DE69835167T2

DE69835167T2 - 1,2,4-benzotriazin-oxide enthaltende zubereitungen

Info

Publication number: DE69835167T2
Application number: DE69835167T
Authority: DE
Inventors: Stephen Brown; Edward Baker
Original assignee: Sanofi Synthelabo Inc
Current assignee: Sanofi Aventis US LLC
Priority date: 1997-04-21
Filing date: 1998-04-14
Publication date: 2007-06-06
Also published as: DE69835167T8; NO995109L; US6153610A; EP1044005B1; WO1998047512A1; EP1044005A1; AU6969098A; PT1044005E; DK1044005T3; US5827850A; BR9808958A; NO325275B1; CA2287257A1; ES2267183T3; ATE332139T1; DE69835167D1; NO995109D0; CA2287257C; JP2001523248A; EP1044005A4

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Behandlung von Krebstumoren. Spezieller bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Behandlung von Krebstumoren mit 1,2,4-Benzotriazinoxiden, die in einem wässerigen gepufferten Vehikel enthalten sind.
Berichtete Entwicklungen
1,2,4-Benzotriazinoxide sind bekannte Verbindungen. US-Patent Nr. 3,980,779 offenbart 3-Amino-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid-Zusammensetzungen mit der Formel
worin
einer von R und R¹ Wasserstoff, Halogen, Niederalkyl, Halogen(niederalkyl), Niederalkoxy, Carbamoyl, Sulfonamido, Carboxy oder Carbo(niederalkoxy) ist und der andere von R und R¹ Halogen, Niederalkyl, Halogen(niederalkyl), Niederalkoxy, Carbamoyl, Sulfonamido, Carboxy oder Carbo(niederalkoxy) ist, als antimikrobielle Zusammensetzung, die verwendet wird, um das Viehwachstum zu beschleunigen.
US-Patent 5,175,287, erteilt am 29. Dezember 1992, offenbart die Verwendung von 1,2,4-Benzotriazinoxiden in Kombination mit einer Bestrahlung zur Behandlung von Tumoren. Die 1,2,4-Benzotriazinoxide sensibilisieren die Tumorzellen für die Bestrahlung und machen sie für diese Behandlungsmethode zugänglicher.
Holden et al. (1992) „Enhancement of Alkylating Agent Activity by SR-4233 in the FSaIIC Murine Fibrosarkom" JNCI 84: 187-193 offenbaren die Verwendung von SR-4233, nämlich 3-Amino-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid, ebenso bekannt als Tirapazamin und hierin nachste hend manchmal so bezeichnet, in Kombination mit einem Antitumoralkylierungsmittel. Die vier Antitumoralkylierungsmittel, Cisplatin, Cyclophosphamid, Carmustin und Melphalan, wurden jeweils getestet, um die Fähigkeit von Tirapazamin zu untersuchen, die Resistenz von hypoxischen Tumorzellen gegen Antitumoralkylierungsmittel zu überwinden. Tirapazamin wurde allein und in Kombination mit variierenden Mengen von jedem der Antitumoralkylierungsmittel getestet. Wenn SR-4233 noch vor der Einzeldosisbehandlung mit Cyclophosphamid, Carmustin oder Melphalan verabreicht wurde, wurde eine deutliche Dosisverstärkung, die zu synergistischen zytotoxischen Wirkungen auf Tumorzellen führte, beobachtet.
Die internationale Anmeldung Nr. PCT/US89/01037 offenbart 1,2,4-Benzotriazinoxid als Radiosensibilisator und selektive zytotoxische Mittel. Andere verwandte Patente umfassen: US-Patente Nr. 3,868,372 und 4,001,410, die die Herstellung von 1,2,4-Benzotriazinoxiden offenbaren; und US-Patente Nr. 3,991,189 und 3,957,799, die Derivate von 1,2,4-Benzotriazinoxiden offenbaren.
Es ist festgestellt worden, daß Mitglieder von 1,2,4-Benzotriazinoxiden bei der Behandlung von Krebstumoren, wenn sie in Kombination mit einer Strahlentherapie und Chemotherapie verwendet werden, wirksam sind.
Strahlentherapie und Chemotherapie zusammen mit der Chirurgie bleiben die drei primären Methoden bei der Behandlung von Krebs. Die Strahlentherapie und Chemotherapie fungieren als Alternative zur Chirurgie bei der primären Kontrolle einer Vielzahl von Neoplasmen, wenn die Chirurgie aus anatomischen Gründen eingeschränkt ist. Derzeitiges Wissen zeigt, daß höhere Heilungsraten und bessere Lebensqualität für Krebspatienten erhalten werden könnten, wenn die Wirksamkeit der Strahlentherapie und Chemotherapie verbessert würden.
Ein Weg zur Verbesserung der Wirksamkeit der Strahlentherapie oder Chemotherapie besteht darin, sich die Hypoxie zu Nutze zu machen, die in Tumoren existiert – einer der wenigen nutzbaren Unterschiede zwischen normalem und Tumorgewebe. Die abnormale Entwicklung von Blutgefäßen ist für eine große Anzahl von festen Tumoren charakteristisch. Dieses abnormale Kapillarsystem führt oftmals zu Bereichen mit Hypoxie, vorübergehend oder dauerhaft. Im allgemeinen erhöht die Hypoxie die Beständigkeit einer Zelle, normal oder krebsar tig, gegen Therapie. Ein Verfahren, das den Tod von hypoxischen Tumorzellen verstärkt (oder den Strahlungsschaden für normale Gewebe einschränkt), würde den therapeutischen Index von Strahlung und Chemotherapie verbessern.
Die Benzotriazinverbindungen sind entwickelt worden, um sich diese relative Hypoxie in dem Tumor zu Nutze zu machen. Tirapazamin, das bis heute vielversprechendste Mitglied der Benzotriazinreihe, wird unter Hypoxiebedingungen zu einem aktiven Zwischenprodukt bioreduziert. Dieses aktive Zwischenprodukt kann DNA-Schäden induzieren, die die Wirkungen der Strahlentherapie oder Chemotherapie verstärken, und ist selbst zytotoxisch. Da benachbarte normale Gewebe nicht hypoxisch sind, ermöglicht diese Bioreduktion selektive zytotoxische Wirkungen auf hypoxische Tumorzellen.
Die Forschung zeigte eine wesentliche Überlegenheit der Benzotriazine gegenüber Nitroimidazol-Strahlungssensibilisatoren und anderen Bioreduktionsmitteln in vitro, wie in Tabelle I gezeigt. TABELLE I Hypoxische Zytotoxizitätsverhältnisse für verschiedene Bioreduktionsarzneimittel in vitro

^a hypoxisches Zytotoxizitätsverhältnis = Verhältnis der Arzneimittelkonzentration, die unter aeroben Bedingungen erforderlich ist, gegenüber der, die unter hypoxischen Bedingungen erforderlich ist, für äquivalente Zelltötungsniveaus.

Tirapazamin hat jedoch die Nachteile, daß es in pharmazeutischen Vehikeln, die zur parenteralen Verabreichung geeignet sind, unzureichend löslich und in diesen Vehikeln auch instabil ist. Es ist herausgefunden worden, daß die Löslichkeit von Tirapazamin in Wasser etwa 0,81 mg/ml beträgt, was ein großes Volumen der Lösung erforderlich machen würde, ungefähr 1 Liter, das einem Patienten zur Bereitstellung der richtigen Dosierung verabreicht werden soll. Ansätze zur Verbesserung der Löslichkeit unter Verwendung von oberflächenaktiven Mitteln, wie Tween 80, und Polymeren, wie Pluronic F68, Povidon und Albumin, waren bei minimaler Erhöhung der Löslichkeit nicht erfolgreich. Die Löslichkeitsverbesserung mit Hilfslösungsmitteln war erfolgreicher, jedoch würde der Anteil an Hilfslösungsmitteln, die notwendig sind, um die erwartete, minimale, verträgliche Dosis von Tirapazamin löslich zu machen, die Infusion signifikanter Mengen an Hilfslösungsmitteln, beispielsweise bis zu 120 ml Propylenglykol als eine 50 Vol.-%ige Propylenglykol/wässerige Lösung bedeuten. Dieses große Volumen eines Hilfslösungsmittels in einer injizierbaren Formulierung ist unerwünscht und birgt das Risiko unerwünschter klinischer Auswirkungen auf einen Patienten.
Dem Tirapazamin mangelt es ebenso an Lagerungsstabilität: eine vollständige Zersetzung tritt nach weniger als vierstündigem Kochen unter Rückfluß in 0,1 N Natriumhydroxid ein.
Hauptgegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, eine wässerige infundierbare/injizierbare Formulierung bereitzustellen, die ausreichende Mengen des Antikrebstumormittels enthält und lagerungsstabil ist. Während unserer gründlichen klinischen Studien an Tirapazamin wurde festgestellt, daß dieses vielversprechenden Arzneimittel ohne zureichende Löslichkeit und Stabilität den unzähligen Patienten, die an Krebstumoren leiden, nicht helfen würde.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt eine wässerige parenterale Formulierung zur Behandlung von Krebstumoren bereit, umfassend:
eine wirksame Krebstumor-Behandlungsmenge einer Verbindung der Formel
oder ein pharmakologisch akzeptables Salz der Verbindung in einem parenteral akzeptablen Puffer mit einer Konzentration von etwa 0,001 M bis etwa 0,1 M.
Bevorzugt umfaßt die wässerige parenterale Formulierung die Verbindung oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz der Verbindung in einem Citratpuffer mit einer Konzentration von etwa 0,005 M bis etwa 0,5 M. Bevorzugt weist der Citratpuffer einen pH von etwa 3,7 bis 4,3 auf.
Stärker bevorzugt umfaßt die parenterale Formulierung zur Behandlung von Krebstumoren der vorliegenden Erfindung:
etwa 0,500 bis etwa 0,810 g 3-(2-Methoxyethyl)-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
etwa 0,100 bis etwa 9,000 g Natriumchlorid;
etwa 0,1 bis etwa 10,00 g Zitronensäure;
etwa 0,02 bis etwa 3,00 g Natriumhydroxid; und
q. s. für pH 3,0 bis 5,0 in Wasser auf 1.000 ml.
Die vorliegende Erfindung ist ebenso auf die Verwendung der erfindungsgemäßen Formulierung bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Krebstumors gerichtet.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Antitumormittel
Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung und ihre Verwendung bei der Behandlung von Säugerkrebstumoren, einschließlich menschlichen Krebstumoren, insbesondere festen Tumoren bereit. In diesem Aspekt der Erfindung wird eine wirksame Menge der Verbindung 3-(2-Methoxyethyl)-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid, die in einer Citratpufferlösung enthalten ist, verwendet, um ein Medikament zur Behandlung eines Säugers mit einem Krebstumor herzustellen, welches angepaßt wird, um etwa eine halbe Stunde bis etwa 24 Stunden verabreicht zu werden, bevor eine wirksame Menge eines Chemotherapiemittels, auf das der Tumor empfindlich reagiert, dem Säuger verabreicht wird.
Bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Formulierung wurden intensive Studien durchgeführt, um die ausreichende Löslichkeit der Krebstumorverbindung bereitzustellen und um die Formulierung lagerungsstabil zu machen, was aus der folgenden Beschreibung deutlich werden wird.
Die vorliegende Erfindung wird insbesondere in bezug auf Tirapazaminformulierungen beschrieben.
Die erfindungsgemäße Antikrebstumorverbindung ist 3-(2-Methoxyethyl)-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid mit der Strukturformel
und einem Molekulargewicht von 221,22.
Löslichkeitseigenschaften von Tirapazamin
Die Löslichkeit von Tirapazamin in Wasser und verschiedenen Vehikeln wird in Tabelle II gezeigt.
TABELLE II Löslichkeit von Tirapazamin in wässerigen Medien
Die begrenzte Löslichkeit von 0,81 mg/ml würde bis zu einem Liter an Flüssigkeit, die infundiert werden soll, erfordern, weshalb die Löslichkeit erhöht werden muß, um das Flüssigkeitsvolumen zu minimieren. Versuche zur Verbesserung der Löslichkeit unter Verwendung von oberflächenaktiven Mitteln (Tween 80) und Polymer (Pluronic F68, Povidon, Albumin) waren bei der minimalen Erhöhung der Löslichkeit nicht erfolgreich.
Eine Löslichkeitsverbesserung wurde mit Hilfslösungsmitteln erreicht, jedoch würde der Anteil an Hilfslösungsmittel, der notwendig ist, um die erwartete, minimale, verträgliche Dosis an Tirapazamin (~ 700 mg) zu lösen, das Infundieren signifikanter Mengen an Hilfslösungsmittel bedeuten (beispielsweise bis zu 120 ml Propylenglykol (PG), als 50 Vol.-%ige PG/wässerige Lösung).
Die physikochemischen Eigenschaften von Tirapazamin zeigen, daß das Molekül weder stark polar ist noch einen hoch lipophilen Charakter hat. Dies wird durch (i) den Verteilungskoeffizienten (Octanol/Wasser) von 0,15 (logP –0,82) und (ii) die beobachtete Zersetzung beim Schmelzen bei 200°C veranschaulicht, was darauf schließen läßt, daß die Kristallstruktur von Tirapazamin stark durch intermolekulare Kräfte gebunden ist. Die planare Beschaffenheit des Moleküls würde eine geordnete Stapelung des Kristalls mit intermolekularen Anziehungen (Ladungsübertragungsinteraktionen) zwischen jeder Ebene über Stickstoff und Sauerstoff der N-Oxid-Funktionen erleichtern. Eine hydratisierte Form von Tirapazamin kann existierten, wo Wassermoleküle an die Sauerstoffkomponenten Wasserstoff-gebunden sind.
Um die Löslichkeit der Verbindungen in Wasser-Lösungsmittel-Gemischen vorherzusagen, sind verschiedene Ansätze gemacht worden, um organische Lösungsmittel unter Verwendung von Parametern, wie Dielektrizitätskonstante, Löslichkeitsparameter, Oberflächenspannung, Grenzflächenspannung, Wasserstoffbindungsdonator- und -akzeptordichten und Octanol-Wasser-Verteilungskoeffizient, zu klassifizieren. Werte für ausgewählte Lösungsmittel, die in Tirapazaminlöslichkeitsstudien verwendet wurden, werden in Tabelle III angegeben. Diese Parameter sind mathematisch verwendet worden, um die Löslichkeit von nicht-polaren gelösten Stoffen durch Korrelieren dieser Parameter mit dem Anstieg der Löslichkeitsdiagramme, die aus den experimentellen Daten konstruiert werden, vorherzusagen. Diese Parameter, die die Kohäsionseigenschaften von Lösungsmitteln, wie Löslichkeitsparameter und Grenzflächenspannung, reflektieren, führen zur höchsten Korrelation mit dem Anstieg, wie es die Wasserstoffbindungsfähigkeit des reinen Hilfslösungsmittels tut, ausgedrückt als die Dichte von Protonen-abgebenden Gruppen oder Akzeptorgruppen. TABELLE III Polaritätsindizes von Lösungsmitteln
worin:

DMSO = Dimethylsulfoxid
DMF = Dimethylformamid
DMA = Dimethylacetamid
GLYC = Glycerol
PG = Propylenglykol
PEG400 = Polyethylenglykol 400

Aprotische Lösungsmittel bei hohen Volumenfraktionen, beispielsweise Dimethylsulfoxid (DMSO), Dimethylformamid (DMF) und Dimethylacetamid (DMA), unterbrechen die Was serstruktur durch dipolare und hydrophobe Wirkungen. Amphiprotische Lösungsmittel, beispielsweise Glycerol, PEG 400 und Propylenglykol (PG), können sowohl selbstassoziierend sein als auch durch Wasserstoffbrückenbindung an Wasser gebunden sein, weshalb solche Lösungsmittel nicht ideal für gelöste Stoffe geeignet sind, die sich nicht an der Wasserstoffbrückenbindung beteiligen können. Der Verteilungskoeffizient des gelösten Stoffes ist ein Indikator zum Vorhersagen, ob Hilfslösungsmittel wirksam sein werden. Die folgende Gleichung ist verwendet worden, um die Löslichkeit in verschiedenen Lösungsmittelsystmen erfolgreich vorherzusagen: log Cs = log C0 = f (log R + 0,89 log P + 0,03)worin C_s und C₀ die Löslichkeiten im Lösungsmittelgemisch bzw. Wasser sind, f die Hilfslösungsmittelfraktion ist, R die relative Lösungsmittelkraft ist (typische Werte sind DMF = 4, Glycerol = 0,5) und P der Verteilungskoeffizient ist. Wenn P in Richtung Eins tendiert (log P ⇒ 0), dann ist keine Erhöhung der Löslichkeit möglich, da log Cs = log C0
Da log P für Tirapazamin –0,8 ist, würde diese Gleichung vorhersagen, daß eine signifikante Wirkung von Hilfslösungsmittel auf die Wasserlöslichkeit unwahrscheinlich ist. Experimente, die mit diesen Hilfslösungsmitteln durchgeführt wurden, führten zu dem Ergebnis, daß die Löslichkeit von Tirapazamin durch diese Hilfslösungsmittel nicht signifikant verbessert wurde.
Stabilität
Spannungsstudien wurden unter Verwendung von mehreren Autoklavenzyklen von 21 Minuten bei 121°C durchgeführt. Diese Studien zeigten, daß Tirapazamin in sauren Lösungen von physiologischer Kochsalzlösung oder Lösungen, die auf pH 4 unter Verwendung von 0,05 M Citrat oder 0,1 M Lactatpuffer gepuffert wurden, stabiler war. Tirapazamin war in Gegenwart von Phosphatpuffer bei pH 5,9 und in Citratpuffer bei pH 6 instabil. Eine Verschiebung des pH in der Formulierung von physiologischer Kochsalzlösung fand nach acht Autoklavenzyklen von 4,5 auf 4,9 statt, daher erforderten die Formulierungen einen gewissen Grad an Pufferung.
Die Formulierungen wurden ebenso durch die Lagerung bei erhöhten Temperaturen von 50°C und 70°C nach einem einzelnen Autoklavenzyklus von 21 Minuten bei 121°C bean sprucht. Es wurde festgestellt, daß Tirapazamin in Gegenwart von Lactatpuffer nach der Lagerung bei 70°C instabil war. Diese Instabilität ging aus mehreren Autoklavenbeanspruchungen nicht hervor. Es wurde festgestellt, daß die stabilste Formulierung 0,05 M Citrat pH 4 war.
Die Formulierung von Tirapazamin wurde deshalb unter Verwendung von Citratpuffer weitergeführt. Die Löslichkeit von Tirapazamin bei 15°C erforderte, daß die Konzentration von 1 auf 0,5 mg/ml reduziert wurde. Eine weitere Beanspruchung in Citratpuffer bei pH 3,5, 4,0 und 4,5 wurde durchgeführt, um die wahrscheinlichen Grenzen für den pH zu bestimmen. Basierend auf den Daten aus dieser Studie wurden die Grenzen auf pH 4,0 ± 0,3 eingestellt.
Basierend auf den erzeugten Stabilitätsdaten war die stabilste Formulierung von Tirapazamin in Citratpuffer bei pH 4. Die Löslichkeit von Tirapazamin in Citratpuffer betrug 0,81 mg/ml bei 15°C. Um daher das Volumen an infundierter Flüssigkeit zu begrenzen, wurde eine maximale Konzentration von 0,7 mg/ml zur weiteren Formulierungsentwicklung verwendet.
Die Wirkung der Pufferkonzentration (0,05 oder 0,005 M) auf die Stabilität wurde durch Beanspruchen von 2 × 10 l Stabilitätschargen von Tirapazamin (0,7 mg/ml) in Citratpuffer bei pH 4,0 bewertet.
Tirapazamin war nach 2 Monaten in sowohl 0,005 M als auch 0,05 M Citratpuffer bei 50°C stabil. Bei 70°C gab es den Nachweis von Instabilität bei der 0,05 M-Citratformulierung, deshalb wurde die niedrigere Citratkonzentration (0,005 M) zur Entwicklung als klinische Formulierung ausgewählt. Die klinische Formulierung, die in den später erläuterten chemischen Studien verwendet wurde, war folgendermaßen:

Tirapazamin 0,700 g

Natriumchlorid 8,700 g

Zitronensäure 0,9605 g

Natriumhydroxid 0,2500 g

q. s. für pH 4,0 in Wasser auf 1.000 ml.
Tirapazamin wird in 20-ml-Klarglasampullen, enthaltend 0,7 mg/ml (14 mg) Tirapazamin in dem isotonischen Citratpuffer, gelagert. Die Ampullen werden bei 15°C bis 30°C in lichtundurchlässigen Verpackungen gelagert.
Dosierung
Eine Studie der akuten Toleranz bei Mäusen, Einzel- und Mehrfachdosierungsstudien bei Ratten und Hunden und eine in-vitro-Knochenmarksuppressionsstudie sind mit der erfindungsgemäßen Formulierung durchgeführt worden.
Bei einer Studie der akuten Toleranz bei der Maus betrugen die LD₁₀ und LD₅₀ für Tirapazamin 98 bzw. 101 mg/kg.
Einzel- und 2-Wochen- und 2-Monats-Mehrfachdosierungs-Studien wurden an der Ratte und am Hund durchgeführt. Klinische Anzeichen und Symptome wurden in beiden Spezies beobachtet, und jede Therapie, die Speichelabsonderung umfaßte, verringert den Meßwert der weißen Blutkörperchen (einschließlich Lymphozytenzahl beim Hund) und verringert den Meßwert der roten Blutkörperchen.
Pharmakologie
Die Wirkung von Tirapazamin auf eine Vielzahl von aeroben und hypoxischen Zellen ist in Kultur untersucht worden, um die Selektivität der Tirapazaminzytotoxizität zu messen. Tirapazamin (20 μM) war ein wirksamer und selektiver Killer von hypoxischen Zellen in vitro, mit hypoxischen Zytotoxizitätsverhältnissen von 150, 119 und 52 für Hamster-, Maus- bzw. menschliche Zellinien (1-2 Größenordnungen höher als Strahlensensibilisatoren wie Nitroimidazole, Mitomycin C und Porfiromycin). Diese Zytotoxizität wurde ebenso über einen Sauerstoffpartialdruckbereich (1 %-20 % O₂; in erster Linie bei 1 %-4 % O₂) beobachtet.
In vivo war Tirapazamin gleichermaßen bei Maustumormodellen bei einer Einzeldosis von 0,30 mmol/kg (160 mg/m²) oder bei Mehrfachdosierungen von 0,08 mmol/kg (43 mg/m²) wirksam, wenn es mit fraktionierter Strahlung (2,5 Gy × 8) verwendet wurde. Tirapazamin war ebenso bei einer Einzeldosis von 0,30 mmol/kg (160 mg/m²) mit einer einmaligen großen Stralungsdodsis (20 Gy) wirksam. Tirapazamin erschien am wirksamsten, bei Mehrfachdosierungen von 0,08 mmol/kg (43 mg/m²), die vor jeder Strahlungsfraktion (2,5 Gy × 8) gegeben wurden, was zu mehrfachen Heilungen bei Maus-SCCVII-Tumoren führte; und Tirapazamin erschien am wenigstens wirksam, wenn es ohne Strahlung gegeben wurde, was typischerweise zu weniger als 1 log Zelltod führte. Wenn Tirapazamin mit fraktionierter Strahlung verwendet wird, erzeugte es eine Wirkung, die der Wirkung gleicht, die erwartet wird, wenn Tirapazamin auf eine separate Zellpopulation einwirkte (hypoxische Zellen), im Verhältnis zu der darauf einwirkenden Strahlung (aerobe Zellen).
Der Mechanismus der Wirkung von Tirapazamin ist ausführlich untersucht worden und ist eng an den Stoffwechsel des Arzneimittels gebunden. Die nachstehende Darstellung zeigt den vorgeschlagenen Mechanismus der Wirkung für die Tirapazaminproduktion eines freien Radikals während der Reduktion zu dem Mono-N-oxid, das Einzel- oder Doppelstrangbrüche in der DNA verursacht. Unter hypoxischen Bedingungen wird Tirapazamin zu dem 2-Elektronen-Reduktionsprodukt WIN 64102 (Mono-N-oxid; SR 4317) und dann zu dem 4-Elektronen-Reduktionsprodukt WIN 60109 (Zero-N-oxid; SR 4330) verstoffwechselt. Mehrere Studien, die die DNA-Schadensreparatur nach der Behandlung mit Tirapazamin untersuchten, zeigten, daß die DNA-Reparaturinhibierung dosisabhängig und ähnlich der ist, die durch Röntgenstrahlen erzeugt wird.
Das Benzotriazin-di-N-oxid-Tirapazamin wurde gründlich sowohl in vitro als auch in vivo untersucht, um seine Wirksamkeit zu bestimmen und zu quantifizieren und seinen Wirkungsmechanismus zu erforschen.
In Vitro
Die Wirkungen von Tirapazamin auf eine Vielzahl von aeroben und hypoxischen Zellen sind in Kultur untersucht worden, um die Selektivität der Tirapazaminzytotoxizität zu messen. Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO-HA-1), Mauszellen (C3H 10T1/2, RIF-1, und SCCVII), und menschliche Zellinien (HCT-8, AG 1522, A549 und HT 1080) wurden verwendet. Tirapazamin (20 μM) war ein wirksamer und selektiver Killer von hypoxischen Zellen in vitro, wie in Tabelle 4 gezeigt. TABELLE 4 In-Vitro-Zytotoxizität von Tirapazamin auf acht Zellinien, inkubiert unter aeroben oder hypoxischen Bedingungen

^a hypoxisches Zytotoxizitätsverhältnis = Konzentration an Tirapazamin in Luft/Konzentration an Tirapazamin in Stickstoff, um ungefähr dieselbe Überlebensrate zu erhalten.
^b Sensibilitätsindex = Zeit (in Minuten) zum Erreichen von 10^–2 (1 %) überlebender Fraktion bei 20 μM unter hypoxischen Bedingungen.
^c IC₅₀ = Konzentration, erforderlich, um Zellwachstum um 50 % in einer Inkubation von 1 Stunde unter hypoxischen Bedingungen zu inhibieren.
^d Normal = nicht-tumorerzeugend.

In Vivo
Tirapazamin allein
Wenn Tirapazamin bei Mäusen in vivo – in Einzeldosierungen – allein verabreicht wird, würde erwartet werden, daß es zu einen relativ kleinen Zelltod führt, entsprechend dem Prozentsatz an Tumorzellen, die hypoxisch sind. Eine Vielzahl an Experimenten zeigte, daß dies der Fall ist, mit Zelltoden von typischerweise weniger als ein log (überlebende Fraktion ≥ 1·10^–1). Beispielsweise war der maximale Zelltod, der nach einer Einzeldosis beobachtet wurde, in dem SCCVII-Tumor (überlebende Fraktion = 5·10^–1), und es wurde nur eine geringe Tumorwachstumsverzögerung von 3 Tagen in dem FSaIIC-Fibrosarkom erzeugt.
Mehrfachdosierungen von Tirapazamin, verabreicht ohne Strahlung, könnten erwartungsgemäß leicht stärkeren Zelltod als eine Einzeldosierung selbst bei geringeren Dosierungen von Tirapazamin erzeugen. Jedoch betrug die niedrigste überlebende Fraktion, die in vier unterschiedlichen Maustumoren gesehen wurde, 5·10^–1, und bis hinunter zu 5·10^–2 in einem fünften Maustumor (RIF-1 Tumor).
Tirapazamin mit Strahlung
In einer Vielzahl von nachstehend beschriebenen Modellsystemen verstärkt Tirapazamin die Antitumoraktivität der Strahlung, was durch den Zelltod oder die Tumorwachstumsverzögerung bewertet wird. Die getesteten Tumore umfassen FSaIIC, SCCVII, RIF-1, EMT6 und KHT. Tirapazamin verstärkt den Zelltod, wenn es nach einem Einzel- oder Mehrfachdosierungsplan verabreicht wird, und wenn das Arzneimittel mit entweder einer Einzeldosis an Strahlung oder fraktionierter Strahlung kombiniert wird.
In einer Studie überschreitet die Antitumorwirkung von Tirapazamin plus Strahlung die additive Wirkung von diesen zwei Behandlungen. Die Verstärkung der Aktivität durch Tirapazamin tritt auf, wenn das Arzneimittel 2,5 bis 0,5 Stunden vor der Strahlung oder bis zu 6 Stunden danach verabreicht wird. Zusätzlich zu der Aktivität gegen hypoxische Zellen radiosensibilisiert Tirapazamin aerobe Zellen in vitro, wenn die Zellen dem Arzneimittel unter hypoxischen Bedingungen entweder vor oder nach der Strahlung ausgesetzt werden.
In einer Studie verbesserte die Behandlung mit Tirapazamin die Antitumoraktivität der Strahlung auf ein größeres Ausmaß, als es der hypoxische Zellensensibilisator Etanidazol tat.
Die Sauerstoffkonzentrations/Zytotoxizitäts-Kurve von Tirapazamin scheint für die Kombination mit der Strahlentherapie besonders gut geeignet zu sein. Unter ungefähr 30 Torr (mm Hg) Zellen werden gegen die schädlichen Wirkungen der Strahlung stark resistent. Nitroaromatische und chinonantibiotische Radiosensibilisatoren sind jedoch nur bei viel geringeren Sauerstoffniveaus am wirksamsten. Daher sind sie für die mäßig hypoxischen, strahlenresistenten Zellen, die in Tumoren vorliegen, nicht toxisch. Im Gegensatz dazu bleibt die Zytotoxizität von Tirapazamin relativ konstant über den gesamten Bereich der Sauerstoffkonzentrationen, die Strahlenresistenz verleihen.
Im Gegensatz zu anderen Radiosensibilisatoren, die bis heute untersucht wurden, verringert sich die Toxizität von Tirapazamin bei hohen Sauerstoffkonzentrationen (d. h. denen, die in normalem Gewebe gefunden werden). Bei einem in-vitro-System war die Toxizität von Tirapazamin mindestens 50- bis > 2.000fach höher unter Hypoxie als unter 100%igem Sauerstoffdampf. Da es gegen einen breiten Bereich an strahlenresistenten Tumorzellen wirksam ist, aber für normale Zellen mit hohen Sauerstoffkonzentrationen nicht toxisch ist, ist Tirapazamin gegen hypoxische Tumorzellen selektiv zytotoxisch.
Tirapazamin mit Chemotherapie
Wenn Tirapazamin (25 bis 75 mg/kg IP = 83,3 bis 250 mg/m²) Mäusen verabreicht wird, die FSaIIC-Fibrosarkom tragen, wurde der direkte Tumorzelltod beobachtet. Die Zugabe von Tirapazamin (50 mg/kg IP = 167 mg/m²) zu Cyclophosphamid (150 mg/kg IP = 500 mg/m²), Melphalan (10 mg/kg IP = 33 mg/m²) oder Cisplatin (10 mg/kg IP = 33 mg/m²) in diesem Modell erzeugte eine 1,6- bis 5,3fache Zunahme der Tumorwachstumsverzögerung.
Wirkung auf normales Gewebe
Weibliche C3H/Km-Mäuse wurden in zwei Assays verwendet, um das Potential zu untersuchen, mit dem Tirapazamin die normale Gewebesensibilität auf ionisierende Strahlung beeinflussen könnte. Sowohl normale Hautreaktions- und Beinkontraktionstests (Schenkel) wurden mit fraktionierter Strahlung durchgeführt. Tirapazamin beeinflußte die Gewebe in keinem der Assays.
Um zu bestimmen, ob Tirapazamin normales Gewebe beeinflussen kann, wurden die rechten Hinterbeine der weiblichen C3H/km-Mäuse mit acht Fraktionen (3, 4, 5 oder 6 Gy) über vier Tage (einmal alle 12 Stunden) bestrahlt. Den Mäusen wurde entweder physiologische Kochsalzlösung oder Tirapazamin (0,08 mmol/kg = 43 mg/m²) 30 Minuten vor oder direkt nach jeder Fraktion injiziert. Hautreaktionen über den bestrahlten Schenkeln wurden dreimal wöchentlich von Tag 10 bis Tag 32 nach der ersten Strahlungsdosis bewertet. Die Mäusen wurden „blind" bewertet – ohne Kenntnis der Behandlungsgruppe – gemäß einer Skala ähnlich einer, die zuvor entwickelt wurde [Brown JM, Goffinet DR, Cleaver JE, Kallman RF, „Preferential radiosensitization of mouse sarcoma relative to normal mouse skin by chronic intraarterial infusion of halogenated pyrimidine analogs", JNCI (1971) 47, 77-89]. Es wurde keine Radiosensibilisierung oder zusätzliche Toxizität durch die Zugabe von Tirapazamin bei der Strahlenbehandlung erzeugt, wie durch die Hautreaktion bestimmt worden war.
Nach der Beschreibung der Erfindung in bezug auf deren bevorzugte Ausführungsformen sollte es selbstverständlich sein, daß Modifikationen innerhalb des Umfangs der Erfindung für den Fachmann offensichtlich sein werden.

Claims

Wässerige parenterale Formulierung zur Behandlung von Krebstumoren, umfassend: eine wirksame Krebstumor-Behandlungsmenge einer Verbindung der Formel
oder ein pharmakologisch akzeptables Salz der Verbindung in einem parenteral akzeptablen Puffer mit einer Konzentration von etwa 0,001 M bis etwa 0,1 M.
Wässerige parenterale Formulierung zur Behandlung von Krebstumoren, umfassend eine Verbindung, wie in Anspruch 1 definiert, oder ein pharmakologisch akzeptables Salz der Verbindung in einem Citratpuffer mit einer Konzentration von etwa 0,005 M bis etwa 0,05 M.
Wässerige parenterale Formulierung zur Behandlung von Krebstumoren, umfassend etwa 0,500 bis etwa 0,810 g einer Verbindung der Formel
oder eines pharmakologisch akzeptablen Salzes der Verbindung in einem Citratpuffer mit einer Konzentration von etwa 0,005 M bis etwa 0,05 M; etwa 0,100 bis etwa 9,000 g Natriumchlorid; etwa 0,9000 bis etwa 10,00 g Zitronensäure; etwa 0,200 bis etwa 3,000 g Natriumhydroxid; und q. s. für pH 3,0 bis 5,0 in Wasser auf 1.000 ml.
Wässerige parenterale Formulierung nach Anspruch 2, wobei der Citratpuffer einen pH von etwa 3,7 bis 4,3 aufweist.
Verwendung der Formulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Krebstumors.