EP1214978B1 - Verfahren zur Temperierung von Proben auf unterschiedliche Temperaturen in einer Labortemperiereinrichtung - Google Patents

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EP1214978B1
EP1214978B1 EP01125514A EP01125514A EP1214978B1 EP 1214978 B1 EP1214978 B1 EP 1214978B1 EP 01125514 A EP01125514 A EP 01125514A EP 01125514 A EP01125514 A EP 01125514A EP 1214978 B1 EP1214978 B1 EP 1214978B1
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EP
European Patent Office
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groups
samples
steps
different
temperatures
Prior art date
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EP01125514A
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French (fr)
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EP1214978A3 (de
EP1214978A2 (de
Inventor
Ernst Tennstedt
Lars Dr. Peters
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Eppendorf SE
Original Assignee
Eppendorf SE
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Publication date
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
    • B01L7/54—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices using spatial temperature gradients
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
    • B01L7/52—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation

Definitions

  • the invention relates to a method referred to in the preamble of claim or claim 11 Art.
  • Such methods are used for tempering reaction samples, which are brought to temperatures in different temperature ranges in steps of a sequence of steps. The sequence of steps is repeated cyclically in one run. Such methods are suitable for carrying out special chemical reactions, in particular enzyme reactions.
  • the main field of application is PCR (Polymerase Chain Reaction).
  • the denaturation step is carried out at about 90 ° C.
  • the annealing step at about 50 ° C.
  • the elongation step at about 60 ° C.
  • reaction samples are arranged in a surface array in rows and columns according to the prior art.
  • a temperature gradient is applied in one direction of the array, that is, for example, in the direction of the lines. This results in the first groups of samples being formed by the columns, with equal temperatures within the columns, but different temperatures between the columns.
  • the temperatures each apply a degree differently and thus determine the optimum temperature.
  • the main field of application of the generic laboratory tempering devices is in the field of PCR. This usually uses three steps. It would be very advantageous to be able to optimize all three steps in a simple manner in a single tempering run. There are also known processes with more than three steps where the same problems exist. It is therefore an object of the present invention to provide a laboratory tempering device, which reduces the labor and equipment costs in determining the optimum temperatures of all steps of the sequence of steps.
  • the invention is based on the finding that in most of the generic Labortemperier wornen feasible processes and in particular in the usual three-step PCR process, the temperature changes in the individual steps do not always affect the same evaluation parameters.
  • temperature changes in the annealing step and in the elongation step affect substantially the same parameter, namely the specificity, ie the ratio of correctly amplified DNA strands of the correct length to incorrectly amplified strands of differing length.
  • temperature changes during the denaturation step essentially influence another parameter, namely the yield, that is to say the amount of amplified DNA material obtained.
  • the laboratory tempering device applies the gradients in different directions and in two steps (eg annealing step and .phi.) For two steps which influence the same parameter (eg annealing step and elongation step) Denaturation step) affecting different parameters, gradients in any direction. In the latter case, the temperature gradients can even be created in both steps in the same direction. Since the evaluation parameters in the two steps are different and can be determined independently, the optimum temperatures for both steps can be determined separately.
  • the invention is not limited to two-dimensional array arrangements of the reaction samples in row and column alignment.
  • the reaction samples may also be provided in a three-dimensional arrangement. Then you can optimize three steps in different gradient directions.
  • the invention then gives the advantage, even with more than three-step sequences, if at least one of the steps an independent parameter is affected to be able to optimize all steps in a single pass.
  • the invention is not limited to the usual arrangement of the reaction samples in a thermally conductive tempering block, e.g. is heated and cooled at opposite ends and thus generates a temperature gradient across the block.
  • a thermally conductive tempering block e.g. is heated and cooled at opposite ends and thus generates a temperature gradient across the block.
  • any random arrangements of the reaction samples and of the individual gradients are possible.
  • first groups of reaction samples are then appropriately tempered
  • second groups of reaction samples are tempered in accordance with the specification of claim 1. These groups may be randomly distributed across the sample array with any arrangement of reaction samples and / or temperature steps. With today's computer technology, the resulting complicated linking of the samples to first and second groups is not a problem.
  • the features of claim 2 are provided.
  • the scheme of group formation for the first groups can be used for the third group formation. This simplifies the tempering considerably.
  • the first groups consist of lines
  • the third groups also consist of lines. It is therefore possible to adopt the activation geometry of the first step for the second step.
  • the direction of the gradient of the second step may coincide with that of the gradient of the first step in parallel or anti-parallel.
  • the first groups it is only necessary for at least one of the first groups to have at least two of the samples belonging to different second groups.
  • This can be very simple coarsely rasterized optimizations perform the z. B. examine only two different temperatures per step.
  • the features of claim 3 are provided, according to which z. B. even with larger groups, each sample of the second groups belong to different first groups. For a flat array with rows and columns, this would mean that z. B. in the first step, the temperatures between the columns are different and in the second step between the lines are different, so all samples of a column in different rows (second groups) are.
  • the invention can also be carried out with a very complex arrangement of the reaction samples.
  • the features of claim 4 are provided. This allows the formation of the laboratory tempering device according to the invention in the usual standard construction, such. B. from one of the aforementioned publications.
  • the features are also advantageous Of the claim 5, so the usual clear orthogonal arrangement is used, which has the advantage that gradient can be generated in the row and column direction of the orthogonal edges of a block ago.
  • the groups according to claim 6 are assigned to the rows and columns.
  • the third groups can be chosen as desired. You can also coincide according to claim 2 with the first groups. Advantageously, you can also be selected according to claim 9. Thereafter, the third groups are divided in a two-dimensional array arrangement of the reaction samples into contiguous areas, which are occupied only with each sample of a group. This allows a particularly simple evaluation. In an arrangement of the samples in the tempering in rows and columns, the third groups so deviating from the rows and columns in areas such. B. in four sectors, may be arranged, provided that the temperature control of their type permits this. With individual temperature control of the reaction samples, the areas assigned to the third groups can be chosen as desired. For thermal reasons, for example, it is possible to place warmer groups in the interior of the array and colder groups towards the edge.
  • the invention can only be applied to a few of the steps, e.g. B. be applied to two of three steps, in which case the third step without temperature optimization is carried out with the same temperature of all reaction samples.
  • the features of claim 10 are advantageous intended.
  • temperature optimization represents a significant advantage in all steps of a process.
  • reaction samples are assigned to first, second and third groups which each have different temperatures for one of the steps in the associated temperature range between the groups but equal temperatures within the groups. This can be used at each step in different group distribution with different temperatures. In one run, the optimum temperatures can thus be determined for all three steps of the customary PCR process.
  • the samples may be arranged 3-dimensionally, whereby three dimensions, that is with regular arrangement e.g. Form columns, rows, and levels that can be grouped in a clear way. As already mentioned above for claim 1, irregular 3-dimensional arrangements with a correspondingly more complicated group division are possible if individual heating of the reaction samples are provided.
  • the features of claim 12 are provided.
  • this very simple arrangement with temperature gradients in the X, Y and Z directions can be carried out in a conventional thermally conductive block in which the reaction samples are arranged.
  • the tempering block In contrast to the known arrangement, however, the tempering block must be designed to be 3-dimensional and heatable here.
  • reaction samples are arranged in a surface.
  • sub-areas that have the usual XY arrangement of samples and that correspond to the levels of a 3-dimensional arrangement, for example, next to each other in one Be arranged surface.
  • the slightly confusing 2-dimensional arrangement can be converted into the 3-dimensional arrangement well-ordered with three coordinates for purposes of illustration.
  • the features of claim 14 are provided. Gradients of opposite direction are applied in partial steps in two steps, with the partial surfaces of the two steps overlapping in quadrants. In the third step, the formed quadrants are brought to different temperatures. In this way, it is also very easily possible to optimize the temperature for all steps in a single pass in a flat arrangement of reaction samples in three steps.
  • Fig. 1 shows a plan view of an array of a total of 35 reaction samples 1 arranged in a two-dimensional array in orthogonal rows and columns.
  • the field is bounded by a dashed edge 2.
  • It may be a usual, limited to the edge 2 Temperierblock 3, as he z. B. in DE 196 46 115 A1 to Fig. 5 is explained, with the possibility of applying a temperature gradient in the direction of the rows or in the direction of the columns.
  • the illustrated laboratory tempering device is operated to perform the annealing step of the standard PCR process. It is applied in the X direction of the line running in the direction of the arrow arrow, which ensures that all reaction samples 1 of the first column are at 40 °, all samples of the last column to 60 ° and the middle column to 50 °. The remaining columns have intermediate temperatures.
  • reaction samples 1 are thus tempered differently in first groups, wherein the first groups correspond to the columns of the arrangement shown. Within each first group (column), all reaction samples 1 have the same temperature; different temperatures prevail between the columns.
  • FIG. 2 shows the tempering device of FIG. 1 during the elongation step.
  • a temperature gradient in the sense of the arrow shown in the Y direction is created with suitable devices, not shown.
  • the bottom line is at 70 °
  • the top line at 76 °.
  • the intermediate lines have corresponding intermediate temperatures.
  • the reaction samples in second groups are kept at different temperatures, the second groups corresponding to the rows. It can be seen from comparison of FIGS. 1 and 2 that in the two steps illustrated in FIGS. 1 and 2, in each case all samples of a first group (column) belong to different second groups (rows) and vice versa. In the area representation, this means that the groups and also the temperature gradients are orthogonal to one another.
  • Fig. 3 shows the same tempering in the execution of a third step, namely the Denatur michsitzes. This step is also to be optimized for the most favorable temperature, namely in a temperature range which in the example shown lies at 90 ° -96 °. The temperature gradient is applied here in the Y direction.
  • the three steps of annealing, elongation and denaturation form a sequence of steps which is repeated several times for exponential amplification.
  • FIGS. 1-3 show, the temperature is varied during all steps in the temperature range assigned to each step.
  • different first groups columns
  • second groups rows
  • third groups are held at different temperatures between 90 ° -96 °.
  • different temperatures are applied.
  • Different annealing temperatures essentially affect the specificity of the reaction result. Specificity refers to the ratio of correctly amplified correct length DNA pieces to incorrectly amplified pieces of DNA of differing lengths.
  • the elongation temperature essentially influences the same evaluation parameter, namely the specificity.
  • the denaturation temperature in the step shown in FIG. 3 substantially affects the yield, that is, the amount of the reaction material obtained.
  • the tempering device is therefore designed so that it applies the temperature gradients in the independent direction X and Y in the two steps annealing ( Figure 1) and elongation ( Figure 2), which influence the same evaluation parameters.
  • the temperature gradient can be set in any desired direction. In the embodiment shown in Fig. 3, it is in the Y direction. However, it can also be in the X direction.
  • Fig. 4 shows in an embodiment variant of the device of Figs. 1-3 at Denaturierungs intimid, ie in the temperature range between 90 ° -96 °.
  • the third groups of different temperature are not arranged in rows or columns, but in the form of the three surface areas shown, which are at the three temperatures 90 °, 93 ° and 96 °.
  • the surface areas are subdivided by the illustrated area boundaries.
  • FIG. 4 assumes a slightly different construction.
  • a highly thermally conductive block suitable for the application of temperature gradients in the X and Y directions, as used for the embodiment of Figures 1-3 is, the formation of well demarcated in evenly tempered surfaces of FIG. 4 would be poorly suited.
  • special constructions can do this, in particular devices with individual temperature control of the individual reaction samples 1.
  • Such a construction of the laboratory tempering device can of course also generate the temperature gradients shown in FIGS. 1-3.
  • FIG. 5 again shows a highly schematic arrangement of a planar array of reaction samples arranged in rows and columns. Each reaction sample is represented by a number / letter combination. The numbers mean the columns and the letters the rows. A reaction sample in the second row and in the third column is thus shown as 3b.
  • Fig. 6 shows the same reaction samples shown in Fig. 5, but in a different, for example, random arrangement. Even with such an arrangement, which, however, requires individual temperature control of the reaction samples, a laboratory tempering device can work according to the invention. You must z. B. with computer support first groups (eg, the numbers 1-4) determine and temper at a first step but different in itself equal and they must in a second step second groups (letters) in groups different but tempered with the same temperatures , If the evaluation parameters are different for the two steps, they can form any groups in the two steps and be tempered accordingly.
  • first groups eg, the numbers 1-4
  • the reaction samples are sorted in area arrays in row and column order. This facilitates in particular the use of conventional tempering, which are suitable only for the formation of temperature gradients in the orthogonal direction and in the direction of the columns or rows.
  • this is equipped with Einzelemperempertechnik for the individual reaction samples, completely arbitrary arrangements can be chosen differently from the row and column pattern.
  • the invention is not limited to devices with a two-dimensional arrangement of the reaction samples.
  • the reaction samples can also be arranged in three dimensions, for. B. in a three-dimensional grid.
  • three steps can be simultaneously optimized in terms of their temperature, all of which influence the same evaluation parameters. If it is a Temperleitersprozeß having more than three steps, the already used directions can be used again with additional steps, provided that the evaluation parameters are independent.
  • the mentioned three-dimensional arrangement can also be rearranged with individual heating of the samples, as explained in the two-dimensional example in FIGS. 5 and 6. In this case, an arrangement in a plane is possible, to which the three-dimensional arrangement is shown.
  • the resulting cross-array allows to determine the effect of applied temperature gradients in both the X and Y directions on each of a number of samples.
  • the unoccupied sample places can remain empty.
  • the laboratory temperature device can also be designed in a special version only for the purpose of temperature optimization and then have only the sample points underlined in FIGS. 1 to 3.
  • FIG. 7 shows a further embodiment of a laboratory tempering device in which the reaction samples are arranged in an orthogonally arranged 3-dimensional arrangement with six columns, four rows and three levels. The three levels that are actually superimposed are shown side by side in FIG. 7 in order to simplify the overview.
  • reaction samples are provided, which are shown in Figure 7 with three-digit numbers. In each case, the first digit means the column, the second digit the line and the third digit the level. In the lowest level in Figure 7, therefore, all numbers end with 3, because this is the third level.
  • the samples are arranged in a 3-dimensional block of thermally conductive material.
  • gradients in the X-direction, Y-direction or Z-direction can be applied to this block. If a gradient is applied in the X direction, samples with a low number of columns are at lower and samples with a higher number of columns are at a higher temperature. If the gradient is applied in the Y-direction, it lies across the lines, thus bringing them to different temperatures. If the gradient is in the Z direction, the planes are brought to different temperatures. In each case, the rows, columns or planes, which are transverse to the respective applied gradient, are at the same temperature.
  • a gradient in the X direction, in every second step, a gradient in the Y direction and in every third step, a gradient in the Z direction are created.
  • FIG. 8 shows a variant in which all samples shown in FIG. 7 are arranged in the illustrated planar array. It can be seen that here the three levels shown individually in Figure 7 are arranged side by side in a surface, in the first six columns one above the other the upper and middle surface of FIG. 7 and in the 7 and 8 column the lowest surface of FIG 7 in rearrangement. With individual heating of the reaction samples or e.g. suitable subdivision of larger, not shown heaters can be applied to the samples of the arrangement of Figure 8 stepwise the same gradient, as explained for the embodiment of Figure 7.
  • FIGS. 9 to 11 show a further embodiment of the laboratory tempering device in three steps of a three-step sequence of steps.
  • FIG. 9 shows the annealing step
  • FIG. 10 shows the elongation step
  • FIG. 11 shows the denaturation step.
  • the temperatures indicated in the figures correspond to the associated temperature ranges, which have already been explained with reference to the figures 1 to 4.
  • reaction samples are arranged in six columns and four rows in orthogonal orientation.
  • the array surface is subdivided into two first sub-areas (left and right of the center line) with a vertically aligned first center line.
  • the temperature gradients shown by arrows are applied, which lead to the temperature distribution indicated by the numbers.
  • the right and left outer columns are at 40 °, the columns lying near the first center line are at 60 °. These are the same gradients, but with the opposite direction.
  • a corresponding temperature distribution is applied within the temperature range of 70 ° to 76 ° required for the elongation step.
  • opposing equal gradients are applied in the second partial areas thus formed.
  • Figure 11 shows the denaturation step.
  • different temperatures of 90 ° to 96 ° are applied, ie in the temperature range required for denaturation.
  • the sample for which all three temperatures are optimal would be the second column and the third row. It should be noted that, as shown in Fig. 9, when the optimum temperature is 50 ° as mentioned above, the optimum temperature exists in both the fifth row and the second row. In the example of Fig. 10, the optimum temperature is in the second row and also in the third row.
  • FIGS. 9 to 11 a very small array area with few reaction samples is shown in order to facilitate the graphic representation. This results in the elongation step in Figure 10 for the reaction samples only a differentiation into two temperatures. If the number of rows and columns is increased significantly, significantly finer temperature differences can be evaluated.
  • the tempering block can be used, for example. B. on its side facing away from the sample underside with nine Peltier elements in 3x3 arrangement be occupied over a large area. The middle peltier elements lie below the center lines in both directions and heat two neighboring quadrants from the edge. With this arrangement, the gradient tempering according to FIG. 9 and according to FIG. 10 can alternately be achieved in different current application of the Peltier elements.
  • the underside of the tempering block could additionally be provided with heating foils covering the quadrants, which individually bring the quadrants to the desired temperature in the step according to FIG. 11 and when the Peltier elements are switched off.
  • the gradients can also be applied in a different manner.
  • the right upper and lower right quadrants are applied with the same gradient in the same direction.
  • the gradient could also be applied in opposite directions in these two quadrants. The same applies to the quadrants on the top left and bottom. It can, for. B in the upper left quadrant of the gradient with left and left arrow below the gradient with the arrow to the right. This consideration also applies to FIG. 10.
  • gradients are applied in different directions in the four partial areas formed by the quadrants in each case in the first and second step, and in the third step (FIG. 11) in each case all Samples of a partial surface are at the same temperature. If four but eg six different temperatures are not required in the third step, as shown in FIG. 11, then six partial surfaces to be treated in the manner described above are required.

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Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren der im Oberbegriff des Anspruches bzw. des Anspruches 11 genannten Art.
  • Derartige Verfahren werden zum Temperieren von Reaktionsproben verwendet, die in Schritten einer Schrittfolge auf Temperaturen in unterschiedlichen Temperaturbereichen gebracht werden. Die Schrittfolge wird in einem Durchlauf zyklisch wiederholt. Solche Verfahren eignen sich zur Durchführung spezieller chemischer Reaktionen, insbesondere von Enzymreaktionen. Das Hauptanwendungsgebiet ist die PCR (Polymerase Chain Reaction). Dabei werden in dem üblichen dreischrittigen Verfahren der Denaturierungschritt bei zirka 90°C, der Annealingschritt bei zirka 50°C und der Elongationsschritt bei zirka 60°C durchlaufen.
  • Ein Problem ist dabei, insbesondere beim Annealingschritt, aber auch bei den anderen Schritten stets die Ermittlung der optimalen Temperatur. Dazu werden Versuche bei unterschiedlichen Temperaturen benötigt.
  • Um diese Versuche zur Auffindung der optimalen Temperatur eines Schrittes zu vereinfachen, wurde das gattungsgemäße Verfahren entwickelt, wie es z. B. in US-A-5 525 300, US-A-6 054 263 sowie in DE 196 46 115 A1 beschrieben ist.
  • Beim gattungsgemäßen Stand der Technik wird in einem der Schritte, zumeist im Annealingschritt mit unterschiedlichen Temperaturen gearbeitet. Bei den anderen Schritten werden gleiche Temperaturen verwendet. Die Reaktionsproben sind nach dem Stand der Technik in einem Flächenarray in Reihen und Spalten angeordnet. In dem Schritt, der unterschiedliche Temperaturen verwendet, wird in einer Richtung des Arrays, also beispielsweise in Richtung der Zeilen ein Temperaturgradient angelegt. Dies führt dazu, das erste Gruppen von Proben von den Spalten gebildet werden, wobei innerhalb der Spalten gleiche Temperaturen, zwischen den Spalten jedoch unterschiedliche Temperaturen anliegen.
  • Bei der Auswertung der Proben nach abgeschlossenem Temperierungsdurchlauf kann ermittelt werden, in welcher der Spalten das optimale Ergebnis vorliegt. Die zugehörige Temperatur ist dann die optimale Temperatur dieses Schrittes, z. B. des Annealingschritt.
  • Wird der Temperaturgradient auf den Annealingschritt angewendet und liegt bei diesem der Temperaturbereich z.B. bei 50°-60°C, so kann man z. B. in zehn Spalten die Temperaturen je ein Grad unterschiedlich anlegen und somit die optimale Temperatur ermitteln.
  • Will man auch bei den anderen Schritten der Schrittfolge die Temperaturen optimieren, so muß derselbe Durchlauf wiederholt werden, wobei nun aber der Gradient in einem anderen der Schritte angelegt wird. Will man bei dem üblichen dreischrittigen PCR-Verfahren alle drei Schritte optimieren, so müssen drei komplette Temperierdurchläufe nacheinander durchgeführt werden. Dazu ist ein erheblicher Zeitaufwand von zirka 1,5 h pro Durchlauf und ein erheblicher Verbrauch an zum Teil extrem teuren Proben erforderlich. Da die optimalen Temperaturen der einzelnen Schritte in unterschiedlichen Durchläufen ermittelt werden, werden eventuelle Wechselwirkungen zwischen den Temperaturen der Schritte nicht berücksichtigt. Dies kann zur Ermittlung nichtoptimaler Temperaturen führen.
  • In der DE 196 46 115 A1 ist zu Fig. 5 ein zu Anspruch 11 gattungsgemäßes Verfahren beschrieben, das bei zwei Schritten der Schrittfolge Gradienten in unterschiedlichen Richtungen (X, Y) an das Array der Reaktionsproben anlegt. Damit ist es möglich, in nur einem Durchlauf in zwei Temperaturbereichen die optimale Temperatur zu ermitteln.
  • Auch bei dem letztgenannten Verfahren ist ein weiterer Durchlauf zur Optimierung der dritten Temperatur erforderlich. Bei einer flächigen Arrayanordnung von Reaktionsproben stehen aber nur zwei Richtungen X und Y zur Verfügung. Für eine dritte Temperatur wäre eine dritte Richtung Z erforderlich, die bei einer zweidimensionalen Anordnung nicht vorhanden ist.
  • Dabei wurde es nach dem Stand der Technik für unabdingbar erforderlich gehalten, Gradienten bei unterschiedlichen Schritten in unterschiedlichen Richtungen anzulegen, also z. B. beim einen Schritt in Richtung der Spalten und beim anderen Schritt in Richtung der Zeilen, um bei der Ermittlung der Reaktionsergebnisse, die sich ergebenden Unterschiede eindeutig den Temperaturvariationen im einen Schritt und im andern Schritt zuordnen zu können.
  • Das Hauptanwendungsgebiet der gattungsgemäßen Labortemperiereinrichtungen liegt auf dem Gebiet der PCR. Diese verwendet üblicherweise drei Schritte. Es wäre sehr vorteilhaft, alle drei Schritte auf einfache Weise in einem einzigen Temperierdurchlauf optimieren zu können. Es sind auch Prozesse mit mehr als drei Schritten bekannt, bei denen dieselben Probleme bestehen. Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Labortemperiereinrichtung zu schaffen, die den Arbeits- und Geräteaufwand bei der Ermittlung der optimalen Temperaturen aller Schritte der Schrittfolge verringert.
  • Diese Aufgabe wird mit den Merkmalen des Anspruches 1 sowie des Anspruches 11 gelöst.
  • Bei der Lösung des Anspruches 1 geht die Erfindung von der Erkenntnis aus, daß bei den meisten auf gattungsgemäßen Labortemperiereinrichtungen durchführbaren Prozessen und insbesondere bei dem üblichen dreischrittigen PCR-Prozess die Temperaturänderungen bei den einzelnen Schritten nicht immer denselben Auswertparameter beeinflussen. Bei dem üblichen PCR-Prozess beeinflussen Temperaturänderungen beim Annealingschritt und beim Elongationsschritt im wesentlichen denselben Parameter, nämlich die Spezifität, also das Verhältnis von korrekt amplifizierten DNA-Strängen der richtigen Länge zu falsch amplifizierten Strängen abweichender Länge. Temperaturänderungen beim Denaturierungschritt beeinflussen aber im wesentlichen einen anderen Parameter nämlich die Ausbeute, also die Menge gewonnenen amplifizierten DNA-Materiales. Diese beiden Parameter sind voneinander unabhängig am Reaktionprodukt bestimmbar. Wenn man beim einfachen Beispiel einer Temperiereinrichtung mit flächig in Zeilen und Spalten angeordneten Reaktionsproben bleibt, legt die Labortemperiereinrichtung also bei zwei Schritten, die denselben Parameter beeinflussen (z.B. Annealingschritt und Elongationsschritt), die Gradienten in unterschiedlichen Richtungen an und bei zwei Schritten (z.B. Annealingschritt und Denaturierungschritt), die unterschiedliche Parameter beeinflussen, Gradienten in beliebiger Richtung an. Im letztgenannten Fall können die Temperaturgradienten sogar in beiden Schritten in derselben Richtung angelegt werden. Da hierbei die Auswertparameter bei den beiden Schritten unterschiedlich sind und unabhängig bestimmbar sind, können die optimalen Temperaturen für beide Schritte getrennt ermittelt werden. Es ergibt sich der enorme Vorteil, daß bei der mit Gradienten in X- und Y-Richtung arbeitenden Konstruktion der DE 196 46 115 A1 entgegen der bisherigen Erwartungen der Fachwelt doch alle drei Schritte des Standard PCR-Prozesses in einem Temperierdurchlauf optimiert werden können. Da die Temperaturen mehrerer Schritte in einem gemeinsamen Durchlauf ermittelt werden, werden auch Wechselwirkungen zwischen den Schritten (Crosstalk) berücksichtigt, was z.B. bei Annealingschritt und Elongationsschritt der Fall ist.
  • Die Erfindung ist nicht auf zweidimensionale Array-Anordnungen der Reaktionsproben in Zeilen- und Spaltenausrichtung beschränkt. Die Reaktionsproben können auch in einer dreidimensionalen Anordnung vorgesehen sein. Dann lassen sich drei Schritte in unterschiedlichen Gradientenrichtungen optimieren. Die Erfindung gibt dann den Vorteil, auch bei mehr als dreischrittigen Schrittfolgen, sofern bei wenigsten einem der Schritte ein unabhängiger Parameter beeinflußt wird, alle Schritte in einem Durchlauf optimieren zu können.
  • Bei der Optimierung eines Reaktionsprozesses, wie z.B. des PCR-Prozesses, kommt es nicht allein auf die Temperaturoptimierung bei den einzelnen Schritten an, sondern es kann auch erforderlich sein, die Reaktionsproben hinsichtlich anderer Parameter z.B. hinsichtlich der Verdünnung zu optimieren. Der Vorteil der Erfindung, Temperaturoptimierungen in mehr Schritten durchführen zu können als unabhängige Richtungen in der Probenanordnung vorhanden sind, bietet auch hierfür eine Lösung. In einer 3-dimensionalen Anordnung können z.B. mehrere Flächen in Ebenen übereinander gelegt werden, in denen Proben unterschiedlicher Verdünnung angeordnet sind. Da sich die Verdünnung auf dieselben Auswertparameter auswirken kann, ist es vorteilhaft, die Richtung, in der unterschiedliche Verdünnungen vorliegen, nicht zum Anlegen unterschiedlicher Temperaturen zu verwenden. Daher werden die Temperaturgradienten in den Ebenen angelegt. Es können also in einem Durchlauf alle drei Schritte des PCR-Prozesses hinsichtlich der Temperaturen und auch der Verdünnung optimiert werden.
  • Die Erfindung ist auch nicht beschränkt auf die übliche Anordnung der Reaktionsproben in einem wärmeleitenden Temperierblock, der z.B. an gegenüberliegenden Enden beheizt und gekühlt wird und auf diese Weise über den Block hinweg einen Temperaturgradienten erzeugt. Bei Verwendung von Einzeltemperiereinrichtungen für alle Reaktionsproben sind beliebige, auch zufällige Anordnungen der Reaktionsproben und der einzelnen Gradienten möglich. Es sind dann im ersten Schritt erste Gruppen von Reaktionsproben entsprechend zu temperieren und im zweiten Schritt zweite Gruppen von Reaktionsproben entsprechend der Vorschrift des Anspruch 1 zu temperieren. Diese Gruppen können bei beliebiger Anordnung der Reaktionsproben und/oder der Temperaturschritte zufällig über die Probenanordnung verteilt sein. Bei heutiger Computertechnik stellt die sich ergebende komplizierte Verknüpfung der Proben zu ersten und zweiten Gruppen kein Problem dar.
  • Sind die Auswertparameter zumindest weitgehend voneinander unabhängig, was wie erwähnt beim üblichen PCR-Prozeß z. B. bei dem Annealingschritt und dem Denaturierungsschritt der Fall ist, dann können, wie bereits erwähnt, die Proben der dritten Gruppen völlig beliebig gewählt werden, weil auf die Gruppenzusammenstellung bei den anderen Schritten wegen der unabhängigen Parameterauswertung keine Rücksicht genommen werden muß.
  • Vorteilhaft sind dann die Merkmale des Anspruches 2 vorgesehen. Hierbei können für die dritte Gruppenbildung das Schema der Gruppenbildung für die ersten Gruppen verwendet werden. Das vereinfacht die Temperiereinrichtung erheblich.
  • Bei dem bereits erwähnten Standardanwendungsfall einer flächigen Arrayanordung in Zeilen und Spalten können also z. B. die ersten Gruppen aus Zeilen bestehen und die dritten wiederum ebenfalls aus Zeilen. Es kann also für den zweiten Schritt die Ansteuerungsgeometrie des ersten Schrittes übernommen werden. Wird mit einem Temperaturgradienten in einem wärmeleitfähigem Block gearbeitet, so kann die Richtung des Gradient des zweiten Schrittes mit der des Gradienten des ersten Schrittes parallel oder antiparallel zusammenfallen. Unter anderem bedeutet dies, daß bei einer einfachen Labortemperiereinrichtung, die einen Gradienten in nur einer Richtung erzeugen kann, dennoch bei einem zweischrittigen Verfahren beide Schritte optimiert werden können, sofern bei diesen beiden Schritten die Auswertparameter unterschiedlich sind.
  • Nach der Erfindung ist es ganz allgemein nur erforderlich, daß bei mindestens einer der ersten Gruppen wenigsten zwei der Proben verschiedenen zweiten Gruppen angehören. Damit lassen sich sehr einfache grob gerasterte Optimierungen durchführen, die z. B. nur zwei unterschiedliche Temperaturen pro Schritt untersuchen. Vorteilhaft sind jedoch die Merkmale des Anspruches 3 vorgesehen, wonach z. B. auch bei größeren Gruppen jeweils alle Proben der zweiten Gruppen zu unterschiedlichen ersten Gruppen gehören. Bei einem flächigen Array mit Zeilen und Spalten würde dies bedeuten, daß z. B. im ersten Schritt die Temperaturen zwischen den Spalten unterschiedliche sind und im zweiten Schritt zwischen den Zeilen unterschiedlich sind, also alle Proben einer Spalte in unterschiedlichen Zeilen (zweiten Gruppen) liegen.
  • Wie bereits erwähnt, läßt sich die Erfindung auch mit sehr komplexer Anordnung der Reaktionsproben ausführen. Vorteilhaft sind jedoch die Merkmale des Anspruches 4 vorgesehen. Dies erlaubt die Ausbildung der erfindungsgemäßen Labortemperiereinrichtung in üblicher Standardbauweise, wie z. B. aus einer der eingangs genannten Schriften bekannt. Vorteilhaft sind dabei auch die Merkmale des Anspruches 5 vorgesehen, wird also die übliche übersichtliche orthogonale Anordnung verwendet, die den Vorteil hat, daß von den orthogonalen Kanten eines Blockes her Gradienten in Zeilen- und Spaltenrichtung erzeugt werden können. Dann sind vorteilhaft die Gruppen gemäß Anspruch 6 den Zeilen und Spalten zugeordnet.
  • Gattungsgemäße Verfahren dienen nicht nur der Optimierung der Temperaturen der einzelnen Schritte, sondern sind insbesondere auch nach Ermittlung der optimalen Temperaturen zur Massenverarbeitung von Proben vorgesehen. Sie nehmen daher eine sehr große Zahl von Reaktionsproben auf, z. B. 384 Proben in 24 Spalten und 16 Zeilen.
  • Dabei sind vorteilhaft die Merkmale des Anspruches 7 vorgesehen. Wenn hiernach z. B. nur eine der ersten Gruppen mehrere Proben enthält, und auch nur eine der zweiten Gruppen mehrere Proben enthält, ergibt sich im Falle der Anordnung in einem zweidimensionalen Array mit Zeilen und Spalten z. B. nur bei einer Zeile und nur einer Spalte eine vollständige Besetzung mit Proben, also pro Richtung nur eine besetzte Reihe. Werden bei den Schritten Gradienten in Zeilen- und Spaltenrichtung angelegt, so kann die Temperaturoptimierung mit sehr wenigen Proben, also mit sehr sparsamem Verbrauch der teuren Proben erfolgen. Dabei kann die Labortemperiereinrichtung durchaus zur Aufnahme einer sehr großen Probenzahl, z. B. 384 Proben ausgebildet sein. Die übrigen Probenplätze bleiben unbesetzt. Es kann jedoch auch ein Spezialgerät verwendet werden, das nur eine Probenspalte und ein Probenzeile aufweist und das speziell nur zur Optimierung vorgesehen ist und nicht für den Massendurchsatz. Selbstverständlich können pro Richtung auch mehr als eine besetzte Reihe verwendet werden, z.B. zwei parallele Reihen direkt nebeneinander oder auch im Abstand.
  • Dabei sind vorteilhaft die Merkmale des Anspruches 8 vorgesehen. Durch dieses Merkmal ist sichergestellt, daß jede Gruppe bei Schritten, bei denen ihre Proben auf gleicher Temperatur liegen, im mittleren Bereich des zugeordneten Temperaturbereiches liegen. Es wird also z.B. beim Annealingschritt mit unterschiedlichen Temperaturen nach der optimalen Temperatur gesucht. Bei den anderen Schritten werden aber die mittleren Temperaturen des Temperaturbereiches verwendet, um aussagekräftige Ergebnisse zu gewährleisten.
  • Wenn bei zwei Schritten unterschiedliche Auswertparameter beeinflußt werden, die ausgewerteten Ergebnisse also unabhängig sind, so können die dritten Gruppen beliebig gewählt werden. Sie können auch gemäß Anspruch 2 mit den ersten Gruppen zusammenfallen. Vorteilhaft können Sie auch gemäß Anspruch 9 gewählt werden. Danach sind die dritten Gruppen bei einer zweidimensionalen Array Anordnung der Reaktionsproben in zusammenhängende Flächen unterteilt, die nur mit jeweils Proben einer Gruppe besetzt sind. Dies ermöglicht eine besonders einfache Auswertung. Bei einer Anordnung der Proben in der Temperiereinrichtung in Zeilen und Spalten können die dritten Gruppen also abweichend von den Zeilen und Spalten in Flächen, z. B. in vier Sektoren, angeordnet sein, vorausgesetzt, daß die Temperiereinrichtung ihrer Bauart nach dies zuläßt. Bei Einzeltemperierung der Reaktionsproben können die den dritten Gruppen zugeordneten Flächen beliebig gewählt werden. Man kann beispielsweise aus thermischen Gründen wärmere Gruppen in das Innere des Arrays und kältere Gruppen zum Rand hin legen.
  • Die Erfindung kann bei mehrschrittigen Schrittfolgen nur auf wenige der Schritte, z. B. auf zwei von drei Schritten angewendet werden, wobei dann der dritte Schritt ohne Temperaturoptimierung mit gleicher Temperatur aller Reaktionsproben durchgeführt wird. Vorteilhaft sind jedoch die Merkmale des Anspruches 10 vorgesehen. Wie bereits erwähnt stellt die Temperaturoptimierung bei allen Schritten eines Prozesses einen erheblichen Vorteil dar.
  • Bei der Erfindung gemäß Anspruch 11 werden Reaktionsproben ersten, zweiten und dritten Gruppen zugeordnet, die jeweils für einen der Schritte in dem zugehörigen Temperaturbereich zwischen den Gruppen unterschiedliche Temperaturen, innerhalb der Gruppen jedoch gleiche Temperaturen aufweisen. Hiermit kann bei jedem Schritt in unterschiedlicher Gruppenaufteilung mit unterschiedlichen Temperaturen gearbeitet werden. In einem Durchlauf können somit bei allen drei Schritten des üblichen PCR-Prozesses die optimalen Temperaturen ermittelt werden.
  • Die Proben können 3-dimensional angeordnet sein, wodurch sich drei Dimensionen, also bei regelmäßiger Anordnung z.B. Spalten, Zeilen und Ebenen ausbilden, nach denen in übersichtlicher Weise gruppiert werden kann. Wie bereits oben zu Anspruch 1 erwähnt, sind auch unregelmäßige 3-dimensionale Anordnungen mit entsprechend komplizierterer Gruppenunterteilung möglich, wenn Einzelheizungen der Reaktionsproben vorgesehen sind.
  • Vorteilhaft sind die Merkmale des Anspruches 12 vorgesehen. Bei dieser sehr einfachen Anordnung mit Temperaturgradienten in X-, Y- und Z-Richtung kann in einem üblichen wärmeleitenden Block gearbeitet werden, in dem die Reaktionsproben angeordnet sind. Gegenüber der bekannten Anordnung muß hier allerdings der Temperierblock 3-dimensional und beheizbar ausgebildet sein.
  • Vorteilhaft sind auch die Merkmale des Anspruches 13, wonach die Reaktionsproben in einer Fläche angeordnet sind. Es können beispielsweise Teilflächen, die die übliche X-Y-Anordnung von Proben aufweisen und die den Ebenen einer 3-dimensionalen Anordnung entsprechen, zu mehreren z.B. nebeneinander in einer Fläche angeordnet sein. In dem die Labortemperiereinrichtung steuernden Computer kann zu Darstellungszwecken die etwas unübersichtliche 2-dimensionale Anordnung in die mit drei Koordinaten wohlgeordnete 3-dimensionale Anordnung umgerechnet werden.
  • Vorteilhaft sind die Merkmale des Anspruches 14 vorgesehen. In zwei Schritten werden jeweils in Teilflächen Gradienten entgegengesetzter Richtung angelegt, wobei sich die Teilflächen der beiden Schritte in Quadranten überlappen. Im dritten Schritt werden die gebildeten Quadranten auf unterschiedliche Temperaturen gebracht. Auf diese Weise ist es ebenfalls sehr einfach möglich, in einer flächigen Anordnung von Reaktionsproben in drei Schritten die Temperatur für alle Schritte in einem Durchgang zu optimieren.
  • Die Merkmale der Ansprüche 1 bis 10 sowie 11 bis 14 können in vorteilhafter Weise auch kombiniert werden.
  • In den Zeichnungen ist die Erfindung beispielsweise und schematisch dargestellt. Es zeigen:
    • Fig. 1
    eine stark schematisierte, erfindungsgemäß betriebene Labortemperiereinrichtung in Draufsicht auf ein nach Zeilen und Spalten geordnetes zweidimensionales Array von Reaktionsproben mit einem in X-Richtung angelegten Temperaturgradienten für den Annealingschritt eines Standard PCR-Prozesses,
    Fig. 2
    die Ansicht nach Fig. 1 für den Elongationsschritt mit einem Temperaturgradient in Y-Richtung,
    Fig. 3
    eine Ansicht nach Fig. 1 für den Denaturierungsschritt mit einem Temperaturgradienten ebenfalls in Y-Richtung,
    Fig. 4
    eine Ansicht nach Fig. 1 für den Denaturierungsschritt mit einer Aufteilung des Arrays in drei flächig gestaltete Gruppen,
    Fig. 5
    die schematische Darstellung eines nach Zeilen und Spalten geordneten Arrays von Reaktionsproben, die ersten Gruppen (Zahlen) und zweiten Gruppen (Buchstaben) zugeordnet sind,
    Fig. 6
    eine Darstellung entsprechend Fig. 5 mit anderer Anordnung der Reaktionsproben,
    Fig. 7
    eine stark schematisierte erfindungsgemäße Labortemperiereinrichtung mit 3-dimensionaler Anordnung von Reaktionsproben, wobei drei Ebenen der 3-dimensionalen Anordnung in der Figur übereinander dargestellt sind,
    Fig. 8
    die Darstellung einer Anordnung der Proben der Ausführungsform der Figur 7 in einem Flächenarray und
    Fig. 9-11
    zeigen eine in weiterer Ausführungsform betriebene Labortemperiereinrichtung mit den jeweils eingestellten Temperaturen bei drei Schritten.
  • Fig. 1 zeigt eine Draufsicht auf ein Array von insgesamt 35 Reaktionsproben 1, die in einem zweidimensionalen Array in orthogonalen Zeilen und Spalten angeordnet sind. Das Feld ist mit einem gestrichelt dargestellten Rand 2 umgrenzt. Es kann sich beispielsweise um einen üblichen, mit dem Rand 2 begrenzten Temperierblock 3 handeln, wie er z. B. in der DE 196 46 115 A1 zu Fig. 5 erläutert ist, mit der Möglichkeit, in Richtung der Zeilen oder in Richtung der Spalten einen Temperaturgradienten anzulegen. Zu den technischen Einzelheiten dazu wird auf die genannte Schrift ausdrücklich Bezug genommen.
  • In Fig. 1 ist die dargestellte Labortemperiereinrichtung zur Ausführung des Annealingschrittes des Standard PCR-Prozesses betrieben. Es ist in X-Richtung der mit in Zeilenrichtung laufendem Pfeil dargestellte Temperaturgradient angelegt, der dafür sorgt, daß alle Reaktionsproben 1 der ersten Spalte auf 40° liegen, alle Proben der letzten Spalte auf 60° und die der mittleren Spalte auf 50°. Die übrigen Spalten weisen dazwischen liegende Temperaturen auf.
  • Die dargestellten Reaktionsproben 1 sind somit in ersten Gruppen unterschiedlich temperiert, wobei die ersten Gruppen den Spalten der dargestellten Anordnung entsprechen. Innerhalb jeder ersten Gruppe (Spalte) weisen alle Reaktionsproben 1 gleiche Temperatur auf, zwischen den Spalten herrschen unterschiedliche Temperaturen.
  • Fig. 2 zeigt die Temperiereinrichtung der Fig. 1 beim Elongationsschritt. Hier ist mit geeigneten, nicht dargestellten Einrichtungen ein Temperaturgradient im Sinne des dargestellten Pfeiles in Y-Richtung angelegt. Die unterste Zeile liegt auf 70°, die oberste Zeile auf 76°. Die Zwischenzeilen haben entsprechende Zwischentemperaturen. Hier sind also die Reaktionsproben in zweiten Gruppen auf unterschiedlichen Temperaturen gehalten, wobei die zweiten Gruppen den Zeilen entsprechen. Aus Vergleich der Figuren 1 und 2 ist ersichtlich, daß bei den beiden in Fig. 1 und 2 dargestellten Schritten jeweils alle Proben einer ersten Gruppe (Spalte) unterschiedlichen zweiten Gruppen (Zeilen) angehören und umgekehrt. In der flächigen Darstellung bedeutet dies, daß die Gruppen und ebenso die Temperaturgradienten orthogonal zueinander stehen.
  • Fig. 3 zeigt dieselbe Temperiereinrichtung bei der Ausführung eines dritten Schrittes, nämlich des Denaturierungsschrittes. Auch dieser Schritt soll auf die günstigste Temperatur optimiert werden und zwar in einem Temperaturbereich, der im dargestellten Beispiel bei 90°-96° liegt. Der Temperaturgradient wird hier in Y-Richtung angelegt.
  • Die drei Schritte Annealing, Elongation und Denaturierung bilden eine Schrittfolge, die mehrfach wiederholt wird zur exponentiellen Amplifizierung.
  • Wie die Figuren 1-3 zeigen, wird bei allen Schritten in dem jeweils dem Schritt zugeordneten Temperaturbereich die Temperatur variiert. Gemäß Fig. 1 sind unterschiedliche erste Gruppen (Spalten) auf unterschiedlichen Temperaturen zwischen 40°-60° gehalten. Gemäß Fig. 2 sind zweite Gruppen (Zeilen) auf unterschiedlichen Temperaturen im Temperaturbereich zwischen 70°-76° gehalten. Gemäß Fig. 3, beim Denaturierungsschritt, sind unterschiedliche dritte Gruppen (wiederum Zeilen) auf unterschiedlichen Temperaturen zwischen 90°-96° gehalten. Bei allen drei Schritten werden unterschiedliche Temperaturen angelegt. Durch Auswertung des Reaktionsergebnisses nach abgeschlossenem Durchlauf kann ermittelt werden, welche Temperatur in welchem Schritt optimal ist. Das Reaktionsergebnis kann auch während des Durchlaufes laufend verfolgt werden (Onlinemonitoring).
  • Diese Auswertung stellt bei den beiden Schritten gemäß Fig. 1 und Fig. 2 kein Problem dar, da die Gradienten in X- und Y-Richtung, also orthogonal zueinander stehen. Man braucht nur auszuwerten in welcher Reaktionsprobe das beste Ergebnis vorliegt und kann dann nach Zeile und Spalte ersehen, welches die beste Annealingtemperatur (Fig. 1) und welches die beste Elongationstemperatur (Fig. 2) ist. Bei dem Denaturierungsschritt gemäß Fig. 3 fallen die dort unterschiedlich temperierten dritten Gruppen mit den in Fig. 2 unterschiedlich temperierten zweiten Gruppen zusammen. Bei beiden Gruppen handelt es sich um Zeilen.
  • Unterschiedliche Annealingtemperaturen beeinflussen im wesentlichen die Spezifität des Reaktionsergebnisses. Mit Spezifität wird das Verhältnis der korrekt amplifizierten DNA-Stücke mit korrekter Länge zu nicht korrekt amplifizierten DNA-Stücken abweichender Länge bezeichnet. Die Elongationstemperatur beeinflußt im wesentlichen denselben Auswertparameter, nämlich die Spezifität. Die Denaturierungstemperatur im Schritt gemäß Fig. 3 beeinflußt jedoch im wesentlichen die Ausbeute, also die Menge des erhaltenen Reaktionsmateriales.
  • Die Temperiereinrichtung ist daher so ausgebildet, daß sie bei den beiden Schritten Annealing (Fig 1) und Elongation (Fig. 2), die den selben Auswertparameter beeinflussen, die Temperaturgradienten in unabhängiger Richtung X und Y anlegt. Bei dem Schritt gemäß Fig. 3 (Denaturierung), der einen abweichenden Auswertparameter nämlich die Ausbeute beeinflußt, kann der Temperaturgradient in beliebiger Richtung gelegt werden. In dem in Fig. 3 dargestellten Ausführungsfall liegt er in Y-Richtung. Er kann jedoch auch in X-Richtung liegen.
  • Fig. 4 zeigt in einer Ausführungsvariante die Einrichtung der Fig. 1-3 beim Denaturierungsschritt, also im Temperaturbereich zwischen 90°-96°. Die dritten Gruppen unterschiedlicher Temperatur sind hier jedoch nicht zeilenweise oder spaltenweise angeordnet, sondern in Form der drei dargestellten Flächenbereiche, die auf den drei Temperaturen 90°, 93° und 96° liegen. Die Flächenbereiche sind durch die dargestellten Bereichsgrenzen unterteilt.
  • Die Ausführungsform der Fig. 4 setzt eine etwas andere Konstruktion voraus. Ein gut wärmeleitender Block, der sich zur Anlegung von Temperaturgradienten in X- und Y-Richtung eignet, wie er für die Ausführungsform der Figuren 1-3 verwendbar ist, wäre zur Ausbildung gut abgegrenzter in sich gleichmäßig temperierter Flächen gemäß Fig. 4 nur schlecht geeignet. Sonderkonstruktionen können dies jedoch leisten, insbesondere Einrichtungen mit individueller Temperierung der einzelnen Reaktionsproben 1. Eine solche Konstruktion der Labortemperiereinrichtung kann dann selbstverständlich auch die in den Figuren 1-3 dargestellten Temperaturgradienten erzeugen.
  • Die Erfindung ist nicht beschränkt auf die in den Figuren 1-4 dargestellte Ausführungsform.
  • Fig. 5 zeigt noch einmal stark schematisiert eine flächige Arrayanordnung von Reaktionsproben, die in Zeilen und Spalten angeordnet sind. Jede Reaktionsprobe ist mit einer Zahl/Buchstabe-Kombination dargestellt. Dabei bedeuten die Zahlen die Spalten und die Buchstaben die Zeilen. Eine Reaktionsprobe in der zweiten Zeile und in der dritten Spalte ist also mit 3b dargestellt.
  • Fig. 6 zeigt dieselben Reaktionsproben, die in Fig. 5 dargestellt sind, jedoch in einer anderen, z.B, zufälligen Anordnung. Auch mit einer solchen Anordnung, die allerdings Einzeltemperierung der Reaktionsproben voraussetzt, kann eine Labortemperiereinrichtung erfindungsgemäß arbeiten. Sie muß z. B. mit Computerunterstützung erste Gruppen (z. B. die Zahlen 1-4) ermitteln und bei einem ersten Schritt unterschiedlich aber in sich gleich temperieren und sie muß in einem zweiten Schritt zweite Gruppen (Buchstaben) gruppenweise unterschiedlich aber mit in sich gleichen Temperaturen temperieren. Wenn bei den beiden Schritten die Auswertparameter unterschiedlich sind, kann sie in den beiden Schritten beliebige Gruppen bilden und entsprechend temperieren.
  • In den dargestellten Ausführungsformen sind die Reaktionsproben in flächigen Arrays in Zeilen- und Spaltenanordnung sortiert. Dies erleichtert insbesondere die Verwendung herkömmlicher Temperierblocks, die nur zur Ausbildung von Temperaturgradienten in orthogonaler Richtung und zwar in Richtung der Spalten bzw. Zeilen geeignet sind. Bei anderer Ausbildung der Einrichtung, insbesondere, wenn diese mit Einzeltemperierung für die einzelnen Reaktionsproben ausgerüstet ist, können auch völlig willkürliche Anordnungen abweichend vom Zeilen- und Spaltenmuster gewählt werden.
  • Die Erfindung ist nicht auf Einrichtungen mit zweidimensionaler Anordnung der Reaktionsproben beschränkt. Die Reaktionsproben können auch dreidimensional angeordnet sein, z. B. in einem dreidimensionalen Gitter. Dann lassen sich drei Schritte gleichzeitig hinsichtlich ihrer Temperatur optimieren, die alle drei denselben Auswertparameter beeinflussen. Handelt es sich um einen Temperierungsprozeß, der mehr als drei Schritte aufweist, so können bei zusätzlichen Schritten die bereits verwendeten Richtungen erneut verwendet werden, sofern die Auswertparameter unabhängig sind. Die erwähnte dreidimensionale Anordnung kann bei Einzelheizung der Proben auch, wie am zweidimensionalen Beispiel in den Fig. 5 und 6 erläutert, umsortiert werden. Dabei ist auch eine Anordnung in einer Ebene möglich, auf die die dreidimensionale Anordnung abgebildet ist.
  • Im Ausführungsbeispiel der Figuren 1 bis 3 ist ein Array von Proben 1 dargestellt, das 5 Zeilen und 7 Spalten ausbildet, also insgesamt 35 Proben aufweist. Um in einem Durchlauf die optimalen Temperaturen für die drei Schritte zu ermitteln, müssen somit 35 teure Proben eingesetzt werden.
  • Es ist eine Einsparung möglich, indem, wie in den Figuren 1 bis 3 dargestellt, nur eine Spalte und nur eine Zeile mit Proben besetzt wird. In den Figuren 1 bis 3 ist dies durch Unterstreichung der Proben in der 5. Spalte und in der 4. Zeile dargestellt.
  • Die sich ergebende Kreuzanordnung ermöglicht, die Auswirkung der angelegten Temperaturgradienten sowohl in X-Richtung als auch in Y-Richtung jeweils an einer Reihe von Proben zu ermitteln. Die nicht besetzten Probenplätze können leer bleiben. Die Labortemperatureinrichtung kann auch in Spezialausführung nur zu Zwecken der Temperaturoptimierung ausgebildet sein und dann nur die in den Figuren 1 bis 3 unterstrichen dargestellten Probenplätze aufweisen.
  • Figur 7 zeigt eine weitere Ausführungsform einer Labortemperiereinrichtung, bei der die Reaktionsproben in einer orthogonal geordneten 3-dimensionalen Anordnung mit sechs Spalten, vier Zeilen und drei Ebenen angeordnet sind. Die drei Ebenen, die tatsächlich übereinander liegen, sind in Figur 7 nebeneinander dargestellt, um die Übersicht zu vereinfachen. An den Plätzen der dargestellten Anordnung sind Reaktionsproben vorgesehen, die in Figur 7 mit dreistelligen Zahlen dargestellt sind. Dabei bedeutet jeweils die erste Ziffer die Spalte, die zweite Ziffer die Zeile und die dritte Ziffer die Ebene. In der in Figur 7 ganz unten liegenden Ebene enden daher alle Zahlen mit 3, weil dies die dritte Ebene ist.
  • Im Ausführungsbeispiel sind die Proben in einem 3-dimensionalen Block aus wärmeleitfähigem Material angeordnet. Nach aus dem Stand der Technik bekannter Weise können an diesem Block Gradienten in X-Richtung, Y-Richtung oder Z-Richtung angelegt werden. Wird ein Gradient in X-Richtung angelegt, so liegen Proben mit niedriger Spaltenzahl auf niedrigerer und Proben mit höherer Spaltenzahl auf höherer Temperatur. Wird der Gradient in Y-Richtung angelegt, so liegt er quer zu den Zeilen, bringt also diese auf unterschiedliche Temperaturen. Liegt der Gradient in Z-Richtung an, so werden die Ebenen auf unterschiedliche Temperatur gebracht. Dabei liegen jeweils die Zeilen, Spalten oder Ebenen, die quer zum jeweils angelegten Gradienten stehen, auf gleicher Temperatur.
  • Bei einem Prozeß mit einer dreischrittigen Schrittfolge können mit der dargestellten Labortemperiereinrichtung mit zyklisch wiederholter Schrittfolge, z.B. immer wieder im ersten Schritt ein Gradient in X-Richtung, in jedem zweiten Schritt ein Gradient in Y-Richtung und in jedem dritten Schritt ein Gradient in Z-Richtung angelegt werden.
  • Die in Figur 7 dargestellt 3-dimensionale Anordnung mit orthogonal geordneter Anordnung der Reaktionsproben zeichnet sich durch gute Übersichtlichkeit aus. Werden die Proben nicht in einen wärmeleitfähigen Block sondern mit Einzelheizung temperiert, so können auch abweichende 3-dimensionale Anordnungen verwendet werden, bei denen die Proben z.B. beliebig vertauscht angeordnet sind, analog zur Vertauschung zwischen den Figuren 5 und 6.
  • Figur 8 zeigt eine Ausführungsvariante, bei der alle in Figur 7 dargestellten Proben in dem dargestellten flächigen Array angeordnet sind. Man kann erkennen, daß hier die in Figur 7 einzeln dargestellten drei Ebenen nebeneinander in einer Fläche angeordnet sind, und zwar in den ersten sechs Spalten übereinander die obere und mittlere Fläche gemäß Fig. 7 und in der 7 und 8 Spalte die unterste Fläche der Fig. 7 in Umordnung. Mit Einzelheizung der Reaktionsproben oder z.B. geeigneter Unterteilung größerer, nicht dargestellter Heizeinrichtungen können an die Proben der Anordnung gemäß Figur 8 schrittweise dieselben Gradienten angelegt werden, wie zur Ausführungsform der Figur 7 erläutert.
  • Die Figuren 9 bis 11 zeigen eine weitere Ausführungsform der Labortemperiereinrichtung in drei Schritten einer dreischrittigen Schrittfolge. Dabei zeigt Figur 9 den Annealingschritt, Figur 10 den Elongationsschritt und Figur 11 den Denaturierungsschritt. Die in den Figuren angegebenen Temperaturen entsprechen den zugehörigen Temperaturbereichen, die anhand der Figuren 1 bis 4 bereits erläutert wurden.
  • In allen drei Figuren 9 bis 11 ist dieselbe flächige Arrayanordnung von Reaktionsproben, jeweils mit Kreisen angedeutet, dargestellt. Im Ausführungsbeispiel sind die Reaktionsproben in sechs Spalten und vier Zeilen in orthogonaler Ausrichtung angeordnet.
  • Beim Annealingschritt der Figur 9 ist die Arrayfläche mit einer lotrecht stehenden ersten Mittellinie in zwei erste Teilflächen (links bzw. rechts der Mittellinie) unterteilt. In den beiden so gebildeten Teilflächen sind die mit Pfeilen dargestellten Temperaturgradienten angelegt, die zu der mit den Zahlen angegebenen Temperaturverteilung führen. Die rechts und links außen liegenden Spalten liegen auf 40 °, die nahe der ersten Mittellinie liegenden Spalten liegen auf 60 °. Es handelt sich also um gleiche Gradienten jedoch mit umgekehrter Richtung.
  • Beim Elongationsschritt der Figur 10 wird eine entsprechende Temperaturverteilung jedoch innerhalb des für den Elongationsschritt benötigten Temperaturbereiches von 70° bis 76 ° angelegt. Hier liegt allerdings die zweite Mittellinie senkrecht zur ersten Mittellinie, also waagerecht. Es sind wiederum gegenläufige gleiche Gradienten in den so gebildeten zweiten Teilflächen angelegt.
  • Figur 11 zeigt den Denaturierungsschritt. Bei diesem wird in den aus den beiden aus Figur 9 und 10 ersichtlichen Mittellinien gebildeten vier Quadranten jeweils unterschiedliche Temperatur von 90° bis 96° angelegt, also im Temperaturbereich der für die Denaturierung erforderlich ist.
  • Betrachtet man die unterstrichen gekennzeichnete Reaktionsprobe die in Spalte 5, Zeile 2 liegt, und verfolgt man diese durch die drei in den Figuren 9, 10 und 11 dargestellten Schritte, so erkennt man, daß diese Probe eindeutig hinsichtlich der optimalen Temperaturen in den drei Schritten identifiziert werden kann. Sie benötigt für den Annealingschritt gemäß Figur 9 etwa 50°, für den Elongationsschritt gemäß Figur 10 etwa 75° und für den Denaturierungsschritt gemäß Figur 11 etwa 92°.
  • Läge die optimale Temperatur bei dem Schritt gemäß Fig. 9 bei 50, gemäß Fig. 10 bei 75°, gemäß Fig. 11 jedoch anders, und zwar beispielsweise bei 96°, so läge die Probe, für die alle drei Temperaturen optimal sind, in der zweiten Spalte und der dritten Zeile. Es ist zu beachten, daß, wenn in Fig. 9 die optimale Temperatur wie erwähnt bei 50° liegt, dann sowohl in der fünften Zeile als auch in der zweiten Zeile die optimale Temperatur herrscht. Beim gewählten Beispiel der Fig. 10 liegt die optimale Temperatur in der zweiten Zeile und auch in der dritten Zeile.
  • Es wird nur angemerkt, daß in den Figuren 9 bis 11 eine sehr kleine Arrayfläche mit wenigen Reaktionsproben dargestellt ist, um die zeichnerische Darstellung zu erleichtern. Dadurch ergibt sich beim Elongationsschritt in Figur 10 für die Reaktionsproben nur eine Differenzierung in zwei Temperaturen. Wird die Anzahl der Zeilen und Spalten deutlich erhöht, so lassen sich wesentlich feinere Temperaturunterschiede auswerten.
  • Wird anstelle der in den Figuren 9 bis 11 dargestellten Arrayfläche mit 24 Proben in sechs Spalten und vier Zeilen die übliche, wesentlich größere Anzahl von 384 Proben in vierundzwanzig Spalten und sechzehn Zeilen verwendet und wird, wie in den Figuren 9 bis 11 dargestellt, mit Teilflächen in Form von Quadranten gearbeitet, so ergeben sich vier Quadranten mit je zwölf Spalten und acht Zeilen. Sollen Temperaturübergangsprobleme im Bereich der Mittellinien zwischen den Quadranten vermieden werden, so können beispielsweise jeweils die beiden den Mittellinien in jedem Quadranten benachbarten Zeilen bzw. Spalten frei gelassen werden. Es verbleiben dann noch in den vier Ecken des Arrays angeordnete, mit Proben besetzte Bereiche, die jeweils in zehn Spalten und sechs Zeilen sechzig Proben aufnehmen und in denen mit hoher Temperaturauflösung die optimale Temperatur gesucht werden kann.
  • Wird bei einer solchen Labortemperiereinrichtung mit einem durchgehend wärmeleitfähigen Temperierblock nach Art der Konstruktion gearbeitet, die in der DE 196 46 115 C2 in den Figuren 1 bis 3 dargestellt ist, dann kann der Temperierblock z. B. an seiner den Proben abgewandten Unterseite mit neun Peltierelementen in 3x3 Anordnung großflächig besetzt sein. Dabei liegen in beiden Richtungen die mittleren Peltierelemente unter den Mittellinien und beheizen jeweils vom Rand her zwei benachbarte Quadranten. Mit dieser Anordnung läßt sich in unterschiedlicher Strombeaufschlagung der Peltierelemente abwechselnd die Gradiententemperierung nach Fig. 9 und nach Fig. 10 erzielen. Zur Erzeugung der quadrantenweise unterschiedlichen Beheizung gemäß Fig. 11 könnte die Unterseite des Temperieblockes zusätzlich mit die Quadranten bedeckenden Heizfolien versehen sein, die bei dem Schritt gemäß Fig. 11 und bei ausgeschalteten Peltierelementen die Quadranten einzeln auf die gewünschte Temperatur bringen.
  • Anders als bei der in den Fig. 9 bis 11 dargestellten Ausführungsform können die Gradienten auch in anderer Weise angelegt werden. Gemäß Darstellung in Fig. 9 werden der rechte obere und der rechte untere Quadrant mit dem selben Gradienten in der selben Richtung beaufschlagt. Der Gradient könnte in diesen beiden Quadranten auch mit entgegengesetzter Richtung angelegt sein. Dasselbe gilt auch für die Quadranten links oben und unten. Es kann z. B im linken oberen Quadranten der Gradient mit Pfeil nach links und links unten der Gradient mit Pfeil nach rechts angelegt sein. Diese Überlegung gilt auch für die Fig. 10.
  • Allgemein gilt für diese Ausführungsform, daß in den vier durch die Quadranten gebildeten Teilflächen jeweils im ersten und zweiten Schritt Gradienten in verschieden Richtungen angelegt sind und im dritten Schritt (Fig. 11) jeweils alle Proben einer Teilfläche auf gleicher Temperatur liegen. Werden im dritten Schritt nicht, wie in Fig. 11 dargestellt, vier sondern z.B. sechs unterschiedliche Temperaturen benötigt, so sind dementsprechend sechs auf die vorbeschriebene Weise zu behandelnde Teilflächen erforderlich.
  • In jeder Teilfläche liegt im dritten Schritt eine andere Temperatur an, und werden in den beiden anderen Schritten Gradienten über jede Teilfläche angelegt. Da es für jede Kombination der unterschiedlichen Temperaturen der unterschiedlichen Schritte eine Probe gibt, die mit dieser Temperaturkombination behandelt wurde, werden mit dieser Anordnung auch alle Wechselwirkungen zwischen den Schritten berücksichtigt.

Claims (14)

  1. Verfahren zur gemeinsamen Temperierung von Reaktionsproben in einer Labortemperiereinrichtung in mindestens zwei Schritten in jeweils zugeordneten bestimmten Temperaturbereichen, wobei die Schritte als Schrittfolge wiederholt nacheinander ausgeführt werden, wobei in einem beliebig ausgewählten ersten Schritt der Schrittfolge mehrere erste Gruppen von Proben, wobei wenigstens eine der Gruppen mehrere Proben enthält, auf innerhalb der Gruppen gleiche und zwischen den Gruppen unterschiedliche Temperaturen innerhalb des dem ersten Schritt zugeordneten ersten Temperaturbereiches gebracht werden, dadurch gekennzeichnet, daß in einem beliebig ausgewählten zweiten Schritt der Schrittfolge, entweder, wenn das Reaktionsprodukt bei den beiden Schritten hinsichtlich gleicher Auswertparameter beeinflußt wird, bei mindestens einer der ersten Gruppen wenigstens zwei der Proben verschiedenen zweiten Gruppen angehören, die auf innerhalb der Gruppen gleiche und zwischen den Gruppen unterschiedliche Temperaturen innerhalb des dem zweiten Schritt zugeordneten zweiten Temperaturbereiches gebracht werden, oder, wenn die Auswertparameter unterschiedlich sind, wenigstens zwei beliebige der Proben unterschiedlichen dritten Gruppen angehören, die auf innerhalb der Gruppen gleiche und zwischen den Gruppen unterschiedliche Temperaturen innerhalb des dem zweiten Schritt zugeordneten zweiten Temperaturbereiches gebracht werden.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei zwei Schritten mit unterschiedlichen Auswertparametern alle Proben einer dritten Gruppe in einer ersten Gruppe enthalten sind oder alle Proben einer ersten Gruppe in einer dritten Gruppe enthalten sind.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei zwei Schritten mit gleichen Auswertparametern bei allen zweiten Gruppen jeweils alle Proben unterschiedlichen ersten Gruppen angehören.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Proben in einem Array in Zeilen und Spalten angeordnet sind.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Zeilen und Spalten orthogonal zueinander angeordnet sind.
  6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß alle Proben einer Gruppe in einer Zeile oder in einer Spalte liegen.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß nur je eine der ersten und/oder zweiten und/oder dritten Gruppen mehrere Proben enthalten.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die mehrere Proben enthaltenden Gruppen Proben derjenigen anderen Gruppen enthalten, die in ihrem jeweils zugeordneten Temperaturbereich in der Nähe der mittleren Temperatur liegen.
  9. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die dritten Gruppen Teilbereiche des Arrays ausbilden, welche mit ihren Bereichsgrenzen nur jeweils Proben derselben dritten Gruppe umschließen.
  10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei allen Schritten der Schrittfolge die Proben auf gruppenweise unterschiedliche Temperaturen im Bereich des zugeordneten Temperaturbereiches gebracht sind.
  11. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Reaktions produkt bei den beiden Schritten hinsichtlich gleicher Auswertparameter wird, dadurch gekennzeichnet, daß in einem beliebig ausgewählten dritten Schritt der Schrittfolge bei mindestens einer der ersten Gruppen und mindestens einer der zweiten Gruppen wenigstens jeweils zwei Proben verschiedenen dritten Gruppen augehören, die auf innerhalb der Gruppen gleiche und zwischen den Gruppen unterschiedliche Temperaturen innerhalb des dem dritten Schritt zugeordneten dritten Temperaturbereiches gebracht werden.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionsproben 3-dimensional angeordnet sind und zur Erzeugung der unterschiedlichen Temperaturen für drei Schritte Temperaturgradienten in X-, Y- und Z-Richtung angelegt werden.
  13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionsproben in einer Fläche angeordnet sind.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß in dem ersten Schritt die Fläche mit einer ersten Mittellinie in zwei erste Teilflächen geteilt ist, in denen jeweils gleiche Temperaturgradienten mit entgegengesetzter Richtung senkrecht zur Mittellinie angelegt sind, und daß in dem zweiten Schritt die Fläche mit einer zweiten Mittellinie, die senkrecht zur ersten Mittellinie steht, in zwei zweite Teilflächen geteilt ist, in denen jeweils gleiche Temperaturgradienten mit entgegengesetzter Richtung senkrecht zur Mittellinie angelegt sind, und daß in dem dritten Schritt in den durch die beiden Mittellinien gebildeten vier Quadranten der Fläche unterschiedliche Temperaturen angelegt sind.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7452712B2 (en) 2002-07-30 2008-11-18 Applied Biosystems Inc. Sample block apparatus and method of maintaining a microcard on a sample block
US7570443B2 (en) 2003-09-19 2009-08-04 Applied Biosystems, Llc Optical camera alignment
US20050237528A1 (en) * 2003-09-19 2005-10-27 Oldham Mark F Transparent heater for thermocycling
EP2608088B1 (de) * 2011-12-20 2018-12-12 F. Hoffmann-La Roche AG Verbessertes Verfahren zur Analyse von Nukleinsäure
US9188514B1 (en) * 2013-05-23 2015-11-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy System and method for producing a sample having a monotonic doping gradient of a diffusive constituent or interstitial atom or molecule

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1323309A (en) * 1969-12-24 1973-07-11 Toyo Kagaku Sangyo Kk Nobe A Apparatus for establishing temperature gradients in specimen containers
FI77055C (fi) * 1987-05-15 1989-01-10 Limitek Oy Vaermegradient-inkubator.
FI81831C (fi) * 1989-03-06 1990-12-10 Biodata Oy Temperaturgradient-inkubator foer undersoekning av temperaturavhaengiga fenomen.
US5255976A (en) * 1992-07-10 1993-10-26 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Temperature gradient calorimeter
US5525300A (en) * 1993-10-20 1996-06-11 Stratagene Thermal cycler including a temperature gradient block
DE19646115C2 (de) * 1996-11-08 2000-05-25 Eppendorf Geraetebau Netheler Verwendung von Temperiereinrichtungen zur Temperierung eines Temperierblockes
DE29623597U1 (de) * 1996-11-08 1999-01-07 Eppendorf - Netheler - Hinz Gmbh, 22339 Hamburg Temperierblock mit Temperiereinrichtungen
GB9720926D0 (en) * 1997-10-03 1997-12-03 Molecular Sensors Ltd Intelligent control of nucleic amplification procedures including the polymerase chain reaction
US6337435B1 (en) * 1999-07-30 2002-01-08 Bio-Rad Laboratories, Inc. Temperature control for multi-vessel reaction apparatus
DE29917313U1 (de) * 1999-10-01 2001-02-15 MWG-BIOTECH AG, 85560 Ebersberg Vorrichtung zur Durchführung chemischer oder biologischer Reaktionen
AU2001238638A1 (en) * 2000-02-23 2001-09-03 Mj Research, Inc. Thermal cycler that allows two-dimension temperature gradients and hold time optimization
US7727479B2 (en) * 2000-09-29 2010-06-01 Applied Biosystems, Llc Device for the carrying out of chemical or biological reactions
DE10062890A1 (de) * 2000-12-12 2002-06-27 Eppendorf Ag Labortemperiereinrichtung zur Temperierung von Reaktionsproben

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