DE69836582T2

DE69836582T2 - Kurze peptide die die aktivität serine/threonine kinasen modulieren

Info

Publication number: DE69836582T2
Application number: DE69836582T
Authority: DE
Inventors: A. Shmuel BEN-SASSON
Original assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem; Childrens Medical Center Corp
Current assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem; Childrens Medical Center Corp
Priority date: 1997-05-21
Filing date: 1998-05-20
Publication date: 2007-09-20
Anticipated expiration: 2018-05-21
Also published as: ATE347590T1; JP2002500649A; AU734642B2; AU7583398A; EP0983346A2; DE69836582D1; CA2290721A1; US6174993B1; EP0983346B1; WO1998053050A3; WO1998053050A2; CN1257538A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Serin/Threonin-Kinasen stellen ein Vertreter der eukaryotischen Proteinkinase-Superfamilie dar. Enzyme dieser Klasse phosphorylieren Serin- oder Threoninreste von intrazellulären Proteinen spezifisch und sind von Bedeutung bei der Vermittlung der Signal-Transduktion in vielzelligen Organismen. Viele Serin/Threonin-Kinasen treten als intrazelluläre Proteine auf, welche an der Signal-Transduktion innerhalb der Zelle beteiligt sind, einschließlich der Signal-Transduktion zum Kern und der Aktivierung von anderen Proteinen. Andere Serin/Threonin-Kinasen wie die an G-Proteine gebundene Rezeptorkinasen werden in Zellmembranen gefunden und nehmen an der Transmembran-Signalübertragung teil.
Als solches stellt die Phosphorylierung von Serin oder Threonin durch Serin/Threonin-Kinasen einen wichtigen Mechanismus zur Regulation von intrazellulären Ereignissen in Reaktion auf Veränderungen der Umgebung dar. Ein breites Spektrum von zellulären Ereignissen werden von Serin/Threonin-Kinasen reguliert. Einige wenige Beispiele sind die Fähigkeit der Zellen, in die Mitose einzutreten und/oder sie zu vollenden, die Zellproliferation, die Zelldifferenzierung, Die Kontrolle des Fettstoffwechsels, Immunantworten, Entzündungsreaktionen und die Kontrolle des Glykogenstoffwechsels.
Somit weisen Agenzien, welche die Aktivität von Serin/Threoninkinasen modulieren (erhöhen oder senken) können ein großes Potential für die Behandlung eines breiten Spektrums von Krankheiten und Zuständen auf, wie z.B. Krebs, Fettsucht, Autoimmunerkrankungen, Entzündungen und Typ II-Diabetes.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist jetzt gefunden worden, dass kurze Peptide, welche Derivate des HJ-Loops einer Serin/Threonin-Kinase sind, die Aktivitäten von die Serin/Threonin-Kinase exprimierenden Zellen signifikant beeinflussen (der "HJ-Loop wird weiter unten definiert). Beispielsweise hemmen die Peptidderivate des HJ-Loops von Raf und Polo die Proliferation von Aortazellen des Rindes sowie die transformierten Mauszelllinien MS1 und/oder SVR in vitro bei niedrigen Konzentration von 10 μM (Beispiel 2). Auf Grundlage der zuvor erwähnten Entdeckungen werden hier neuartige Peptide beschrieben, welche Peptidderivate fes HJ-Loops der Serin/Threonin-Kinasen sind. Verfahren zur Identifizierung eines Peptiderivats eines HJ-Loops der Serin/Threonin-Kinase, dasa die Aktivität dieser Serin/Threonin-Kinase moduliert, werden ebenfalls beschrieben. Verfahren zur Modulation der Aktivität einer Serin/Threonin-Kinase in einem Subjekt werden ebenfalls beschrieben.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein neuartiges Peptid, das Peptidderivat des HJ-Loops der Serin/Threonin-Kinase ist. Das Peptid umfasst zwischen etwa 5 und etwa 20 Aminosäureresten oder Aminosäurerest-Analogen und moduliert die Aktivität der Serin/Threonin-Kinase. Der N-Terminus und/oder C-Terminus des Peptids kann substituiert oder nicht substituiert sein. Das Peptid kann linear oder cyclisch sein.
Die Peptide der vorliegenden Erfindung lassen sich in einem Verfahren zur Modulation der Serin/Threonin-Kinase in einem Subjekt verwenden. Das Verfahren umfasst die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Peptids, das wie oben beschrieben ein Derivat des HJ-Loops dieser Serin/Threonin-Kinase ist.
Es wird ein Verfahren zur Identifizierung eines Peptids beschrieben, das die Aktivität einer Serin/Threonin-Kinase moduliert. Das Verfahren umfasst das zur Verfügung stellen eines "Testpeptids", welches etwa 5 bis etwa 20 Aminosäurereste Oder Aminosäure-Analoga aufweist und das ein Peptidderivat des HJ-Loops dieser Serin/Threonin-Kinase ist. Das Testpeptid wird mit Zellen mit einer Zellaktivität oder -funktion unter der Kontrolle dieser Serin/Threonin-Kinase unter Bedingungen inkubiert, die zur Bestimmung der Aktivität der Serin/Threonin-Kinase geeignet sind. Die Aktivität der Serin/Threonin-Kinase wird ermittelt und mit Zellen des gleichen Typs, die unter den gleichen Bedingungen in Abwesenheit der Testpeptide gezüchtet wurden, verglichen. Eine größere oder kleinere Aktivität im Vergleich mit in Abwesenheit des Testpeptids gezüchteten Zellen zeigt an, dass das Testpeptid die Aktivität der Serin/Threonin-Kinase moduliert.
Die Peptide der vorliegenden Erfindung lassen sich bei der Behandlung eines breiten Spektrums von Krankheiten einsetzen die von einer Überaktivität oder einer Unteraktivität einer STK verursacht wurden. Beispiele sind, aber nicht ausschließlich, Krebs, Diabetes, Fettleibigkeit, Krankheiten des Zentralnervensystems, Entzündungserkrankungen, Autoimmunkrankheiten und Herzgefäßerkrankungen. Die Peptide der vorliegenden Erfindung sind auch in vitr von Nutzen, z.B. bei der Gewinnung von Antikörpern, welche die Serin/Threonin.Kinase spezifisch binden, von der das Peptid abstammte. Diese Antikörper kann man verwenden, um die Serin/Threonin.Kinase exprimierenden Zellen zu identifizieren und die intrazelluläre Verteilung der Serin/Threonin.Kinase zu untersuchen. Zusätzlich können die Peptide der vorliegenden Erfindung dazu benutzt werden, Liganden zu identifizieren und quantitativ zu bestimmen, welche den HJ-Loop der Serin/Threonin.Kinase binden, von dem das Peptid abstammte.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 ist eine Sequenz, welche die Konsensus-Sequenz von Aminosäure 1 bis Aminosäure 10 des in der Familie der Serin/Threonin-Kinasen gefundenen HJ-Loops wiedergibt.
2 ist eine Sequenz, welche die Konsensus-Sequenz von Aminosäure 1 bis Aminosäure 20 des HJ-Loops der AMP-abhängigen Protein-Kinase und der Protein.Kinase C.
3 ist eine die Aminosäuresequenz des HJ-Loops der folgenden Serin/Threonin-Kinasen wiedergebende Tabelle: RAF (SEQ ID NO.: 1), cyclische AMP-abhängige Proteinkinase (CAPK) (SEQ ID NO.: 2), Protein-Kinase C (SEQ ID NO.: 3), ab deb G-REzeptor gekoppelte Proteinkinasen β2-adrenerger Rezeptor-Kinasen 1 und 2 (bARK1.2) (SEQ ID NO.: 4), Calmodulin-abhängige Kinase (SEQ ID NO.: 5), Polo-Kinasen (SEQ ID NO.: 6), Akt/PKB (SEQ ID NO.: 7) die an das G-Protein gekoppelten Rezeptorkinasen GRK1 (SEQ ID NO.: 8), GRK4 (SEQ ID NO.: 9), GRK5 (SEQ ID NO.: 10), GRK6 (SEQ ID NO.: 11) und GSK3 (SEQ ID NO.: 12). Ebenfalls gezeigt sind Beispiele für konservative Substitutionen in diesen Aminosäuresequenzen. An "*" gibt einen aliphatischen, substituierten aliphatischen, benzylischen, substituierten benzylischen, aromatischen oder substituierten aromatischen Ester der Glutaminsäure oder der Asparaginsäure an.
4 ist eine Tabelle, welche die Sequenzen der folgenden Peptide wiedergibt: HJ-38 (SEQ ID NO.: 13), J-41 (SEQ ID NO.: 14), J-42 (SEQ ID NO.: 15), J-43 (SEQ ID NO.: 16), J-43.1 (SEQ ID NO.: 17), J-45 (SEQ ID NO.: 18), J-46 (SEQ ID NO.: 19), J-47 (SEQ ID NO.: 20), J-48 (SEQ ID NO.: 21) und J-29 (SEQ ID NO.: 22). Alle Peptide sind N-acetyliert und C-amidiert. "E!" zeigt einen Benzylester der Glutaminsäure an.
5 ist eine graphische Darstellung und zeigt die prozentuale Hemmung der Kollagenproduktion in fötalen Fibroblasten der Lunge in Gegenwart wachsender Konzentrationen (μM) von K048H101 (SEQ ID NO.: 24) relativ zur Kontrolle. K048H101 ist ein Peptidderivat des HJ-Loops der Serin/Threonin-Kinase ALK1.
6 ist eine Tabelle, welche die Sequenz der beispielhaften Peptidderivate der vorliegenden Beschreibung sowie die Serin/Threonin-Kinasen zeigt, aus welchen sie abstammen. Die in 6 gezeigten Peptidderivate sind
K095H101 (SEQ ID NO.: 23); K048H101 (SEQ ID NO.:
24); K098H101 (SEQ ID NO.: 25); K099H101 (SEQ ID NO.
26); K093H101 (SEQ ID NO.: 27); K014H101 (SEQ ID NO.:
28); K004H001 (SEQ ID NO.; 29); K004H002 (SEQ ID NO.:
30); K049H101 {SEQ ID HO.: 31); K050H101 (SEQ ID NO.:
32); K088H001 (SEQ ID NO.: 33); K088H101 (SEQ ID NO.:
34); K088H103 (SEQ ID NO.: 35); K088H104 (SEQ ID NO.
36); K092H001 (SBQ ID NO.: 37); K018H101 (SEQ ID NO.:
38); K087H001 (SEQ ID NO.: 39); K087H101 (SEQ ID NO.
40); K087H102 (SEQ ID NO.: 41); K087H103 (SEQ ID NO-
42); K090H101 (SEQ ID NO.: 43); K091H001 (SEQ ID NO.:
44); K091H101 (SEQ ID NO.: 45); K107H001 (SEQ ID NO.
46); K107H101 (SEQ ID HO.: 47); K107H102 (SEQ ID NO.:
48); K045H101 (SEQ ID NO.: 49); K045H102 {SEQ ID NO,
50); K008H001 (SEQ ID NO.: 51); K008H101 (SEQ ID NO.:
52); K008HL02 (SEQ ID NO.: 53); K008H103 (SEQ ID NO.:
54); K035H001 (SEQ ID NO.: 55}; K035H101 (SEQ ID NO.:
56); K038H101 (SEQ ID NO.: 57); K038H102 (SEQ ID NO.:
58); K003H103 (SEQ ID NO.: 59) K003H104 {SEQ ID NO.:
60); K001H102 (SEQ ID NO.: 61) und K001H103 {SEQ ID
NO.: 62).
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Eine Serin/Threonin-Kinase (im Folgenden als "STK" bezeichnet) ist ein intrazelluläres oder membrangebundenes Protein, welches das γ-Phosphat von ATP oder GTP benutzt, um an der Hydroxylgruppe eines Serin- oder Threoninrestes Phosphatmonoester zu erzeugen. STKs weisen homologe "Kinasedomänen" oder "katalytische Domänen" auf, welche diese Phosphorylierung ausführen.
Basierend auf einem Vergleich einer großen Anzahl von Proteinkinasen ist nun bekannt, dass die Kinasedomäne der Proteinkinasen, einschließlich der STKs, in zwölf Subdomänen unterteilt werden kann, welches Abschnitte sind, die im Allgemeinen nicht von großen Aminosäure-Insertionen unterbrochen sind und charakteristische Muster von konservierten Resten enthalten (Hanks und Hunter, "The Eukaryotic Protein Kinase Superfamily", in Hardie und Hanks (Hrg.), The Protein Kinase Facts Book, Band I, Academic Press, Kapitel 2, 1995. Diese Subdomänen werden als Subdomäne I bis Subdomäne XII bezeichnet.
Der HJ-Loop, auf den hier Bezug genommen wird, wird in der Kinasedomäne der STKs zwischen der Mitte von Subdomäne IX und der Mitte von Subdomäne X gefunden. Wegen des hohen Grades an Homologie, die in den Subdomänen der unterschiedlichen Proteinkinasen, einschließlich der STKs, gefunden wird, lässt sich mit den Aminosäuresequenzen der Domänen der unterschiedlichen STKs ein Proteinalignment durchführen. Somit lässt sich der HJ-Loop einer STK unter Bezugnahme auf die Aminosäuresequenz einer prototypischen Proteinkinase wie z.B. PKA-Cα definieren und es kann gesagt werden, dass er einer zusammenhängenden Sequenz von etwa 20 Aminosäureresten entspricht, die man zwischen den Aminosäuren 229 und 248 von PKA-Cα findet.
Eine zweite Definition für einen HJ-Loop einer STK, welche zu der im vorhergehenden Ansatz abgegebenen Definition komplementär ist, kann unter Bezugnahme auf die dreidimensionale Struktur der Kinasedomäne der STKs erfolgen. Es wurde gefunden, dass die Kinasedomäne der STKs mindestens neun α-Helices enthält, die als Helix A bis Helix I bezeichnet werden (Tabor et al., Phil. Trans. R. Soc. Lond. B340: 315 (1993), Mohammadi et al., Cell 86: 577 (1996) und Hubbard et al., Nature 372: 746 (1994)). Der HJ-Loop ist eine zusammenhängende Sequenz von etwa 20 Aminosäuren, welche in der F-Helix etwa 5 Aminosäurereste vom N-Terminus der F-Helix entfernt beginnt und sich bis zu etwa 5 Aminosäurereste in die G-Helix hinein erstreckt.
Wahlweise können der C-Terminus oder der N-Terminus oder beide von den Peptiden der vorliegenden Erfindung mit einer Schutzgruppe für eine Carbonsäure bzw. einer Schutzgruppe für ein Amin substituiert sein. Geeignete Schutzgruppen werden in Green und Wuts, "Protecting Groups in Organic Synthesis", John Wiley and Sons, Kapitel 5 und 7, 1991 beschrieben, wovon die Lehre hiermit als Referenz eingeführt wird. Bevorzugte Schutzgruppen sind solche, welche den Transport des Peptids in eine Zelle erleichtern, indem sie z.B. die hydrophilen Eigenschaften des Peptids herabsetzen und die lipophilen Eigenschaften erhöhen. Beispiele für Schutzgruppen des N-Terminus sind Acylgruppen (-CO-R₁) und Alkoxycarbonyl- oder Aryloxycarbonyl (-CO-O-R₁), worin R₁ eine aliphatische, eine substituierte aliphatische, eine Benzyl-, eine substituierte Benzyl-, eine aromatische oder eine substituierte aromatische Gruppe ist. Spezielle Beispiele für Acylgruppen sind Acetyl, (Ethyl) -CO-, n-Propyl-CO-, iso-Propyl-CO-, n-Butyl-CO-, sec-Butyl-CO-, t-Butyl-CO-, Phenyl-CO-, substituierter Phenyl -CO-, Benzyl-CO- und (substituierter Benzyl)-CO-. Beispiele für Alkoxycarbonyl- und Aryloxycarbonyl-Gruppen sind CH₃-O-CO-, (Ethyl)-O-CO-, n-Propyl-O-CO-, iso-Propyl-O-CO-, n-Butyl-O-CO-, sec-Butyl-O-CO-, t-Butyl-O-CO-, Phenyl-O-CO-, substituierter Phenyl-O-CO- und Benzyl-O-CO-, (substituierter Benzyl)-O-CO-. Die Carboxylgruppe am C-Terminus kann z.B. als Amid (d.h. die Hydroxylgruppe am C-Terminus wird durch -NH₂, -NHR₂ und -NR₂R₃ ersetzt) oder als Ester (d.h. die Hydroxylgruppe am C-Terminus wird durch -OR₂ ersetzt) geschützt werden. R₂ und R₃ sind unabhängig voneinander eine aliphatische, eine substituierte aliphatische, eine Benzyl-, eine substituierte Benzyl-, eine Aryl- oder eine substituierte Aryl-Gruppe Zusätzlich können zusammen mit dem Stickstoffatom R₂ und R₃ einen heterocyclischen C2- - C8-Ring bilden mit etwa 0 bis 2 zusätzlichen Heteroatomen wie z.B. Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel. Beispiele für geeignete heterocyclische Ringe sind Piperidinyl, Pyrrolidinyl, Morpholino, Thiomorpholino oder Piperazinyl. Beispiele für C-terminale Schutzgruppen sind -NH₂, -NHCH₃, -N(CH₃)₂, -NH(Ethyl), -N(Ethyl)₂, N(Methyl)(Ethyl), -Nh(Benzyl), -N(C1-C4-Alkyl)(Benzyl), -NH(Phenyl), -N(C1-C4-Alkyl)(Phenyl), -OCH₃, -O-(Ethyl), -O-(n-Propyl), -O-(t-Butyl), -O-Benzyl und -O-Phenyl.
Ein "Peptidderivat des HJ-Loops" umfasst ein Peptid mit der Aminosäuresequenz des HJ-Loops. Ein "Peptidderivat des HJ-Loops" umfasst auch z.B. eine Nebensequenz des HJ-Loops der STK. Eine Nebensequenz ist eine zusammenhängende Sequenz von ca. 5 bis ca. 20 Aminosäuren oder Aminosäureresten, die innerhalb einer größeren Sequenz gefunden werden. Somit ist eine Nebensequenz des HJ-Loops eine zusammenhängende Sequenz von ca. 5 bis ca. 20 Aminosäuren oder Aminosäureresten, die im HJ-Loop gefunden werden. Eine Nebensequenz des HJ-Loops kann auch als "Fragment" des HJ-Loops bezeichnet werden.
Ein "Peptidderivat" umfasst auch ein Peptid mit einer "modifizierten Sequenz", in welcher eine oder mehrere Aminosäuren in der ursprünglichen Sequenz oder Nebensequenz durch eine natürlich vorkommende Aminosäure oder durch ein Aminosäureanaloges (auch als "modifizierte Aminosäure" bezeichnet) ersetzt worden sind.
Ein "Aminosäurerest" ist ein in einem Peptid gefundener Anteil und wird durch -NH-CHR-CO- wiedergegeben, worin R die Seitenkette einer natürlich vorkommenden Aminosäure ist. Bei Bezugnahme auf einen in einem Peptid gefundenen Anteil sind in dieser Anmeldung die Begriffe "Aminosäurerest" und "Aminosäure" austauschbar. Ein "Analoges eines Aminosäurerests" umfasst D- oder L-Reste mit der folgenden Formel: -NH-CHR-CO-, worin R eine aliphatische Gruppe, eine substituierte aliphatische Gruppe, eine Benzylgruppe, eine substituierte Benzylgruppe, eine aromatische Gruppe oder eine substituierte aromatische Gruppe ist und R nicht der Seitenkette einer natürlich vorkommenden Aminosäure entspricht. Wenn auf einen in einem Peptid gefundenen Anteil Bezug genommen wird, werden in dieser Anmeldung die Ausdrücke "Analoges eines Aminosäurerests" und "Aminosäureanaloges" als untereinander austauschbar verwendet.
Die hier verwendeten aliphatischen Gruppen umfassen geradkettige, verzweigte oder cyclische C1-C8-Kohlenwasserstoffe, die vollständig gesättigt sind und ein oder zwei Heteroatome wie Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthalten und/oder die eine oder mehrere nicht gesättigte Einheiten enthalten. Die aromatischen Gruppen umfassen carbocyclische aromatische Gruppen wie Phenyl und Naphthyl sowie heterocyclische aromatische Gruppen wie Imidazolyl, Indolyl, Thienyl, Furanyl, Benzofuranyl, Chinolinyl, Isochinolinyl und Acridinyl.
Geeignete Substituenten an einer aliphatischen, aromatischen oder Benzyl-Gruppe sind -OH, Halogen (-Br, -Cl, -I und -F), -O(aliphatische, substituierte aliphatische, Benzyl-, substituierte Benzyl-, Aryl- oder substituierte Aryl- Gruppe), -CN, -NO₂, -COOH, -NH₂, -NH(aliphatische, substituierte aliphatische, Benzyl-, substituierte Benzyl-, Aryl- oder substituierte Aryl-Gruppe), -N(aliphatische, substituierte aliphatische, Benzyl-, substituierte Benzyl-, Aryl- oder substituierte Aryl-Gruppe), -COO(aliphatische, substituierte aliphatische, Benzyl-, substituierte Benzyl-, Aryl- oder substituierte Aryl-Gruppe), -CONH₂, -CONH(aliphatische, substituierte aliphatische, Benzyl-, substituierte Benzyl-, Aryl- oder substituierte Aryl-Gruppe), -SH, -S(aliphatische, substituierte aliphatische, Benzyl-, substituierte Benzyl-, aromatische oder substituierte aromatische Gruppe) und NH-C(=NH)-NH₂. Eine substituierte benzylisch oder aromatische Gruppe kann auch eine aliphatische oder substituierte aliphatische Gruppe als Substituenten haben. Eine substituierte aliphatische Gruppe kann auch eine Benzyl-, substituierte Benzyl-, Aryl- oder substituierte Aryl-Gruppe als Substituenten haben. Eine substituierte aliphatische, substituierte aromatische oder substituierte Benzyl-Gruppe kann einen oder mehrere Substituenten haben.
Geeignete Substitutionen für die Aminosäurereste in der Sequenz eines HJ-Loops oder einer Nebensequenz eines HJ-Loops umfassen konservative Substitutionen, die zu Peptidderivaten Führen, welche die Aktivität einer STK modulieren. Eine "konservative Substitution" ist eine Substitution, in welcher die substituierende Aminosäure (natürlich vorkommend oder modifiziert) etwa die gleiche Größe und elektronischen Eigenschaften besitzt wie die substituierte Aminosäure. Somit hätte die substituierende Aminosäure die gleiche oder eine ähnliche funktionelle Gruppe in der Seitenkette wie die ursprüngliche Aminosäure.
Eine "konservative Substitution" bezieht sich auch auf die Verwendung einer substituierenden Aminosäure, die mit der substituierten Aminosäure identisch ist, mit der Ausnahme, dass eine funktionelle Gruppe in der Seitenkette mit einer geeigneten Schutzgruppe funktionalisiert ist. Geeignete Schutzgruppen werden in Green und Wuts, "Protecting Groups in Organic Synthesis", John Wiley and Sons, Kapitel 5 und 7, 1991 beschrieben.
Wie bei den N-terminalen und C-terminalen Schutzgruppen, sind bevorzugte Schutzgruppen solche, welche den Transport des Peptids in eine Zelle erleichtern, indem sie z.B. die hydrophilen Eigenschaften des Peptids herabsetzen und die lipophilen Eigenschaften erhöhen und welche sich in vivo innerhalb der Zelle entweder mittels einer Hydrolyse oder enzymatisch spalten lassen (Ditter et al., J. Pharm. Sci. 57: 783 (1968); Ditter et al., J. Pharm. Sci. 57: 828 (1968); Ditter et al., J. Pharm. Sci. 58: 557 (1969); King et al., Biochemistry 26: 2294 (1987); Lindberg et al., Drug Metabolism and Disposition 17: 311 (1989) und Tunek et al., Biochem. Pharm. 37: 3867 (1988), Anderson et al., Arch. Biochem. Biophys. 239: 538 (1985) und Singhal et al., FASEB J. 1: 220 (1987)). Die Hydroxyl-Schutzgruppen umfassen Ester-, Carbonat- und Carbamat-Schutzgruppen. Die Aminschutzgruppen umfassen, wie oben für die N-terminalen Schutzgruppen beschrieben, Alkoxy- und Aryloxycarbonylgruppen. Carbonsäure-Schutzgruppen umfassen, wie oben für die C-terminalen Schutzgruppen beschrieben, aliphatische, Benzyl- und Aryl-Ester. In einer Ausführungsform wird die Carbonsäuregruppe in der Seitenkette von einem oder mehreren Glutaminsäure- und Asparaginsäureresten in einem Peptid der vorliegenden Erfindung vorzugsweise als Methyl-, Ethyl-, Benzyl- oder substituierter Benzyl-Ester geschützt, mehr bevorzugt als Benzylester.
Unten werden Gruppen von natürlich vorkommenden und modifizierten Aminosäuren angegeben, in welchen jede Aminosäure in einer Gruppe ähnliche elektronische und sterische Eigenschaften aufweist. Folglich kann eine konservative Substitution erfolgen, indem eine Aminosäure durch eine andere Aminosäure aus der gleichen Gruppe ersetzt wird. Selbstverständlich geben diese Gruppen nicht alle Möglichkeiten wieder, d.h. es gibt für jede Gruppe noch zusätzliche modifizierte Aminosäuren, welche in die Gruppe mit einbezogen werden könnten.
Gruppe I umfasst Leucin, Isoleucin, Valin, Methionin, Serin, Cystein, Threonin und die modifizierten Aminosäuren mit den folgenden Seitenketten: Ethyl, n-Butyl, -CH₂CH₂OH, -CH₂CH₂CH₂OH, -CH₂CHOHCH₃ und -CHSCH₃. Vorzugsweise umfasst die Gruppe I Leucin, Isoleucin, Valin und Methionin.
Gruppe II umfasst Glycin, Alanin, Valin, Serin, Cystein, Threonin und eine modifizierte Aminosäure mit einer Ethyl-Seitenkette. Vorzugsweise umfasst die Gruppe II Glycin und Alanin.
Gruppe III umfasst Phenylalanin, Phenylglycin, Tyrosin, Tryptophan, Cyclohexylmethyl und modifizierte Aminosäurereste mit substituierten Benzyl- oder Phenyl-Seitenketten Bevorzugt sind einer oder mehrere der folgenden Substituenten: Halogen, Methyl, Ethyl, Nitro, Methoxy, Ethoxy und -CN. Vorzugsweise umfasst die Gruppe III Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan.
Gruppe IV umfasst Glutaminsäure, Asparaginsäure, einen substituierten oder unsubstituierten aliphatischen, aromatischen oder Benzyl-Ester der Glutamin- oder Asparaginsäure (z.B. Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, Cyclohexyl, Benzyl oder substituierten Benzyl), Glutamin, Asparagin, CO-NH-alkyliertes Glutamin oder Asparagin (z.B. Methyl, Ethyl, n-Propyl und Isopropyl) und modifizierte Aminosäuren mit der Seitenkette -(CH₂)₃-COOH, einen Ester derselben (substituierter oder unsubstituierter aliphatischer, aromatischer oder Benzyl-Ester), ein Amid derselben sowie ein substituiertes oder unsubstituiertes N-alkyliertes Amid derselben. Vorzugsweise umfasst die Gruppe IV Glutaminsäure, Asparaginsäure, Methylaspartat, Ethylaspartat, Benzylaspartat sowie Methylglutamat, Ethylglutamat, und Benzylglutamat.
Gruppe V umfasst Histidin, Lysin, Arginin, N-Nitroarginin, β-Cycloarginin, γ-Hydroxyarginin, N-Amidinocitrullin und 2-Amino-4-guanidinobutansäure, Homologe des Lysins, Homologe des Arginins und Ornithins. Vorzugsweise umfasst die Gruppe V Histidin, Lysin, Arginin und Ornithin. Ein Homologes einer Aminosäure umfasst 1 bis 3 zusätzliche Methyleneinheiten in der Seitenkette.
Gruppe VI umfasst Serin, Threonin, Cystein und modifizierte Aminosäuren mit geradkettigen oder verzweigten C1-C5-Alkyl-Seitenketten, welche -OH oder -SH substituiert sind. Vorzugsweise umfasst die Gruppe VI Serin, Cystein oder Threonin.
In einem anderen Aspekt umfassen geeignete Substitutionen für Aminosäurereste in der Sequenz eines HJ-Loops oder einer Nebensequenz eines HJ-Loops "harte" Substitutionen, die zu Peptidderivaten führen, welche die Aktivität einer STK modulieren. Harte Substitutionen, die zu Peptidderivaten führen, welche die Aktivität einer STK modulieren, sind weit mehr an den Positionen möglich, die überall in der Familie der Serin/Threonin-Kinasen nicht stark konserviert sind, als an Positionen, welche stark konserviert sind. 1 zeigt die Konsensus-Sequenz der ca. zehn ersten Aminosäuren des HJ-Loops der STKs. 2 zeigt die Konsensus-Sequenz der ca. 20 Aminosäuren des HJ-Loops der cyclischen AMP-abhängigen Kinase und der Proteinkinase C. Die Positionen, welche in der STK-Familie stark konserviert sind und die an diesen Positionen im Allgemeinen gefundenen konservierten Aminosäuren sind kenntlich gemacht. Die Positionen, welche in der STK-Familie stark konservativ sind, sind mit einem "X" gekennzeichnet. Da D-Aminosäuren ein Wasserstoffatom an einer Position aufweisen, die identisch mit dem Wasserstoffatom in der Seitenkette des Glycins ist, kann das Glycin an Position 6 in 1 oder an den Positionen 6 und 12 in 2 durch D-Aminosäuren oder deren Analoga ersetzt werden.
Eine "harte Substitution" ist eine Substitution, bei welcher die substituierende Aminosäure (natürlich vorkommend oder modifiziert) über eine deutlich unterschiedliche Größe und/oder elektronische Eigenschaften verfügt im Vergleich mit der zu substituierenden Aminosäure. So kann die Seitenkette der substituierenden Aminosäure deutlich größer oder kleiner sein als die Seitenkette der zu substituierenden Aminosäure und/oder die substituierende Aminosäure kann über funktionelle Gruppen mit deutlich unterschiedlichen elektronischen Eigenschaften verfügen als die zu substituierende Aminosäure. Beispiele für harte Substitutionen dieses Typs sind der Ersatz von Alanin durch Phenylalanin oder Cyclohexylmethylglycin, von Glycin durch Isoleucin, von einer L-Aminosäure durch eine entsprechende D-Aminosäure oder von Asparaginsäure durch -NH-CH[(-CH₂)₅-COOH]-CO-. Alternativ kann eine funktionelle Gruppe an die Seitenkette angeheftet, aus der Seitenkette entfernt oder durch eine andere funktionelle ausgetauscht werden. Beispiele für harte Substitutionen dieses Typs sind das Anheften eines Amins oder Hydroxyl oder einer Carbonsäure an die aliphatische Seitenkette von Valin, Leucin oder Isoleucin, ein Austausch der Carbonsäure in der Seitenkette von Asparagin- oder Glutaminsäure durch ein Amin oder die Entfernung der Amingruppe in der Seitenkette von Lysin oder Ornithin. In noch einer anderen Alternative kann die Seitenkette der substituierenden Aminosäure deutlich unterschiedliche sterische und elektronische Eigenschaften zu der funktionellen Gruppe der zu substituierenden Aminosäure haben. Beispiele für derartige Modifikationen sind Tryptophan an Stelle von Glycin, Lysin an Stelle von Asparaginsäure und -(CH₂)₄COOH an Stelle der Seitenkette von Serin. Diese Beispiele sollen jedoch nicht einschränkend ausgelegt werden.
Beispielhafte STKs, deren Aktivität sich, wie hier beschrieben, von Peptiden und Peptidderivaten modulieren lässt, sind, jedoch nicht ausschließlich, STKs, die zu den folgenden STK-Familien gehören: Polo-Familie (Glover et al., J. Cell Biol., 135: 1681 (1996)), Raf, (Mitogen-aktivierte Proteinkinasen (MAP-Konasen), Akt/PKB (Frank et al., Cell 88: 435 (1997)) und Hemmings et al., Science 275: 638 (1997)) sowie an das G-Protein-gebundene Rezeptorkinasen. Andere geeignete STKs sind von cyclischem AMP (cAMP) abhängige Proteinkinase, Proteinkinase C, Calmodulin-abhängige Kinase, Glykogensynthase-Kinase-3 (GSK3) und cyclische GMP (cGMP)-abhängige Proteinkinase.
Geeignete Vertreter der Polo-Familie sind, aber nicht ausschließlich, Plk, Snk und Sak. Geeignete Vertreter der Raf-Familie sind, aber nicht ausschließlich, Raf-1, A-Raf und B-Raf. Geeignete G-Protein-abhängige Kinasen sind, aber nicht ausschließlich, β-adrenerge Rezeptorkinasen 1 und 2, Rhodopsin-Kinase (GRK1), GRK4, GRK5 und GRK6. geeignete MAP-Kinasen sind, aber nicht ausschließlich, MAPK, MAPKK und MAPKKK. Ebenfalls mit umfasst werden die Isoformen der Proteinkinase C, in welchen, aber nicht ausschließlich, die als α,β_I/H, γ, δ, ε. η_(L), ξ, ι und λ bezeichneten Isoformen enthalten sind.
3 zeigt die Sequenzen der HJ-Loops der folgenden STKs: RAF, cyclische AMP-abhängige Kinase, Proteinkinase C, die G-Protein-gebundenen Rezeptorkinasen βARK 1 und 2 und GRK1, GRK4, GRK5 und GRK6, die Calmodulin-abhängige Kinase, Polo, Akt/PKB und GSK3.
3 zeigt auch das Schema der Nummerierung für die Aminosäuresequenz in einem Loop. Die Aminosäure am N-Terminus des HJ-Loops ist an Position 1 und kann als "[AA]₁" bezeichnet werden. Die nächste Aminosäure in der Sequenz, mit [AA]₂ bezeichnet, ist an Position 2 und wird gefolgt von den Aminosäuren [AA]₃ bis [AA]₂₀, die sich an den Positionen 3–20 befinden. Somit umfasst ein 20-mer Peptid mit einer Aminosäuresequenz [AA]₁ bis [AA]₂₀ die zwanzig Aminosäuren im HJ-Loop. Ein Peptidderivat des HJ-Loops mit einer Aminosäuresequenz [AA]₃ bis [AA]₁₀ umfasst, wie im vorstehenden Absatz angegeben, die dritte Aminosäure bis zur zehnten Aminosäure in diesem Loop.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Peptide mit Aminosäuresquenzen, die einer modifizierten Sequenz oder Nebensequenz des HJ-Loops der STKs entsprechen und welche die die Aktivität von STKs einschließlich RAF, CAMP-abhängige Kinase, Proteinkinase C, Die G-Protein-gebundenen βARK1, βARK2, GRK1 und GRKs4-6, Calmodulin-abhängige Kinase und Polo modulieren. In einem Aspekt werden eine, zwei oder mehr der Aminosäuren in der Sequenz oder Nebensequenz durch konservative Substitutionen modifiziert; die Substitutionen können an Konsensus-Positionen, Nicht-Konsensus-Positionen oder beidem stattfinden. In einem anderen Aspekt werden eine, zwei oder mehr der Aminosäuren in der Sequenz oder Nebensequenz mit harten Substitutionen modifiziert; die Substitutionen finden bevorzugt an Nicht-Konsensus-Positionen statt. Ebenfalls umfasst ist die Substitution von konservativen Glycinresten (z.B. Position 6 in 1 oder die Positionen 6 und 12 in 2) mit D-Aminosäureresten oder Analogen derselben. 3 zeigt auch Beispiele von konservativen Aminosäuresubstitutionen für den HJ-Loop von RSF, CAMP-abhängige Kinase, Proteinkinase C, den G-Protein-gebundenen Rezeptorkinasen βARKI, βARK2, GRK1 und GRKs4-6, Calmodulin-abhängige Kinase, Polo, Akt/PKB und GSK3.
Spezielle Beispiele für Peptidderivate der vorliegenden Erfindung sind die Peptide HJ-38 (SEQ ID NO.: 13), J-41 (SEQ ID NO.: 14), J-42 (SEQ ID NO.: 15), J-43 (SEQ ID NO.: 16), J-43.1 (SEQ ID NO.: 17), J-45 (SEQ ID NO.: 18), J-46 (SEQ ID NO.: 19), J-47 (SEQ ID NO.: 20), J-48 (SEQ ID NO.: 21) und J-29 (SEQ ID NO.: 22), von denen die Sequenzen in 4 gezeigt werden. Der N-Terminus und/oder der C-Terminus dieser Peptide kann, wie oben beschrieben, modifiziert werden. Wie in 4 gezeigt, wird der N-Terminus dieser Peptide acetyliert und der C-Terminus amidiert. Es können, wie oben beschrieben, andere Schutzgruppen für die Amide und Carbonsäuren verwendet werden. Wahlweise können auch eine oder beide Schutzgruppen weggelassen werden. Die Peptide können linear oder cyclisch sein.
Ebenso umfasst sind Peptide mit der Sequenz HJ-38 (SEQ ID NO.: 13), J-41 (SEQ ID NO.: 14), J-42 (SEQ ID NO.: 15), J-43 (SEQ ID NO.: 16), J-43.1 (SEQ ID NO.: 17), J-45 (SEQ ID NO.: 18), J-46 (SEQ ID NO.: 19), J-47 (SEQ ID NO.: 20), J-48 (SEQ ID NO.: 21) und J-29 (SEQ ID NO.: 22), unter der Voraussetzung, dass jeder der Aminosäurereste im Peptid variieren kann und jede natürlich vorkommende Aminosäure oder ein Analoges derselben sein kann. Die vorliegende Erfindung umfasst auch Peptide mit den oben angeführten Sequenzen unter der Voraussetzung, dass jeder zweite der Aminosäurereste im Peptid variieren kann und jede natürlich vorkommende Aminosäure oder ein Analoges derselben sein kann.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch cyclische Peptide mit Aminosäuresequenzen, die einer modifizierten Sequenz oder Nebensequenz des HJ-Loops der STKs entsprechen und welche die Aktivität der STKs modulieren.
Ein "cyclisches Peptid" nimmt z.B. auf ein Peptid oder Peptidderivat Bezug, in welchen über eine Peptidbindung zwischen dem N-Atom am N-Terminus und dem Carbonyl-Kohlenstoff am C-Terminus ein Ring gebildet wird.
"Cyclisiert" betrifft auch die Bildung eines Rings über eine kovalente Bindung zwischen dem Stickstoff am N.Terminus der Verbindung und der Seitenkette einer geeigneten Aminosäure im Peptid, vorzugsweise der C-terminalen Aminosäure. Ein Amid kann z.B. zwischen dem N-Atom am N-Terminus und dem Carbonyl-Kohlenstoff in der Seitenkette von Asparagin- oder Glutaminsäure gebildet werden. Alternativ kann das Peptid oder Peptidderivat cyclisiert werden, indem eine kovalente Bindung zwischen dem Carbonyl am C-Terminus der Verbindung und der Seitenkette einer geeigneten Aminosäure im Peptid, vorzugsweise der N-terminalen Aminosäure, ausgebildet wird. Ein Amid kann z.B. zwischen dem Carbonyl-Kohlenstoff am C-Terminus und dem Amino-Stickstoffatom in der Seitenkette von Lysin oder Ornithin gebildet werden; ein Ester kann zwischen dem C-Terminus und dem Hydroxyl-Sauerstoffatom in der Seitenkette von Serin oder Threonin gebildet werden.
"Cyclisiert" bezieht sich auch auf die Ausbildung eines Rings über eine kovalente Bindung zwischen den Seitenketten von zwei geeigneten Aminosäuren im Peptid, vorzugsweise den terminalen Aminosäuren. Ein Disulfid kann sich z.B. zwischen den Schwefelatomen in den Seitenketten von zwei Cysteinen ausbilden. Alternativ kann dem Carbonyl-Kohlenstoff in der Seitenkette von z.B. Glutamin- oder Asparaginsäure und dem Sauerstoffatom in der Seitenkette von z.B. Serin oder Threonin ein Ester gebildet werden. Ein Amid kann zwischen dem Carbonyl-Kohlenstoff in der Seitenkette von z.B. Glutamin- oder Asparaginsäure und dem Amino-Stickstoff in der Seitenkette von z.B. Lysin oder Ornithin gebildet werden.
Zusätzlich kann ein Peptid oder Peptidderivat mit einer Verbindungsgruppe zwischen den beiden Enden, zwischen einem Terminus und der Seitenkette einer Aminosäure im Peptid oder Peptidderivat oder zwischen der Seitenkette von zwei Aminosäuren im Peptid oder Peptidderivat cyclisiert werden. Geeignete Verbindungsgruppen werden in Lobl et al., WO 92/15958 beschrieben.
Geeignete Substitutionen in den ursprünglichen Aminosäuresequenz oder Nebensequenz sind solche, welche zu einem wie oben definierten Peptidderivat führen, das die Aktivität einer STK moduliert. Die Aktivität einer STK ist "moduliert", wenn die Aktivität der STK erhöht oder erniedrigt ist. Eine Anhebung oder Senkung in der Aktivität einer STK lässt sich nachweisen, indem das Ausmaß der Phosphorylierung eines Proteinsubstrats der zu untersuchenden STK in vitro ermittelt wird oder über eine entsprechende Modulation, eine Anhebung oder Senkung, in einer zellulären Aktivität oder Funktion, die unter der Kontrolle der STK steht. Beispiele für diese Zellfunktionen sind die Zellproliferation, Die Zelldifferenzierung, die Zellmorphologie das Überleben der Zelle oder Apoptose, die Reaktion der Zelle auf externe Reize, die Genexpression, der Lipidstoffwechsel, der Glykogenstoffwechsel und die Mitose.
Es lässt sich leicht ermitteln, ob eine Peptid oder Peptidderivat die Aktivität einer STK moduliert, indem für Zellen gesorgt wird, welche eine oder mehrere Zellaktivitäten unter der Kontrolle einer STK haben. Die Zellen werden mit dem Peptid oder Peptidderivat inkubiert, um eine Testmischung unter Bedingungen zu erzeugen, die für die Bestimmung der Aktivität der STK geeignet sind. Die Aktivität der STK wird bestimmt und mit einer geeigneten Kontrolle verglichen, z.B. der Aktivität der gleichen Zellen, die unter den gleichen Bedingungen in Abwesenheit des Peptids oder Peptidderivats inkubiert wurden. Eine größere oder kleinere Aktivität der STK in der Testmischung im Vergleich mit der Kontrolle zeigt an, dass das Testpeptid oder Peptidderivat die Aktivität dieser STK moduliert.
Geeignete Zellen für den Assay umfassen normale Zellen, welche eine membrangebundene oder intrazelluläre STK exprimieren, Zellen, welche gentechnisch manipuliert worden sind, um eine STK zu exprimieren, maligne Zellen, die eine STK exprimieren oder unsterblich gemachte Zellen, welche eine STK exprimieren.
Zur Bestimmung der STK-Aktivität geeignete Bedingungen umfassen Bedingungen, die zur Bestimmung der Aktivität einer Zellaktivität oder -funktion unter Kontrolle der STK geeignet sind. Im Allgemeinen lässt sich eine Zellaktivität oder -funktion bestimmen, wenn die Zellen Bedingungen ausgesetzt werden, die für das Zellwachstum geeignet sind, einschließlich einer geeigneten Temperatur (z.B. zwischen ca. 30°C bis ca. 42°C) und der Gegenwart geeigneter Konzentrationen an Nährstoffen im Medium (z.B. Aminosäuren, Vitamine, Wachstumsfaktoren).
In einem anderen Aspekt kann die Aktivität bestimmter STKs (z.B. Atk/PKB, Dudek et al., Science 275: 661 (1997)) bestimmt werden, indem Zellen unter den Bedingungen eines Serumentzugs gezüchtet werden. Typischerweise werden Zellen in Kultur in Gegenwart eines Serums wie Rinderserum, Pferdeserum oder fötalem Kalbsserum gezüchtet. Viele Zellen, z.B. Nervenzellen wie die P-12 Zellen überleben im Allgemeinen bei ungenügender Serumgabe nicht. Die Verwendung von ungenügendem Serum bei Zellkulturen wird als "Serummangelbedingungen" bezeichnet und umfasst z.B. ca 0% bis ca. 4% Serum. Die STK-Aktivität wird über das Ausmaß bestimmt, bis zu welchem ein Peptid oder Peptidderivat Zellen wie z.B. Nervenzellen vor den Folgen eines Serummangels schützen kann. Spezielle Bedingungen werden in Dudek et al. und in Beispiel 4 der mit anhängigen und gleichzeitig eingereichten Anmeldung WO 98/53051 mit dem Titel "KURZE PEPTIDE, WELCHE EINE INTRAZELLULÄRE SIGNALÜBERTRAGUNG SELEKTIV MODULIEREN" (eingereicht am 21. Mai, 1997, Aktenzeichen CMCC-547)) angegeben.
Im Allgemeinen wird die Aktivität der STK in der Testmischung ermittelt, indem die Zellaktivität, welche die STK kontrolliert, gemessen wird. Die Zellaktivität kann z.B. die Zellproliferation sein. Beispiele für Zellen, in denen die Proliferation von einer STK kontrolliert wird, sind Endothelzellen wie die Aortazellen des Rindes, MSI-Zellen oder SVR-Zellen der Maus/siehe Arbiser et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 861 (1997)), glatte Gefäßmuskelzellen und maligne Zellen verschiedener Gewebe (wie bei Brustkrebs, Lungenkrebs, Dickdarmkrebs, Prostatakrebs, Melanomen). Die STK-Aktivität wird durch Messung der Zellproliferation ermittelt, indem z.B. die Anzahl der nach einem vorgegebenen Zeitraum vorliegenden Zellen mit der ursprünglich vorhandenen Zahl der Zellen verglichen wird. STKs, die bei der Zellproliferation eine Rolle spielen, sind Vertreter der Polo-Familie, TAf oder Atk/PKB. Falls Zellen eingesetzt werden, in denen die STK die Zelldifferenzierung kontrolliert (z.B. Präadipocyten wie 3T3-L1 exprimierende STKs Akt/PKB, GSK3 und die Proteinkinase A – siehe Kohn et al., J. Biol. Chem. 271: 31372 (1996), wird die Aktivität durch Messen des Differenzierungsgrads ermittelt. Die Aktivität kann über die Veränderungen in der Stoffwechselaktivität von Zellen wie z.B. primären Adipocyten, Hepatocyten und Fibroblasten durch Messung der Veränderung bei der Glucose-Aufnahme, der Lipogenese oder dem Glykogenstoffwechsel (siehe z.B. Weiss et al., J.Biol. Chem. 270: 3442 (1995)) ermittelt werden. Die Aktivität kann auch über das Ausmaß ermittelt werden, bis zu welchem sich die Genexpression, die Zellmorphologie oder der Phänotyp der Zelle ändern (z.B. Grad, bis zu welchem sich die Zellform ändert oder der Grad, bis zu welchem die Zellen eine spindelähnliche Struktur annehmen. Ein Beispiel für eine Änderung in der Zellmorphologie wird in der mit anhängigen WO 98/53051 mit dem Titel "KURZE PEPTIDE, WELCHE EINE INTRAZELLULÄRE SIGNALÜBERTRAGUNG SELEKTIV MODULIEREN" (eingereicht am 21. Mai, 1997, Aktenzeichen CMCC-547)) angegeben, wo beschrieben wird, dass bestimmte Peptidderivate des HJ-Loops der Protein-Tyrosinkinasen glatte Gefäßmuskelzellen dazu bringen, länglich zu werden und eine spindelähnliche Form anzunehmen.
Spezifische Beispiel für Bedingungen, die für die Bestimmung der Aktivität von STKs durch Ermitteln der Zellproliferation geeignet sind, werden in Beispiel 2 angegeben.
Selbstverständlich kann der hier beschriebene Assay zur Bestimmung, ob ein Peptid oder Peptidderivat eine Zellaktivität oder -funktion unter Kontrolle einer STK moduliert auch mit anderen Zellen als die hier speziell beschriebenen durchgeführt werden. Noch nicht entdeckte STKs oder STKs, deren Funktion noch nicht bekannt ist, können in diesem Assay ebenfalls eingesetzt werden, wenn erst einmal ermittelt ist, welche Zellfunktionen oder -aktivitäten sie kontrollieren. Diese STKs liegen ebenfalls im Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung von Peptiden in einem Verfahren zur Modulation der Aktivität einer Serin/Threinin-Kinase für die Therapie. Ein "Subjekt" ist vorzugsweise ein Mensch, kann aber ebenso ein Tier sein, das eine Behandlung benötigt, z.B. Haustiere (z.B. Hunde, Katzen und dergl.), Farmtiere (z.B. Kühe, Schweine, Pferde und dergl.) und Labortiere (z.B. Ratten, Mäuse, Meerschweinchen und dergl.).
Die Aktivität einer STK in einem Subjekt kann zur Behandlung von Krankheiten moduliert werden, die von einer Überaktivität oder Unteraktivität der STKs verursacht sind. Die MAP-Kinasen (Seger und Krebs, FASEB J. 9: 726 (1995)) und die Cyclin-abhängigen Proteinkinasen ("Molecular Biology of the Cell", Alberts, Bray, Lewis, Raff, Roberts und Watson. Hrg. Kapitel 5, (Garland Publishing, Inc.), (1994)) sind z.B. zentrale Bestandteile des Kontrollsystems für den Zellteilungs-Zyklus in eukaryotischen Zellen. Andere STKs wie z.B. die Proteinkinase C, die Raf-Kinasen (Nishizuka, The FASEB Journal 9: 484 (1995), Locric, et al., Oncogene 12: 1109 (1996) und Laird et al., J. Biol. Chem. 270: 26, 742 (1995)) und die G-Proteingebundenen Rezeptoren (Lange-Carter, et al., Science 260: 315 (1993) spielen dann wieder bei der Kontrolle der MAP-Kinasen eine Rolle oder werden während der Mitose aktiviert. Die G-Protein-gebundenen Rezeptorkinasen (GRKs) desensibilisieren anderseits die Rezeptoren und spielen dadurch bei der Regulation von verschiedenen hormonellen Reaktionen eine Rolle (Freedman and Lefkowitz, Recent Prog. Hormon. Res. 51: 319 (1996). Die Aktivierung von Akt/PKB ist in die Hemmung der Apoptose, d.h. den vorgrammierten Zelltod, verwickelt (Frank et al., Cell 88: 435 (1997) und Hemmings Science 275: 628 (1997)). Die Peptide und Peptidderivate der vorliegenden Erfindung, welche die Aktivität dieser Enzyme modulieren, lassen sich zur Behandlung von Krebs in einem Subjekt einsetzen, wenn sie dem Subjekt in einer therapeutisch wirksamen Menge verabreicht werden.
Die cAMP-abhängige Kinase, GSK3 und Akt/PKB spielen bei der Kontrolle des Glykogenstoffwechsels eine Rolle. Die Peptide und Peptidderivate der vorliegenden Erfindung, welche die Aktivität der cAMP-abhängige Kinase modulieren, lassen sich zur Behandlung von Typ II Diabetes und hämorrhagischem Schock in einem Subjekt einsetzen, wenn sie dem Subjekt in einer therapeutisch wirksamen Menge verabreicht werden. Von den cAMP-Derivaten wurde auch berichtet, dass sie das Wachstum von menschlichen Krebszelle hemmen (Katsros et al., FEBS Lett. 223: 97 (1987)), was darauf hinweist, dass Inhibitoren der cAMP-abhängigen Kinasen bei der Behandlung von Krebs ebenfalls von Nutzen sein können.
Die Raf-Kinasen spielen bei der Kontrolle des Lipidstoffwechsels eine Rolle. Die Peptide und Peptidderivate der vorliegenden Erfindung, welche die Aktivität der Raf-Kinasen modulieren, lassen sich zur Behandlung von Fettsucht in einem Subjekt einsetzen, wenn sie dem Subjekt in einer therapeutisch wirksamen Menge verabreicht werden.
Mittel, welche die Aktivität der Proteinkinase C modulieren, lassen sich zur Behandlung eines breiten Spektrums von Krankheiten einsetzen, einschließlich Herzgefäßerkrankungen (z.B. Thrombose, Atherosklerose, Arteriosklerose, Herzhypertrophie, Ischämie, Reperfusionsschäden und Überdruck), immunsuppressive und Entzündungskrankheiten (z.B. Asthma, Schuppenflechte, systemischer Lupus erythematosus, Diabetes mellitus, Unterdrückung einer Organtransplantat-Abstoßung, multiple Sklerose, entzündliche Darmerkrankung und AIDS), Krankheiten des zentralen Nervensystems (z.B. Alzheimer Krankheit, Herzschlag und Trauma), ein auf der Aktivierung einer Proteinkinase C beruhender septischer Schock und eine durch Nierenversagen ausgelöste Ischämie (Nambi, WO 93/16703, Bradshaw, et al., Agents Action 38: 135 (1993) und Birchall et al., The J. Pharm. and Exper. Therapeut. 2: 922 (1994)). Die Peptide und Peptidderivate der vorliegenden Erfindung, welche die Aktivität der Proteinkinase C modulieren, lassen sich zur Behandlung dieser Krankheiten in einem Subjekt einsetzen, wenn sie dem Subjekt in einer therapeutisch wirksamen Menge verabreicht werden.
Es ist bekannt (Freedman and Lefkowitz, Recent Prog. Hormon. Res. 51: 319 (1996), dass eine Phosphorylierung durch G-Protein-Rezeptorkinasen zu einer Desensibilisierung des Rezeptors führt, wodurch die Dauer von hormonellen Wirkungen von z.B. Adrenalin verlängert wird. Somit verfügen Mittel, welche die Aktivität der G-Protein-Rezeptorkinasen modulieren über ein Potential bei der Behandlung von Krankheiten, die von einer geringen Bioverfügbarkeit des entsprechenden Liganden wie z.B. Dopamin herrühren, Es wurde berichtet, dass Inhibitoren der Calmodulin-abhängenden Kinasen eine Freisetzung von Dopamin hemmen (Nagatsu et al., Biochem. Biophys. Research Commun. 132: 1045 (1987)). Somit sind Mittel, welche die Aktivität von G-Protein-Rezeptorkinasen modulieren, bei der Behandlung von Krankheiten, bei denen wie z.B. bei der Parkinson-Krankheit eine Fehlfunktion der Dopamin-Signalübertragung eine Rolle spielt, potentiell von Nutzen. Es wurde auch berichtet, dass Inhibitoren der Calmodulin-abhängenden Kinasen den Arterienmuskel entspannen (Saitoh et al., J. Biol. Chem. 262: 7796 (1987)) und daher über ein Potential bei der Behandlung von Bluthochdruck verfügen. Eine Hemmung von GSK3 könnte die intrazelluläre Aktivität des Insulinrezeptors steigern und dadurch die Glucoseaufnahme und andere verwandte Stoffwechselaktivitäten beschleunigen. Somit sind Mittel, welche die Aktivität von GSK3 modulieren, bei der Behandlung von Typ I und Typ II Diabetes potentiell von Nutzen.
Auf Grundlage der hier beschriebenen Verfahren können die Peptide und Peptidderivate so konzipiert werden, dass sie die Aktivität der STKs, deren HJ-Loop sequenziert worden war und deren Zellfunktion bekannt ist, modulieren. In Folge davon können die Peptide und Peptidderivate so konzipiert werden, dass sie solche Zellfunktionen beeinflussen (verstärken oder abschwächen). Es ist möglich, dass die künftige Forschung herausbekommt, dass bestimmte Krankheiten, deren zu Grunde liegende Ursachen derzeit nicht bekannt sind, von einer Überaktivität oder Unteraktivität von Zellfunktionen ausgelöst werden, die von STKs kontrolliert werden. Diese Krankheiten lassen sich durch Verabreichung von Peptiden behandeln, welche Peptidderivate des HJ-Loops der überaktiven oder unteraktiven STK sind. Mit den hier beschriebenen Verfahren lassen sich geeignete Peptide und Peptidderivate identifizieren. Diese Behandlungsverfahren, Peptide und Peptidderivate werden vom Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung mit umfasst.
Eine "therapeutisch wirksame Menge" ist die Menge einer Verbindung, welche als Ergebnis der Behandlung im Vergleich mit einem typischen klinischen Befund ohne die Behandlung zu einem besseren Befund führt. Ein "besserer klinischer Befund" umfasst eine längere Lebenserwartung von Individuen mit der Krankheit als Ergebnis der Behandlung. Ein "besserer klinischer Befund" kann bei dem Individuum mit der Krankheit auch von dem Auftreten von weniger Symptomen oder Komplikationen der Krankheit als Ergebnis der Behandlung herrühren. In Bezug auf Krebs ist ein "besserer klinischer Befund" eine längere Lebenserwartung. Er kann auch eine Verlangsamung oder ein Anhalten der Wachstumsgeschwindigkeit eines Tumors sein, was ein Schrumpfen der Timorgröße, eine geringere Metastasenrate und/oder eine Verbesserung in der Lebensqualität (z.B. eine Abnahme physischer Beschwerden oder eine zunehmende Mobilität) zur Folge hat.
In Bezug auf Diabetes bezieht sich ein besserer klinischer Befund auf eine längere Lebenserwartung, ein Rückgang bei den Komplikationen der Krankheit (z.B. eine Neuropathie, eine Retinopathie, eine Nephropatie und eine Degenerierung der Blutgefäße) und eine, wie oben beschrieben, bessere Lebensqualität.
Was Fettleibigkeit anbelangt bezieht sich ein besserer klinischer Befund auf eine zunehmende Gewichtsreduktion pro eingenommener Kalorien. Er bezieht sich auch auf eine Abnahme der Komplikationen, die auf Fettleibigkeit zurückzuführen sind, z.B. eine Herzkrankheit wie Arteriosklerose und Bluthochdruck.
Die dem Individuum verabreichte Menge an Peptid oder Peptidderivat hängt von der Art und der Schwere der Krankheit und den Eigenschaften des Individuums ab, wie z.B. dem allgemeinen Gesundheitszustand, dem Alter, dem Geschlecht, dem Körpergewicht und der Arzneimittelverträglichkeit. Der Fachmann ist in der Lage, je nach diesen und anderen Faktoren passende Dosierungen zu bestimmen. Typischerweise kann eine therapeutisch wirksame Menge des Peptids oder Peptidderivats für einen Erwachsenen im Bereich von ca. 1 mg Pro Tag bis ca. 1000 mg pro Tag liegen. Bevorzugt sind Dosierungen von ca. 1 mg pro Tag bis ca. 100 mg pro Tag.
Die Peptide und Peptidderivate der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise parenteral verabreicht. Eine parenterale Verabreichung kann z.B. eine systemische Verabreichung wie eine intramuskuläre, intravenöse, subkutane oder intraperitoneale Injektion umfassen. Peptide oder Peptidderivate, die einer Proteolyse widerstehen, können oral z.B. in Kapseln, Suspensionen oder Tabletten verabreicht werden.
Die Peptide oder Peptidderivate können dem Individuum zusammen mit einem verträglichen pharmazeutischen Träger als Teil einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung der oben besprochenen Krankheiten verabreicht werden. Geeignete pharmazeutische Träger können inerte Inhaltsstoffe enthalten, welche mit dem Peptid oder Peptidderivat nicht in Wechselwirkung treten. Es können standardisierte pharmazeutische Formulierungstechniken eingesetzt werden wie die in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA beschriebenen. Geeignete pharmazeutische Träger für eine parenterale Verabreichung sind z.B. steriles Wasser, physiologische Kochsalzlösung, bakteriostatische Kochsalzlösung (Saline mit ca. 0,9% mg/ml Benzylalkohol), phosphatgepufferte Saline, Hanks-Lösung, Ringer Lactat und dergl. Verfahren zur Verkapselung von Zusammensetzungen (wie beim Beschichten von Hartgelatine oder Cyclodextran) sind im Stand der Technik bekannt (Baker, et al., Controlled Release of Biological Aktive Agents, John Wiley and Sons, 1986).
Die peptide und Peptidderivate der vorliegenden Erfindung haben viele andere Anwendungsbereiche als in der Therapie. Einige dieser Anwendungen werden in den folgenden Absätzen beschrieben.
Die HJ-Loop-Peptide der vorliegenden Erfindung stammen aus einem Abschnitt, der im nativen Protein linear ist. Daher können sie bei der Herstellung von spezifischen Antikörpern gegen STKs von Nutzen sein.
Da die HJ-Loop-Sequenz einzigartig für jede Unterfamilie der STK ist, können darüber hinaus Anti-HJ-Loop-Antikörper spezifisch zur Isolierung bestimmter Unterfamilien der STK eingesetzt werden.
Durch Konjugation an einen geeigneten Träger wie z.B. das das Hämocyanin oder Serumalbumin der Napfschnecke lassen sich geeignete Antikörper gegen ein HJ-Loop-Peptid erzeugen; die Produktion von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern kann mit jeder geeignete Technik erfolgen. Es wurden verschieden Verfahren beschrieben (siehe Köhler et al., Nature, 256: 495–497 (1975) und Eur. J. Immunol. 6: 511–519 (1976); Milstein et al., Nature 266: 550–552 (1977); Koprowski et al., US-Patent 4,172,124; Harlow, E. und D. Lane, 1988, Antibodies; A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY); Current Protocols In Molecular Biology, Band 2 (Supplement 27, Sommer 1994), Ausubel, P.M. et al., Hrg., (John Wiley & Sons.: New York, NY), Kapitel 11, (1991)). Im Allgemeinen lässt sich ein Hybridom durch Fusion einer geeigneten unsterblichen Zelle (z.B. eine Myeloma-Zelllinie wie SP2/0) mit Antikörper produzierenden Zellen gewinnen. Die Antikörper produzierenden Zellen, vorzugsweise solche der Milz oder Lymphknoten, können aus mit dem in Frage stehenden Antigen immunisierten Tieren gewonnen werden. Die fusionierten Zellen (Hybridoma) können unter Einsatz von selektiven Kulturbedingungen isoliert und durch eingeschränkte Verdünnung kloniert werden. Zellen, welche Antikörper mit der gewünschten Spezifität produzieren, lassen sich mit einem geeigneten Assay (z.B. ELISA) aussuchen.
Antikörper, einschließlich monoklonale Antikörper, finden viele Verwendungen gegen HJ-Loop-Peptide. Beispielsweise können solche, die gegen das Protein, aus welchem die HJ-Peptide stammen, gerichtet sind oder mit ihnen reagieren und vorzugsweise spezifisch an dieses Protein binden, verwendet werden, um Zellen zu identifizieren und/oder auszusortieren, welche diese Protein an der Zelloberfläche anbieten (z.B. mit Hilfe von fluoreszenzaktiviertem Aussortieren der Zellen oder einer histologischen Analyse). Spezifisch auf das Protein reagierende monoklonale Antikörper können dazu verwendet werden, um das auf der Oberfläche einer Zelle exprimierte oder in einer Probe vorkommende Protein (z.B. in einem ELISA) nachzuweisen und/oder quantitativ zu bestimmen. Alternativ können die Antikörper dzu benutzt werden, um zu bestimmen, ob eine intrazelluläre STK im Cytoplasma der Zelle vorkommt. Es wird ein klares Lysat der Zelle erzeugt (z.B. durch Behandlung der Zellen mit Natriumhydroxid (0,2 N) und Natriumdodecylsulfat (1%), Zentrifugation und Abtrennung des Überstands von dem Pellet) und mit einem spezifisch auf die STK reagierenden Anti-HJ-Loop-Antikörper behandelt. Das klare Lysat wird sodann auf Komplexe zwischen der STK und dem Antikörper hin untersucht, z.B. mittels Western-Blotting oder einer Immunfällung. Einige STKs waren nach einer Stimulierung membrangebunden oder mit dem Cytoskelett assoziiert. Die Anti-HJ-Loop-Antikörper können verwendet werden, um die intrazelluläre Verteilung (Kompartimentierung) verschiedener Unterfamilien der STKs unter verschiedenen physiologischen Bedingungen mittels Anwendung von herkömmlichen Immuncytochemie-Verfahren wie der Immunofluoreszenz, der Immunoperoxidase-Technik und der Immunoelektronenmikroskopie zusammen mit dem spezifischen Anti-HJ-Loop-Antikörper zu untersuchen.
Mit dem Immunogen reaktive Antikörper sind ebenfalls von Nutzen. Sie können z.B. verwendet werden, das Immunogen in einer Probe nachzuweisen und/oder quantitativ zu bestimmen oder um das Immunogen zu reinigen (z.B. mit einer Immunoaffinitäts-Reinigung).
Der HJ-Loop innerhalb der STKs spielt eine Schlüsselrolle bei der Regulation der Aktivität der STKs, wie dies durch die Tatsache zum Ausdruck kommt, dass die Peptide und Peptidderivate der vorliegenden Erfindung eine derartig dramatische Wirkung auf die Aktivität der STKs hat. Die HJ-Loop-Peptide der vorliegenden Erfindung können auch verwendet werden, um Liganden zu identifizieren, welche mit den HJ-Loops der spezifischen STKs in Wechselwirkung treten und welche die Aktivität der STKs modulieren. Beispielsweise kann eine Affinitätssäule präpariert werden, an welche ein spezifischer HJ-Loop kovalent direkt oder über einen Linker gebunden ist. Diese Säule kann dann wieder für die Isolierung und Identifizierung von spezifischen Liganden verwendet werden, welche das HJ-Loop-Peptid binden und welche ebenso die STK binden, von welcher das HJ-Loop-Peptid abstammte. Der Ligand kann dann aus der Säule eluiert, charakterisiert und auf seine Fähigkeit hin untersucht werden, die STK-Funktion zu modulieren.
Eine andere Klasse von Proteinkinasen stellen die Protein-Tyrosin-Kinasen dar. Diese Proteine treten als membrangebundene Rezeptoren auf, die an der Transmembran-Signalübertragung teilnehmen oder als intrazelluläre Proteine, die an der Signalübermittlung innerhalb der Zelle einschließlich der Signalübermittlung in den Kern beteiligt sind. Die Anbindung eines Liganden führt zu einer durch die Phosphorylierung der Tyrosinreste der intrazellulären Proteine von der Kinase eingeleitete Signalübermittlung. Wie bei den STKs kontrollieren die Tyrosinkinasen die Zellfunktionen mittels diese Phosphorylierungs-Mechanismus. Die Tyrosinkinasen weisen eine hohen Grad an Homologie mit den STKs auf, einschließlich einen HJ-Loop. Folglich lässt sich die Aktivität der Tyrosinkinasen sowie die Zellfunktionen, die sie kontrollieren, mit Peptiden modulieren, welche, wie oben für die STKs beschrieben, Peptidderivate ihrer HJ-Loops sind. Peptide und Peptidderivate des HJ-Loops der Protein-Tyrosinkinasen sowie Verfahren zu deren Verwendung werden in der mit anhängigen und gleichzeitig eingereichten Anmeldung mit dem Titel "KURZE PEPTIDE; WELCHE DIE INTRAZELLULÄRE SIGNAL-ÜBERTRAGUNG SELEKTIV MODULIEREN" (Aktenzeichen CMCC-547, eingereicht am 21. März 1997), deren Lehre hiermit in diese Anmeldung eingeführt wird.
Die Peptidsequenzen in der vorliegenden Erfindung lassen sich mit Hilfe des Verfahrens der Festphasen-Peptidsynthese (z.B. BOC oder FMOC), mittels Synthese in der Lösungsphase oder mit jeder anderen geeigneten Technik einschließlich der Kombinationen der vorstehenden Verfahren synthetisieren. Die BOC- und FMOC-Verfahren, die eingeführt sind und eine breite Verwendung gefunden haben, werden in Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 88: 2149 (1963); Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides, C.H. Li, Hrg., Academic Press, 1983, SS. 48–267 und Barany und Merrifield, in The Peptides, E. Gross und J. Meienhofer, Hrg. Acadenic Press, New York, 1980, SS. 3–285 beschrieben. Die Methoden der Festphasen-Peptidsynthese werden in Merrifield, R.B., Science, 232: 341 (1986); Carpino, L.A. und Han, G.Y., J. Org. Chem, 37: 3404 (1972) und Gauspohl, H. et al., Synthesis, 5: 315 (1992) beschrieben.
Verfahren zur Cyclisierung von Verbindungen mit Peptidsequenzen werden z.B. in Lobl et al., WO 92/00995 beschrieben, dessen Lehre hiermit als Referenz eingeführt wird. Cyclisierte Verbindungen lassen sich herstellen, indem die Seitenketten der beiden beidem Ringschluss zu verwendenden Aminosäuren mit Gruppen geschützt werden, welche sich selektiv entfernen lassen, während alle anderen die Seitenketten schützenden Gruppen intakt bleiben. Eine selektive Abspaltung von Gruppen wird am besten mit der Verwendung eines rechtwinkligen Seitenkettenschutzes erreicht, wie z.B. mit den Schutzgruppen Allyl (OAI) (z.B. für die Carboxylgruppe der Seitenkette von Glutamin- oder Aspsrsginsäure), mit Alloxycarbonyl (Aloc) (z.B. für den Aminostickstoff in der Seitenkette von Lysin oder Ornithin) oder mit Acetamidomethyl (Acm) (für die Sulhydrylgruppe des Cysteins). OAI und Aloc werden leicht mit Pd* entfernt und Acm wird leicht durch Behandlung mit Iod entfernt.
Die Erfindung wird in den folgenden beispielen veranschaulicht, welche die Erfindung keineswegs einschränken sollen.
Beispiel 1 – Herstellung von HJ-Peptiden
Die neuen Verbindungen dieser Erfindung können unter Einsatz eines 430A Peptidsynthesizers von Applied Biosystems unter Verwendung der F-Moc-Technologie nach der Vorschrift des Herstellers synthetisiert werden. Andere geeignete Verfahren zur Herstellung von Peptiden sind dem Fachmann bekannt. Siehe z.B. Merrifield, R.B., Science, 232: 341 (1986); Carpino, L.A., Han, G.Y., J. Org. Chem., 37: 3404 (1972); Gauspohl, H. et al., Synthesis, 5: 315 (1992), deren Lehren hiermit als Referenz eingeführt werden.
Für die Synthese von C-amidierten Peptiden wurde ein Rink-Amidharz [4(2',4'-Dimethoxyphenyl-FMOC-aminomethyl)phenoxyharz] verwendet. Die α-Aminogruppe der Aminosäure wurde mit einer FMOC-Gruppe geschützt, die am Anfang von jedem Zyklus von einer schwachen Base, 20% Piperidin in N-Methylpyrrolidon (NMP), entfernt wurde. Nach Entfernung der Schutzgruppe wurde das Harz mit NMP gewaschen, um das Piperidin zu entfernen. Die in situ-Aktivierung des Aminosäurederivats erfolgte mit dem FASTMOC-Cerfahren unter Verwendung von HBTU (2(1-Benzotriazolyl-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium) gelöst in HOBt (1-Hydroxybenzotriazol) und DMF (Dimethylformamid). Die Aminosäure wurde in dieser Lösung mit zusätzlichem NMP gelöst. Zur anfänglichen Aktivierung wurde DIEA (Diisopropylethylamin) zugegeben. Alternativ wurde die Aktivierungsmethode von DCC (Dicyclohexylcarbodiimid) und HOBt verwendet, um einen HOBt-aktiven Ester zu bilden. Die Kopplung erfolgte in NMP. Nach der Acetylierung des N-Terminus (optional) wurde das TFA (Trifluoressigsäure)-Verfahren zur Abspaltung des Peptids von dem Harz und den Seitenkettenschutzgruppen angewandt, indem 0,75 g kristallines Phenol, 0,25 ml EDT (1,2-Ethandiol), 0,5 ml Thioanisol, 0,5 ml destilliertes und ionisiertes H₂O und 10 ml TFA eingesetzt wurden.
Beispiel 2 – Die HJ-Peptidderivate von Raf und Polo modulieren die Proliferation von Endothelzellen in vitro.
Aortazellen des Rindes (hier als "A19-Zellen" bezeichnet) wurden nach dem in Gospodorowicz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 73: 4120 (12976) beschriebenen Verfahren erhalten. Die MS1- und SVR-Zellen der Maus wurden nach dem in Arbiser et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 861 (1997) beschriebenen verfahren erhalten.
Gewebskultur-Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen und flachem Boden wurden unmittelbar vor dem Plattieren der Zellen mit Gelatine (Difco) vorbeschichtet, indem 0,100 ml/Vertiefung frisch gefilterte 1% Gelatine in zweifachdestilliertem Wasser (DDW) zugegeben wurden. Die Vertiefungen wurden etwa 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert und dann die Überschüssige Lösung durch Absaugen entfernt.
Aus DMEM, Penicillin/Streptomycin/Glutamin (Penicillin – 100 E/ml; Streptomycin – 100 μg/ml; und Glutamin – 2 mM) und 10% endotoxinfreiem Rinderkalbsserum (Hyclone) wurde ein Kulturmedium hergestellt. Eine Suspension des zu untersuchenden Zelltyps wurde mit 25 × 10³ Zellen/ml in dem oben beschriebenen Kulturmedium zubereitet und 0,160 ml/Vertiefung (ca. 4000 Endothelzellen pro Vertiefung) verteilt.
Es wurde eine Reihe von HJ-Peptid Vorratslösungen durch Verdünnen einer 10 mM Lösung von HJ-Peptid in 100% DMSO mit phosphatgepufferter 0,1% BSA enthaltender Saline (PBS) zubereitet. Die Konzentration des HJ-Peptids in jeder Vorratslösung wurde auf den 9-fachen Wert der gewünschten Konzentration für das HJ-Peptid in der Assay-Mischung eingestellt.
Etwa 2 Stunden nach dem Plattieren der Zellen wurden 0,020 ml von jeder HJ-Peptid-Vorratslösung mit sechs Wiederholungen für jede Konzentration zu den entsprechenden Vertiefungen gegeben. Zusätzlich wurde eine BSA-Lösung ohne zugesetztes HJ-Peptid als Kontrolle verwendet. Die Vertiefungen wurden 72–80 Stunden lang bei 37°C in einer mit 10% CO₂ befeuchteten Inkubator inkubiert.
Die Platten wurden markiert und das Medium verworfen. Jede Platte wurde dann einmal mit PBS (0,200 ml/Vertiefung) gewaschen. Durch Waschen mit 100% Ethanol (0,200 ml/Vertiefung über 5 Minuten) wurden die Platten dann fixiert. Das Ethanol wurde entfernt und die Vertiefungen vollständig getrocknet. Alternativ wurden die Vertiefungen mit 4% Formaldehyd-PBS (PBS-gepuffertes 10% Formalin von Fisher Scientific; Katalog-Nr. HC200-1) (0,12 ml/Vertiefung) mindestens 30 Minuten lang fixiert. Das Fixieren mit Formaldehyd erhöht die optische Dichte im Vergleich mit Ethanol.
Die Vertiefungen wurden einmal mit Boratpuffer (0,1 M, pH 8,5) gewaschen. Sodann wurde eine frisch filtrierte 1% Methylenblau-Lösung (0,600 ml/Vertiefung) zu den Vertiefungen gegeben und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Vertiefungen wurden dann fünfmal mit Leitungswasser gewaschen, wonach die Vertiefungen vollständig getrocknet wurden. Um, die Farbe zu extrahieren wurden 0,200 ml/Vertiefung 0,1 N HCl zugegeben. Nach der Extraktion über Nacht wurde bei 630 nm die optische Dichte gemessen, um die Anzahl der Zellen pro Vertiefung zu bestimmen. Die Prozedur zum Zählen der Zellen wird genauer in Oliver et al., J. of Cell Sci., 92: 513 (1989) beschrieben, deren Lehre hiermit als Referenz eingeführt wird.
Die Ergebnisse für eine Anzahl von unterschiedlichen HJ-Peptiden werden in der Tabelle wiedergegeben.
Tabelle

*Konzentration, bei welcher eine deutliche Hemmung der Zellproliferation beobachtet wurde

Wie aus den Ergebnissen in der Tabelle ersichtlich hemmten die HJ-Peptidderivate von RAf und Polo die Proliferation der Aortazellen des Rindes und der transformierten Mauszelllinien MS1 und SVR.
Beispiel 3- Das NH-Peptidderivat von Activin/TGFbR Ko48H101 (SEQ ID NO.: 24) hemmt die Produktion von Kollagen durch fötale Lungenfibroblasten
Zellen
Fötale Lungenfibroblasten werden in 0,5% FCS enthaltendem DMEM-Medium suspendiert und in einer Gewebskulturplatte mit 96 Vertiefungen und flachem Boden mit einer Dichte von 50.000 Zellen pro Vertiefung (45 μl pro Vertiefung) ausgesät. Die Zellen werden 48 Stunden in Gegenwart von 45 μl eines hitzeaktivierten TGFβ enthaltenden Konditionsmediums (Aus MCF-7 Zellen erhalten) und in Abwesenheit oder Gegenwart zunehmender Konzentrationen des untersuchten Peptids (0–10 μM in 10 μl PBS + 0,1% BSA + 1% DMSP) inkubiert. Das Gesamtvolumen beträgt 100 μl pro Vertiefung.
Lösliches Kollagen
Am Ende der Inkubationszeit wurden die Überstände entfernt und in Aliquots von 50 μl pro Vertiefung auf eine neue Gewebskulturplatte plattiert. Die Platte wurde bei 37°C 24 Stunden lang unter feuchter Atmosphäre inkubiert, damit sich das Kollagen anheften kann und dann bei 37°C 24 Stunden lang getrocknet. Die trockene Platte wird dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen, 200 μl pro Vertiefung und 1 Minute pro Waschvorgang und mit 100 μl 0,1% Direktrot 80 in gesättigter Pikrinsäure (w/v) pro Vertiefung 1 Stund lang bei Raumtemperatur angefärbt. Der überschüssige Farbstoff wird durch fünfmaliges Waschen der Vertiefungen mit 10 mM HCl, 200 μl pro Vertiefung und 10 Sekunden pro Waschvorgang entfernt. Der an Kollagen gebundene Farbstoff wird mit 200μl 0,1 M NaOH pro Vertiefung eluiert und bei 540 nm gemessen.
Zellzählung
Nach Entfernung des Überstands werden die Zellen mit 200 μl gepuffertem Formalin pro Vertiefung 1 Stunde lang bei Raumtemperatur fixiert und dann mit 200 μl 0,1 M Boratpuffer pro Vertiefung gewaschen. Die fixierten Zellen werden mit 50 μl 1% Methylenblau pro Vertiefung 15 Minuten lang bei Raumtemperatur angefärbt. Der überschüssige Farbstoff wird mit Leitungswasser ausgewaschen. Der zellgebundene Farbstoff wird mit 200 μl 1 M HCl pro Vertiefung eluiert und bei 595 nm gemessen. Das Kollagen wird pro Zelle angegeben.
Die Ergebnisse für K048H101 (SEQ ID NO.: 24) werden in 5 gezeigt. Wie aus 5 ersichtlich, tritt bei niedrigen Konzentrationen von 1 μM K048H101 eine nahezu vollständige Hemmung auf. Eine etwa 80% Hemmung ist in Gegenwart von ca. 0,6 μM K048H101 zu beobachten.
Die Hemmung der Bildung von Kollagen könnte für die Hemmung der Narbenbildung von Nutzen sein, z.B. in der plastischen Chirurgie, und für die Hemmung der Adhäsionsbildung, einer Hauptkomplikation bei der Bauchchirurgie.
Beispiel 4 – Die HJ-Peptidderivate von Integrin-gebundener Kinase (ILK) K107H101 (SEQ ID NO.: 47) verursacht morphologische Veränderungen in B16-Melanomzellen
Eine Veränderung der Morphologie von B16-Melanomzellen wurde beobachtet, wenn sie in Gegenwart von K107H101, einem vom HJ-Loop der Serin/Threonin-Kinase stammenden Peptidderivat mit dem Namen Integrin-gebundene Kinase (ILK), inkubiert wurden. Wie in Wu C. et al., J. Biol. Chem. 273: 528–536 (1998) beschrieben, spielt ILK bei der Tumorbildung eine Rolle. Von ILK stammende Peptide könnten daher als Antikrebsmittel von Nutzen sein.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Ein zur Modulation der Aktivität einer Serin/Threonin-Kinase befähigtes Peptid mit einer Struktur, welche die zwölf Subdomänen und zwölf Alpha-Helices umfasst, die für die Serin/Threonin-Superfamilie charakteristisch sind, wobei das Peptid besteht aus (a) einer Nebensequenz eines HJ-Loop-Peptids, welche mindestens aus fünf benachbarten Aminosäuren eines HJ-Loop-Peptids mit der Konsensussequenz Y/F-L/M-L/M/A/I-X-G/A-X-hydrophob-P-F/Y besteht und welches Nebensequenzpeptid die Aktivität der Serin/Threonin-Kinase moduliert, von welcher das HJ-Loop-Peptid einen Teil darstellt, wobei das HJ-Loop-Peptid ein Peptid ist, das aus einer Sequenz von 20 Aminosäureresten der Serin/Threonin-Kinase zwischen der Mitte der Subdomöne IX und der Mitte der Subdomäne X besteht, fünf Reste vom N-terminalen Ende der F-Helix entfern beginnt und sich fünf Aminosäurereste in die G-Helix hinein erstreckt, welche Aminosäuren einer kontinuierlichen Strecke der prototypischen PKA-Cα in den Positionen 229 bis 248 der PKA-Cα entsprechen und welches HJ-Loop-Peptid die Aktivität der Serin/Threonin-Kinase moduliert, von welcher die Nebensequenz einen Teil darstellt; (b) einem modifizierten Sequenzpeptid mit einer modifizierten Sequenz von (a), in welcher jeweils bis zu zwei Reste durch einen anderen Aminosäurerest oder ein anderes Analoges eines Aminosäurerests substituiert sind, welches modifizierte Sequenzpeptid die Aktivität der Serin/Threonin-Kinase moduliert, von welcher die Nebensequenz (a) einen Teil darstellt und welches modifizierte Peptid ausgewählt ist aus der Gruppe Myristyl-G M M S G R L P-NH₂ (K014H101), Acetyl-M A A G Y P-NH₂ (K004H001), Acetyl-M A A G Y P P F F-NH₂ (K004H002), Acetyl-M L A G E* L P W D*-NH₂ (K088H001), Myristyt-G M L A G E L P-NH₂ (K088H101), Myristyl-G M L A G E L-NH₂ (K088H103), Myristyt-G M L A G E L P W D-NH₂ (K088H104), Acetyl I L L S G A S P F L G-NH₂ (K092H001), Myristyf-G L L L G Q P I-NH₂ (K018H101), Acetyt F L V G M P P F-NH₂ (K087H001), Myristyl-G F L V G M P P-NH₂ (K087H101), Myristyl-G F L V G M P-NH₂ (K087H102), Myristyl G F L V G M P P F E-NH₂ (K087H103), Myristyl-G I A G Y R P F L-NH₂ (K090H101), Acetyl-I T G F R P F L-NH₂ (K091H001), Myristyl-G I T G F R P F L-NH₂ (K091H101), Myristyt-G L V S G S L P-NH₂ (K045H102), Acetyl-M L A G Q A P F-NH₂ (K008H001), Myristyl-G M L A G Q A P-NH₂ (K008H101), Myristyl-G M L A G Q A-NH₂ (K008H102), Myristyt-G M L A G Q A P F E-NH₂ (K008H103), Acetyl-L L V G K P P F-NH₂ (K035H001), Myristyl-G L L V G K P P-NH₂-NH₂ (K035H101), Myristyl-G M L L G R P P F E*-NH₂ (K038H101) Myristyt-G M L L G R P P-NH₂ (K038H102), Myristyl-G L M T G Q L-NH₂ (K003H103), Myristyl-G L M T G Q L P Y S-NH₂ (K003H104), Myristyl-G L M T G E L-NH₂ (K001H102), oder Myristyl-G L M T G E L P Y S-NH₂ (K001H103), wobei die Reste mit * Benzylester sind; (c) einem geschützten Peptid (a) oder (b), in welchem das N-terminale Ende und/oder das C-terminale Ende mit einer Schutzgruppe geschützt sind, wobei das geschützte Peptid die Aktivität der Serin/Threonin-Kinase moduliert, von welcher die Nebensequenz (a) einen Teil darstellt; oder (d) einem cyclisierten Peptid von (a), (b) oder (c) welches cyclisiert worden ist, wobei das cyclisierte Peptid die Aktivität der Serin/Threonin-Kinase moduliert, von welcher die Nebensequenz (a) einen Teil darstellt.
Peptid nach Anspruch 1, welches aus der Nebensequenz von (a) besteht, die cyclisiert worden ist, wobei das cyclisierte Peptid die Aktivität der Serin/Threonin-Kinase moduliert, von welcher die Nebensequenz (a) einen Teil darstellt.
Peptid nach Anspruch 1, welches aus einem der modifizierten Sequenzpeptide von (b) besteht, welche cyclisiert worden sind, wobei ein cyclisiertes Peptid die Aktivität der Serin/Threonin-Kinase moduliert, von welcher die Nebensequenz (a) einen Teil darstellt.
Peptid nach Anspruch 1, wobei die Serin/Threonin-Kinase ein Vertreter einer Serin/Threonin-Kinase-Familie ist, welche ausgewählt ist aus der Gruppe von Familien, die aus Polo-Kinasen, Raf-Kinasen, Mitogen-aktivierten Proteinkinasen (MAP-Kinasen) und G-Protein gekoppelten Rezeptorkinasen besteht.
Peptid nach Anspruch 1, wobei die Serin/Threonin-Kinase ausgewählt ist aus der Gruppe Proteinkinase C, cyclische AMP-abhängige Kinase, Calmodulin-abhängige Kinase, cyclische GMP-abhängige Kinase, Akt/PKB und GSK3.
Peptid nach Anspruch 1, wobei das Peptid die Sequenz Acetyl-V M T G Q L P F-NH₂(HJ-38), Acetyl-V M T G E* L P F-NH₂ (J-41), Acetyl-M L LG R P P F E*-NH₂(J^I2), Acetyl-M L L G K P P F-NH₂ (J-43), Acetyl-M L L G K P P F E*-NH₂ (J-43.1), Acetyl-L G R P P F E* T S-NH2 (J-45), Acetyl-M L L G R P P F E* T S-NH2 (J-46), Acetyl-G R L P F F N-NH2 (J-47), Acetyl-E* M M S G R L P F F N-NH2 Acetyl-L L L G Q P I F P G-NH2 (J-29) aufweist, in welchen die Reste mit * Benzylester sind.
Peptide nach jedem der Ansprüche 1 bis 6 zur Verwendung in der Therapie.