ES2551441T3

ES2551441T3 - Detección sistemática diferencial cualitativa

Info

Publication number: ES2551441T3
Application number: ES05003839.7T
Authority: ES
Inventors: Fabien Schweighoffer; Laurent Bracco; Bruno Tocque
Original assignee: Diaxonhit SA
Current assignee: Diaxonhit SA
Priority date: 1998-03-11
Filing date: 1999-03-11
Publication date: 2015-11-19
Anticipated expiration: 2019-03-11
Also published as: AU2839999A; JP4527280B2; ATE295426T1; AU760656B2; EP1566453A3; US6251590B1; DE69925253D1; DE69925253T2; JP2002505887A; EP1566453A2; EP1062364B1; FR2775984B1; PT1566453E; EP1566453B1; FR2775984A1; IL138249A0; WO1999046403A1; DK1566453T3; CA2323231A1; PT1062364E

Abstract

Composición que comprende un soporte y oligonucleótidos, caracterizada por que dichos oligonucleótidos son de hebra simple, con una longitud comprendida entre 5 y 50 nucleótidos, y son específicos de variaciones en las formas y/o perfiles de corte y empalme de varios genes distintos, y por que dichos oligonucleótidos son susceptibles de ser obtenidos por un procedimiento que comprende: (a) la identificación de un evento de corte y empalme característico de una situación fisiopatológica, y de la secuencia del dominio cortado y empalmado; (b) la síntesis artificial de uno o varios oligonucleótidos que corresponden a una o varias regiones de este dominio y que permiten, por hibridación, poner en evidencia la forma no cortada y empalmada en los ARN de una muestra de ensayo; (c) la síntesis artificial de uno o varios oligonucleótidos que corresponden a la región de unión entre los dos dominios separados mediante el dominio cortado y empalmado, y que permite, por hibridación, poner en evidencia la forma cortada y empalmada en los ARN de una muestra de ensayo; (d) la reproducción de las etapas (a) a (c) anteriores con otros eventos de corte y empalme característicos de dicha situación fisiopatológica; y (e) la transferencia de los oligonucleótidos sobre un soporte apropiado.

Description

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aislar de manera exhaustiva las variaciones de secuencias debidas a cortes y empalmes alternativos, y que distinga dos situaciones fisiopatológicas dadas.

Las composiciones de la invención se pueden utilizar igualmente, por lo tanto, para la detección o el seguimiento del potencial tóxico y/o terapéutico de un compuesto basado en la detección de formas y/o de perfiles de corte y empalme inducidos por este compuesto sobre una muestra biológica.

Ejemplos de aplicación de tales bancos se pueden suministrar mediante modelos de cultivo de hepatocitos, tal como la línea HepG2, de células epiteliales renales, tal como la línea HK-2, o de células endoteliales, tal como la línea ECV304, tratadas mediante agentes tóxicos tal como etanol, camptotecina o PMA.

Se puede igualmente suministrar un buen ejemplo mediante el uso en cosmetología de modelos de cultivo de pieles tratadas o no mediante agentes tóxicos o irritantes.

Las composiciones de la invención se pueden utilizar igualmente para evaluar (predecir) o mejorar el potencial terapéutico de compuestos de ensayo (genofarmacología).

En esta utilización, el principio utilizado es muy cercano al descrito anteriormente. Se establecen bancos diferenciales de referencia entre los ADNc y los ARN de un cultivo celular o de un órgano en una situación de control y de su equivalente mimético de un modelo de patología. Entonces, la eficacia terapéutica de un producto se puede evaluar siguiendo su capacidad de antagonizar las variaciones cualitativas de la expresión génica que son específicas del modelo patológico. Esto se pone en evidencia mediante la modificación del perfil de hibridación de una sonda que proviene del modelo patológico sobre los bancos de referencias: sin tratamiento, la sonda híbrida solamente con el banco que contiene las firmas específicas de la enfermedad. Tras tratamiento con un producto eficaz, la sonda aunque proviene del modelo patológico hibrida preferentemente con el otro banco, que lleva las firmas del modelo equivalente sano.

Un ejemplo de tal aplicación se puede suministrar mediante un modelo de apoptosis mimético de algunos aspectos de la neurodegeneración que son antagonizados por factores tróficos de referencia. Así, las células derivadas de feocromocitomas PC12 diferenciadas en cuerpos neuronales en presencia de NGF entran en apoptosis mediante eliminación de este factor de crecimiento. Esta apoptosis se acompaña por la expresión de numerosos marcadores de muerte celular programada de los cuales varios se regulan mediante corte y empalme alternativo y cuya aparición se inhibe mediante acción de IGF1. Dos bancos que provienen de detección sistemática diferencial cualitativa se establecen a partir de ARNm extraídos de células PC12 diferenciadas entradas en apoptosis mediante eliminación de NGF por una parte, y a partir de PC12 diferenciadas salvaguardadas de la apoptosis mediante la adición de IGF1 por otra parte. En estos bancos se pueden hibridar sondas realizadas a partir de ARNm extraídos de PC12 diferenciadas entradas en apoptosis y cuya supervivencia se mejora mediante tratamiento con un producto neuroprotector a ensayar. La eficacia de la inversión de las características cualitativas inducidas por el compuesto de ensayo se puede por lo tanto apreciar mediante la capacidad de la sonda para hibridar específicamente con los clones específicos del banco representativo de las células cuya supervivencia está mejorada. Después, este ensayo se puede utilizar para probar la eficacia de derivados del compuesto o de cualquier otra nueva familia de compuestos neuroprotectores, y para mejorar el perfil farmacológico.

Las composiciones de la invención permiten igualmente evaluar la eficacia de un compuesto de ensayo neuroprotector mediante hibridación con un banco diferencial según la invención, entre una célula nerviosa sana, y presentando está célula un modelo de neurodegeneración.

Como se indica anteriormente, la invención puede además ser utilizada para mejorar las propiedades de un compuesto, ensayando diferentes derivados para su capacidad de inducir un perfil de hibridación cercano del banco representativo de la muestra sana.

La invención se puede utilizar también en farmacogenómica, es decir, para evaluar (predecir) la respuesta de un paciente a un compuesto o tratamiento de ensayo.

La farmacogenómica tiene como ambición establecer perfiles genéticos de pacientes a fin de determinar qué tratamiento es susceptible de tener más éxito para una patología dada. Las técnicas descritas en la presente invención permiten a este respecto establecer bancos de ADNc representativos de las diferencias cualitativas que existen entre una situación patológica que responde a un tratamiento dado y otra que responde poco o mal, susceptible de ser el objeto de otra estrategia terapéutica. Estos bancos de referencias establecidos se pueden hibridar con sondas realizadas a partir de ARN mensajeros de pacientes. Los resultados de hibridación permiten saber qué paciente tiene un perfil de hibridación que corresponde a la situación de respondedor o de no respondedor y así afinar la elección del tratamiento.

En esta aplicación, el objetivo es, por una parte, proponer en función del paciente el tratamiento más apropiado, más susceptible de ser exitoso y, por otra parte, enrolar en un tratamiento a los pacientes más susceptibles de responder con éxito. Como en las demás aplicaciones, dos bancos de detección sistemática diferencial cualitativa se realizan: uno a partir de un modelo o de una muestra patológica conocida por responder a un tratamiento, el otro a partir de otro modelo o muestra patológica que responde poco o mal a la acción terapéutica. Después, estos dos bancos se

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hibridan con sondas que provienen de ARNm extraídos de biopsias de distintos pacientes. Según que estas sondas hibriden preferentemente con los cortes y empalmes alternativos específicos de una u otra situación, los pacientes se pueden repartir en respondedores o en no respondedores al tratamiento de referencia que ha definido los modelos de partida.

Después, el uso de filtros o cualquier otro soporte que presente los ADNc de estos bancos permite realizar hibridaciones con sondas derivadas de ARNm de biopsias de tumores de las cuales se quiere anticipar la respuesta a dicho tratamiento. Estos resultados permiten así proponer una inserción optimizada de los pacientes en un protocolo clínico.

Un ejemplo particular de este procedimiento consiste en determinar la respuesta de tumores a un tratamiento mediante el gen supresor de tumor p53. En efecto, se ha descrito que algunos pacientes y algunos tumores responden más o menos bien a este tipo de tratamiento (Roth et al., Nature Medicine, 2 (1995) 958). Por lo tanto, es importante poder determinar qué tipos de tumores y/o qué pacientes son sensibles a un tratamiento mediante terapia génica por p53 salvaje, con el fin de optimizar el tratamiento y favorecer el enrolamiento de los pacientes en los ensayos clínicos en curso. El procedimiento de la invención permite ventajosamente facilitar estas etapas proponiendo bancos específicos de las cualidades de células respondedoras y de células no respondedoras a p53. Ejemplos de modelos celulares sensibles o resistentes a p53 se describen por ejemplo por Sabbatini et al. (Genes Dev. 9 (1995) 2184) o por Roemer et al. (Oncogene 12 (1996) 2069). La hibridación de estos bancos con sondas derivadas de biopsias de pacientes permite fácilmente evaluar su potencial de respuesta. Además, los bancos específicos permiten igualmente identificar ácidos nucleicos implicados en la respuesta a p53.

Por lo tanto, la presente solicitud se refiere igualmente al establecimiento de composiciones a partir de muestras patológicas, o de modelos de patología, que responden diferentemente al menos a un agente farmacológico. Se refiere también a la exposición de estos bancos sobre filtros o sobre soportes conocidos por el experto en la técnica (nitrocelulosa, nailon...). Ventajosamente, estos soportes pueden ser chips o chips que definen así chips de farmacogenómica.

Aquí esta invención describe así que variaciones en las formas y/o perfiles de cortes y empalmes constituyen fuentes de marcadores de farmacogenómica, es decir fuentes de marcadores que permiten la puesta en evidencia de la capacidad y de la manera de un paciente a responder a tratamientos. Para ello, la invención describe igualmente el uso de la intervariabilidad, entre individuos, de isoformas generadas mediante corte y empalme alternativo (análisis del espliceoma) como fuente de marcadores de farmacogenómica. Aquí esta invención describe también el uso de modificaciones de corte y empalme inducidas por tratamientos como fuente de marcadores de farmacogenómica.

Estos distintos ejemplos generales ilustran el interés de las composiciones de la invención en estudios de genotoxicidad, genofarmacología, farmacogenomía así como en búsquedas de dianas de interés diagnóstico o terapéutico. Otras ventajas y aplicaciones de la presente invención aparecerán con la lectura de los ejemplos siguientes, que se deben considerar como ilustrativos y no limitativos. Los campos de aplicación de la invención se representan en la figura 7.

LEYENDA DE LAS FIGURAS

Figura 1. Representación esquemática de las detecciones sistemáticas diferenciales según la invención (figura 1A) utilizando una (figura 1B) o dos (figura 1C) hibridaciones, y uso de los ácidos nucleicos (figura 1D).

Figura 2. Representación esquemática que describe la obtención de híbridos ARN/ADN que permiten caracterizar las secuencias de ARN de hebra simple, firmas específicas del estado patológico o del estado sano.

Figura 3. Representación esquemática que describe un medio que permite aislar y caracterizar mediante secuenciación las secuencias de ARN de hebra simple específicas de una situación patológica o de una situación sana.

Figura 4. Representación esquemática que describe otro medio que permite caracterizar mediante secuenciación todo o parte de los ARN de hebra simple específicos de una situación patológica o de una situación sana.

Figura 5. Representación esquemática que permite aislar los productos de cortes y empalmes alternativos gracias a estructuras de bucle R.

Figura 6. Representación esquemática de la detección sistemática diferencial cualitativa mediante restricción de bucles (formación de homodúplex ADNcdb/ADNc y extracciones de las informaciones, Figura 6A), y descripción de las informaciones obtenidas (Figura 6B).

Figura 7. Aportaciones de la detección sistemática diferencial cualitativa en las distintas etapas de la búsqueda y del desarrollo farmacéutico.

Figura 8. Aislamiento de un dominio diferencialmente cortado y empalmado en el modelo grb2/grb33. A) Producción de los ARN sintéticos de grb2 y de grb33. B) Seguimiento de las primeras etapas DATAS que conducen a la

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EJEMPLOS

1. CLONACIÓN DIFERENCIAL DE LOS CORTES Y EMPALMES ALTERNATIVOS Y OTRAS MODIFICACIONES CUALITATIVAS DE LOS ARN UTILIZANDO ADNc DE HEBRA SIMPLE

Los ARN mensajeros que corresponden a dos situaciones, una normal (mN) y la otra patológica (mP), se aíslan a partir de biopsias o de células en cultivo. Estos ARN mensajeros se convierten en ADN complementarios (cN) y (cP) con la ayuda de la transcriptasa inversa (RT). Después, se realizan híbridos mN/cP y cN/mP en fase líquida (véase el esquema de la figura 2 que ilustra uno de los dos casos que dan lugar a la formación de cN/mP).

Estos híbridos se realizan ventajosamente en emulsión fenólica (técnica PERT o Phenol Emulsion DNA Reassociation Technique) mantenida por termociclos (Miller, R., D. y Riblet, R., 1995, Nucleic Acids Research, vol 23, nº 12, p 2339-2340). Típicamente, esta etapa de hibridación se realiza entre 0,1 a 1 µg de ARN poliA+ y 0,1 a 2 µg de ADN complementario en una emulsión formada de una fase acuosa (tampón fosfato de sodio 120 mM, NaCl 2,5M, EDTA 10 mM) y de una fase orgánica que representa 8% de la fase acuosa y constituida de fenol bidestilado.

Igualmente, se usa ventajosamente otra técnica a fin de obtener heterodúplex: al final de la transcripción inversa, el ADNc neosintetizado se separa del cebador oligodT biotinilado sobre columna de exclusión. Se coprecipita 0,1 a 2 µg de este ADNc con 0,1 a 1 µg de ARN poliA+ en presencia de 0,3M de acetato de sodio y de dos volúmenes de etanol. Estos ácidos nucleicos coprecipitados se recogen en 30 µl de un tampón de hibridación que contiene 80% de formamida, 40 mM de PIPES (ácido piperazinabis(2-etanosulfónico)) pH 6,4, 0,4 M de NaCl y 1 mM de EDTA.

Los ácidos nucleicos en disolución se desnaturalizan mediante calentamiento 10 min. a 85ºC, después se realiza su hibridación durante al menos 16h y hasta 48h a 40ºC.

El interés de la técnica de hibridación en formamida es permitir condiciones de selectividad más grande durante el emparejamiento de las hebras de ADNc y de ARN.

Al final de cada una de estas dos técnicas de hibridación, se dispone de heterodúplex ARN/ADN cuya perfección de emparejamiento depende de la eficacia de la RT para sintetizar la longitud total de los ADNc. Las regiones de ARN (y de ADN) que corresponden a los cortes y empalmes alternativos que diferencian los dos estados fisiopatológicos estudiados permanecen igualmente en forma de hebras simples.

Después, el objetivo del método es de caracterizar la información genética llevada por estos bucles de corte y empalme.

Para ello, los heterodúplex se purifican mediante captura de los ADNc (cebadores con oligodT biotinilados) gracias a perlas que llevan grupos estreptavidinas. Ventajosamente, estas perlas son perlas que tienen propiedades magnéticas, lo que permite separarlas de los ARN no introducidos en los heterodúplex mediante acción de un separador magnético. Tales perlas y tales separadores están disponibles comercialmente.

Los heterodúplex se aíslan en este momento del procedimiento así como los ADNc no introducidos en hibridaciones con ARN. Después, este material se somete a la acción de la ARNasaH que va a hidrolizar específicamente las regiones de ARN hibridadas con los ADNc. Los productos resultantes de esta hidrólisis son por una parte los ADNc y por otra parte los fragmentos de ARN que corresponden a los bucles de corte y empalme o a las regiones no hibridadas por el hecho del rendimiento parcial de la transcriptasa inversa. Los fragmentos de ARN se separan del ADN mediante separación magnética según el mismo modo de realización que el mencionado más arriba y mediante digestión con la ADNasa libre de cualquier contaminación por una actividad ARNasa.

1.1. Validación de la técnica DATAS sobre las variantes de corte y empalme del gen Grb2

Se realizó una puesta en evidencia de la factibilidad de este enfoque sobre un sistema in vitro utilizando un ARN que corresponde a la región que codifica Grb2 por una parte y, un ADNc de hebra simple complementario a la región que codifica Grb3.3. Grb2 es un gen que posee una fase que codifica 651 pares de bases. Grb33 es una isoforma de grb2 generada mediante corte y empalme alternativo y que comprende una supresión de 121 pares de bases en el dominio funcional SH2 de grb2 (Fath et al., Science (1994), 264, 971-4). Los ARN de Grb2 y de Grb33 se sintetizan según las técnicas conocidas por el experto en la técnica a partir de un plásmido que contiene la secuencia que codifica Grb2 o Grb33, bajo control del promotor T7 con la ayuda del kit RiboMax (Promega). El análisis de los productos demuestra una síntesis homogénea (figura 8A). Con un objetivo de visualización, el ARN de Grb2 ha sido igualmente hecho radioactivo mediante incorporación de una base marcada durante la transcripción in vitro con la ayuda del kit RiboProbe (Promega). Los ADNc de Grb2 y Grb3.3 han sido sintetizados mediante transcripción inv4ersa a partir de los ARN sintéticos producidos aquí arriba, del kit Superscript II (Life Technologies) y mediante un cebador oligonucleotídico biotinilado común a Grb2 y a Grb33 que corresponde al complementario de la secuencia (618-639) de Grb2. Los ARN y ADNc han sido tratados según las indicaciones de los proveedores (Promega, Life

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Technologies), purificados sobre columna de exclusión (sephadex sin ARNasa G25 o G50, 5 Prime, 3 Prime) y cuantificados mediante espectrofotometría.

Las primeras etapas de DATAS se han aplicado asociando, en suspensión 10 ng de ARN marcado de Grb2 con:

1.: 100 ng de ADNc de grb33 biotinilado,

2.: 100 ng de ADNc de grb2 biotinilado,

3.: agua

en 30 µl de tampón de hibridación que contiene 80% de formamida, 40 mM PIPES (pH 6,4), 0,4 M NaCl, 1 mM EDTA. Los ácidos nucleicos se desnaturalizan mediante calentamiento 10 min. a 85ºC, después, la hibridación se realiza durante 16 horas a 40ºC. Tras la captura con la ayuda de perlas de estreptavidina, las muestras se tratan con la ARNasa H como se ha descrito anteriormente.

El análisis de estas etapas se realiza mediante electroforesis sobre gel de acrilamida al 6% seguido por un tratamiento de los geles con la ayuda de un Instant imager (Packard Instruments) permitiendo la cualificación y la cuantificación de las especies que provienen del ARN de grb2 marcado (figura 8B). Así, los pocillos 2, 3 y 4 indican que los dúplex grb2/grb33 y grb2/grb2 se han formado de manera cuantitativa. La migración del complejo grb2/grb33 se retrasa con relación a la del ARN de grb2 (pocillo 2) mientras que la del complejo grb2/grb2 se aumenta (pocillo 3). Los pocillos 5, 6 y 7 corresponden a las muestras no retenidas por las perlas de estreptavidina demostrando que 80% de los complejos grb2/grb33 y grb2/grb2 han sido retenidos sobre las perlas mientras que el ARN de grb2 solo, no biotinilado, se encuentra exclusivamente en el sobrenadante de las perlas. El tratamiento con la ARNasa H libera, además de los nucleótidos libres que inmigran más rápidamente que el azul de Bromofenol (BPB) una especie que migra debajo del azul de xileno Cianol (XC) (marcado mediante una flecha en la figura) y eso, específicamente en el pocillo 8 que corresponde al complejo grb2/grb33 con relación a los pocillos 9 y 10 que corresponden al complejo grb2/grb2 y al ARN de grb2. Los pocillos 11, 12 y 13 corresponden a los pocillos 8, 9 y 10 tras paso de las muestras sobre columna de exclusión para eliminar los nucleótidos libres. La migración observada en los pocillos 8 y 11 es la esperada para una molécula de ARN que corresponde a la supresión de 121 nucleótidos que diferencian grb2 de grb33.

Este resultado muestra bien la posibilidad de obtener los bucles de ARN generados mediante la formación de heterodúplex entre dos secuencias derivadas de dos isoformas de corte y empalme.

1.2. Aplicación de la técnica DATAS para la generación de bancos cualitativos de células hepáticas en un estado sano y tóxico

Se estudió una situación más compleja. En el ámbito de la aplicación de la tecnología DATAS como herramienta de predicción de toxicidad de moléculas, se trataron células humanas de tipo hepatocitario, HepG2, mediante etanol 0,1M durante 18 horas. Los ARN han sido extraídos a partir de células tratadas o no. La variante de DATAS descrita aquí arriba (preparación de ADNc sb biotinilados, hibridaciones cruzadas en fase líquida, aplicación de un campo magnético para separar las especies, tratamiento con ARNasaH) se ha aplicado con las células no tratadas en situación de referencia (o situación A), y las células tratadas en situación de ensayo (situación B) (figura 9). No estando los ARN extraídos marcados radiactivamente, la visualización de las poblaciones de ARN generadas mediante digestión con la ARNasaH se realiza efectuando una reacción de intercambio del fosfato en 5’ de los ARN por un fosfato marcado, con la ayuda de polinucleótido quinasa de T4 y de gamma-P32ATP. Después, estos marcajes se depositan sobre un gel de acrilamida/urea, y se analizan mediante exposición con la ayuda de un Instant Imager (Packard Instruments). Entonces, se pueden visualizar firmas complejas que provienen de las hibridaciones A/B y B/A con un primer grupo de señales que migran débilmente en el gel y que corresponden a secuencias de ácidos nucleicos de tamaño importante, y un segundo grupo de señales que migran entre 25 y 500 nucleótidos. Estas firmas son de intensidad mucho más débil a partir de la situación A/A lo que sugiere que el etanol puede inducir una reprogramación del corte y empalme de los ARN, traducida por la existencia de señales en A/B y B/A.

1.3. Clonación y preparación de bancos a partir de los ácidos nucleicos identificados.

Después, varias variantes experimentales se pueden prever para clonar estos fragmentos de ARN resistente a la acción de la ARNasa H:

A. Un primer enfoque consiste en aislar estos bucles y en clonarlos (Figura 3).

Según este enfoque, se procede a una ligación de oligonucleótidos en cada uno de los extremos mediante la acción de la ARN ligasa según las condiciones conocidas por el experto en la técnica. Después, estos oligonucleótidos se utilizan como cebadores para efectuar una RT PCR. Los productos de PCR se clonan y se detectan sistemáticamente con sondas de ADN complementarias totales que corresponden a las dos situaciones fisiopatológicas de interés. Solamente los clones que hibridan preferentemente con una sola de las dos sondas contienen los bucles de corte y empalme que a continuación se secuencian y/o se utilizan para generar bancos.

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B. El segundo enfoque (Figura 4) consiste en efectuar una transcripción inversa sobre el ARN de hebra simple liberado de los heterodúplex tras acción de la ARNasaH, iniciada con la ayuda de cebadores al menos en parte aleatorios. Así, puede tratarse de cebadores aleatorios en 3’ y en 5’, de cebadores aleatorios en 3’ y determinados en 5’, o también de oligonucleótidos semi-aleatorios, es decir que comprenden una zona de degeneración y una zona definida.

Según esta estrategia, los cebadores son por lo tanto susceptibles de hibridarse bien en cualquier sitio en el ARN de hebra simple, o bien en cada sucesión de bases fijada por la elección del cebador semi-aleatorio. Una PCR con cebadores que corresponden a los oligonucleótidos descritos aquí arriba, permite obtener a continuación secuencias derivadas de los bucles de corte y empalme.

La figura 10 (pocillos 1 a 12) muestra el análisis sobre gel de acrilamida de los fragmentos de PCR obtenidos a partir de varios ensayos DATAS y acoplados al uso de los oligonucleótidos semi-aleatorios siguientes:

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La comparación con la complejidad de las señales obtenidas utilizando los mismos oligonucleótidos, pero ADNc total como matriz (pocillo 13) demuestra que DATAS ha permitido filtrar (“perfilar”) informaciones que corresponden a diferencias cualitativas.

Esta variante se utilizó con el fin de clonar un evento que corresponde al dominio ARN de grb2 generado por acción de la ARNasa H a partir del dúplex ARN grb2 / ADNc de hebra simple de grb33 según el protocolo descrito anteriormente (ejemplo 1.1.). Con este fin, se utilizó un oligonucleótido de secuencia: GAGAAGCGTTATNNNNNNNNTCCC (SEQ ID NO: 2), elegido sobre el modelo GAGAAGCGTTATNNNNNNNWXYZ (en el que N se define como anteriormente, W, X e Y representan cada uno una base fija determinada, y Z representa bien una base determinada o bien un grupo 3’-OH, SEQ ID NO: 3) y seleccionado para amplificar un fragmento en la supresión de grb2, permitiendo generar un fragmento PCR cuya clonación y secuenciación ha demostrado que provenía efectivamente del dominio suprimido de grb2 (194-281 en grb2).

Estos dos enfoques permiten por lo tanto la producción de composiciones de ácidos nucleico representativos de los cortes y empalmes diferenciales en las dos situaciones ensayadas que se pueden utilizar como sondas o para construir bancos de ADNc de diferencias cualitativas. La capacidad de la tecnología DATAS para generar bancos perfilados de ADNc representativos de diferencias cualitativas se ilustra igualmente por el ejemplo 1.4. siguiente.

1.4. Producción de bancos perfilados representativos de células endoteliales humanas

Este ejemplo se realizó a partir de una línea de células endoteliales humanas (ECV304). El análisis cualitativo de la expresión genética se realizó a partir de ARN citosólicos extraídos de células en proliferación, por una parte, y de células en anoikis (apoptosis mediante privación de soporte de unión), por otra parte.

Las células ECV se cultivaron en medio 199 con un suplemento de sales de Earle (Life Sciences). Su puesta en anoikis se realizó mediante paso durante 4 horas sobre placas de cultivo tratadas con polyHEMA. Durante la preparación de los ARN, las células se lisaron en un tampón que contiene Nonidet P-40. Después, se apartan los núcleos mediante centrifugación. Después, la disolución de extracto citoplásmico se ajustó a fin de fijar de manera específica el ARN a la matriz de sílice Rneasy según las instrucciones de la empresa Qiagen. Tras lavar, los ARN totales se eluyen en agua tratada con DEPC. Los ARN mensajeros se preparan a partir de los ARN totales mediante separación sobre perlas magnéticas Dynabeads oligo (dT)25 (Dynal). Tras haber puesto en suspensión las perlas en un tampón de fijación, el ARN total se incuba durante 5 min. a temperatura ambiente. Después de la separación magnética y el lavado, las perlas se recogen en un tampón de elución para una incubación a 65ºC que libera los ARN mensajeros.

Las síntesis de ADN de primer hebra se efectúan a partir de los ARN mensajeros utilizando la Transcriptasa Inversa SuperScript II o ThermoScript (Life Technologies) con la ayuda de cebadores olido (dT). Después de ARNasaH, los nucleótidos libres se eliminan mediante paso sobre columna Sephadex G50 (5 Prime-3 Prime). Tras extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol, las muestras se cuantifican mediante absorbancia UV.

Las cantidades requeridas de ARN y de ADNc (en este caso, 200 ng de cada uno) se combinan y se precipitan con etanol. Las muestras se recogen en un volumen de 30 µl en un tampón de hibridación (Hepes (pH 7,2) 40 mM, NaCl 400 mM, EDTA 1mM) con un suplemento de formamida desionizada (80% (v/v), salvo indicación contraria). Tras desnaturalización 5 min. a 70ºC, las muestras se incuban una noche a 40ºC.

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Las perlas de Streptavidina (Dynal) se lavan y después se reacondicionan en un tampón de fijación (2X = Tris-HCI (pH 7,5) 10 mM, NaCl 2M, EDTA 1mM). Las muestras de hibridación se llevan a un volumen de 200 µl con agua, después se ajustan a 200 µl de perlas para una incubación de 60 min. a 30ºC. Tras captura sobre imán y lavados de las perlas, éstas se recogen en 150 µl de tampón ARNasaH y después se incuban durante 20 min. a 37ºC. Tras captura sobre imán, las regiones no hibridadas se han liberado en el sobrenadante que se trata con la ADNasa, después se extrae con fenol ácido /cloroformo, y después se precipita con etanol. Las precipitaciones con etanol de bajas cantidades de ácidos nucleicos se efectúan con la ayuda de un polímero comercial SeeDNA (Amersham Pharmacia Biotech) permitiendo recuperar de manera cuantitativa ácidos nucleicos a partir de disoluciones muy diluidas (del orden de ng/ml).

La síntesis de ADNc a partir de las muestras de ARN que provienen de la acción de la ARNasaH se efectúa a partir de hexanucleótidos aleatorios con la ayuda de Transcriptasa Inversa Superscript II. Después, el ARN se degrada con la ayuda de una mezcla de ARNasaH y de ARNasa T1. El cebador, los nucleótidos no incorporados y las enzimas se separan del ADNc con la ayuda de un cartucho “GlassMAX Spin”. Después, el ADNc que corresponde a los bucles de corte y empalme se somete a una reacción de PCR utilizando oligonucleótidos de tipo semi-aleatorio ya descritos más arriba en la invención. En este caso, los oligonucleótidos elegidos son:

GAGAAGCGTTATNNNNNCCA (SEQ ID NO: 4)

La reacción de PCR se realiza con la ayuda de Taq Polimerasa sobre 30 ciclos:

•: Desnaturalización inicial: 94ºC durante 1 min.

•: 94ºC durante 30 s

•: 55ºC durante 30 s

•: 72ºC durante 30 s

•: Extensión final: 72ºC durante 5 min.

Los productos de PCR se clonaron en el vector pGEM-T (Promega) que posee un T flotante en los extremos 3’ a fin de facilitar la clonación de fragmentos que provienen de la actividad de la Taq Polimerasa. Tras transformación en las bacterias JM109 competentes (Promega), las colonias obtenidas se repican sobre filtro de nitrocelulosa, y se hibridan con sondas derivadas de productos de PCR efectuadas sobre ADNc totales de las células en proliferación por una parte, y en anoikis por otra parte. Para estas PCR se utilizan los mismos oligonucleótidos GAGAAGCGTTATNNNNNCCA. En una primera realización experimental, se aislaron 34 clones que hibridan preferentemente con la sonda de las células en apoptosis y 13 clones que hibridan preferentemente con la sonda de las células en proliferación.

Entre estos 13 clones, 3 clones contienen el mismo fragmento de ADNc que deriva del dominio SH2 de la proteína SHC.

La secuencia de este fragmento es la siguiente:

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El uso de cebadores de PCR que encuadran el dominio SH2 de SHC (oligo5’: GGGACCTGTTTGACATGAAGCCC (SEQ ID NO: 6); oligo3’: CAGTTTCCGCTCCACAGGTTGC (SEQ ID NO: 7)) ha permitido caracterizar la supresión del dominio SH2 de SHC que se observa específicamente en las células ECV en anoikis. Con esta pareja de cebador, un solo producto de amplificación que corresponde a un fragmento de ADNc de 382 pares de bases que contiene el dominio SH2 integro se obtiene a partir de ARN de células ECV en fase exponencial. Un fragmento adicional de 287 pares de bases se observa cuando la PCR se realiza a partir de ARN de células en anoikis. Este fragmento suplementario deriva de un ARN mensajero derivado del mensajero de SHC pero que presenta una supresión.

La secuencia de esta supresión es la siguiente:

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Esta supresión corresponde a las bases 1198 a 1293 de la fase abierta del mensajero que codifica las formas de 52kDa y 46kDa de la proteína SHC (Pelicci, G. et al., 1992, Cell, 70, p 93-104).

Los datos estructurales de los dominios SH2 así como la bibliografía indican que tal supresión lleva a la perdida de la afinidad para las fosfotirosinas puesto que engloba los aminoácidos implicados en las interacciones con las tirosinas fosforiladas (Waksman, G. et al, 1992, Nature, vol 358, p 646-653). Siendo las proteínas SHC adaptadores que conectan distintas parejas mediante sus dominios SH2 y PTB (dominio de unión fosfo tirosina), esta supresión genera por lo tanto un dominante negativo natural de SHC que denominamos ∆SHC. Estando los dominios SH2 de las proteínas cuyos genes se secuencian portados por dos exones, es posible que la supresión identificada mediante el método DATAS corresponda a un exón alternativo del gen SHC.

Las secuencias proteicas y nucleicas de ∆SHC son las representadas en la Figura 17 (SEQ ID NO: 9 y 10).

Estando el dominio SH2 de SHC implicado en la transducción de numerosas señales implicadas en la proliferación y la viabilidad celulares, el examen de la secuencia de ∆SHC permite anticipar sus propiedades de dominante negativo sobre la proteína SHC y su capacidad de interferir con distintas señales celulares.

Aquí, se describe igualmente esta nueva forma cortada y empalmada de SHC, el dominio proteico que corresponde al corte y empalme, cualquier anticuerpo o sonda nucleica que permita su detección en una muestra biológica, y sus usos diagnóstico o terapéutico, por ejemplo.

Aquí, se describe particularmente cualquier variante de SHC que comprende al menos una supresión que corresponde a las bases 1198 a 1293, más particularmente una supresión de la secuencia SEQ ID NO: 8. La invención se refiere más específicamente a la variante ∆SHC que tiene la secuencia SEQ ID NO: 9, codificada por la secuencia SEQ ID NO: 10.

Aquí, se describe también cualquier sonda nucleica, oligonucleótido o anticuerpo que permita identificar la variante ∆SHC aquí arriba, y/o cualquier alteración de la relación SHC/∆SHC en una muestra biológica. Puede tratarse especialmente de una sonda u oligonucleótido complementario de todo o parte de la secuencia SEQ ID NO: 8, o de un anticuerpo dirigido contra el dominio proteico codificado por esta secuencia. Tales sondas, oligonucleótidos o anticuerpos permiten detectar la presencia de la forma no cortada y empalmada (por ejemplo, SHC) en una muestra biológica.

Los materiales pueden además ser utilizados en paralelo con sondas, oligonucleótidos y/o anticuerpos específicos de la forma cortada y empalmada (por ejemplo, ∆SHC), es decir que corresponde por ejemplo a la región de unión resultante del corte y empalme (localizado alrededor del nucleótido 1198 de la secuencia SEQ ID NO: 10).

Tales materiales se pueden utilizar para el diagnóstico de patologías relacionadas con una inmunodepresión (cáncer, tratamiento inmunosupresor, SIDA, etc.).

Aquí, se describe también cualquier procedimiento de detección sistemática de moléculas basado sobre el bloqueo

(i) del dominio cortado y empalmado en la proteína SHC (especialmente para inducir un estado de tolerancia inmunitaria por ejemplo en las enfermedades auto-inmunes o los rechazos de injertos, y los cánceres) o (ii) de las ganancias de función adquiridas mediante la proteína ∆SHC.

Aquí, se describe además el uso terapéutico de ∆SHC, y especialmente para el tratamiento de células cancerosas o de cánceres (ex vivo o in vivo) en los que una hiperfosforilación de la proteína SHC se puede poner en evidencia, por ejemplo. Para ello, aquí se describe también cualquier vector, especialmente viral, que comprende una secuencia que codifica ∆SHC. Se trata preferentemente de un vector capaz de transfectar células cancerosas o en proliferación, tales como células musculares lisas, células endoteliales (restenosis), fibroblastos (fibrosis), preferentemente de origen mamífero, especialmente humano. Como vector viral, se pueden citar especialmente vectores adenovirales, retrovirales, AAV, herpes, etc.

2. CLONACIÓN DIFERENCIAL DE LOS CORTES Y EMPALMES ALTERNATIVOS Y OTRAS MODIFICACIONES CUALITATIVAS DE LOS ARN UTILIZANDO ADNc DOBLE HEBRA (FIGURA 5).

Se producen los ARN mensajeros que corresponden a las situaciones normales (mN) y patológicas (mP), así como los ADN complementarios doble hebra correspondientes (dsN y dsP) mediante protocolos clásicos de biología molecular. Entonces, se obtienen estructuras de tipo “bucle R” hibridando mN con dsP y mP con dsN en una disolución que contiene 70% de formamida. Los dominios nucleicos diferencialmente cortados y empalmados entre la situación N y P quedarán en forma de ADN doble hebra. Entonces, las simples hebras de ADN desplazadas se tratan con glioxal con el fin de evitar el redesplazamiento de la hebra de ARN durante la retirada de la formamida. Tras la retirada de la formamida y del glioxal y tras tratamiento con ARNasaH, nos encontramos con estructuras de tipo abeja, los ADN de hebra simple no emparejados representan las alas de la abeja y el dominio de doble hebra equipado de interés representa el cuerpo de la abeja. El uso de enzimas que degradan específicamente el ADN de hebra simple como la nucleasa S1 o la nucleasa Mung Bean permite el aislamiento del ADN que quedó en forma doble hebra que a continuación se clona y después se secuencia. Esta segunda técnica permite la obtención directa

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Siendo uno de los aportes del corte y empalme diferencial cualitativo permitir la evaluación del potencial tóxico de un compuesto, tal como se indica en el capítulo siguiente, un buen ejemplo de realización de la tecnología es la obtención mediante DATAS de clones de ADNc que corresponden a secuencias específicas de células HepG2 sin tratamiento, por una parte, y tratadas con etanol, por otra parte. Estas células presentan firmas de citotoxicidad y una degradación de su ADN mediante fragmentación internucleosomal a partir de 18h en presencia de 1M de etanol. Con el fin de obtener marcadores precoces de la toxicidad etanólica, los ARN mensajeros se prepararon a partir de células sin tratamiento y de células tratadas durante 18h con etanol con una concentración de 0,1M. Tras realizar la variante de DATAS que utiliza el ADNc de hebra simple y la ARNasa H, los ADNc clonados obtenidos se amplificaron mediante PCR, se sometieron a una electroforesis sobre gel de agarosa y después se transfirieron sobre un filtro de nailon según las técnicas conocidas por el experto en la técnica. Para cada conjunto de clones específicos por una parte de las diferencias cualitativas específicas del estado sin tratamiento y, por otra parte de las secuencias específicas de las células tratadas con etanol, se efectuaron dos réplicas idénticas de filtros. Así, las huellas de cada conjunto de clones se hibridan por una parte con una sonda específica de las células no tratadas y, por otra parte, con una sonda específica de las células tratadas con 0,1M de etanol durante 18h.

El perfil de hibridación diferencial obtenido y presentado en la figura 12, permite apreciar la cualidad de la sustracción efectuada durante la realización de la técnica DATAS. Así, los clones que provienen de la hibridación del ARNm de células no tratadas (NT) con el ADNc de células tratadas (Tr) y que deben corresponder a diferencias cualitativas específicas de la situación sin tratamiento hibridan preferentemente con una sonda que representa la población total de los ARN mensajeros de las células no tratadas. Recíprocamente, los clones que provienen de los productos resistentes a la ARNasa H habiendo actuado sobre los heterodúplex ARN(Tr)/ADNc(NT) hibridan preferentemente con una sonda derivada de la población total de los ARN mensajeros de las células tratadas.

Los dos conjuntos de clones específicos por una parte de la situación tratada y por otra parte de la situación no tratada representan un ejemplo de bancos de diferencias cualitativas característicos de dos estados celulares distintos.

4. USOS Y APORTACIONES DE LOS BANCOS DIFERENCIALES CUALITATIVOS.

Las posibilidades de uso de los bancos diferenciales de corte y empalme de la invención se ilustran especialmente en las Figuras 13 a 15. Así, estos bancos son utilizables para:

4.1. La evaluación del potencial tóxico de un compuesto (figura 13):

En este ejemplo, la situación de referencia se designa por A y la situación tóxica se designa por B. Se obtienen ábacos de toxicidad mediante tratamiento de la situación A en presencia de distintas concentraciones de un compuesto tóxico de referencia, durante periodos variables. En distintos puntos de los ábacos de toxicidad, se construyen bancos diferenciales cualitativos (pares de bancos), en este ejemplo, bancos restringidos rA/cB y rB/cA. Los pares de bancos se depositan ventajosamente sobre un soporte. Después, el soporte se híbrida con sondas que provienen de la muestra biológica inicial tratada mediante distintas dosis de compuestos de ensayo: Productos X, Y y Z. La hibridación se revela y hace aparecer el potencial tóxico de los productos de ensayo: en este ejemplo, el producto Z presenta una toxicidad fuerte y el producto Y ofrece un perfil intermedio. La factibilidad de esta constitución de ábacos de toxicidad se ilustra bien por el ejemplo de constitución de bancos de detección sistemática diferencial cualitativa descrito aquí anteriormente y que utiliza el etanol y células HepG2.

4.2. La evaluación de la eficacia de una composición farmacéutica (figura 14):

En este ejemplo, se realiza un par de bancos restringidos según la invención a partir de un modelo patológico B y de un modelo sano A (o del modelo patológico tratado con un producto activo de referencia). Los bancos diferenciales rA/cB y rB/cA se depositan, llegado el caso, sobre un soporte. Este par de bancos agrupa las diferencias de corte y empalme entre las dos situaciones. Este par de bancos permite evaluar la eficacia de un compuesto de ensayo, es decir determinar su capacidad de generar un perfil de tipo “sano” (rA/cB) a partir del perfil de tipo patológico (rB/cA). En este ejemplo, el par de bancos se híbrida con sondas preparadas a partir de las situaciones A y B con o sin tratamiento mediante el compuesto de ensayo. El perfil de hibridación que se puede obtener se presenta en la figura

14. La factibilidad de esta aplicación es la misma que la de la constitución de bancos de diferencias cualitativas características de situaciones sanas y tóxicas presentada más arriba. La situación tóxica se sustituye por el estado patológico y es posible apreciar la capacidad de un compuesto de ensayo para producir una sonda que híbrida con más o menos preferencia con las situaciones de referencia o patológica.

4.3. La anticipación de la respuesta de una muestra patológica a un tratamiento (figura 15):

En este ejemplo, se realiza una par de bancos restringido según la invención a partir de dos modelos patológicos, de los cuales uno responde a un tratamiento mediante un producto dado (el gen p53 salvaje por ejemplo): situación A; y el otro es refractario: situación B. Este par de bancos (rA/cB; rB/cA) se deposita sobre un soporte.

Después, este par de bancos se utiliza para determinar la sensibilidad de una muestra patológica de ensayo a este mismo producto. Para ello, este par de bancos se híbrida con sondas que provienen de biopsias de pacientes de los

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-cualquier constitución y cualquier utilización de bancos virtuales informáticos que reúnen exones o intrones alternativos, caracterizados por que estos bancos permiten concebir sondas nucleicas o cebadores oligonucleotídicos con el objetivo de caracterizar los cortes y empalmes alternativos que diferencian dos estados fisiopatológicos distintos.

-cualquier composición farmacéutica o de diagnóstico que comprende polipéptidos, ácidos nucleicos con sentido o antisentido, o moléculas químicas capaces de interferir con los productos de corte y empalme alternativos puestos en evidencia y clonados mediante las técnicas de la invención,

-cualquier composición farmacéutica o de diagnóstico que comprende polipéptidos, ácidos nucleicos con sentido o antisentido, o moléculas químicas capaces de restaurar un corte y empalme representativo de una situación normal mediante oposición al evento alternativo característico de una situación patológica.

5. DESREGULACIONES DE LOS MECANISMOS DE CORTE Y EMPALME DE LOS ARN MEDIANTE AGENTES TÓXICOS.

Este ejemplo muestra que las diferencias de formas y/o de perfiles de cortes y empalmes se pueden utilizar como marcadores para el seguimiento y/o la supresión de toxicidad y/o de eficacia de compuestos.

Los efectos de agentes tóxicos sobre las desregulaciones de cortes y empalmes de los ARN se ensayaron de la manera siguiente. Células hepatocitarias, HepG2, se trataron mediante distintas dosis de tres compuestos tóxicos (etanol, camptotecina, PMA (forbol 12-miristato 13-acetato)). Dos ensayos de citotoxicidad (Azul de Tripán, MTT) se realizaron en distintos momentos: 4h y 18h para el etanol; 4h y 18h para la camptotecina; 18h y 40h para el PMA.

El Azul de Tripán es un colorante que se puede incorporar por las células vivas. Un sencillo recuento de las células “azules” y “blancas” con microscopio permite determinar el porcentaje de células vivas tras tratamiento o porcentaje de supervivencia. Los puntos se efectúan por triplicado.

El ensayo MTT es un ensayo colorimétrico que mide la capacidad de las células vivas de convertir las sales solubles de tetrazolio (MTT) en un precipitado insoluble de formazán. Estos cristales de formazán, azul oscuro, se pueden disolver y su concentración se puede determinar mediante medida de absorbancia a 550 nm. Así, tras sembrar placas de 24 pocillos mediante 150.000 células en la noche, y tras tratamiento de las células mediante los compuestos tóxicos, se añaden 50 µl de MTT (Sigma) (a 5 mg/ml en PBS). La reacción de formación de los cristales de formazán se efectúa en 5 h en incubador con CO2 (37ºC, 5% CO2, 95% humedad). Tras adición de 500 µl de disolución de solubilización (Hcl 0,1N en isopropanol-Triton X-100 (10%)), los cristales se disuelven bajo agitación y se miden las absorbencias a 550 a 660 nm. Los puntos se efectúan por triplicado con controles (viabilidad, muerte celular, blancos) apropiados.

Se realizó igualmente un ensayo de apoptosis o muerte celular programada mediante medida de la fragmentación de ADN mediante el uso de anticuerpos anti-histona y medidas de ELISA. El ensayo utilizado es el Cell Death ELISA Plus de Roche.

Los resultados de estos tres ensayos (Figuras 18 A, B, C) han permitido determinar que las dosis siguientes:

•: etanol: 0,1M

•: camptotecina: 1 µg/ml

•: PMA: 50 ng/ml

eran mucho menores que las CI50 medidas.

Así, las células HepG2 se trataron mediante estos tres compuestos con estas tres dosis durante 4h para el etanol y la camptotecina y 18h para PMA. Los ARN mensajeros se purificaron mediante perlas Dynal-Oligo-(dT) a partir de ARN totales purificados según el kit Rneasy (Quiagen). Las síntesis de ADNc se efectuaron a partir de estos ARN mensajeros y de la Transcriptasa Inversa Superscript (Life Technologies) utilizando hexámeros aleatorios como cebadores.

Estas primeras hebras han servido de matrices para reacciones de amplificación mediante PCR (94ºC 1 mn, 55ºC 1 mn, 72ºC 1 mn, 30 ciclos) con la ayuda de los cebadores oligonucleotídicos siguientes:

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Estos cebadores corresponden a regiones comunes a las distintas isoformas descritas de MACH-α (1, 2 y 3, amplificando 595, 550 y 343 pares de bases respectivamente). MACH-α (Caspasa-8) es una proteasa implicada en la muerte celular programada (Boldin et. al., Cell (1996), 85, 803-815).

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Estos cebadores corresponden a regiones comunes a las distintas isoformas descritas de bcl-X (bcl-XI, bcl-Xs, BCLXβ) (Boise et al., Cell (1993) 74, 597-608; U72398 (Genbank)), y deben amplificar un fragmento único para estas tres isoformas de 204 pares de bases.

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10 Estos cebadores corresponden a regiones comunes a algunas isoformas de FASR y deben amplificar un fragmento de 478 pares de bases para la forma salvaje de FasR, 452 para la isoforma ∆8 y 415 para la isoforma ∆TM.

Los resultados reportados en la figura 19 indican que:

• la camptotecina induce una disminución de la expresión de la isoforma MACH-α1 y un aumento de la isoforma MACH-α3.

15 • La camptotecina induce la aparición de una nueva isoforma de bcl-X (banda superior del doblete que migra hacia 200 pares de bases).

•: La camptotecina induce una disminución de la forma salvaje del receptor de fas, sustituido por una expresión de una isoforma más corta que puede corresponder a Fas ∆TM.

•: El etanol induce la desaparición de bcl-x, sustituido por una isoforma más corta.

20 • El etanol induce una aumento de la forma larga, salvaje, del receptor de fas, esto a costa de la isoforma más corta.

Estos resultados demuestran que los tratamientos mediante agentes tóxicos con dosis bajas pueden inducir desregulaciones de cortes y empalmes alternativos de algunos ARN, esto de manera específica. La identificación de estas desregulaciones al nivel post-transcripcional, especialmente mediante la aplicación de la tecnología DATAS permite así definir una herramienta de predicción de la toxicidad de moléculas.

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Claims

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