (en las bandas no digeridas) para la
transcripción in vitro del ARN marcado utilizando el kit
RiboProbe de Promega. Se utilizaron transcritos marcados para el
análisis de detección de la proteína de unión de ARN descrito
anteriormente. Se incubaron soluciones de enlace que contenían el
ARN marcado con 0,5 \mug de proteína aislada de la misma célula
de la que se generó el producto por RT-PCR, y se
resolvieron los productos en un gel no desnaturalizante. Se
utilizaron a continuación las UTR marcadas que presentan actividad
de enlace en un segundo experimento en el que se añaden a las
reacciones de enlace un exceso molar de 10, 100 y 1.000 veces de ARN
idéntico no marcado o el mismo exceso de ARN diferente. Se observó
una inhibición de la formación del complejo con competidor
específico dependiente de la concentración mientras que no se
observó ninguna competencia cuando se añadía ARN mutante en
exceso.
Los expertos en la materia reconocerán o serán
capaces de determinar utilizando no más que la experimentación de
rutina, muchos equivalentes a las formas de realización específicas
de la invención descritos en la presente memoria. Dichos
equivalentes se pretende que estén comprendidos en las
reivindicaciones siguientes.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Tony Gordiano, Deborah L. Beach y Gretchen L. Temeles
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROCEDIMIENTO PARA LA IDENTIFICACIÓN DE COMPUESTOS QUE AFECTAN A LAS INTERACCIONES ARN/PROTEÍNA DE UNIÓN DE ARN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 11
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE LA CORRESPONDENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Patrea L. Pabst
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 2800 One Atlantic Center 1201 West Peachtree Street
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Atlanta
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Georgia
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 30306-3450
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- MEDIO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA INFORMÁTICO: PatentIn Release nº 1.0. Versión nº 1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIONES DEL CONSULTOR O APODERADO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Pabst, Patrea L.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 31.284
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/ETIQUETA: MES101
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIONES DE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (404) 873-8794
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FAX: (404) 873-8795
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN RELATIVA A LA SEC ID nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 125 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN RELATIVA A LA SEC ID nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 102 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- CADENA COMPLEMENTARIA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN RELATIVA A LA SEC ID nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 139 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- CADENA COMPLEMENTARIA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN RELATIVA A LA SEC ID nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1043 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- CADENA COMPLEMENTARIA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN RELATIVA A LA SEC ID nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 271 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- CADENA COMPLEMENTARIA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN RELATIVA A LA SEC ID nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 316 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- CADENA COMPLEMENTARIA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN RELATIVA A LA SEC ID nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 272 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- CADENA COMPLEMENTARIA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN RELATIVA A LA SEC ID nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- CADENA COMPLEMENTARIA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAUUUAUUUAU UUAUUUAUUU A
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN RELATIVA A LA SEC ID nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- CADENA COMPLEMENTARIA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGAGCGUACG CGAGCUACAG GCUCGCGUAC GCUCC
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN RELATIVA A LA SEC ID nº 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- CADENA COMPLEMENTARIA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAUCCAUUGC ACUCCGGAUU U
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN RELATIVA A LA SEC ID nº 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- CADENA COMPLEMENTARIA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAAAAGGCUC UUUUCAGAGC CACCCA
\hfill26
Claims (3)
1. Procedimiento de utilización de una secuencia
de ácido nucleico para la identificación de compuestos que ejercen
un efecto sobre las interacciones entre una proteína de unión de
ARN y una molécula de ARN que comprende la secuencia de ácido
nucleico mediante:
la detección de las interacciones entre la
proteína de unión de ARN y la molécula de ARN en presencia de un
compuesto de ensayo y en ausencia del compuesto de ensayo,
en el que la secuencia de nucleótidos es la SEC.
ID. nº: 5.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que el procedimiento comprende:
- (a)
- formar un conjunto de una o más soluciones de ensayo, en el que cada solución de ensayo comprende la molécula de ARN y los componentes del tampón, en el que los componentes del tampón comprenden un tampón, un catión monovalente, un catión divalente, un agente reductor y un agente de densidad,
- (b)
- calentar la solución de ensayo durante un periodo de tiempo y a una temperatura suficientes para desnaturalizar las moléculas de ARN,
- (c)
- enfriar las soluciones de ensayo,
- (d)
- añadir las proteínas de unión de ARN a la solución de ensayo, y
- (e)
- detectar las interacciones entre las moléculas de ARN y las proteínas de unión de ARN en las soluciones de ensayo,
en el que uno de los compuestos de ensayo se
añade a la solución de ensayo durante o después de alguna(s)
de la(s)
etapa(s) (a) a (d)
etapa(s) (a) a (d)
en el que el procedimiento comprende además,
antes, simultáneamente o después de las etapas (a) a (e)
- (f)
- formar la solución de referencia que comprende la molécula de ARN y los componentes del tampón, en el que la solución de referencia no contiene ninguno de los compuestos de ensayo,
- (g)
- calentar la solución de referencia durante un tiempo y a una temperatura suficientes para desnaturalizar las moléculas de ARN,
- (h)
- enfriar la solución de referencia,
- (i)
- añadir las proteínas de unión de ARN a la solución de referencia, y
- (j)
- detectar las interacciones entre las moléculas de ARN y las proteínas de unión de ARN en la solución de referencia,
en el que un compuesto de ensayo se identifica
como un compuesto que ejerce un efecto sobre las interacciones
entre la molécula de ARN y la proteína de unión de ARN si difieren
las interacciones detectadas en la solución de referencia y las
interacciones detectadas en la solución de ensayo que contiene el
compuesto de ensayo.
3. Molécula de ácido nucleico en el que dicha
molécula de ácido nucleico consiste en la secuencia de nucleótidos
SEC. ID. nº: 5.
Applications Claiming Priority (2)
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