DE69906532T2

DE69906532T2 - Biologisch kompatible und biologisch abbaubare zubereitungen enthaltend hyaluronsäure und deren derivate zur behandlung von geschwüren im verdauungsapparat

Info

Publication number: DE69906532T2
Application number: DE69906532T
Authority: DE
Inventors: Lanfranco Callegaro; Luigi Ambrosio; Annaclaudia Esposito
Original assignee: Fidia Advanced Biopolymers SRL
Current assignee: Anika Therapeutics SRL
Priority date: 1998-07-06
Filing date: 1999-07-02
Publication date: 2004-04-08
Anticipated expiration: 2019-07-03
Also published as: JP2002519381A; CA2336443A1; EP1096940A1; EP1096940B1; WO2000001394A1; AU4905399A; DE69906532D1; ATE235909T1; CA2336443C; ITPD980168A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Hyaluronsäure oder deren Derivaten zur Herstellung einer Matrix als Träger für das Zellwachstum zur Herstellung von biologischem Material zur Behandlung von Geschwüren, Läsionen und Divertikeln des Verdauungs- und Magen-Darm-Apparats.
Die Matrix kann gegebenenfalls pharmakologisch oder biologisch wirksame Stoffe umfassen. Die Matrix, die Zellen umfaßt, kann zur Rekonstruktion der Wand des Verdauungsapparates verwendet werden.
Technischer Hintergrund
Die Therapie von Magengeschwüren hing lange von H2-Rezeptorantagonisten wie Cimetidin und Ranitidin ab, die die Magensäuresekretion hemmen können.
Seit kurzem werden Arzneistoffe wie Omeprazol verwendet, die die Sekretion von Magensäure durch einen spezifischen Mechanismus der Hemmung der Protonenpumpe auf der Ebene der Parietalzellen reduzieren.
Die Arzneistoffe werden häufig mit Antibiotika wie Amoxicillin, Tetracyclin, Metronidazol und Claritromycin verwendet, die wirksam gegen Heliobacter pylori sind, den Gram-negativen Mikroorganismus, der für das Wiederauftreten von gastrointestinalen Geschwüren verantwortlich gemacht wird.
Auf die Chirurgie wird nur in den Fällen von Magengeschwüren zurückgegriffen, die als bösartig vermutet werden, oder in Fällen von gastrointestinalen Geschwüren, die durch Stenose verkompliziert sind, was den Nahrungsdurchtritt beeinträchtigt. Fälle von Perforation erfordern ebenfalls dringend eine Operation, um die Läsion zu schließen und potentiell tödliche Konsequenzen wie Peritonitis zu vermeiden.
Eine weitere Pathologie, die das Verdauungssystem betrifft, ist eine Divertikulitis der Speiseröhre.
Divertikel des Verdauungstraktes, insbesondere der Speiseröhre, sind begrenzte, trichterförmige oder sackartige Ausstülpungen, die alle Schichten oder gerade die Schleimhaut oder Submukosa der Darmwand beinhalten.
Nahrungsmittelreste, die in einem Divertikel verbleiben, verursachen dessen Entzündung und können ebenfalls ihren Weg in das respiratorische System als Ergebnis von Husten oder Rückstauung finden, was Bronchitis, Bronchialpneumonie und Lungenabszesse ab ingestis verursacht.
Komplikationen wie oesophago-bronchiale Fisteln, Oesophagitis, Blutungen, bösartige Neoplasie des Divertikels können ebenfalls auftreten.
Die Behandlung der Pathologie muß eine geeignete Ernährung und die Verwendung von antispastischen und prokinetischen Arzneistoffen einschließen, während ernstere Fälle eine Operation erfordern können.
Geschwüre im Verdauungstrakt können nicht nur durch Pathologien verursacht werden, sondern ebenfalls durch ein äußeres Trauma, indem scharfe Fremdkörper oder ätzende Substanzen verschluckt werden.
Im letzteren Fall kann sich die Chirurgie als nutzlos erweisen und der betroffene Teil kann unwiederbringbar seine Funktionen von Absorption, Sekretion und Peristaltik verlieren.
Die Rolle von Hyaluronsäure, einem natürlichem Polysaccharid, im Prozeß der Gewebereparatur ist seit langem bekannt (P. H. Weigel et al.: "A Model for the role of hyaluronic acid and fibrin in the early events during the inflammatory response and wound healing", J. Theor. Biol., 119: 219, 1986), speziell in den frühen Stufen der Granulation, da sie die Koagulationsmatrix stabilisiert und ihren Abbau steuert, was die Rekrutierung von Entzündungszellen, wie polymorphonukleären Leukozyten und Monozyten, Mesenchymzellen wie Fibroblasten und Endothelzellen, begünstigt und schließlich die anschließende Migration der Epithelzellen ausrichtet.
Aus den obigen Gründen wird Hyaluronsäure weithin in pharmazeutischen Formulierungen in Form von Cremes, Sprays und Mullbinden (Connettivina^®) verwendet, die die Heilung von Abszessen, Wunden und Verbrennungen beschleunigen können ( EP 0138572 ).
Außerdem ist bekannt, daß Hyaluronsäure-Derivate ( EP 0216543 B1 ) als Gerüste für die Kultur von Zellen wie Fibroblasten, Keratinozyten und Knochenmarks-Stammzellen verwendet werden (WO 97/18842), um Transplantate für Knochengewebe, Knorpel und Haut herzustellen.
Schließlich gibt es bekannte pharmazeutische Zubereitungen in Form von Tabletten oder Granalien, die Ester von sauren Polysacchariden mit Cholin ( EP 0605478 ) mit Antigeschwüreigenschaften auf der Ebene des Magens aufgrund ihrer Fähigkeit zur Bildung von Gelen und zum Schutz der Schleimhaut enthalten.
JP-B-6048950 betrifft Antigeschwürmittel, die als Wirkstoff wenigstens ein Zinksalz einer Verbindung mit niedrigem Molekulargewicht von sauren Polysacchariden, einschließlich Hyaluronsäure, enthalten.
JP-B-61047418 offenbart eine pharmazeutische Zusammensetzung zum Schutz der Magenschleimhaut, die Hyaluronsäure oder ein Salz davon, Lecithin und Protein enthält.
WO 98/10773 betrifft pharmazeutische Zusammensetzungen mit antimikrobieller Wirkung, die als wirksamen Bestandteil Assoziate (Komplexe) von Hyaluronsäure enthalten, d. h. Zink- und Cobalthyaluronate.
EP-B-526 756 beschreibt eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Revitalisierung von Narbengewebe, die ein biologisch wirksames Material umfaßt, ausgewählt aus natürlich vorkommenden Wachstumsfaktoren, aktiven Peptidsegmenten verschiedener Wachstumsfaktoren, synthetischen Wachstumsfaktoren und Mischungen daraus; und die zusätzlich eine pharmazeutisch akzeptable Matrix zur kontrollierten Freisetzung umfaßt, einschließlich Hyaluronsäure, worin das biologisch wirksame Material immobilisiert ist.
Obwohl Hyaluronsäure und ihre Derivate topisch verwendet werden, ist ihre Anwendung im Verdauungs- und Magen-Darm-System bislang unbekannt.
Es wurde jetzt überraschend gefunden, daß Zusammensetzungen auf Basis von Hyaluronsäure oder deren Derivaten in Verbindung mit Wachstumsfaktoren oder Zellkulturen, die geeignet zur endoskopischen Verabreichung sind, wirksam in der Behandlung von Läsionen oder Geschwüren im Verdauungs- und Magen-Darm-System verwendet werden können.
Wenn es einen Verlust oder eine Degeneration einer großen Gewebefläche oder eine Perforation des Wand des Verdauungsapparates gibt, kann eine Operation durchgeführt werden, und es ist möglich, den verletzten Teil durch Transplantieren von Zellkulturen zu rekonstruieren, die auf Gerüsten gezüchtet wurden, die durch Hyaluronsäure-Derivate gebildet werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Der Anmelder hat unerwartet gefunden, daß Hyaluronsäure oder Derivate davon vorteilhaft in der Behandlung von Geschwüren, Läsionen und Divertikeln des Verdauungs- und Magen-Darm-Apparates verwendet werden können.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher die Verwendung von Hyaluronsäure oder einem Derivat davon zur Herstellung einer Matrix als Träger für das Zellwachstum zur Herstellung eines biologischen Materials zur Behandlung der oben genannten Krankheiten.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt ein elektronenmikroskopisches Bild (Vergrößerung: 14,97 k X) am 38. Kulturtag, gezüchtet auf Petrischalen;
2 zeigt ein elektronenmikroskopisches Bild (Vergrößerung: 17,50 k X) am 38. Kulturtag, gezüchtet auf "Transwells";
3 zeigt ein elektronenmikroskopisches Bild (Vergrößerung: R 17,50 k X) am 38. Kulturtag, gezüchtet auf Laserskin^® (zweidimensionale Matrix, die Hyaluronsäureester umfaßt);
4 zeigt ein elektronenmikroskopisches Bild (Vergrößerung: 15,02 k X) am 38. Kulturtag, gezüchtet auf Hyaff11 3D (dreidimensionale Matrix, die Hyaluronsäureester umfaßt);
4a zeigt ein elektronenmikroskopisches Bild (Vergrößerung: 898 X) am 38. Kulturtag, gezüchtet auf Hyaff11 3D (dreidimensionale Matrix, die Hyaluronsäureester umfaßt);
5 zeigt ein elektronenmikroskopisches Bild (Vergrößerung: 15,02 k X) am 38. Kulturtag, gezüchtet auf Polyurethan;
6 zeigt Diagramme mit der ALP-Aktivität (ALP: alkalische Phosphatasen) (mE/mg Proteine) auf der Ordinate und mit den Tagen der Kultur auf der Abszisse.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Von den Hyaluronsäure-Derivaten, die erfindungsgemäß verwendet werden können, sind die folgenden bevorzugt:

– Hyaluronsäureester, worin ein Teil oder alle Carboxyfunktionen mit Alkoholen der aliphatischen, aromatischen, arylaliphatischen, cycloaliphatischen oder heterocyclischen Reihe verestert sind ( EP 0216453 B1 );
– selbstvernetzte Ester von Hyaluronsäure, worin ein Teil oder alle Carboxy-Gruppen mit den alkoholischen Funktionen der gleichen Polysaccharidkette oder anderer Ketten verestert sind ( EP 0341745 B1 );
– vernetzte Hyaluronsäure-Verbindungen, worin ein Teil oder alle Carboxy-Gruppen mit Polyalkoholen der aliphatischen, aromatischen, arylaliphatischen, cycloaliphatischen oder heterocyclischen Reihe verestert sind, wobei die Vernetzung mittels Spacer-Ketten erzeugt wird ( EP 0265116 B1 );
– Halbester der Bernsteinsäure oder Schwermetallsalze des Halbesters der Bernsteinsäure mit Hyaluronsäure oder mit Partial- oder Vollestern der Hyaluronsäure (WO 96/357207);
– O-sulfatierte Derivate (WO 95/25751) oder N-sulfatierte Derivate (WO 98/45335);
– amidische Derivate von Hyaluronsäure oder von den oben aufgeführten Verbindungen, erhalten durch Reaktion eines primären oder sekundären Amins der aliphatischen, aromatischen, arylaliphatischen, cycloaliphatischen oder heterocyclischen Reihe, das gegebenenfalls eine pharmazeutisch aktive Substanz sein kann, mit einer freien Carboxyl-Gruppe der Hyaluronsäure oder eines Derivats davon; oder durch Reaktion einer Säure der aliphatischen, aromatischen, arylaliphatischen oder cycloaliphatischen Reihe, die gegebenenfalls eine pharmazeutisch aktive Substanz sein kann, mit einer desacylierten Amino-Gruppe von Hyaluronsäure oder einem Derivat davon.

Die erfindungsgemäße Matrix kann ebenfalls pharmakologisch oder biologisch aktive Substanzen enthalten, wie Antibiotika, insbesondere Antibiotika, die gegen Heliobacter pylori wirksam sind, Wachstumsfaktoren, Antimykotika, antimikrobielle Mittel und antivirale Mittel. Zusammensetzungen, die Antibiotika enthalten, die gegen Heliobacter pylori wirksam sind, sind z. B. in Form von Mischungen oder Salzen oder kovalent gebunden mit den zuvor genannten Hyaluronsäure-Derivaten; Schwermetallsalze, wie Zink und Cobalt, Salze des Halbesters der Bernsteinsäure oder Hyaluronsäure oder mit Partial- oder Vollestern der Hyaluronsäure.
Die erfindungsgemäß verwendete Matrix ist bevorzugt in Form von Vliesgewebe oder perforierten Membranen.
Zweidimensionale oder dreidimensionale Matrix, die ein Hyaluronsäure-Derivat enthält, kann als Träger für das Zellwachstum zur Herstellung von biologischem Material verwendet werden, das geeignete Zellkulturen enthält, zur Regenerierung der Wände oder zum Auffüllen von Divertikeln im Verdauungsapparat. Die Zellen können reife intestinale Zellen, Mesenchymzellen, Fibroblasten, Epithelzellen oder eine Mischung daraus sein.
Diese biologischen Materialien können z. B. intestinale Zellen enthalten, die nützlich in der Rekonstruktion des verletzten Verdauungsapparates sind. Diese biologischen Materialien werden auf die Läsionsstelle durch chirurgische Verfahren implantiert.
Beispiel
Wachstum von Epithelzellen auf Gerüsten, die aus Benzylestern von Hyaluronsäure hergestellt sind
Intestinale Zellen wurden auf Gerüste geimpft, die aus dem Vollbenzylester von Hyaluronsäure hergestellt wurden, in Form einer perforierten Membran und Vliesgewebe, um ihre Biokompatibilität zu testen, und ihre morphologischen und biochemischen Reaktionen wurden beobachtet.
Die Zellen gehörten zur CaCO₂-Zellinie (abstammend aus humanem Kolonkarzinom), die spontan zu Enterozyten differenzieren, die typisch für das reife intestinale Epithel sind.
Die Zellen wurden im Durchgang 98 verwendet. Sie wurden mit einer Dichte von ca. 9 × 10 ³/cm² in DMEM, 4,5 g Glucose/L, enthaltend 20% FBS Penicillin/Streptomycin, Fungizon und nicht-essentielle Aminosäuren (1%), in einer angefeuchteten Atmosphäre mit 95% CO₂ geimpft. Das Kulturmedium wurde alle 48 Stunden gewechselt. Andere Zellen wurden auf Petrischalen und Transwell-Vertiefungen mit Polycarbonat-Membranen unter den gleichen Kulturbedingungen geimpft und dienten als Kontrollen.
Polyurethan (Chronoflex^TM), ein Material für biomedizinische Zwecke, wurde als Negativkontrolle verwendet. Am 3., 15., 20. und 40. Kulturtag wurden die Zellen zur Beobachtung unter Verwendung eines Rasterelektronenmikroskops (REM) und zur Bewertung der Gesamtproteine und der Aktivität alkalischer Phosphatasen (ALP) gemäß den folgenden Verfahren vorbereitet: REM: Fixieren in 2,5% Glutaraldehyd in Phosphatpuffer (PBS), pH 7,4. Osmiumtetroxid, 1% in PBS, Entwässern in Ethanol und Erhöhen der Konzentrationen auf bis zu 100% und Entwässern mit einem "Critical Point"-Trockner. Die Zellen wurden dann mit Gold metallisiert und im REM betrachtet. ALP-Aktivität: Die Zellen wurden durch Abschaben in einem Lyse-Puffer, 2 mM Tris-HCl, 50 mM Mannit pH 7,2 (1 ml Endvolumen) (mit Ausnahme derjenigen, die auf Hyaff 3D geimpft wurden), geerntet und in Eis ultraschallbehandelt. Die ALP-Aktivität der zellulären Lysate wurde durch Spektrophotometrie durch Hydrolyse des p-Nitrophenylphosphats unter Verwendung eines Boehringer-Kits bestimmt. Die Gesamtproteine wurden durch das Lowry-Verfahren bestimmt. Die vorhandene Aktivität in den Fällen, die auf einem Gerüst in Form eines Vlieses gezüchtet wurden, wurde in Lysaten bestimmt, die durch Ultraschallbehandeln der die Zellen in toto enthaltenden Membran erhalten wurden.
Die morphologische Differenzierung wurde auf der Basis der Gegenwart von Mikrozotten auf der oberen Oberfläche der Zellen beurteilt, während die biologische Differenzierung auf der Basis der Zunahme der ALP-Aktivität bewertet wurde (siehe Ergebnisse in 6). Beide wurden als Biokompatibilitätsparameter betrachtet.
1, 2, 3, 4, 4a und 5 zeigen elektronenmikroskopische Bilder der Zellen am 38. Kulturtag, gezüchtet auf Petrischalen, Transwells, Membranen aus Hyaluronsäure (Laserskin®), Hyaluronsäure-Matrizen (Hyaff11 3D) bzw. Polyurethan-Membranen. Wie daraus ersichtlich ist, zeigen die auf Laserskin und Transwell gezüchteten Zellen eine deutliche Differenzierung aufgrund des Erscheinens zahlreicher Mikrozotten auf ihren Oberflächen, wohingegen diejenigen, die auf Petrischalen gezüchtet wurden, weniger und weniger gut entwickelte Mikrozotten zeigen. Die auf dem Gerüst (in Form eines Vliesgewebes) und auf Chronoflex gezüchteten Zellen zeigen keinerlei Bildung von Mikrozotten, während diejenigen, die auf Chronoflex allein gezüchtet wurden, eine Ausstülpung zeigen, die bezeichnend für eine Zellbeanspruchung ist.

Claims

Verwendung einer Matrix, die wenigstens eine Hyaluronsäure oder ein Derivat davon umfasst, zur Herstellung eines biologischen Materials zur Behandlung von Geschwüren, Läsionen und Divertikeln des Verdauungs- und Magen-Darm-Trakts, worin die Matrix ein Gerüst für Zellwachstum ist und das biologische Material auf die Läsion durch Operation implantierbar ist.
Verwendung gemäss Anspruch 1, worin die Hyaluronsäurederivate Hyaluronsäureester sind, worin ein Teil oder alle Carboxyfunktionen mit Alkoholen der aliphatischen, aromatischen, arylaliphatischen, cycloaliphatischen oder heterocyclischen Reihe verestert sind.
Verwendung gemäss Anspruch 1, worin die Hyaluronsäurederivate die vernetzten Ester von Hyaluronsäure sind, worin ein Teil oder alle Carboxygruppen mit den alkoholischen Funktionen der gleichen Polysaccharidkette oder anderer Ketten verestert sind.
Verwendung gemäss Anspruch 1, worin die Hyaluronsäurederivate die vernetzten Verbindungen von Hyaluronsäure sind, worin ein Teil oder alle Carboxygruppen mit Polyalkoholen der aliphatischen, aromatischen, arylaliphatischen, cycloaliphatischen oder heterocyclischen Reihe verestert sind, wobei die Vernetzung mittels Spacer-Ketten erzeugt wird.
Verwendung gemäss Anspruch 1, worin die Hyaluronsäurederivate Halbester der Bernsteinsäure oder Schwermetallsalze des Halbesters der Bernsteinsäure mit Hyaluronsäure oder Partial- oder Vollester von Hyaluronsäure sind.
Verwendung gemäss Anspruch 1, worin die Hyaluronsäurederivate O-sulfatierte oder N-sulfatierte Hyaluronsäurederivate sind.
Verwendung gemäss Anspruch 1, worin die Hyaluronsäurederivate Hyaluronsäureamide sind, worin ein Teil oder alle freien Carbonsäuregruppen der Hyaluronsäure mit einem primären oder sekundären Amin umgesetzt sind, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem aliphatischen, aromatischen, arylaliphatischen, cycloaliphatischen oder heterocyclischen Amin besteht, das gegebenenfalls eine pharmazeutisch aktive Substanz sein kann.
Verwendung gemäss Anspruch 1, worin die Hyaluronsäurederivate Amide sind, worin eine desacylierte Aminogruppe von Hyaluronsäure oder eines Derivats davon wie in den Ansprüchen 2 bis 6 definiert mit einer Säure umgesetzt ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer aliphatischen, aromatischen, arylaliphatischen oder cycloaliphatischen Säure besteht, die gegebenenfalls eine pharmazeutisch aktive Substanz sein kann.
Verwendung gemäss Anspruch 1, worin die Matrix in Form eines Vliesgewebes ist.
Verwendung gemäss Anspruch 1, worin die Matrix in Form einer perforierten Membran ist.
Verwendung gemäss Anspruch 1, worin die Zellen aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus reifen Zellen, Mesenchymzellen, Fibroblasten, Epithelzellen und Mischungen daraus besteht.
Biologisches Material, umfassend: (a) Darmzellen, gegebenenfalls zusammen mit Fibroblasten, Mesenchymzellen, reifen Zellen und/oder Epithelzellen; (b) eine Matrix, die wenigstens ein Hyaluronsäurederivat wie in den Ansprüchen 2 bis 8 definiert umfasst, worin die Matrix ein Gerüst ist, auf dem die Zellen wachsen, und das biologische Material durch Operation auf die Läsionsstelle implantierbar ist.
Biologisches Material gemäss Anspruch 12, worin die Matrix in Form eines Vliesgewebes ist.
Biologisches Material gemäss Anspruch 12, worin die Matrix in Form einer perforierten Membran ist.