DE69820122T2

DE69820122T2 - Apparat zur suspension von kultivierten zellen aus gewebe und mikroorganismen

Info

Publication number: DE69820122T2
Application number: DE69820122T
Authority: DE
Inventors: Ivanovich Vasily KISLYKH; Akhmetovich Jury RAMAZANOV; Petrovich Andrei REPKOV
Original assignee: BIOZEX TECHNOLOGIES CORP VANCOUVER; Biozex Technologies Corp
Current assignee: BIOZEX TECHNOLOGIES CORP VANCOUVER; Biozex Technologies Corp
Priority date: 1998-09-22
Filing date: 1998-09-22
Publication date: 2004-08-26
Anticipated expiration: 2018-09-23
Also published as: JP3936842B2; DE1120460T1; ATE255161T1; EP1120460B1; DE69820122D1; DK1120460T3; US6632657B1; EP1120460A1; EP1120460A4; JP2002526063A; WO2000017314A1; RU2135579C1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung bezeiht sich auf die Biotechnik und insbesondere auf eine Vorrichtung zum Kultivieren von Gewebezellen oder Mikroorganismen in einer Suspension.
Stand der Technik
Aus dem Stand der Technik (SU, A1, Nr. 1331888, 1987) ist eine Vorrichtung zum Kultivieren von Gewebezellen und Mikroorganismen in einer Suspension bekannt, die einen geschlossenen Behälter umfasst, mit dessen Boden Abzweigrohre zum Einspeisen von Belüftungsgas verbunden sind. Eine Gruppe der Abzweigrohre ist zu der Zylinderwand des Behälters tangential angeordnet und die andere parallel dazu. Bei dem Kultiviervorgang wird das Belüftungsgas sofort in einer Wirbelbewegung mit gleichzeitiger Zirkulation in der Form von aufsteigenden und absteigenden Strömungen entlang der Achse der Vorrichtung in die Suspension eingebunden.
Derartige Vorrichtungen können jedoch für die Kultivierung von tierischen Zellen und menschlichem Gewebe nicht verwendet werden: diese Zellen können leicht traumatisiert werden, da in dem Kultiviervorgang in der Suspension eine große Anzahl an Gasblasen gebildet wird und die Zerstörung dieser Blasen das Absterben vieler Zellen verursachen wird. Die Belüftung durch Gaseinblasen führt ferner zu einer Schaumbildung die auch zum Verlust eines Teils der Zellen führt. Die Schaumunterdrückung wird das Einbringen von konstenintensiven, nicht toxischen chemischen Entschäumern in den Nährboden erfordern, wobei der technologische Kultiviervorgang verkompliziert wird. Darüber hinaus wird die Verwendung der Entschäumer die Eigenschaften des Nährbodens verschlechtern.
Aus dem Stand der Technik (US, A, Nr. 4259449, 1981) ist eine Vorrichtung zum Kultivieren von Gewebezellen und Mikroorganismen in einer Suspension bekannt, die einen zylindrischen Behälter mit einem Deckel und Abzweigrohren zum Einspeisen eines Belüftungsgases und Entfernen von gasförmigem Medium und eine Einrichtung zum Rühren der Zellsuspension umfasst, wobei die Einrichtung als ein Gitter ausgestaltet ist, das in dem Bodenabschnitt des Behälters angeordnet ist. Dem Behälter wird durch das Gitter Luft zugeführt, um einen hydrostatischen Druck zu erzeugen, der die Ausscheidung von Zellen aus der Suspension verhindert.
Die Produktivität derartiger Vorrichtungen bei der Zellkultivierung ist jedoch aufgrund der Verschlechterung der Massentransportcharakteristika niedrig, die wiederum beeinträchtigt sind, insoweit die Intensität des Einspeisens des Belüftungsgases reduziert ist, um das Traumatisieren der Zellen zu vermeiden. Selbst in diesem Fall kann das Traumatisieren der Zellen nicht vollständig ausgeschlossen werden und eine intensive Schaumbildung findet statt.
Aus dem Stand der Technik (WO 92/05245, A1, 02.04.92) ist ferner eine Vorrichtung zum Kultivieren von Gewebezellen und Mikroorganismen in einer Suspension bekannt, die eine zylindrischen Behälter mit einer Abdeckung und Abzweigrohren zum Einspeisen und Entfernen von Gas und eine Einrichtung zum Belüften und zum Rühren der Suspension umfasst. Die Einrichtung zum Belüften und zum Rühren umfasst ein horizontales Schaufelrad, das an einer vertikalen Antriebswelle befestigt und in dem oberen Teil des Behälters direkt unter der Abdeckung angeordnet ist und eine ringförmige Platte, die darunter platziert ist, wobei diese zum Entfernen des Gases mit einer Mittelöffnung versehen ist und über ihren Umfang davon an der Wand des Behälters angebracht ist, um so zum Einspeisen und Abführen von Gas einen ringförmigen Raum um das Schaufelrad zu bilden. Schlitzförmige Öffnungen sind für den Gasdurchgang in der ringförmigen Trennung gebildet, wobei die Schlitze in einem Winkel zu der horizontalen Ebene gleichmäßig über den Umfang verteilt sind. Das Abzweigrohr zum Einspeisen des Gases ist in der Abdeckung koaxial zum dem Schaufelrad eingebaut und das Abzweigrohr zum Entfernen des Gases ist mit dem ringförmigen Raum gekoppelt und an der Kante der Abdeckung angeordnet.
Der Nachteil einer derartigen Vorrichtung liegt darin, dass in ihnen die Bildung einer Flüssigkeitswirbelbewegung (Potentialwirbel mit axialer Rückströmung), bei hohen Gasströmungsgeschwindigkeiten (größer als 15–18 m/s) über der Oberfläche dieser Flüssigkeit erreicht werden kann, d. h. die Wirbelbildung bringt einen zu berücksichtigenden Leistungsbedarf mit sich. Zur gleichen Zeit tritt das Mitreißen von Flüssigkeitstropfen von der Oberfläche der Suspension mit nachfolgendem Ausstoßen dieser Tropfen auf die Wand des Behälters auf. Zellen in den Suspensionstropfen werden durch den Aufprall gegen die Wand der Vorrichtung traumatisiert, d. h. ein Massensterben der Zellen findet statt. Mit einem Absenken der Gasströmungsgeschwindigkeit (6–8 m/s) wird eine instabile Flüssigkeitsströmung über der Oberfläche der Zellsuspension beobachtet, d. h. die axialsymmetrische Wirbelbewegung der Flüssigkeit ändert sich periodisch zu Eigenschwingungen der Flüssigkeit, in welchem Modus eine Wellenwanderung entlang der Wand des Behälters entsteht. Die Oberfläche der Flüssigkeit krümmt sich und stellt einen asymmetrischen Rotationsparaboloid dar. Die gesamte Flüssigkeit in der Vorrichtung oszilliert als eine einzige Gesamtheit, die gesamte Vorrichtung beginnt zu wackeln und dies erzeugt einen wenig bevorzugten Effekt in dem Zellkultivierungsvorgang. Daneben erlaubt die Ausgestaltung der Vorrichtung das Kultivieren von Zellen innerhalb des Behälters, der bis zu einer Höhe gleich oder weniger als einem Durchmesser dieses Behälters gefüllt ist. Wird der Behälter mit der Zellsuspension bis zu einer Höhe größer als einem Durchmesser davon gefüllt, wird sich ein bewegungsloser Bereich am Boden des Behälters bilden. Während der Kultivierung werden sich Zellen unvermeidlich in diesem Bereich ablagern und aufgrund eines Mangels an Sauerstoff absterben.
Es ist auch eine Vorrichtung zum Kultivieren von Gewebezellen oder Mikroorganismen in einer Suspension bekannt (WO 93/21301, A1, 28.10.93. – erste Ausführungsform der Vorrichtung), welche einen zylindrischen Behälter mit einer Abdeckung und Abzweigrohren entsprechend zum Einspeisen eines Belüftungsgases und Entfernen eines gasförmigen Mediums und eine Einrichtung zum Belüften und Rühren der Suspension, die ein horizontales Schaufelrad umfasst, das an einer vertikalen Hohlwelle befestigt und in dem oberen Teil des Behälters direkt unter der Abdeckung angeordnet ist, umfasst. Die Einrichtung zum Belüften und Rühren des Mediums ist mit einer ringförmigen Trennung versehen, die in dem zylindrischen Behälter koaxial zu dem Schaufelrad eingebaut ist, wobei ein Zwischenraum zwischen der zylindrischen Wand des Behälters und der ringförmigen Trennung ausgebildet ist. Die Einrichtung ist ferner mit einem Mechanismus zum Festlegen der Position der ringförmigen Trennung in bezug auf die Oberfläche der Zellsuspension versehen. Gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung ist der Mechanismus zum Festlegen der Position der ringförmigen Trennung in bezug auf die Oberfläche der Zellsuspension in der Form eines Gestells ausgestaltet, das an der Abdeckung des Behälters und der ringförmigen Trennung mit Hilfe von Klinken mit der Möglichkeit, die Position der ringförmigen Trennung in bezug auf die Höhe des Behälters zu ändern, angebracht ist. Die ringförmige Trennung sollte bis zu einer Tiefe von H ≥ 0,02(D₁ – D₂) eintauchen, wobei
D₁ der Durchmesser der ringförmigen Trennung ist; und
D₂ der Durchmesser der axialen Öffnung in der ringförmigen Trennung ist.
Ein Nachteil dieser Ausführungsform der Vorrichtung lautet wie folgt. In vielen Fällen wird der Kultiviervorgang von Zellen und Gewebe von Änderungen des Niveaus der ursprünglichen Füllung des Bioreaktors begleitet (z. B. aufgrund von periodischen Probeentnahmen oder des Ausführens der Kultivierung mit kleinen Mengen an Nährboden im Anfangsstadium, wohingegen das Ausführen des Kultivierens im Endstadium mit einer maximalen Füllung des Behälters des Reaktors durchgeführt wird). Als Folge davon ändert sich die Tiefe (H) des Eintauchens der ringförmigen Trennung, d. h. die Bedingung H ≥ 0,02(D₁ – D₂) wird gestört. Eine Verminderung des Werts (H) führt zum "Verschließen" des Flüssigkeitsabflusses durch die axiale Öffnung in der ringförmigen Trennung und dies führt zur Verschlechterung des Rührprozesses und der Belüftung der kultivierten Zellen. Sollte die ringförmige Trennung stationär über der Oberfläche der Zellsuspension hängen, werden die Massentransportparameter weiter verschlechtert. Ist die Eintauchtiefe (H) der ringförmigen Trennung merkbar größer als H = 0,02(D₁ – D₂), wird eine wandernde Welle auf der Oberfläche der Suspension gebildet, die allmählich zum Wackeln der gesamten Masse der Zellsuspension führt und diese in einen Zustand instabilen Rührens mit verminderten Massentransportparametern bringt. Unter der Bedingung periodischer Änderungen des Füllniveaus des Behälters der Vorrichtung beim Kultiviervorgang ist diese Einrichtung daher entweder nahezu nicht betreibbar oder das Einführen eines zusätzlichen Mechanismus zum automatischen Festlegen der ringförmigen Trennung auf die optimale Tiefe in bezug auf die Änderungen des Füllniveaus des Vorrichtungsbehälters wird notwendig. Dies wird die Vorrichtung sehr viel komplizierter gestalten. Darüber hinaus wird die Verwendung einer stationären ringförmigen Trennung einen zusätzlichen Leistungsbedarf und einen höheren Zeitaufwand, um den Betriebszustand des Bioreaktors zu erreichen, mit sich bringen.
Der bezüglich der vorgeschlagenen technischen Lösung (Prototyp) relevanteste bekannte Stand der Technik ist eine Vorrichtung zum Kultivieren von Gewebezellen oder Mikroorganismen in einer Suspension, der einen zylindrischen Behälter mit einer Abdeckung und Abzweigrohren entsprechend zum Einspeisen eines Belüftungsgases und Entfernen von gasförmigem Medium und eine Einrichtung zum Belüften und Rühren der Suspension umfassend ein horizontales Schaufelrad, das an einer vertikalen Hohlwelle angebracht und in dem oberen Teil des Behälters direkt unter der Abdeckung angeordnet ist, umfasst (WO 93/21301, A1, 28.10.93. – die zweite Ausführungsform der Vorrichtung). Die Einrichtung zum Belüften und Rühren des Mediums mit einer ringförmigen Trennung ausgestattet, die koaxial zu dem Schaufelrad in dem Behälter eingebaut ist, wobei ein Zwischenraum zwischen der zylindrischen Wand des Behälters und der ringförmigen Trennung gebildet ist. Die Einrichtung ist ferner mit einem Mechanismus zum Festlegen der Position der ringförmigen Trennung in bezug auf die Oberfläche der Zellsuspension versehen. Der Mechanismus zum Festlegen der Position der ringförmigen Trennung in bezug auf die Oberfläche der Zellsuspension besteht aus Schwimmkörpern mit Führungsschaufeln, die an der oberen Fläche der ringförmigen Trennung befestigt sind. Die ringförmige Trennung sollte bis zu einer Tiefe von H ≥ 0,02(D₁ – D₂) eintauchen, wobei
D₁ der Durchmesser der ringförmigen Trennung ist; und
D₂ der Durchmesser der axialen Öffnung in der ringförmigen Trennung ist.
Der Nachteil dieser Ausführungsform der Vorrichtung (die Ausführungsform mit der schwimmenden ringförmigen Trennung) besteht darin, dass zum Erreichen einer hohen Dichte an pflanzlichen und tierischen Zellen in der Suspension oder beim Kultivieren von hoch aeroben Zellkulturen die Geschwindigkeit der Luftwirbel über der Oberfläche der Flüssigkeitsphase größer als 7–8 m/s sein sollte, um optimale Bedingungen zum Belüften der biologischen Objekte bereitzustellen. Mit derartigen Geschwindigkeit der Luftwirbel ist aber die Intensität der aufsteigenden Fluidströmung (axiale Rückströmung) derart, dass die ringförmige Trennung (aufgrund des Druckunterschiedes über und unter der Trennung) aufschwimmt und zwar in Richtung der Oberfläche der Zellsuspension (der Zustand des optimalen Eintauchens der ringförmigen Trennung H ≥ 0,02(D₁ – D₂) wird gestört, woraus folgt, dass der hydrodynamische Strömungsmodus (Rühren) der Flüssigkeit (Zellsuspension) gestört ist, wobei die Belüftungsbedingungen der Zellen, die kultiviert werden, verschlechtert sind, was von dem Ausfällen der Biomasse auf den Boden des Reaktors und dem Absterben der Zellen aufgrund des Mangels an Sauerstoff begleitet wird). Auf Änderungen der Viskosität der Flüssigkeitsphase beim Kultivieren von biologischen Objekten kann die ringförmige Trennung aufgrund ihres konstanten Auftriebs unkontrollierbar ihre Position in bezug auf die Oberfläche der Flüssigkeitsphase ändern.
Nebenbei bemerkt bilden sich, da sich die schwimmende ringförmige Trennung in der Zellsuspension dreht, bewegungslose Schattenzonen, die hinter den Schwimmkörpern entstehen, in welchen die Zellen, die kultiviert werden, ausfallen und sich die Zellen ansammeln. Die unteren Schichten der Zellen verderben aufgrund des Mangels an Sauerstoff in den Bereichen und die Qualität des Endprodukts wird dadurch verschlechtert und die technologischen Eigenschaften der Vorrichtung werden vermindert.
Offenbarung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist auf das Bereitstellen einer Vorrichtung zum Kultivieren von Gewebezellen oder Mikroorganismen in einer Suspension gerichtet, die die Bildung einer axial-symmetrischen Flüssigkeitswirbelbewegung mit einer axialen Rückströmung in der Zellsuspension ohne bewegungslose Bereiche, sowohl bei niedrigen Geschwindigkeiten der Gasbewegung (3–6 m/s), als auch bei hohen Geschwindigkeiten davon (7–10 m/s oder mehr) über der Oberfläche dieser Flüssigkeit, aufgrund des Aufrechterhaltens der ringförmigen Trennung in der optimalen Tiefe und zwar unabhängig von Änderungen der Intensität des Gaswirbels über der Oberfläche der Zellsuspension und Änderungen in der Viskosität der Flüssigkeitsphase, sichert, was wiederum das Kultivieren von Gewebezellen oder Mikroorganismen mit unterschiedlichen Sauerstofferfordernissen erlaubt.
Die festgelegte Aufgabe wird aufgrund der Tatsache erreicht, dass bei einer Vorrichtung zum Kultivieren von Gewebezellen oder Mikroorganismen in einer Suspension, die einen Behälter mit einer Abdeckung und entsprechenden Abzweigrohren zum Einspeisen eines Belüftungsgases und Abführen eines gasförmigen Mediums und eine Vorrichtung zum Belüften und Rühren der Suspension, umfassend ein horizontales Schaufelrad, das an einer vertikalen hohlen Welle befestigt ist und in dem oberen Teil des Behälters direkt unter der Abdeckung angeordnet ist, eine ringförmige Trennung, die in dem zylindrischen Behälter koaxial zu dem Schaufelrad mit einem Zwischenraum, der zwischen der Zylinderwand des Behälters und der ringförmigen Trennung ausgebildet ist, eingebaut ist und einen Mechanismus zum Festlegen der Position der ringförmigen Trennung in bezug auf die Oberfläche der Flüssigkeitsphase (der Zellsuspension), der in Form von Führungselementen und Schwimmkörpern ausgebildet ist, umfasst, gemäß der Erfindung die Führungselemente des Mechanismus zum Festlegen der Position der ringförmigen Trennung in bezug auf die Oberfläche der Flüssigkeit als abnehmbare Schaufeln mit einer flachen oberen Fläche und einer konvexen unteren Fläche ausgestaltet sind, wobei die Schaufeln in bezug auf die ringförmige Trennung radial orientiert sind und die Flächen der Schaufeln ein aerodynamisches Profil der "forward-sweep wing"-Art bilden; die Schaufeln mit Hilfe von Stützen an der oberen Fläche der ringförmigen Trennung angebracht sind oder die Schaufeln mit Hilfe von Stützen an der Oberseite und Unterseite dieser Trennung angebracht sind, wobei die Schaufeln mit Einheiten zum Ändern des Anstellwinkels in bezug auf den einströmenden Gas- oder Flüssigkeitsstrom und zum Sichern der entsprechenden Schaufeln an den Stützen auf der ringförmigen Trennung bzw. darunter ausgestattet sind.
Die aero- oder hydrodynamische Kraft, die entsteht, wenn die Schaufeln mit einem derartigen Design (mit dem Profil der "forward-sweep wing"-Art) von einem Gas oder einer Flüssigkeit umströmt werden, wird gegen die hydrodynamische Kraft geleitet, die ein Aufschwimmen der ringförmigen Trennung verursacht und dies erlaubt die ringförmige Trennung in einer optimalen Tiefe zu halten, wenn die Geschwindigkeit des Gaswirbels über der Oberfläche der Flüssigkeitsphase größer als 6–7 m/s ist.
Die Einheiten zum Ändern des Anstellwinkels in bezug auf die einströmende Gas- oder Flüssigkeitsströmung und zum Sichern der Schaufeln an den Stützen auf der ringförmigen Trennung und darunter sind als Klemmvorrichtungen ausgebildet. Die Einheiten können als verschiedenartige Steckanschlüsse, z. B. der Schrauben-Muttern- oder Spannbuchsenart ausgestaltet sein.
Wenn die Schaufeln auf der ringförmigen Trennung über der Oberfläche der Zellsuspension angeordnet sind, liegt der Anstellwinkel der Schaufeln in bezug auf die einströmende Gasströmung zwischen –15° bis –90° und wenn die Schaufeln in der Flüssigkeit unter der ringförmigen Trennung angeordnet sind, liegt der Anstellwinkel der Schaufeln in bezug auf die einströmende Flüssigkeitsströmung zwischen 0° bis –35°.
In diesen Neigungswinkelbereichen der Schaufeln gegenüber der einströmenden Gas- oder Flüssigkeitsströmung wird eine stabile Beibehaltung der ringförmigen Trennung in einer optimalen Tiefe mit einem niedrigen Energieverbrauch gesichert.
Die Schwimmkörper des Mechanismus zum Festlegen der Position der ringförmigen Trennung in bezug auf die Oberfläche der Flüssigkeitsphase sind in dem Körper dieser Trennung ausgestaltet. Sie sind als ungleichseitige Pyramidenstümpfe ausgeformt, die mit der abgestumpften Spitze in Richtung der ringförmigen Trennung ausgerichtet und mit einem Zwischenraum in bezug auf die Schaufeln und die ringförmigen Trennung an den Stützen befestigt sind.
Ein derartiger Aufbau der Schwimmkörper sichert eine Erhöhung bezüglich der Zuverlässigkeit des Beibehaltens der ringförmigen Trennung in einer optimalen Tiefe unabhängig von Änderungen bezüglich der Viskosität der Flüssigkeitsphase, während der Zwischenraum zwischen den Schwimmkörpern und der ringförmigen Trennung bewegungslose Schattenbereiche hinter den Schwimmkörpern ausschaltet, wodurch das Ausfällen, Ansammeln und Absterben von kultivierten Zellen in diesen Bereichen verhindert wird.
Das Anordnen der Schwimmkörper in dem Körper der ringförmigen Trennung schließt die bewegungslosen Schattenzonen auf dieser Trennung ebenfalls aus, wodurch das Ausfällen, Ansammeln und Absterben von kultivierten Zellen in diesen Bereichen vermieden wird.
Die ringförmige Trennung taucht in die Zellsuspension bis zu einer Tiefe von (H) gleich H = 0,02 ÷ 0,09(D₁ – D₂) ein, wobei
D₁ der Durchmesser der ringförmigen Trennung ist; und
D₂ der Durchmesser der axialen Öffnung in der ringförmigen Trennung ist.
Ein Absenken bezüglich des Werts H < 0,02(D₁ – D₂) führt zum "Verschließen" des Flüssigkeitsabflusses durch die axiale Öffnung in der ringförmigen Trennung, wobei dies zur Verschlechterung des Vorgangs des Rührens und Belüftens der kultivierten Zellen mit nachfolgendem Ausfällen der Biomasse auf den Boden des Reaktors und Absterben der Zellen aufgrund von Sauerstoffmangel führt. Ist die Eintauchtiefe (H) der ringförmigen Trennung merkbar größer als H = 0,09(D₁ – D₂), wird eine wandernde Welle über der Oberfläche der Suspension gebildet, die allmählich die gesamte Masse der Zellsuspension zum Wackeln bringt und dann in den Modus des instabilen Rührens mit niedrigeren Massentransportparametern (Eigenschwingungsmodus). Dies beeinflusst die Lebensfähigkeit und Produktivität der Biomasse negativ.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die Erfindung wird ferner durch die Beschreibung einer besonderen Ausführungsform davon unter Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen erklärt, in denen:
1 eine schematische Ansicht einer Vorrichtung zum Kultivieren von Gewebezellen und Mikroorganismen in einer Suspension mit über einer ringförmigen Trennung angeordneten Schaufeln und in dem Körper dieser Trennung angeordneten Schwimmkörpern ist;
2 eine Querschnittsansicht der Vorrichtung entlang A-A in 1 ist;
3 ein Mechanismus zum Festlegen der Position der ringförmigen Trennung in bezug auf die Flüssigkeitsoberfläche mit auf Stützen angeordneten Schwimmkörpern und über der ringförmigen Trennung und darunter angeordneten Schaufeln zeigt (die Schaufeln weisen in bezug auf die Gas- und Flüssigkeitsströmung kleine Anstellwinkel auf);
4 einen Mechanismus zum Festlegen der Position der ringförmigen Trennung in bezug auf die Flüssigkeitsoberfläche mit auf Stützen angeordneten Schwimmkörpern und über der ringförmigen Trennung (mit einem Anstellwinkel der Schaufeln in bezug auf die Gasströmung von –90°) und unter dieser Trennung (mit einem in bezug auf die Flüssigkeitsströmung) kleinen Anstellwinkel der Schaufeln angeordneten Schaufeln zeigt.
Beschreibung einer bevorzugten Ausführungsform
Die Vorrichtung der Erfindung zum Kultivieren von Gewebezellen und Mikroorganismen in einer Suspension umfasst einen zylindrischen Behälter 1 (1) für eine Zellsuspension mit einer Abdeckung 2 und Abzweigrohren 3 und 4 zum Einspeisen eines Belüftungsgases bzw. Entfernen eines gasförmigen Mediums und einer Einrichtung zum Belüften und Rühren des Nährbodens. Das Abzweigrohr 3 zum Einspeisen eines Belüftungsgases ist über der Abdeckung 2 koaxial zu dem Behälter 1 angebracht und das Abzweigrohr 4 zum Entfernen von Gas ist an einer Kante der Abdeckung 2 angebracht. Die Einrichtung zum Belüftung und Rühren der Zellsuspension umfasst ein horizontales Schaufelrad 5, das an einer vertikalen Hohlwelle 6 befestigt und in dem oberen Teil des Behälters 1 direkt unter der Abdeckung 2 angebracht ist; eine ringförmige Trennung 7, die in dem Behälter 1 koaxial dazu und zu dem Rad 5 angebracht ist, wobei ein Zwischenraum zwischen der Zylinderwand des Behälters 1 und der ringförmigen Trennung vorgesehen ist; und einen Mechanismus zum Festlegen der Position der ringförmigen Trennung 7 in bezug auf die Oberfläche der Zellsuspension.
Die untere Seite 8 der ringförmigen Trennung 7 ist konvex und die obere Seite davon ist flach. Ferner weist die ringförmigen Trennung 7 einen Durchmesser (D₁) gleich D₁ = (0,7 ÷ 0,9)D₀ auf, wobei der Durchmesser (D₂) der axialen Öffnung 7 gleich D₂ = (0,1 ÷ 0,3)D₁ ist, wobei D₀ dem inneren Durchmesser des zylindrischen Behälters 1 entspricht. Die Trennung 7 sollte bis zu einer Tiefe von (H) gleich H = 0,02 – 0,09(D₁ – D₂) in die Zellsuspension eintauchen.
Der Mechanismus zum Festlegen der Position der ringförmigen Trennung 7 in bezug auf die Oberfläche der Zellsuspension umfasst Schwimmkörper 10 und Führungselemente 11. Die Führungselemente 11 des Mechanismus zum Festlegen der Position der ringförmigen Trennung 7 in bezug auf die Oberfläche der Zellsuspension sind als abnehmbare Schaufeln 12 und 13 mit einer flachen Oberseite 14 und einer konvexen Unterseite 15 ausgestaltet, wobei die Schaufeln in bezug auf die ringförmige Trennung radial ausgerichtet sind und wobei die Oberflächen der Schaufeln ein aerodynamisches Profil der Schaufeln der "forward-sweep wing"-Art definieren. Die Luftkraft F₁, die verursacht wird, wenn die Schaufeln 12 durch Gas umströmt werden und die Wasserkraft F₂ die entsteht, wenn die Schaufeln 13 von Flüssigkeit umströmt werden, werden gegen die hydrodynamische Kraft F₃ geleitet, die in der rotierenden Flüssigkeitsströmung entsteht und aufgrund des Druckunterschiedes über und unter der ringförmigen Trennung das Aufschwimmen der ringförmigen Trennung 7 verursacht.
Bei einer der Ausführungsformen des Mechanismus zum Festlegen der Position der ringförmigen Trennung in bezug auf die Oberfläche der Flüssigkeitsphase (1) sind die Schaufeln 12 mit Hilfe von Stützen 16 auf der ringförmigen Trennung 7 angebracht und die Schwimmkörper 10 sind in dem Körper dieser ringförmigen Trennung 7 ausgestaltet.
Bei einer anderen Ausführungsform des Mechanismus zum Festlegen der Position der ringförmigen Trennung in bezug auf die Oberfläche der Flüssigkeitsphase (3) sind die Schaufeln 12 mit Hilfe von Stützen 16 auf der ringförmigen Trennung 7 angebracht und die Schaufeln 13 sind mit Hilfe von Stützen 17 über der ringförmigen Trennung 7 angebracht. Die Schwimmkörper 10 sind an den Stützen 16 zwischen den Schaufeln 10 und der ringförmigen Trennung 7 angebracht, sowie zwischen den Schwimmkörpern 10 und den Schaufeln 12. Die Schwimmkörper 10 sind unter Bildung eines Zwischenraums zwischen den Schwimmkörpern 10 und der Trennung 7 als ungleichseitige Pyramidenstümpfe ausgebildet, die mit der abgestumpften Spitze in Richtung der ringförmigen Trennung 7 weisen.
Bei einer der Betriebsarten der zweiten Ausführungsform des Mechanismus zum Festlegen der Position der ringförmigen Trennung in bezug auf die Oberfläche der Flüssigkeitsphase (4) sind die Schaufeln 12 in einem Winkel von –90° zu der Trennung 7 angebracht und dienen nur zum Bereitstellen der Drehung dieser Trennung in der Flüssigkeit (in der Zellsuspension).
Die Schaufeln 12 und 13 sind mit Einheiten zum Ändern der Anstellwinkel in bezug auf die einströmende Gas- oder Flüssigkeitsströmung und zum Befestigen der Schaufeln an den Stützen 16 auf der ringförmigen Trennung 7 bzw. den Stützen 17 unter der ringförmigen Trennung 7 ausgestattet. Die Einheiten zum Ändern des Anstellwinkels der Schaufeln 12 und 13 in bezug auf die einströmende Gas- oder Flüssigkeitsströmung bzw. zu ihrer Befestigung an den Stützen 16 und 17 sind als Klemmvorrichtungen 18 des Schrauben-Mutter- oder Hülsen- bzw. Spannbuchsentyps ausgestaltet.
Der Anstellwinkel der Schaufeln 12 in bezug auf die einströmende Gasströmung liegt zwischen –15° bis –90° und der Anstellwinkel der Schaufeln 12 in bezug auf die einströmende Flüssigkeitsströmung liegt zwischen 0° bis –35°.
Die ringförmige Trennung 7 taucht in die Zellsuspension bis zu einer Tiefe (H) gleich H = 0,02 ÷ 0,09(D₁ – D₂) ein, wobei:
D₁ der Durchmesser der ringförmigen Trennung ist; und
D₂ der Durchmesser der axialen Öffnung in der ringförmigen Trennung ist.
Zum Drehen des Schaufelrades 5 wird eine magnetische Kupplung 19 verwendet, wobei eines der beweglichen Teile 20 davon auf der Hohlwelle 6 über der Abdeckung 2 angebracht und das andere Teil 21 auf der hohlen Achse 22 angeordnet ist. Die hohle Achse 22 ist koaxial zu der Welle 6 um den beweglichen Teil 20 der Kupplung 19 angeordnet. Der Teil 20 der Kupplung 19 wird z. B. durch eine Riemenübertragung 23 durch den Elektromotor 24 in Rotation versetzt. In dem Bodenteil des Behälters 1 (in 1) ist ein Abzweigrohr 25 für die Zuleitung des Nährbodens und des Impfstoffs angeordnet. Dasselbe Abzweigrohr 25 dient zum Ablassen der Zellsuspension nach dem Beenden des Kultiviervorgangs.
Die vorgeschlagene Vorrichtung arbeitet wie folgt:
Zum Kultivieren hoch-aerober biologischer Objekte (Zellen von Tieren oder Insekten) werden die Schaufeln 12 mit Hilfe der Klemmvorrichtungen 18 auf den Stützen 16 der ringförmigen Trennung 7 mit einem Anstellwinkel von z. B. –35° (1) angebracht oder die Schaufeln 12 werden an den Stützen 16 mit einem Anstellwinkel der Schaufeln 12 von z. B. –25° und die Schaufeln 13 an den Stützen 17 der ringförmigen Trennung 7 mit einem Anstellwinkel der Schaufeln 13 von z. B. –15° (3) angebracht.
Zum Kultivieren schwach-aerober biologischer Objekte (einige Bakterienarten) werden die Schaufeln 12 mit Hilfe der Klemmvorrichtungen 18 auf den Stützen 16 der ringförmigen Trennung mit einem Anstellwinkel von z. B. –16° (1) oder die Schaufeln 12 werden auf den Stützen 16 der ringförmigen Trennung 7 mit einem Anstellwinkel von z. B. –16° angebracht und die Schaufeln 13 werden an den Stützen 17 der ringförmigen Trennung 7 mit einem Anstellwinkel der Schaufeln 13 von z. B. 0° (3) angebracht.
Danach wird der zylindrische Behälter 1 mit der angebrachten ringförmigen Trennung 7 und dem Mechanismus zum Festlegen seiner Position in bezug auf die Flüssigkeitsoberfläche unter sterilen Bedingungen mit dem Nährboden befällt, so dass ein Raum über der Oberfläche des Mediums in dem oberen Teil des Behälters 1 zur Bewegung des Belüftungsgases frei bleibt und die ringförmigen Trennung 7 auf der Oberfläche oder in einer bestimmen Tiefe in dem Nährboden (durch Auswählen der Schwimmfähigkeit der Schwimmkörper 10), die weniger als die optimale Tiefe H = 0,02 ÷ 0,09(D₁ – D₂) ist, angeordnet ist. Die Schaufeln 12 sind in diesem Fall über der Oberfläche der Flüssigkeit angeordnet. Für einen Behälter mit dem Durchmesser D₀ = 200 mm sind die optimalen Parameter der Vorrichtung z. B. wie folgt: D₁ = 160 mm; D₂ = 32 mm H = 8 mm. Ferner wird die zum Kultivieren von Zellen oder Mikroorganismen erforderliche Betriebstemperatur eingestellt, die notwendige Dosis an Impfstoff eingeführt und der Elektromotor 24 eingeschaltet. Die notwendige Umdrehungszahl des Schaufelrades 5 wird abhängig von den Erfordernissen der kultivierungstechnologischen Bedingungen festgelegt. Wenn sich das Schaufelrad 5 über der Oberfläche des Nährbodens mit dem Impfstoff dreht, wird im Bereich nahe der Achse des Behälters 1 eine Luftverdünnung erzeugt und ein erhöhter Druck wird am Umfang des Behälters erzeugt. Unter dem Effekt des Druckunterschiedes zwischen dem Umfang und dem Bereich nahe der Achse des Gasraums wird eine Wirbelströmung des Belüftungsgases über der Flüssigkeitsoberfläche mit dem Gebiet der potentiellen Wirbelgeschwindigkeit an dem Umfang des Behälters 1 und einer axialen Rückströmung in dem Bereich nahe der Achse davon gebildet, die in der Flüssigkeit eine ähnlich turbulente Drehbewegung mit intensivem Rühren entlang der Achse des Behälters erzeugt.
Beim Kultivieren schwach-aerober biologischer Objekte, z. B. einiger Arten von Bakterienzellen, wird die Rotationsgeschwindigkeit des Gaswirbels auf 3 bis 6 m/s festgelegt. In diesem Fall wird eine Luftkraft F₁ (sie entsteht, wenn die Schaufeln 12 durch die Gasströmung umströmt werden) oder eine Luftkraft F₁ und eine hydrodynamische Kraft F₂ (die letztere Kraft entsteht, wenn die Schaufeln 13 durch die Flüssigkeitsströmung umströmt werden) erzeugt oder nur eine hydrodynamische Kraft F₂ wird erzeugt. Die besagten Kräfte F₁ (1) oder F₁ und F₂ (3) oder F₂ (4) tauchen die ringförmige Trennung 7 zusätzlich unter, wobei sie sie in der optimalen Tiefe (H) festlegen, die in dem Bereich der Tiefen H = 0,02 ÷ 0,09(D₁ – D₂) liegt.
Beim Kultivieren hoch-aerober biologischer Objekte z. B. pflanzlichen oder tierischen Zellen wird die Rotationsgeschwindigkeit des Gaswirbels auf größer als 7 bis 10 m/s festgelegt. Bei derartigen Geschwindigkeiten des Gaswirbels wird auf die Trennung 7, die in der rotierenden Flüssigkeitsströmung liegt, nicht nur durch die Kräfte F₁ (1) oder F₁ und F₂ (3) oder F₂ (4), die vertikal nach unten gerichtet sind, sondern auch durch die zusätzliche hydrodynamische Kraft F₃ (aufgrund der Entstehung einer Flüssigkeitsströmung, die von dem Druckunterschied über der Trennung 7 und darunter stammt, bei derartigen Geschwindigkeiten) eingewirkt, wobei die Kraft F₃ vertikal nach oben gerichtet ist und ein Aufschwimmen der Trennung 7 verursacht. Die Kraft F₃ kompensiert teilweise die Wirkung der Kräfte F₁ und F₂ und die ringförmige Trennung 7 verbleibt zuverlässig in ihrer Position in dem Bereich der Tiefe H = 0,02 ÷ 0,09(D₁ – D₂).
Somit erlaubt der Mechanismus zum Festlegen der Position der ringförmigen Trennung 7, sie in einer optimalen Tiefe (H) unabhängig von dem Kultiviermodus oder dem Volumen der Suspension in der Vorrichtung zu halten. Aufgrund der Installation der ringförmigen Trennung 7 in der Suspension wird die Intensität und die Direktivität ihrer aufsteigenden und absteigenden Strömungen erhöht (d. h., die Effizienz des Gaswirbels wird erhöht).
Nach Berechnungen wird bei durchschnittlichen Gasströmungsgeschwindigkeiten über der Oberfläche der Suspension V_gas = 10 m/s, die durchschnittliche Rotationsgeschwindigkeit der Schaufeln 12 zusammen mit der ringförmigen Trennung 7 (D₁ = 160 mm) in bezug auf die Flüssigkeit V_part. = 2,446 m/s und die Kraft F₃ = 0,393 N betragen.
Bei einer Länge der Schaufeln 12 von l₁ = 7,5 cm und der Schaufelsehne h₁ = 2 cm; ihrer Anzahl n₁ = 3; und bei einem Anstellwinkel der Schaufel 12 in bezug auf die Gasströmung von α₁ = –35° folgt eine Kraft F₁ = 0,4873 N. Somit ist bei der Ausführungsform des Mechanismus zum Festlegen der Position der ringförmigen Trennung 7 in bezug auf die Oberfläche der Flüssigkeit, wie sie in 1 dargestellt ist, die Kraft F₁ teilweise durch die Wirkung der Kraft F₃ kompensiert und die Trennung wird zuverlässig in ihrer Position in der Tiefe H verbleiben.
Bei der Länge der Schaufeln 13 von l₂ = 3,0 cm und der Schaufelsehne h₂ = 1,5 cm; der Anzahl der Schaufeln n₂ = 6; dem Anstellwinkel der Schaufeln 13 in bezug auf die Flüssigkeitsströmung α₂ = 0° folgt eine Kraft F₂ = 0,4845 N. Daher wird bei der Ausführungsform des Mechanismus zum Festlegen der Position der ringförmigen Trennung 7 in bezug auf die Flüssigkeitsoberfläche, der in 4 dargestellt ist, die Kraft F₂ teilweise durch die Wirkung der Kraft F₃ kompensiert und die Trennung wird zuverlässig in ihrer Position in der Tiefe H verbleiben. Nebenbei bemerkt, wird die Stabilität der Position der ringförmigen Trennung 7 in der angegebenen Ausführungsform des Mechanismus durch Ändern der Schwimmfähigkeit der Schwimmkörper 10 gestützt.
Die Schwimmkörper 10, die als ungleichseitige Pyramidenstümpfe konfiguriert sind, erlauben ferner die ringförmige Trennung 7 in ihrer optimalen Tiefe zu halten und zwar unabhängig von dem Modus der Kultivierung oder dem Volumen der Zellsuspension in der Vorrichtung, da im Falle, dass die Trennung 7 ein wenig aufschwimmt, sagen wir aufgrund einer Erhöhung in der Geschwindigkeit des Gaswirbels oder in der Dichte der Zellsuspension im Zuge der Kultivierung, die Schwimmfähigkeit der Schwimmkörper 10 abnimmt (aufgrund ihrer spezifischen Form) und die Trennung 7 in ihre Tiefe (H) zurückkehrt.
Das Anordnen der Schwimmkörper 10 in dem Körper der Trennung 7 ( 1) oder das Festlegen eines Zwischenraums zwischen den Schwimmkörpern 10 und der ringförmigen Trennung 7 (3, 4) stellt das Ausschalten von bewegungslosen (Schatten-) Bereichen auf der Seite 9 der Trennung 7 bereit und verhindert ebenfalls das Ausfällen, Ansammeln und Absterben von kultivierten Zellen in diesen Bereichen.
Bei dem Vorgang des Kultivierens von Zellen oder Mikroorganismen wirkt das Belüftungsgas mit der Flüssigkeitsphase durch seine freie Oberfläche über der ringförmigen Trennung 7 zusammen, ohne sich mit der Flüssigkeit zu vermischen. Daher kommen keine Gasblasen in der Zellsuspension vor, so dass die Traumatisierung von Zellen und die Bildung von Schaum ausgeschlossen wird. Bei einer Geschwindigkeit des Gaswirbels von wenigstens im Bereich von 3 bis 30 m/s tritt das Abtrennen von Suspensionstropfen von der Suspensionsoberfläche nicht auf und die Traumatisierung von Zellen kann zusätzlich reduziert werden.
Aufgrund der Verdünnung in dem Bereich der Achse des Schaufelrades 5 wird eine zusätzliche Einströmung des Belüftungsgases in den Behälter 1 durch das Abzweigrohr 3 bewirkt und aufgrund einer Erhöhung des Drucks am Umfang des Gasraumes über der Oberfläche der Suspension wird die Ausströmung des gasförmigen Mediums aus dem Behälter 1 durch das Abzweigrohr 4 bewirkt. Ein optimales Verhältnis der Belüftungsgaskomponenten zum Bereitstellen normaler Bedingungen zum Kultivieren von Zellen oder Mikroorganismen wird erreicht.
Somit machen es die vorgeschlagenen Ausgestaltungsmerkmale der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung mit unterschiedlichen Ausführungsformen für den Mechanismus zum Festlegen der Position der Trennung 7 in bezug auf das Flüssigkeitsmedium möglich, die Bildung einer axial-symmetrischen Rotationsbewegung der Flüssigkeit mit einer axialen Rückströmung in der Zellsuspension ohne bewegungslose Bereiche entweder bei niedrigen Geschwindigkeiten der Gasbewegung (3–6 m/s) oder bei hohen Geschwindigkeiten davon (7–10 m/s oder mehr) über der Oberfläche der Flüssigkeit aufgrund des Aufrechterhaltens der ringförmigen Trennung in der optimalen Tiefe unabhängig von Änderungen in der Intensität des Gaswirbels über der Oberfläche der Zellsuspension zu sichern. Dies wiederum erlaubt das Kultivieren von Gewebezellen oder Mikroorganismen, die gegenüber der mechanischen Traumatisierung empfindlich sind und unterschiedliche Sauerstofferfordernisse aufweisen, sowie eine höhere Konzentration jeglicher Arten von Zellen in der Suspension zu erreichen.
Industrielle Anwendbarkeit
Die Vorrichtung zum Kultivieren von Gewebezellen und Mikroorganismen in einer Suspension kann in der Mikromedizin und Lebensmittelindustrie weitreichend verwendet werden.

Claims

Vorrichtung zum Kultivieren von Gewebezellen oder Mikroorganismen in einer Suspension, umfassend einen zylindrischen Behälter (1) mit einer Abdeckung (2) und entsprechenden Abzweigrohren (3) und (4) zum Zuführen eines Belüftungsgas und Abführen eines gasförmigen Mediums und eine Vorrichtung zum Belüften und Rühren des Mediums, umfassend einem horizontalen Schaufelrad (5), das an einer vertikalen hohlen Welle (6) befestigt ist und in dem oberen Teil des Behälters (1) direkt unter der Abdeckung (2) angeordnet ist, einer ringförmigen Trennung (7), die koaxial zu dem Schaufelrad (5) mit einem Abstand zwischen der Zylinderwand des Behälters (1) und der ringförmigen Trennung (7) in dem zylindrischen Behälter (1) angebracht ist, und einem Mechanismus zum Festlegen der Position der ringförmigen Trennung in Bezug auf die Oberfläche der Zellsuspension, welcher Mechanismus Führungsteile (11) und Schwimmkörper (10) umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass die Führungsteile (11) des Mechanismus zum Festlegen der Position der ringförmigen Trennung (7) in Bezug auf die Oberfläche der Flüssigkeit als abnehmbare Schaufeln (12 und 13) mit einer flachen Oberseite (14) und einer konvexen Unterseite (15) ausgebildet sind, welche Schaufeln (12 und 13) in Bezug auf die ringförmige Trennung (7) radial ausgerichtet sind und wobei die Oberflächen (14) und (15) der Schaufeln (12) und (13) ein aerodynamisches Profil der "forward-sweep wing"-Art bilden; die Schaufeln mit Hilfe von Stützen (16) an der Oberseite (9) der ringförmigen Trennung (7) angebracht sind oder die Schaufeln (12) an der Oberseite (9) der Trennung (7) angebracht sind und die Schaufeln (13) an der Unterseite (8) der Trennung (7) mit Hilfe von Stützen (17) angebracht sind, wobei die Schaufeln (12) und (13) mit Einheiten zum Variieren des Anstellwinkels in bezug auf den einströmenden Gas- oder Flüssigkeitsstrom und zum Sichern der entsprechenden Schaufeln (12) und (13) an den Stützen (16) und (17) auf der ringförmigen Trennung (7) und darunter ausgestattet sind.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Einheiten zum Variieren des Anstellwinkels der Schaufeln (12) und (13) in Bezug auf den einströmenden Gas- oder Flüssigkeitsstrom und zum Sichern der entsprechenden Schaufeln (12) an den Stützen (16) auf der ringförmigen Trennung (7) und der Schaufeln (13) an den Stützen (17) unter der Trennung (7) als Klemmvorrichtungen (18) ausgebildet sind.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass wenn die Schaufeln (12) auf der ringförmigen Trennung (7) oberhalb der Oberfläche der Zellsuspension angeordnet sind, der Anstellwinkel der Schaufeln in Bezug auf den einströmenden Gasstrom zwischen –15° bis –90° liegt und, dass wenn die Schaufeln (13) in der Flüssigkeit unter der ringförmigen Trennung (7) angeordnet sind, der Anstellwinkel der Schaufel (13) in Bezug auf den einströmenden Flüssigkeitsstrom zwischen 0° und –35° liegt.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Schwimmkörper (10) des Mechanismus zum Festlegen der Position der ringförmigen Trennung (7) in Bezug auf die Oberfläche der Flüssigkeitsphase in dem Körper dieser Trennung (7) angeordnet sind oder als abgestumpfte ungleichseitige Pyramiden geformt sind, die mit den abgestumpften Scheiteln in Richtung der ringförmigen Trennung (7) ausgerichtet und an den Stützen (16) zwischen den Schaufeln (12) und der Trennung (7) in einem Abstand in Bezug auf die ringförmige Trennung und die Schaufeln (12) befestigt sind.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die ringförmige Trennung (7) in die Suspension bis zu einer Tiefe (H) gleich H = 0,02 ÷ 0,09(D₁ – D₂), eintaucht, wobei D₁ der Durchmesser der ringförmigen Trennung ist; und D₂ der Durchmesser der Axialöffnung in der ringförmigen Trennung ist.