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Technisches
Gebiet
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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Anwendung von Fettsäure-CoA-Thioester,
von dem gefunden wurde, dass er eine wirksame Inhibitorsubstanz
gegenüber
peroxisome Proliferator-aktivierte Rezeptoren α und γ (hierin nachstehend als PPARs
bezeichnet) ist, für
Untersuchungen als Arzneimittel, und die Verwendung von Fettsäure-CoA-Thioester
für Arzneimittel.
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Hintergrund
der Erfindung
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Der
peroxisome Proliferator-aktivierte Rezeptor (PPAR) ist ein Transcriptionsfaktor,
welcher aktiviert wird, wenn sich ein Ligand an die Liganden-bindende
Domäne
an der Stelle von C-Termini bindet und eine der Kernrezeptorsuperfamilien
ein Glucocorticoid, Östrogen,
Thyroxin und Vitamin D als Liganden aufweist (Keller, H. et. al.:
Trends Endocrinol. Metab. 4:291.296 (1993)). Bis jetzt sind drei
Arten von Isoformen, die α-Form, γ-Form und δ-Form als
PPARs identifiziert worden, und die Expressionsgewebe und die Funktionen
sind jeweils verschieden (Braissant, O. et al.: Endocrinology 137:354–366 (1996).
PPAR α wird
stark in Geweben mit hoher katabolitischer Aktivität für Fettsäuren ausgepresst,
wie Leber, Niere und Herz. PPARγ teilt
sich durch die Wahl der Promotoren in PPARγ 1 und PPARγ 2 nachdem zwei Arten von Isoformen
mit Stellen unterschiedlicher N-Termini existieren: PPARγ 1 wird in
relativ weit verbreiteten Geweben ausgepresst und PPARγ 2 wird hauptsächlich in
Fettgeweben stark ausgepresst. PPARδ ist in den weit verbreiteten
Geweben verteilt.
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PPARα bindet sich
an die Promotordomäne
von Schlüsselenzymen,
welche im Fettabbausystem vorliegen, wie an Acyl-CoA-Synthase, welches
im Zytosol vorliegt, an Acyl-CoA-Dehydrogenase und HMG-CoA-Synthase,
welche in den Mitochondrien vorliegen und an Acyl-CoA-Oxidase, welches
im Peroxisom der Leber vorliegt (Schoonjans, K. et. al.: J. Lipid
Res. 37:907–925
(1996)). Aus der Analyse von Mäusen
mit PPARα-Mangel
ist geschlossen worden, dass PPARα eine wichtige
Rolle für
die Energieaufnahme im Hungerzustande spielt, das heißt bei der
Oxidation von Fettsäure
und der Bildung von Ketonspezies in der Leber (Kersten, S. et al.;
J. Clin. Invest; 103:1489–1498
(1999)).
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Andererseits
ist bekannt, dass PPARγ tief
in die Differenzierung der Adipozyten eingreift (Forman, B. M. Et
al.: Cell, 83:803–812
(1995). Thiazolidindionderivate wie Troglitazon, Rosiglitazon (BRL-49,653)
und Pioglitazon sind neue therapeutische Arzneimittel für die Typ
2 Diabetes mit der einzigartigen Funktion die Insulinresistenz als
einen der pathogenen Faktoren von Diabetes zu verbessern, wobei
es sich in den letzten Jahren herausgestellt hat, dass jene Arzneimittel
Agonisten gegenüber
PPARγ sind
(Lehmann, J. M. et al.; J. Biol. Chem., 270:12953–12956 (1995).
Es wird angenommen, dass PPARγ eine
wichtige Rolle für
die Energiekonservierung im Organismus spielt. Die Funktion von
PPARδ wird
jedoch, verglichen mit der α-Form
oder γ-Form nicht
voll verstanden.
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Als
Agonisten gegenüber
PPAR sind Arzneimittel der Glitazon-Klasse wohlbekannt, wie vorstehend beschrieben.
Es wird auch berichtet, dass natürliche
oder endogen erzeugte gesättigte
und ungesättigte
Fettsäuren,
bestimmte Arten von Eicosanoid, oxydierte Fettsäuren etc., Agonisten gegenüber PPAR
sind (Forman, BM. et al.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4312–4317 (1997)).
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Andererseits
ist der Status quo, dass die inhibierende Substanz und der Antagonist
gegenüber
PPAR wenig bekannt sind. Es sind nur 2,4-Thiazolidindionderivate als Antagonisten
gegenüber
PPARγ bekannt (Oberfield,
J. L. et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:6102–6106 (1999)).
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Was
die Verwendung von Antagonisten gegenüber PPARγ betrifft, ist die Anwendung
als gegen Fettsucht wirksames Arzneimittel offen gelegt worden (WO
97/10813), ohne jedoch auf die Entdeckung der antagonistischen Substanz
einzugehen.
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Noch
viel weniger ist die Inhibitorsubstanz oder der Antagonist gegenüber PPAR α überhaupt
bekannt.
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Bis
zu diesem Zeitpunkt ist kein Antagonist gegenüber PPARγ und PPARα entdeckt worden, weder in natürlichen
noch in endogenen Substanzen.
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WO
91/00871 betrifft Lungentenside, stabile Tensid-Protein-Kompositionen
und Formulierungen, worin Palmitoylester und Fettsäureester
verwendet werden, sowie Verfahren zu deren Herstellung und Versuche damit.
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WO
98/51296 betrifft ein Verfahren zur Behandlung von Krebs durch Anwendung
einer therapeutischen Zusammensetzung, welche Myristoyl-CoA in einem
physiologisch annehmbaren Träger
und N-Myristoyltransferase in einem physiologisch annehmbaren Träger umfasst.
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Zweck
der Erfindung ist es, einen ganz neuen medizinischen Wirkstoff gegen
Kohlenhydrat- und Fettstoffwechsel-bedingte Krankheiten durch Entdeckung
eine Inhibitorsubstanz oder eines Antagonisten gegen PPARα und PPARγ zu schaffen.
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Offenbarung
der Erfindung
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Als
die Erfinder Untersuchungen über
die Beteiligung von PPAR an der Induktion der Insulinresistenz durchführten, haben
sie zu ihrer Überraschung
festgestellt, das bestimmte Formen von Fettsäure-Co-Thioester als Stoffwechselprodukte
von Fettsäuren
eine Inhibitorwirkung gegenüber
PPARα und
PPARγ aufweisen, was
zur Vervollständigung
der Erfindung führte,
wie sie in den Ansprüchen
1–2 beansprucht
wird.
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Durch
Konkurrenzbindungsversuche unter Verwendung einer Tritium-markierten
Form von KRP-297 (Murakami, K. et al.; Diabetes 47, 1841–1847 (1998)),
welche ein Doppelagonist gegenüber
PPARα und PPARγ ist, ist
nämlich
gefunden worden, dass sich verschiedene Fettsäure-CoA-Thioester gut an die
Ligandenbindenden Domänen
von PPARα und
PPARγ binden,
wodurch sie erkennen ließen,
dass sie sowohl Liganden für α- als auch γ-Rezeptoren
sind.
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Zusätzlich inhibierten
die Fettsäure-CoA-Thioester
dosisabhängig
das Bindevermögen
für die
Konjugatbildung zwischen den Liganden-bindenden Domänen von
PPARα und
PPARγ und
dem Steroidrezeptorcoaktivator (SRC-1). Folglich wiesen die Fettsäure-CoA-Thioester
selbst nach, dass sie Inhibitorsubstanzen gegen PPARα und PPARγ sind.
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Die
Fettsäure-CoA-Thioester
können
erfindungsgemäß zur Erforschung
bei der Schaffung von Arzneimitteln und als Versuchshilfsmittel
als Inhibitorsubstanz oder Antagonist gegen PPARα und PPARγ verwendet werden, was sie wertvoll
macht.
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Namentlich
die Fettsäure-CoA-Thioester,
in denen die Fettsäuregruppe
Myristoyl, Palmitoyl, Stearoyl, Oleoyl, Linoleoyl oder Arachidonoyl
ist, können
zur Schaffung von Arzneimitteln als Inhibitorsubstanz gegen PPARα verwendet
werden, und die Fettsäure-CoA-Thioester,
in denen die Fettsäuregruppe
Myristoyl, Palmitoyl, Stearoyl, Oleoyl, Linoleoyl oder Arachidonoyl
ist, können
zur Schaffung von Arzneimitteln als Inhibitorsubstanzen PPARγ verwendet
werden.
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Weiterhin
kann der Fettsäure-CoA-Thioester
selbst als Arzneimittel verwendet werden. Gebiete für Arzneimittel
sind folgende:
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1) Verwendung als Antagonist
gegen PPARα bei
der Arzneimittelherstellung
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Im
Fall von kritischer Diabetes, hauptsächlich der Typ 1 Diabetes,
kann bekanntlich oft die diabetische Ketoazidose als akute Komplikation
auftreten. Die diabetische Ketoazidose wird klinisch der Entwässerung, Bewusstseinsstörung, niedrigem
Blutdruck, Tachykardie, Atemwegsreizung, Kussmaul-Atmung und Acetongeruch
beim Ausatmen (Keller U. et al.: Diabetologia 28:7–77 (1986))
zugeschrieben. Aufgrund der Tatsache, dass PPARα eine wichtige Rolle bei der
Oxidation von Fettsäure
und der Bildung des Ketonkörpers
in der Leber spielt, wird erwartet, dass der Antagonist von PPARα diese inhibieren
kann und daher bei der Therapie der diabetischen Ketoazidose nützlich ist.
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2) Verwendung als Antagonist
gegen PPARγ bei
der Arzneimittelherstellung
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Fettsucht
ist ein Risiko bei Diabetes, Lipoidspiegelerhöhung, Bluthochdruck, ischämischen
Herzbeschwerden etc., weswegen ihre Verhinderung und Therapie sehr
wichtige klinische Aufgaben sind. PPARγ spielt eine wichtige Rolle
bei der Differenzierung der Adipocyten. Die Thiazolidindionderivate
besitzen als PPARγ-Agonisten in der
Tat eine die Differenzierung von Adipozyten induzierende Wirkung,
wobei berichtet wird, das sie die Zahl der Adipozyten und das Gewicht
von Fettgeweben erhöhen
(Piet De Vos et. al.; J. Clin. Invest. 98:1004–1009 (1996)). Obwohl die Thiazolidindionderivate
als Arzneimittel bei Diabetes nützlich
sind, induzieren sie die Differenzierung von Adipozyten, weswegen
das Potential für
die Förderung
der Fettsucht auch gefürchtet
ist. Es wird auch berichtet, dass das Expressionsniveau von Leptin,
welches als Entfettungsfaktor bekannt ist, durch die Verabreichung
von Thiazolidindionderivaten gesenkt wird (Zhang, E. et al.; J.
Biol. Chem. 271:9455–9459
(1996). Vor diesem Hintergrund unterdrückt der Antagonist von PPARγ die Differenzierung
von Adipozyten und erhöht
gleichzeitig das Auspressungsniveau für Leptin, weswegen ein Potential
als Arzneimittel gegen Fettsucht erwartet wird.
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Optimale Ausführungsform
zur Umsetzung der Erfindung in die Praxis
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Im
Folgenden wird die Erfidung anhand konkreter Beispiele erläuterte;
Die Erfindung ist jedoch nicht auf diese Beispiele beschränkt.
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Beispiel 1
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Messung der
Bindungsaktivität
an PPARα und
PPARγ
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Es
wurden Konkurrenzversuche unter Verwendung einer Tritium-markierten
Form von KRP-297 (Murakami K. et al.; Diabetes 47:1841–1847 (1998))
als Doppelagonist gegen PPARα und
PPARγ durchgeführt. Proteine
(6 × His-hPPARs
LBD), markiert mit 6-Kopie Histidin an der Stelle der N-Termini
in den Ligandenbindungsdömänen vom
menschlichen Typ PPARα und
PPARγ wurden
jeweils in Escherichia coli ausgepresst und über eine Nickel-Säule gereinigt.
6 × His-hPPARs LBD Protein
und 100 nM [3H]KRP-297 (27 Ci/mmol) wurden
bei 25°C
30 min in 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,4), enthaltend 50 mM KCl und
10 mM Dithiothreitol, in Anwesenheit oder Abwesenheit der Testverbindung
(Fettsäure-CoA-Thioester von
Sigma Co.) inkubiert. Anschließend
wurde das an Protein gebundene [3H]KRP-297 über eine
Sephadex G25-Säule
abgetrennt und die Radioaktivität
mit einem Flüssigkeitsscintilationszähler gemessen.
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Als
Referenzwirkstoff für
das Bindevermögen
gegen PPARγ wurde
BRL-49,653 (Wilson TM. et al.; J. Med. Chem. 39:665–668 (1996))
und 15-Deoxy-Δ12,14-Prostaglanidn
J2 (von Cayman Chemical Co.) verwendet,
und als Referenzwirkstoff für
das Bindevermögen
gegen PPARα wurde
8(S)-Hydroxyeicosatetranonsäure (von
Cayman Chemical Co.) verwendet.
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Als
Folge davon wurde klar, dass die Thioester von Myristinsäure-CoA,
Palmitinsäure-CoA,
Stearinsäure-CoA, Ölsäure-CoA,
Linolsäure-CoA
oder Arachidonsäure-CoA
Liganden von PPARα und
PPARγ waren (Tabelle
1).
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Bindung
von Fettsäure-CoA
an die Ligandenbindungsdomäne
von PPAR Tabelle
1
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Die
Werte sind Mittelwerte von 3 Versuchen ± Standardabweichung
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Beispiel 2
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Messung
des Konjugatbildungsvermögens
zwischen PPARs LBD und SRC-1 Die [35S]-markierte Methioninform von
SRC-1, welche 2-Kopien von LXXLL Motif Enthält wurde in vitro (TNTR, Promega
Co., Madison, WI) hergestellt. 6 × His-hPPARs LBD Protein wurde bei 4°C 60 min
in 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,4), enthaltend 50 mM KCl und 10 mM
Dithiothreitol und 0,1 % Rinderserumalbumin, in Anwesenheit oder
Abwesenheit der Testverbindung inkubiert. Danach wurde 2 mg Anti-6 × His-Antikörper (QIAGEN
Co., Deutschland) zugegeben und die Mischung bei 4°C 60 min
inkubiert. Anschließend
wurden 20 ml Protein G Sepharose (Falmasia Biotech Co., Schweden)
zugegeben und die Mischung bei 4°C
60 min inkubiert. Nach 3-maligem Waschen mittels Zentrifugieren,
wurde das Protein G Sepharose mit 20 ml SDS-Puffer, 20% SDS-PAGE,
gelöst und
dann [35S]SRC-1 mittels Autographie nachgewiesen.
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Als
Folge davon inhibierte der Linolsäure-CoA-Thioester aufgrund
der Liganden von PPARα,
KRO-297 und Linolsäure
die Bildung von SRC-1 dosisabhängig
und inhibierte auch dosisabhängig
die Konjugatbildung von SRC-1 aufgrund der Liganden von PPARγ, BRL-49,653
und Linolsäure
(Tabelle 2).
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Inhibierung
der Konjugatbildung zwischen der PPARs-Ligandenbindungsdomäne und SRC-1
durch Fettsäure-CoA Tabelle
2
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Die
Werte sind Mittelwerte von 3 Versuchen ± Standardabweichung
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Anwendungsmöglichkeiten
in der Industrie
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Bei
Untersuchungen zur Beteiligung von PPAR bei der Induktion der Insulinresistenz
wurde gefunden, dass bestimmte Formen von Fettsäure-CoA-Thioestern als Stoffwechselprodukte
von Fettsäuren
eine inhibierende Wirkung gegen PPARα und PPARγ aufwiesen.
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Folglich
können
Fettsäure-CoA-Thioester,
bei denen die Fettsäuregruppe
Myristoyl, Palmitoyl, Stearoyl, Oleoyl, Linoleoyl oder Arachidonoyl
ist, zur Schaffung von Arzneimitteln als Inhibitorsubstanz gegen
PPARα verwendet
werden, und die Fettsäure-CoA-Thioester,
in denen die Fettsäuregruppe
Myristoyl, Palmitoyl, Stearoyl, Oleoyl, Linoleoyl oder Arachidonoyl
ist, können
zur Schaffung von Arzneimitteln als Inhibitorsubstanz PPARγ verwendet
werden.
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Weiterhin
ist es auch möglich
den Fettsäure-CoA-Thioestern
als solchen zur Herstellung von Arzneimitteln für die Behandlung von Kohlenhydrat-
und Fettstoffwechsel bezogenen Krankheiten zu verwenden.
