DE69905194T2

DE69905194T2 - Thermozykliergerät

Info

Publication number: DE69905194T2
Application number: DE69905194T
Authority: DE
Inventors: David Fripp
Original assignee: Hybaid Ltd
Current assignee: Hybaid Ltd
Priority date: 1998-11-30
Filing date: 1999-11-30
Publication date: 2003-11-20
Anticipated expiration: 2019-12-01
Also published as: GB9826237D0; EP1135211A1; JP2002531803A; US6372486B1; EP1135211B1; WO2000032312A1; DE69905194D1; ATE231742T1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Thermozykliergerät für den Einsatz bei der Durchführung von kontrolliertem Erhitzen und Abkühlen biologischer Proben, z. B. von DNA-Strängen.
Um definierte Sequenzen von DNA zu synthetisieren, haben Wissenschaftler nach herkömmlicher Weise auf die Technik der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zurückgegriffen. Dies umfasst grundsätzlich ein Verfahren mit drei Schritten: Abtrennung der DNS zur Amplifikation (DNS-Matrix); Einbrennen kurzer komplementärer DNS- Sequenzen (Primers) in die DNS-Matrix und schließlich das Hinzufügen von Desoxynucleotiden zu den Primer-Strängen, um die Matrix-DNS zu kopieren. Dies wird für gewöhnlich in einem Thermozykliergerät durchgeführt, wobei ein Zyklus mit drei unterschiedlichen Temperaturen etwa 25 bis 30 mal wiederholt wird. Matrix-DNS- Abtrennung und Syntheseschritte erfolgen bei definierten Temperaturen. Die Temperatur, bei welcher die Primer an die DNA gebunden werden, kann jedoch optimiert werden müssen, damit dieser Schritt effizient abläuft und die erwünschten PCR- Ergebnisse erzielt werden. Experimente zur Optimierung der Annelierung von Primern erfordern die Durchführung einer Anzahl unterschiedlicher Experimente, bei denen nur die Primer-Annelierungstemperatur variiert wird. Das Experiment kann drei bis viermal durchgeführt werden müssen, um die optimale Bindungstemperatur festzulegen. Diese Experimente müssten jedes mal wiederholt werden, wenn ein neuer Satz von Primem für unterschiedliche PCRs erforderlich ist. Die Entwicklung eines Temperaturgradientenfelds befähigt die Wissenschaftler, die optimale Bindungstemperatur mehrerer Primersätze in einem einzigen Experiment festzustellen.
Herleitungen nachdem Stand der Technik, mit denen sich ein Temperaturgradient erzeugen lässt, sind jedoch relativ komplex und teuer gewesen.
Das Dokument DE-A-196 46 115 beschreibt ein Thermozykliergerät, welches eine Vielzahl von Heiz- und Kühlmitteln umfasst, die individuell regel- oder steuerbar sind.
Mit der vorliegenden Erfindung soll ein verbessertes Thermozykliergerät offenbart werden.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Thermozykliergerät einschließlich einer Probenplatte vorgesehen, mit der eine Vielzahl von Proben gehalten werden kann, mit einer Vielzahl von Heiz- und Kühlelementen, die entlang der Probenplatte angeordnet sind, einem gemeinsamem Versorgungsmittel, das zur Stromversorgung an die Vielzahl von Heiz- und Kühlelementen angeschlossen ist, und Schaltmitteln, die geeignet sind, den Strom individuell durch jedes Heiz- und Kühlelement oder durch jedes Set einer Vielzahl von Sets an Heiz- und Kühlelementen zu schalten, bzw. verschiedene Heiz- oder Kühleffekte in individuellen Heiz- oder Kühlelementen oder in individuellen Sets von Heiz- oder Kühlelementen zu erzeugen.
Der Temperaturgradientenblock kann gleichzeitig ein Set von diskreten Temperaturen erreichen, wodurch die Anzahl von Optimierungsexperimenten, die der Wissenschaftler benötigt, um seine Arbeit durchzuführen, und damit auch das Arbeitsaufkommen, verringert werden kann.
Ein Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist nachfolgend anhand eines Beispiels mit Bezug auf die beigefügten Figuren beschrieben, in denen:
Fig. 1 eine perspektivische Ansicht auf eine Ausführung eines Heiz- und Kühlfeld eines Thermozykliergeräts darstellt;
Fig. 2 verschiedene Seitenansichten des Felds von Fig. 1 zeigt mit angefügter und entfernter Probenplatte, um eine Vielzahl von Heiz- und Kühlelementen aufzuzeigen;
Fig. 3 bis 8 ein Beispiel eines Schaftbilds zum Betreiben der Heiz- und Kühlelemente von Fig. 2 auf unterschiedlichen Weisen zeigen; und
Fig. 9 ein Graph ist, der das Zeit/Temperaturverhalten des Thermozykliergeräts von Fig. 1 aufzeigt.
Kontrolliertes Erhitzen und Abkühlen von biologischen Proben wird vorzugsweise durch die Verwendung thermoelektrischer Kühler (TECs) erzielt. Diese Ausführung benötigt acht solcher Geräte, die zwischen einer Metallprobenplatte und einer Wärmesenke 2 oder einem Wärmesumpf angebracht sind, wie in Fig. 1 gezeigt ist. Ein TEC erzeugt ein Temperaturdifferenzial über seinen Oberflächen, wenn ein Strom angelegt ist. Durch Änderung der Polarität des angelegten Stroms kann die Temperatur der Probenplatte erhöht oder verringert werden, wie aus dem Stand der Technik bekannt. Wenn gleichförmiges Erhitzen und Kühlen der Probenplatte verlangt ist, werden alle acht TECs in Serie und mit derselben Polarität geschaltet. Um Temperaturgradienten über die Probenplatte zu erzeugen, wird die relative Polarität individueller TECs geändert, oder sie werden gänzlich umgangen.
Unter Bezug auf Fig. 2 ist eine Leiterplatte 3 (wie nachfolgend detaillierter beschrieben wird) an der Wärmesenke angeordnet und in diesem Beispiel sind acht TECs 4 über der Leiterplatte 3 angeordnet. Die Probenplatte 1 hat eine konventionelle Form und ist typischerweise im Stande, viele Proben in einer organisierten Anordnung zu halten.
Unter Bezug auf die Fig. 3 und 8 ist die Schaltung in verschiedenen Betriebszuständen dargestellt, die für die Stromversorgung der TECs 4 verwendet wird. Die spezifischen Komponententypen, die unten erwähnt sind, werden nur beispielhaft angegeben. Der Fachmann wird leicht in der Lage sein, hierfür Alternativen zu finden.
Der Stromfluss durch die TECs wird mittels MOSFETs geschaltet (International Rectifier IRLI3705 N), gezeigt in Fig. 3 als Q1-Q6. Das Design verwendet internationale Rectifier PVI5100 photovoltaische Isolatoren, U1-U6, um eine Betriebsdurchgangsspannung für jeden MOSFET zur Verfügung zu stellen, der vom Kontroll-Interface isoliert ist.
Um gleichmäßiges Heizen und Kühlen zu erzielen, wird das Kontrollsignal C2 auf logisch "1" gesetzt, um einen Basisstrom für Q12 zur Verfügung zu stellen, welcher U3 und US aktiviert und die MOSFETs Q1 und Q4 in Betrieb setzt. Mit einer positiven Spannung an A bezüglich B ist der Stromfluss in den TECs wie in Fig. 4 gezeigt, was zu einem gleichmäßigen Kühlen der Probenplatte 1 führt. Mit einer negativen Spannung an A bezüglich B ist der Stromfluss in den TECs, wie in Fig. 5 gezeigt, was zu einer gleichmäßigen Erhitzung der Probenplatte führt. In diesem Fall fließt der Strom durch die Parasitärdioden in Q1 und Q4.
Um einen Temperaturgradienten entlang der Probenplatte 1 zu erzielen, wird das Kontrollsignal C1 auf logisch "1" gesetzt, um einen Basisstrom für Q7 zu erzeugen, der U2 und U1 aktiviert und die MOSFETs Q2 und Q6 in Gang setzt. Mit einer positiven Spannung an A in Bezug auf B verläuft der Stromfluss in jedem der TECs, wie in Fig. 6 gezeigt, was zu einem Kühlungseffekt in den TEGs P1, P2, P3 und P4 und zu einem Erhitzungseffekt in den TECs PS, P6, P7 und P8 führt. Es ist zu bemerken, dass in diesem Fall der Strom durch die Parasitärdiode in Q3 fließt.
Um einen linearer ausgebildeten Gradienten über die Probenplatte 1 zu erzielen, wird von den inneren TECs P3, P4, PS und P6 weniger Erhitzung/Kühlung erfordert. Dies wird durch Umgehen dieser TECs mittels einem Bypass bewirkt, während die TECs P1, P2, P7 und P8 in einer "Gradient"-Konfiguration belassen werden. Die Kontrollsignale C1 und C0 werden auf logisch "1" gesetzt, um einen Basisstrom für Q7 und Q13 zur Verfügung zu stellen, der U1, U2, U4 und U6 aktiviert und der die MOSFETs Q2, Q3, Q5 und Q6 in Betrieb setzt. Mit einer positiven Spannung an A in Bezug auf B ist der Stromfluss in den TECs, wie in Fig. 7 gezeigt, was zu einem Kühlungseffekt in den TECs P1 und P2 und zu einem Erwärmungseffekt in den TECs P7 und P8 führt. Es ist zu bemerken, dass in diesem Fall der Strom durch die Parasitärdiode in Q3 fließt.
Durch Setzen der Kontrollsignale C1 und C0 auf logisch "1" wird ein Basisstrom für Q12 und Q13 zur Verfügung gestellt, der U3, U4; US und U6 aktiviert und der die MOSFETs Q1, Q3, Q4 und Q5 in Betrieb setzt. Mit einer negativen Spannung an A in Bezug auf B fließt der Strom in den TECs, wie in Fig. 8 gezeigt, was nur zu einem Erwärmungseffekt in den TECs P1, P2, P3 und P4 führt. Dieser Betriebsmodus wird verwendet, um Temperaturgleichmäßigkeit über die Probenplatte wiederherstellen zu helfen. Es ist zu bemerken, dass in diesem Fall der Strom durch die Parasitärdiode in Q2 fließt.
Es ist offensichtlich, dass der Stromfluss durch die inneren TECs P3, P4, P7 und P8 intermittierend geschaltet werden kann, um jeden gewünschten Temperaturgradienten zu erzeugen, was ebenfalls mit den äußeren TECs P1, P2, PS und P6 erzielt werden kann. Der passende Betriebszyklus für die unterschiedlichen TECs kann durch Experimentieren festgelegt werden.
Fig. 9 zeigt eine typische Temperatur-/Zeitcharakteristik, wie sie bei Verwendung dieser Technik erhalten wird. Jede Linie auf dem Graphen gibt die Temperatur bestimmter Stellen auf einer Linie wieder, die von links nach rechts über die Probenplatte verläuft.
Zone A repräsentiert gleichmäßiges Kühlen oder Erhitzen. Der Stromfluss durch die TECs verläuft wie in Fig. 4 (Kühlen) und Fig. 5 (Heizen).
Zone B repräsentiert den Betrieb im Gradientenmodus. In diesem Modus wird gleichmäßiges Erhitzen und Kühlen in Kombination mit der Gradientenbetriebsart eingesetzt, wie in Fig. 6 und 7 dargestellt, um den gewünschten Temperaturstellwert und den gewünschten Temperaturgradienten zu erreichen.
Zone C repräsentiert die Wiederherstellung vom Gradientenmodus. Eine Gleichmäßigkeit der Temperatur entlang der Probenplatte wird durch eine Kombination von gleichmäßigem Erhitzen und teilweisem Erhitzen wiederhergestellt, wie in Fig. 8 dargestellt ist.
Es ist offensichtlich, dass die Paarung von TECs zum Zweck des Erhitzens/Kühlens nur beispielhaft zu verstehen ist.
Eine Beschreibung des bevorzugten Betriebsverfahrens des Systems, vorzugsweise als Software zur Verfügung gestellt, ist nachfolgend dargestellt.
Die acht thermoelektrischen Peltier-Kühler (TECs) sind in vier Paaren zu je zwei Stück verdrahtet. Drei Kontrollsignale werden verwendet, um die Anordnung von Feldeffekt-Transistoren (FETs) Q1 bis Q4 zu schalten, die ihrerseits verwendet werden, um die TEC-Paare in die oder aus dem Stromkreis zu schalten. Die vier Paare Von TECs können in den folgenden Modi betrieben werden:
1. Gewöhnlicher Modus, in dem alle vier Paare zum Heizen oder Kühlen eingesetzt werden.
2. Differential Modus, in dem zwei Paare an einem Ende zum Heizen und zwei Paare am gegenüberliegenden Ende zum Kühlen verwendet werden. Dieser Modus wird während eines Gradientenschritts benutzt.
3. Halbdifferential Modus, in dem nur die beiden äußeren Paare betrieben werden. Dieser Modus wird zur Verbesserung der Linearität über den Block während des Gradientenschritts verwendet.
4. Start-Gradienten-Modus, in dem die beiden Paare am Kühler-Ende des Blocks gekühlt werden und die anderen beiden Paare nicht betrieben werden. Dieser Modus wird eingesetzt, wenn ein Gradientenschritt beginnt.
5. Stop-Gradienten-Modus, in dem die beiden Paare am Kühler-Ende des Blocks erhitzt werden und die beiden anderen Paare nicht betrieben werden. Dieser Modus wird verwendet, wenn ein Gradientenschritt endet.
Eine PID-Schleife kontrolliert die Temperatur des Felds oder Blocks basierend auf Messungen, die mit einem Thermofühler, der am einen Ende des Felds eingebettet ist, gemacht werden. Das Schalten der TECs zwischen den unterschiedlichen Betriebsmodi für einen berechneten Zeitabschnitt ermöglicht, den Temperaturgradienten exakt zu regeln oder zu steuern.

FET-Zustände

Die Gradiententemperaturfeldschaltung eröffnet neun mögliche FET-Zustände. Diese Zustände sind die Kombination aus den drei Kontrollbits C2, C1 und C0 mit der Polarität + oder - der Energieversorgung. Jede der 16 Kombinationen ist benannt 0+, 0-, 1+, 1-... 7+, 7-. Von diesen 16 Kombinationen sind nur neun verwendbar, weil die FETs Dioden haben, die das Fließen von Reversstrom zulassen.
Spalte 1 repräsentiert das variable (Kühler) Ende des Felds, Spalte 4 ist das feste Ende. H steht für Heizen, C bedeutet Kühlen und - bedeutet keine Änderung. Mode 7- ist nicht verwendet, weil er c = 1/3 Kühlen und h = 1/3 Heizen ergibt. Nur die fett gedruckten Zustände werden in dem Expressprogramm verwendet. Zustand 6- ist nur an für ein Zeitfenster und hat einen vernachlässigbaren Effekt. Man geht davon aus, dass dieses Verfahren zum Erzeugen eines Gradienten nie vollständig implementiert wird.
Eine 50 : 50 Verhältnismischung von 2- und 3- ergibt folgenden Durchschnitt:
Dies ergibt eine lineare Steigung.
Zustand 3+ zeigt die C2 = 0, C1 = C0 = 1 an und die Energieversorgung ist im positiven Modus.
Dies stimmt überein mit der positiven Versorgung, die im Schaltbild mit dem B- Terminal verbunden ist.

Betriebsmodus

Eine globale Variable mit der Bezeichnung Gradient wird eingestellt, wenn der Temperaturgradient geändert werden muss. Dies wird berechnet aus dem gemessenen Gradienten und dem verlangten Gradienten.
Im normalen Modus wird CurrentDemand (0) verwendet, um die Energieversorgung einzustellen.
Im Gradientenmodus wird CurrentDemand (1) verwendet, um die Energieversorgung einzustellen. Dies wird beschnitten zu 0 oder zu negativen Werten, weil die Differential-, Halbgradienten- oder Reversedifferential-FET-Zustände nur mit einer Stromrichtung arbeiten.
Im Normalmodus wird ein Zeitwert, genannt ZoneTime (0), berechnet aus dem CurrentDemand (0)-Wert.
Im Gradientenmodus werden zwei Zeitwerte aus dem CurrentDemand (1) Wert berechnet. Diese werden ZoneTime (0) und Zone Time (1) genannt.
ZoneTime (1) ist immer auf die Hälfte des Werts von ZoneTime (0) gesetzt.
ZoneTime (0) ist die Anzahl der Zeitfenster aus 190, in denen die Energieversorgung angeschaltet ist. ZoneTime (1) markiert den Mittelpunkt von ZoneTime (0), so dass bei ansteigenden Gradienten-Modus der FET-Zustand 50% Differential und 50% Halbdifferential (nur an den Enden) sein kann.
Eine Finite Zustände-Maschine, die UpdateCurrentDemand genannt wird, wird zur Kontrolle des Prozesses verwendet.
Zustand 0 initialisiert Variablen.
Zustand 1 entscheidet über eine von drei Untermaschinen
1. Normal
2. Anwachsen des Gradienten
3, Abfallen des Gradienten
Für ein Anwachsen oder Abfallen des Gradienten sind 2561446 Zeitfenster im Normalmodus und 190 im Gradientenmodus.

Normal-Modus:

Der Prozess wird unterteilt in 190 Zeitfenster.
Der FET-Zustand wird in Normal geschaltet.
Die Energieversorgung ist an für ZoneTime (0) aus 190 Fenstern, dann wird sie abgeschalten.

Anwachsender Gradienten-Modus:

Der Prozess wird unterteilt in 190 + 256 = 446 Zeitfenster.
Der FET-Zustand ist Differenzial (2-) für die Hälfte von ZoneTime (0), dann Halb- Differential (3-) für eine andere Hälfte von ZoneTime (0). (Dies ergibt einen stärker linearen Verlauf als nur einer der Zustände allein.)
Dann wird die Energieversorgung abgeschaltet bis zu Zeitfenster 191.
Dann wird der FET-Zustand nach Normal (4+, 4-) geschaltet, und der Gradientenmodus außer Kraft gesetzt für 258 Fenster.

Abfallender Gradientenmodus:

Der Prozess wird unterteilt in 190+256 = 446 Zeitfenster. Der FET-Zustand ist das Reverse-Differential (5+) für ZoneTime (0). Der FET-Zustand wird dann nach Normal geschaltet und der Gradientenmodus für 256 Fenster außer Kraft gesetzt. Die Energieversorgung wird ausgeschaltet bis zu Zeitfenster 191. Dann wird der FET-Zustand nach Normal geschaltet (4+, 4-) und der Gradientenmodus für 256 Fenster außer Kraft gesetzt.
Für jeden Gradientenmodus ist die Energieversorgung für Zone Time (0) im Gradientenmodus (falls verlangt) aus den ersten 190 Fenster, dann für eine weitere ZoneTime (0) aus den nächsten 256 Fenster im Normalmodus angeschaltet.

Zusammenfassung

im Normal (Nicht-Gradienten) Modus ist die Energieversorgung pulsweitenmoduliert, so dass sie für ZoneTime (0) Zeitfenster von 190 angeschaltet ist. Das PWM Verhältnis wird aus der Haupt-PID-Schleife berechnet.
Im Gradientenmodus, wenn eine Änderung des Gradienten verlangt ist, wird der FET-Zustand eingestellt, um die verlangte Änderung zu ergeben, und die Gradienten-PID-Schleife berechnet die ZoneTime (0), ZoneTime (1) und den benötigten Strom.
Wenn die 190 Zeitfenster abgeschlossen sind, wird die Einheit in den Normalmodus für 256 Fenster geschaltet, so dass die gesamte Feldtemperatur eingestellt werden kann. Wenn eine Änderung des Gradienten nicht verlangt ist, bleibt die Einheit im Normalmodus.

Claims

1. Thermozykliergerät mit einer Probenplatte, die zum Halten einer Vielzahl von Proben geeignet ist, einer Vielzahl von Heiz- und Kühlelementen, die entlang der Probenplatte angeordnet sind, einem gemeinsamen Versorgungsmittel, das zur Versorgung mit Strom an die Vielzahl von Heiz- und Kühlelementen angeschlossen ist, und Schaltmitteln, die geeignet sind, den Strom individuell durch jedes Heiz- oder Kühlelement oder durch jedes Set einer Vielzahl von Sets an Heiz- und Kühlelementen zu schalten bzw. verschiedene Heiz- oder Kühleffekte in individuellen Heiz- oder Kühlelementen oder in individuellen Sets von Heiz- oder Kühlelementen zu erzeugen.

2. Thermozykliergerät nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Schaltmittel selektiv betätigbar ist, um die Richtung des Stroms durch die Heiz- und Kühlelemente zu schalten.

3. Thermozykliergerät nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Schaltmittel selektiv betätigbar ist, um die Verbindung des Versorgungsmittel von den Heiz- und Kühlelementen zu trennen.

4. Thermozykliergerät nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Schaltmittel betätigbar ist, um zumindest einige der Heiz- und Kühlelemente miteinander in Serie zu verbinden.

5. Thermozykliergerät nach einem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass das Schaltmittel betätigbar ist, um das Versorgungsmittel zu schalten, um einen Strom in einer ersten Richtung zu einem der Heiz- und Kühlelemente zuzuführen und in einer zweiten Richtung zu anderen der Heiz- und Kühlelemente zuzuführen.

6. Thermozykliergerät nach einem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass das Schaltmittel betätigbar ist, um das Versorgungsmittel zu schalten, um Strom intermittierend einem oder mehreren der Heiz- oder Kühlelemente zuzuführen.