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Die Erfindung betrifft die Präparation
und Verwendung dünner,
photobleichbarer Lumineszenzschichten zur Kalibrierung und Standardisierung
optischer Abbildungsvorrichtungen, wie z. B. optische oder Raman-Mikroskope.
Für die
quantitative Anwendung von optischer und Raman-Mikroskopie ist es
essentiell, dass die Intensitäten
in den Bildern, die mit diesen Mikroskopietechniken aufgenommen
werden, nur durch die räumliche
Verteilung der Konzentrations-, Absorptions- und Emissions-Charakteristika
der Leuchtstoffe in der in Untersuchung befindlichen Probe bestimmt
sind. Wenn dies nicht möglich ist,
sollten die Bildintensitäten
zumindest proportional zu diesen Parametern sein. Im allgemeinen
sind jedoch Variationen der Bildintensitäten nicht nur durch die Probe
bestimmt, sondern auch durch räumliche Inhomogenitäten des
optischen Systems des Mikroskops über das Betrachtungsfeld, so
dass nur qualitative Untersuchungen durchgeführt werden können. Um
die für
eine quantitative Mikroskopie erforderlichen Bilder realisieren
zu können,
muss das Mikroskop kalibriert und standardisiert werden. Die so
erhaltenen Bilder ermöglichen
den Vergleich unterschiedlicher Proben, die an demselben Mikroskop
erhalten wurden, auch zu einem unterschiedlichen Zeitpunkt, oder
den Vergleich von an unterschiedlichen Mikroskopen erhaltenen Bilder,
vorausgesetzt, dass die unterschiedlichen Mikroskope auf die gleiche
Weise kalibriert worden sind.
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In einer früheren Arbeit wurde eine Kalibrierung
und Standardisierung eines optischen Mikroskops mittels eines Ansatzes
unter Verwendung von Bildern einer gleichförmigen Lumineszenzschicht versucht
(K. R. Castleman, Digital Image Processing. Prentice-Hal1, Englewood
Cliffs, New Jersey, 1979, and Z. Jericevic, B. Wiese, J. Brayan & L. C. Smith, "Validation of an
Image System", in
Luminescence Microscopy of Living Cells in Culture, Part B, Quantitative
Luminescence Microscopy Imaging and Spectroscopy, herausgegeben
von D. Lansing Taylor and Y. Wang, Academic Press, San Diego, Kalifornien, 1989).
Ein solcher Ansatz weist drei Nachteile auf. Erstens wird, im Falle
eines Bildes einer Lumineszenzschicht, das Produkt der Beleuchtungs-
und Nachweiseffizienzverteilungen gemessen, und es ist keine Information über die
separaten Verteilungen zugänglich.
Zweitens sind vollständig
gleichförmige Lumineszenzschichten
schwierig zu erhalten. Drittens werden die Ergebnisse der Kalibrierung
und Standardisierung auf Basis dieses Ansatzes durch Lumineszenz-Photobleichung
der Schicht beeinflusst. Für
eine generelle Kalibrierung und Standardisierung in optischer Mikroskopie
wäre es
bevorzugt, einen Ansatz zu haben, welcher diese Nachteile nicht aufweist.
Jericevic et al. (Z. Jericevic, 8. Wiese, J. Brayan & L. C. Smith, "Validation of an
Image System" in
Fluorescence Microscopy of Living Cells in Culture, Part B, Quantitative
Fluorescence Microscopy-Imaging
and Spectroscopy, herausgegeben von D. Lansing Taylor and Y. Wang,
Academic Press, San Diego, Kalifornien, 1989) haben versucht, den
ersten Nachteil zu beseitigen, indem sie Lumineszenz-Photobleichungs-Techniken
für die
Bestimmung von ausschließlich
der Beleuchtungsverteilung verwendeten. In diesem Verfahren waren
wenigstens 20 Bilder einer gleichförmigen Photobleichungs-Lumineszenzschicht
erforderlich. Sie zeigten, dass es mittels numerischem Anfitten
der Lumineszenzintensitätsabnahme
in jedem Pixel des ersten Bildes mit einer Exponentialfunktion möglich war,
nur die Anregungsintensitätsverteilung
in dem Betrachtungsfeld des verwendeten Mikroskops zu bestimmen
(Z. Jericevic, D. M.
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Benson, J. Bryan, & L. C. Smith, "Rigorous Convergence
Algorithm for Fitting a Monoexponential Function with a Background
Term Using the Least-Squares Method," Anal. Chem., 59 (1987), 658–662). Es
existieren einige Nachteile bei diesem Verfahren und dem experimentellen
Ansatz. Erstens muss eine Lumineszenzschicht präpariert werden, indem eine
FITC-IgG-Mischung
auf einem Objektträger
ausgebreitet wird. Mittels einer solchen Prozedur ist es sehr schwierig,
eine gleichförmige
Lumineszenzschicht zu erhalten. Zweitens liefert das Verfahren nur
die Beleuchtungsverteilung; es wird keine Information über die
Nachweisverteilung erhalten. Drittens basiert die Bestimmung der
Beleuchtungsverteilung auf numerischen Anfittungs-Routinen, was
das Verfahren relativ langsam macht.
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Diese Erfindung beschreibt die Präparation und
Verwendung dünner,
photobleichbarer Lumineszenzschichten für die Kalibrierung und Standardisierung
eines optischen oder Raman-Mikroskops
in dem Wellenlängenbereich
von 250 nm–1700
nm, vorzugsweise 250 nm–1100
nm, und bevorzugter 350 nm bis 900 nm.
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Dies wird gemäß der Erfindung mittels Präparation
einer photobleichbaren Lumineszenzkalibrierungsschicht und deren
nachfolgender Verwendung für
die Bestimmung der Rnregungsintensitäts- und Nachweiseffizienzverteilungen
im Betrachtungsfeld des verwendeten Mikroskops erreicht. Der Begriff
Photobleichung umfasst sämtliche
Prozesse, welche zur Reduzierung der Intensität des bei der Wellenlänge der
Anregung erzeugten Lumineszenzlichtes führen. Die Anregung kann mittels
eines Lasers oder mittels einer fokussierten Lichtquelle in den oben
definierten Wellenlängenbereichen
durchgeführt
werden. Beispiele solcher Prozesse sind Photoxidations-, Photoreduktions-,
Photoisomerisierungs- oder Photoadditionsreaktionen, oder lichtinduzierte Elektronentransferprozesse.
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Es ist für die Effektivität der Erfindung
ausreichend, dass die präparierte
Kalibrierungsschicht näherungsweise
gleichförmig,
lumineszierend und photobleichbar ist, vorzugsweise näherungsweise gleichförmig, lumineszierend
und mono-exponentiell photobleichbar in einem bestimmten Bereich.
Die Kalibrierungsschicht sollte die folgenden Anforderungen erfüllen.
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- (i) Die Lumineszenzintensität des Leuchtstoffs in der Kalibrierungsschicht
sollte proportional zu der Anregungsintensität, der Leuchtstoffkonzentration
und der Beleuchtungsdauer sein.
- (ii) Die Photobleichrate des Leuchtstoffs in der Kalibrierungsschicht
sollte proportional zur Beleuchtungsintensität und unabhängig von der Leuchtstoffkonzentration
sein.
- (iii) Die Lumineszenzquantenausbeute, der Absorptionsquerschnitt
und der Bleichfaktor definiert als Verhältnis der Photobleichrate zur
Anregungsintensität – des Leuchtstoffs
in der Kalibrierungsschicht sollten unabhängig von der Mikroumgebung
innerhalb der Schicht sein.
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Die ersten beiden Anforderungen reichen bereits
zur qualitativen Kalibrierung der Messung aus. Die dritte Anforderung
in Kombination mit den ersten beiden ermöglicht absolute Messungen eines Bildes
in optischer- oder Raman-Mikroskopie.
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Die Kalibrierungsschicht wird auf
ein optisch ebenes und transparentes Substrat mittels Spin-Coating,
Tauchbeschichtung ("Dip-Coating") oder Stabbeschichtung
(= "Rod-Coating", "doctor blading" = Abstreichbeschichtung") einer vorzugsweise
1–30 Gew.%-igen
Lösung
eines optisch transparenten Polymers aufgebracht, welches eine bestimmte
Menge eines photobleichbaren Lumineszenzmaterials auf solche Weise
aufweist, dass der endgültige
Polymerfilm weniger als 10 Gew.% Leuchtstoff aufweist und eine optische
Dämpfung
von weniger als 0,3 Absorptionseinheiten in dem Wellenlängenbereich
von Interesse ("wavelength
region of interest")
aufweist, oder eine Lösung
eines Seitenketten-Polymers
mit einer bestimmten Menge von daran kovalent gebundenen photobleichbaren
Lumineszenzgruppen auf solche Weise, dass der relative molare Anteil
der Seitenketten geringer als 10% und die optische Dämpfung der Kalibrierungsschicht
geringer als 0,3 Absorptionseinheiten in dem Wellenlängenbereich
von Interesse ist. Der verwendbare Konzentrationsbereich wird durch die
Notwendigkeit bestimmt, intermolekulare Wechselwirkungen (Energietransfer)
und innere Filter- und Konzentrationsquencheffekte zu vermeiden,
welche zu Abweichungen von der einfachen mono-exponentiellen Abnahme
führen
können.
Eine optische Dämpfung
von mehr als 0,3 Absorptionseinheiten ist möglich, aber es sind mathematische
Korrekturen erforderlich. Eine solche Dämpfung ist daher weniger bevorzugt.
Geeignete polymere Materialien, welche über den Wellenlängenbereich
von Interesse transparent sind, sind Polyacrylate, Polymethacrylate,
Polycarbonate, Polyolefine, Polyetter, Polyurethane, Polyetherketone,
Polyester, Polystyrene, Polysiloxane und dergleichen, oder Copolymere
hiervon. Geeignete polymere Seitenkettenmaterialien basieren auf
den gleichen optisch transparenten Bausteinen, die in den oben erwähnten transparenten
Polymerarten angewandt werden, und einem geeigneten lumineszierenden
und photobleichbaren Molekül,
welches eine funktionelle Gruppe aufweist, so dass es entweder an
dem Polymer gebunden werden kann oder mit anderen funktionellen
Monomeren reagieren kann, um ein lumineszierendes Seitenketten-Hauptkettenpolymer
zu bilden. Alternativ können
dünne Schichten
präpariert
werden, indem von Sol-Gel-Glasbildungsansätzen Gebrauch gemacht wird.
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Das verwendete Lumineszenzmaterial
sollte photobleichbar sein, was bedeutet, dass die Intensität der Lumineszenz
durch die Beleuchtung in dem Mikroskop bei der angewendeten Anregungswellenlänge reduziert
werden sollte. Eine Anzahl von lichtinduzierten Prozessen kann zu
einer solchen Photobleichung führen;
einige Beispiele sind Photooxidations-Photoreduktions-, Photoisomerisierungs-
oder Photoadditionsreaktionen, oder lichtinduzierte Elektronentransferprozesse.
Alle lumineszierenden photochromatischen Materialien können verwendet
werden. Das photobleichbare Lumineszenzmaterial kann einer solchen
Umwandlung entweder reversibel oder irreversibel unterzogen werden.
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In Anbetracht der exzellenten Homogenität der Lumineszenzschichten,
die gemäß der oben
erwähnten
Prozedur erhalten werden, kann sogar die direkte Lumineszenzintensität zur Kalibrierung
verwendet werden.
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Mit der präparierten Kalibrierungsschicht können absolute
Anregungsintensitäts-
und Nachweiseffizienzverteilungen in dem Betrachtungsfeld des verwendeten
Mikroskops von Bildern vor oder nach einer partiellen Photobleichung
der Kalibrierungsschicht und die Lumineszenzquantenausbeute, der
Absorptionsquerschnitt und der Bleichfaktor des Leuchtstoffs in
der Kalibrierungsschicht wie folgt bestimmt werden.
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Wenn die Lumineszenzintensität der Kalibrierungsschicht
proportional zur Anregungsintensität, der Leuchtstoffkonzentration
und der Beleuchtungsdauer ist, wenn ihre Photobleichung mono-exponentiell
ist und wenn ihre Photobleichrate proportional zur Anregungsintensität und unabhängig von
der Leuchtstoffkonzentration ist, kann ein Bild der Schicht, das
aufgenommen wird, bevor jegliche Photobleichung stattgefunden hat
und welches nachfolgend als "erstes
Bild" bezeichnet
wird, als Produkt der Bildbelichtungszeit, der Lumineszenzquantenausbeute,
des Absorptionsquerschnitts, der Bleichfaktors und der Konzentrationsverteilung
des Leuchtstoffs in der Kalibrierungsschicht und der Anregungsintensitäts- und
Nachweiseffizienzverteilungen des verwendeten Mikroskops beschrieben
werden. Die Nachweiseffizienz beinhaltet sämtliche Elemente des Nachweisweges,
die für
die Umwandlung der nachzuweisenden Intensität bis zu dem Intensitätswert eines
Pixels in dem endgültigen
Bild wichtig sind, wie etwa den Sammelbegrenzungs-Raumwinkel ("finite collection
solid angle") der
Objektivlinse, das Reflexionsvermögen und den Transmissionsgrad
der optischen Elmente in dem Nachweisweg, und die Quantenausbeute
des Detektors. Ein Bild, welches nachfolgend als "zweites Bild" bezeichnet wird,
das aufgenommen wird, nachdem die Kalibrierungsschicht während eines
bestimmten Zeitintervalls gebleicht worden ist, kann als das Produkt
aus dem ersten Bild und einer Exponentialfunktion geschrieben werden, welche
durch den Bleichfaktor, die Anregungsintensität und das Bleichzeitintervall
bestimmt wird.
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Basierend auf diesen beiden Bildern
kann die relative Anregungsintensitätsverteilung – oder eine
Verteilung, die proportional zur Anregungsintensitätsverteilung
ist – in
dem Betrachtungsfeld des verwendeten Mikroskops bestimmt werden,
indem der Logarithmus des Verhältnisses
zwischen dem ersten und dem zweiten Bild der Kalibrierungsschicht
berechnet wird. Die absolute Anregungsintensitätsverteilung kann bestimmt
werden, indem das Verhältnis der
relativen Anregungsintensitätsverteilung
und des Bleichfaktors des Leuchtstoffs in der Kalibrierungsschicht
zu dem Bleichzeitintervall berechnet wird. Es ist wichtig, darauf
hinzuweisen, dass es für
die Bestimmung dieser – relativen
oder absoluten – Anregungsintensitätsverteilung
nicht erforderlich ist, dass die Kalibrierungsschicht gleichförmig ist.
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Sobald die relative Anregungsintensitätsverteilung
bestimmt worden ist, kann die relative Nachweiseffizienzverteilung
oder eine Verteilung, die proportional zur Nachweiseffizienzverteilung
ist – wie folgt
bestimmt werden. Als erstes wird eine Verteilung, welche proportional
zu dem Produkt der Nachweiseffizienz- und Leuchtstoffkonzentrationsverteilung
ist und die nachfolgend als "Produktverteilung" bezeichnet wird,
bestimmt, indem das Verhältnis
des ersten Bildes zur relativen Anregungsintensitätsverteilung
berechnet wird. Als zweites wird eine Anzahl von Produktverteilungen
aus der gleichen Anzahl von Bildpaaren, erster und zweiter Bilder,
bestimmt, wobei jedes Bildpaar von einem anderen Teil der Kalibrierungsschicht
aufgenommen wird. Mittels Mittelwertbildung aus diesen unterschiedlichen
Produktverteilungen kann der Beitrag möglicher Inhomogenitäten der
Leuchtstoffkonzentrations-Verteilung eliminiert werden, und es wird
eine Verteilung erhalten, die ausschließlich zu der Nachweiseffizienzverteilung
proportional ist, d. h. die relative Nachweiseffizienzverteilung.
Die Anzahl von Produktverteilungen, die zur Mittelwertbildung erforderlich
ist, hängt
von der Gleichförmigkeit
der Kalibrierungsschicht ab: Für gleichförmige Schichten
ist keine Mittelwertbildung erforderlich, allerdings sollte die
Anzahl unterschiedlicher Produktverteilungen um so größer sein,
je weniger gleichförmig
die Schicht ist. Für
viele Anwendungen ist die Bestimmung relativer Verteilungen bereits
ausreichend.
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Wenn die direkte Lumineszenzintensität verwendet
wird, können
die Anregungsintensitätsverteilung
und die Nachweiseffizienzverteilung nicht separat bestimmt werden.
Für viele
Anwendungen, z. B. Shading-Korrektur-Prozeduren, ist es ausreichend, das
Produkt der Intensitätsverteilungen
für Kalibrierungszwecke
zu verwenden.
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Die absolute Nachweiseffizienzeffizienzverteilung
kann bestimmt werden, indem das Produkt aus der relativen Nachweiseffizienzverteilung,
dem Bleichfaktor des Leuchtstoffs in der Kalibrierungsschicht und
dem Bleichzeitintervall berechnet wird, und das Ergebnis durch die
Bildbelichtungszeit und die Lumineszenzquantenausbeute, den Absorptionsquerschnitt
und die mittlere Leuchtstoffkonzentration des Leuchtstoffs in der
Kalibrierungsschicht dividiert wird. Die Parameter, deren Kenntnis
für eine
absolute Bestimmung der Anregungsintensitäts- und Nachweiseffizienzverteilungen erforderlich
ist, sind der Absorptionsquerschnitt, die Lumineszenzquantenausbeute
und der Bleichfaktor der Kalibrierungsschicht. Alle drei Parameter
können
unabhängig
von dem verwendeten Mikroskop bestimmt werden.
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Der Absorptionsquerschnitt der Kalibrierungsschicht
bei einer bestimmten Wellenlänge
kann bestimmt werden, indem die optische Dämpfung bei der gleichen Wellenlänge bestimmt
wird, und diese Information mit der Dicke der Schicht und ihrer Leuchtstoffkonzentration
kombiniert wird.
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Die Lumineszenzquantenausbeute der
Kalibrierungsschicht kann mittels Vergleichs der Lumineszenz der
Kalibrierungsschicht mit der Lumineszenz einer Referenzschicht,
deren Lumineszenzquantenausbeute bekannt ist, bestimmt werden.
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Der Bleichfaktor der Kalibrierungsschicht kann
bestimmt werden, indem die relative Abnahme der Lumineszenzintensität nach der
Beleuchtung mit einer bekannten Anregungsdosis, d. h. Energie pro Flächeneinheit,
gemessen wird.
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Bei bekannten Anregungsintensitäts- und Nachweiseffizienzverteilungen
sind eine Anzahl von Kalibrierungs- und Standardisierungsschritten
in der optischen Mikroskopie verfügbar.
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- (i) Das Verfahren kann angewandt werden, um
die Anregungsintensitäts-
und Nachweiseffizienzverteilungen unterschiedlicher Mikroskope,
oder die der gleichen Mikroskope zu unterschiedlichen Zeitpunkten
zu vergleichen. Unterschiede zwischen der Gesamtleistung von Mikroskopen
können
auf den Anregungsweg, den Nachweisweg oder beide zurückzuführen sein.
Eine solche Information kann verwendet werden, um selektiv den Weg
zu optimieren, welcher den Leistungsgrad begrenzt. Eine andere Möglichkeit
besteht darin, die Beleuchtungs- und Nachweisparameter unterschiedlicher
Mikroskope so einzustellen, dass sich gleiche – oder zumindest vergleichbare – Anregungs-
und Nachweisbedingungen ergeben. Dies erleichtert den Vergleich
von Messungen, in denen eine (Art von) Probe entweder mit unterschiedlichen
Mikroskopen, oder mit dem gleichen Mikroskop zu unterschiedlichen
Zeitpunkten, untersucht wird.
- (ii) Die Anregungsintensitätsverteilung
ist wichtig bei der Interpretation von Intensitätsvariationen in Bildern, die
mittels sogenannter Lumineszenzbleichratenabbildung erhalten wurden.
(G. J. Brakenhoff, K. Visscher & G.
Gijsbers, "Luminescence
Bleach rate Imaging," J.
Microsc., 175 (1994), 154–161).
In diesem Abbildungsmodus wird die lokale Photobleichrate statt
der Lumineszenzintensität
als Kontrastparameter für
die Bilderzeugung verwendet. Räumliche
Inhomogenitäten
der Anregungsintensitätsverteilung
führen zu
deutlichen – Variationen
der gemessenen Photobleichrate. Bei Verfügbarkeit einer experimentell bestimmten
Anregungsintensitätsverteilung
können
diese deutlichen Variationen korrigiert werden.
- (iii) Das Verfahren kann zur Korrektur von Intensitätsvariationen
in einem Bild einer in Untersuchung befindlichen Probe verwendet
werden, welche durch Inhomogenitäten
des optischen Systems des Mikroskops verursacht werden, eine Prozedur,
die als "Shading-Korrektur" bezeichnet wird.
In dem einfachen Falle einer lumineszierend gekennzeichneten Probe,
deren nachgewiesene Lumineszenzintensität proportional sowohl zur Anregungsintensität als auch
zur Nachweiseffizienz ist, wird die Shading-Korrektur ausgeführt, indem
das Verhältnis
aus dem Bild der in Untersuchung befindlichen Probe und dem Produkt
der – relativen
oder absoluten – Anregungsintensitäts- und Nachweiseffizienzverteilungen
berechnet wird. Die Tatsache, dass bei diesem Verfahren die Anregungsintensitäts- und
Nachweiseffizienzverteilungen separat verfügbar sind, impliziert, dass auch
in komplizierteren Proben, beispielsweise Proben, in welchen lichtlineare
Abhängigkeiten auftreten,
eine Shading-Korrektur möglich
ist.
- (iv) Das Verfahren kann zur quantitativen Untersuchung von Proben
angewandt werden. Die Intensitätsvariationen
in einem shadingkorrigierten Bild einer Probe sind von dem zur Erzeugung
des Bildes verwendeten Mikroskop unabhängig und werden nur durch probenbezogene
Faktoren bestimmt, wie etwa die Konzentrationen von Leuchtstoffen
in der Probe und deren Absorptions- und Emissionscharakteristika.
Wenn Shading-Korrektur auf absoluten Anregungsintensitäts- und Nachweiseffizienzverteilungen
beruht, können
die Intensitäten
in dem shading-korrigierten Hild einer Probe verwendet werden, um
diese probenbezogenen Faktoren quantitativ zu bestimmen. Beispielsweise
können,
wenn ein Leuchtstoff verfügbar
ist, der zur lumineszierenden Kennzeichnung einer Probe verwendet
werden kann, und wenn die Lumineszenzquantenausbeute und der Absorptionsquerschnitt
dieses Leuchtstoffs bekannt sind und von der Mikroumgebung innerhalb
der Probe unabhängig
sind, die Intensitäten
in dem shading-korrigierten Bild verwendet werden, um die Konzentration
dieses Leuchtstoffs in der Probe auf mikroskopischer Ebene quantitativ
zu bestimmen.
- (v) Die Anregungsintensitäts-
und Nachweiseffizienzverteilungen können zur aktiven Bildkorrektur verwendet
werden, indem Beleuchtungs- und Nachweisparameter während der
Bilderfassung auf solche Weise moduliert werden, dass sich eine
räumlich
gleichförmige
Beleuchtung und Nachweiseffizienz ergibt. Diese Möglichkeit
ist wichtig für
bleichratenabbildende, photoaktivierbare Prozesse, Bewertung der
biologischen Zellschädigung
etc.
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Beispiele
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Um die Anwendbarkeit der Erfindung
zu demonstrieren, wurde eine lumineszierende und photobleichbare
Kalibrierungsschicht präpariert
und zur Shading-Korrektur von Bildern verwendet, die mittels eines
konfokalen Lumineszenzmikroskops aufgenommen wurden. Die lumineszierende
und photobleichbare Kalibrierungsschicht basierte auf dem Leuchtstoff
4-Dimethylamin-4'-Nitrostilben (DANS). Lösungen aus
DANS und Polymethylmethacrylat (PMMA) in Chloroform wurden präpariert
und zum Spin-Coating von Standardglas-Deckgläschen verwendet, die zur optischen
Mikroskopie verwendet werden. Zur Untersuchung des Einflusses der Leuchtstoffkonzentration
auf die Lumineszenzintensität
und die Photobleichrate wurden drei Kalibrierungsschichten mit relativen
Konzentrationen von 0.2, 0.5 und 1.0 präpariert. DANS in PMMA kann
im Wellenlängenbereich < 250 nm bis 550
nm angeregt werden; es fluoresziert im Wellenlängebereich 500–850 nm.
Bei Bestrahlung findet eine Photobleichung des Fluorophors statt,
hauptsächlich
aufgrund von Photooxidation.
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Das für diese Demonstration verwendete
Mikroskop war ein Olympus IMT-2 Inversionsmikroskop (Olympus Corporation,
Lake Success, NY, USA), welches mit einer bilateralen konfokalen
INSIGHT-PLUS Zeilenabtasteinheit (Meridian Instruments Inc., Okemos,
MI, USA) und einer 100x, NA = 1.32, Ölimmersionsobjektivlinse ausgestattet
war. Lumineszenz wurde bei 488 nm unter Verwendung eines luftgekühlten Argon-Ionenlasers (Modell
532, Omnichrome, Chino, CA, USA) angeregt. Die Anregungsintensität konnte
variiert werden, indem neutrale Dichtefilter (NDFs) in dem Laserausgangsweg
des Mikroskops eingesetzt wurden. Insgesamt vier NDFs waren verfügbar, mit
einem Transmissionsgrad, welcher von 1% bis 50% reichte. Die erzeugte
Lumineszenz wurde mit einer gekühlten
CCD-Kamera (Model DDE/3200, Astromed, Cambridge, GB) über einen Hochpassfilter
mit einer Grenzwellenlänge
bei 520 nm nachgewiesen. Eine Hewlett-Packard-Workstation, Modell
725/50, (Hewlett-Packard, Palo Alto, CA, USA) wurde zur Bildaufnahme-
und Belichtungssteuerung über
einen mechanischen Lasershutter verwendet. Die Bildanalyse wurde
auf der gleichen Workstation unter Verwendung des Bildverarbeitungspakets
Scillmage (T. K. Ten Kate, R. van Balen, A. W. M. Smeulders, F.
C. A. Groen & G.
A. de Boer, "SCILIAM,
a Multi-level Interactive Image Processing Environment," Pattern Recognition
Leiters, 11 (1990), 429– 441)
durchgeführt.
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Zur Untersuchung der Photobleichungs-Charakteristika
der Kalibrierungsschicht wurden sogenannte "Bleichkurven" bestimmt, indem eine Serie von Bildern – eine Zeitserie – von einem bestimmten
Teil der Kalibrierungsschicht aufgenommen wurde. Die Bildbelichtungszeit
war für
sämtliche Bilder
in der Zeitserie gleich, und es trat keine zusätzliche Belichtung zwischen
aufeinanderfolgenden Bildern auf. von jeder Zeitserie wurden zwei
Größen bestimmt:
die mittlere Anfangslumineszenzintensität und die mittlere Bleichrate.
Die mittlere Anfangslumineszenzintensität wurde berechnet, indem die
Intensitäten
des ersten Bildes der Zeitserie Bemittelt wurden. Die mittlere Bleichrate
sollte Idealerweise bestimmt werden, indem die Bleichraten Bemittelt
werden, die für
jedes Pixel in dem ersten Bild der Zeitserie für eine Anzahl von "Bereichen von Interesse" (ROIs = "regions of interest") berechnet werden,
welche in dem Bild willkürlich
ausgewählt
wurden. Die Daten für
jeden individuellen ROI wurden mit einer (Mono-)Exponentialfunktion
angefittet. Die mittlere Bleichrate wurde als Mittelwert der individuellen ROI-Bleichraten erhalten.
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Für
die Lumineszenzschicht wurde verifiziert, dass die Lumineszenz-
und Photobleich-Charakteristika den Anforderungen des Verfahrens
entsprechen, d. h., dass die Lumineszenzintensität in dem ersten Bild der Kalibrierungsschicht – oder die Anfangslumineszenzintensität – proportional
zur Anregungsintensität,
der Leuchtstoffkonzentration und der Bildbelichtungszeit sein sollte,
ihre Photobleichung mono-exponentiell sein sollte und ihre Photobleichrate
proportional zur Anregungsintensität und unabhängig von der Leuchtstoffkonzentration
sein sollte.
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Es wurde herausgefunden, dass die
Bedingungen für
die Lumineszenzcharakteristika durch die vorgeschlagene Kalibrierungsschicht
erfüllt
werden. Die Photobleichung der Kalibrierungsschicht war anfänglich nicht
streng monoexponentiell; allerdings konnte eine nahezu monoexponentielle
Photobleichung der Kalibrierungsschicht mittels einer "Vor-Bleichung" der Schicht realisiert
werden. Die Daten, die nach 180-sekündiger Vorbleichung erhalten
wurden, wurden verwendet, um die "Rate der Photobleichung" zu berechnen, welche
sich als proportional zur Anregungsintensität und unabhängig von der Leuchtstoffkonzentration
in der Schicht erwies. Daher werden, nach geeigneter Vorbleichung, die
Anforderungen für
die Photobleichcharakteristika durch die präparierte Kalibrierungsschicht
erfüllt.
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Die Anregungsintensitätsverteilung
kann aus zwei Bildern der Kalibrierungsschicht bestimmt werden,
welche durch ein Zeitintervall voneinander getrennt sind, in welchem
die Kalibrierungsschicht partiell gebleicht wird. Um die relative
Anregungsintensitätsverteilung
zu berechnen, wurden das erste und das zweite Bild mit einer Vorbleichzeit
von 180 Sekunden und einem Bleichzeitintervall von 150 Sekunden
aufgenommen, da in diesem Zeitintervall die Abnahme der Lumineszenzintensität gut durch
eine Mono-Exponentialfunktion beschrieben wird. In diesen Bildern
ist ein streifen- und punktartiges Muster zu erkennen, welches unabhängig von
dem Teil der Kalibrierungsschicht ist, von welchem die Bilder aufgenommen
wurden. Dies weist darauf hin, dass das streifen- und punktartige Muster durch Inhomogenitäten des
optischen Systems des Mikroskops verursacht wird. Eine Überprüfung zeigt,
dass die Anregungsintensität
nicht gleichförmig über der
Bildregion verteilt ist, sondern dass ein streifenartiges Muster auftritt.
Es wurde herausgefunden, dass dieses Muster durch den dichroischen
Spiegel in dem Mikroskop verursacht wird. Die relative Größe der Variationen
in der Anregungsintensität über dem
Bildbereich kann als Variationskoeffizient (CF = "coefficient of variation") – das Verhältnis der
Standardabweichung zum Mittelwert ausgedrückt werden. Die Messung zeigt, dass
in der relativen – und
absoluten- Anregungsintensitätsverteilung
Variationen von etwa 10% über die
Bildregion auftreten. Der CF ist ein Maß für die Variation über das
gesamte Bild. Es ist darauf hinzuweisen, dass lokal wesentlich größere Variationen auftreten
können.
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Die Nachweiseffizienzverteilung kann
auch aus zwei Bildern – dem
ersten und dem zweiten Bild – der
Kalibrierungsschicht bestimmt werden. Die relative Nachweiseffizienzverteilung
wird aus der Produktverteilung bestimmt, welche proportional zu
dem Produkt der Nachweiseffizienz- und der Leuchtstoffkonzentrationsverteilung
ist. Die Produktverteilung wird anhand des ersten Bildes der Kalibrierungsschicht
und der bereits bestimmten relativen Anregungsintensitätsverteilung
bestimmt. Mittels Berechnung der Produktverteilung aus verschiedenen,
zufällig
ausgewählten
Teilen der Kalibrierungsschicht und Mittelwertbildung der Ergebnisse
wird die relative Nachweiseffizienzverteilung erhalten. Mittels
Mittelwertbildung über
eine Anzahl von Produktverteilungen, die an unterschiedlichen Teilen
der Kalibrierungsschicht gemessen wurden, wird die relative Nachweiseffizienzverteilung
erhalten. Wie bereits erwähnt
wurde, wird dieses streifenartige Muster durch den dichroischen
Spiegel in dem Mikroskop verursacht, und da dieser Spiegel Teil
sowohl des Anregungs- als auch des Nachweisweges ist, ist das gleiche
Muster in der relativen Anregungsintensitäts- und der Nachweiseffizienzverteilung
sichtbar. Ebenfalls sichtbar sind dunkle Punkte, die in den relativen Anregungsintensitätsverteilungen
nicht sichtbar sind. Diese sind vermutlich durch kleine Staubpartikel
oder andere Unregelmäßigkeiten
in dem Nachweisweg des Mikroskops verursacht. Die relative Größe der Variationen
in der Nachweiseffizienz kann abgeschätzt werden, indem wiederum
der CV als Maß für die Variationen
genommen wird. Variationen von etwa 25% traten in den relativen – und absoluten – Nachweiseffizienzverteilungen
auf. Wiederum können
die Variationen lokal viel größer sein.
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Bei bekannter relativer Anregungsintensitäts- und
Nachweiseffizienzverteilung kann eine Shading-Korrektur eines Bildes
einer Probe durchgeführt
werden, indem das Verhältnis
des Bildes der Probe zu dem Produkt der relativen Anregungsintensitäts- und
der Nachweiseffizienzverteilung berechnet wird.
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Ein Vergleich vor und nach der Korrektur zeigt
eine deutliche Abnahme der Intensitätsvariationen. Auch ist sichtbar,
dass ein Merkmal der Kalibrierungsschicht – die absichtlich photogebleichte
linienförmige
Region – nach
der Korrekturprozedur gut erhalten war, wohingegen die Intensitätsvariationen, welche
durch die Inhomogenitäten
des optischen Systems verursacht sind, verschwunden waren. Ein davon
verschiedener Weg besteht darin, den Effekt der Shading-Korrektur
zu visualisieren, in welchem Falle die Intensitäten vor und nach der Korrektur
aufgetragen werden. Hieraus wird deutlich, dass die Intensitätsvariationen
nach der Korrektur signifikant kleiner als vor der Korrektur sind.
Der Effekt der Shading-Korrektur wurde quantitativ bestimmt, indem
der CV der Intensitäten
in den Bildern berechnet wurde. Die Resultate zeigen CVs von etwa
22% und 4% vor bzw. nach der Korrektur. Dies bedeutet, dass die
Prozedur der Shading-Korrektur
eine mehr als 5-fache Abnahme der Intensitätsvariationen ergab. Lokal
wird die Abnahme der Bildintensitätsvariationen offensichtlich
viel größer sein.