DE69814307T2 - 18Beta, 19 Beta-diacetyloxy-18alpha-19alpha-epoxy-3,13(16), 14 clerodatrien-2-one (Esculentin A) et 18Beta, 19Beta-diacetyloxy-18alpha-19alpha-epoxy-3, 12, 14-clerodatrien-2beta-isovaleryloxy-16Beta-7alpha-diol (Esculentin B). Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung für die Bereitstellung von Arzneimitteln - Google Patents

Description

• Diese Erfindung bezieht sich auf die Verbindungen 18β,19β-Diacetyloxy-18α,19α-epoxy-3,13(16),14-clerodatrien-2-on (Esculentin A) und 18β,19β-Diacetyloxy-18α,19α-epoxy-3,12,14-clerodatrien-2β-isovaleryloxy-6β,7α-diol (Esculentin B), welche aus zur Samydaceae-Familie zählenden Pflanzen, insbesondere Casearia esculenta, erhalten werden, auf ein Verfahren zur deren Herstellung und auf deren Verwendung zur Herstellung von Arzneimitteln.
• Rheumatoide Arthritis ist eine chronische degenerative Entzündungskrankheit, welche etwa 1% der Bevölkerung befällt. Von der Arzneimitteltherapie mit die Krankheit modifizierenden Mitteln wie Methotrexat, Sulfasalazin, Goldsalzen oder Cyclosporin wurde gezeigt, daß diese die Gelenkszerstörung verrin- gern und die Krankheit verlangsamen. Alle gegenwärtigen, die Erkrankung modifizierenden Arzneimittel besitzen jedoch Nebenwirkungen und keines ist fähig, die Erkrankung vollständig aufzuhalten oder sie ausreichend zu verlangsamen, wenn sie sehr aggressiv verläuft. Cytokine wie IL-1 und TNF-α sind Schlüsselmediatoren im Entzündungsprozeß und sie wurden in der Synovialflüssigkeit von Patienten mit rheumatoider Arthritis festgestellt. Verbindungen, welche die Ausbildung oder die Freisetzung von Cytokinen inhibieren, können eine Schlüsselrolle bei der Unterbrechung des Fortschreitens der Krankheit spielen und sie können letztendlich zu einer Langzeitremission von rheumatoider Arthritis führen.
• Morita et al. (Chem. Pharm. Bull. 1991, 39(3), 693–697) beschreiben Diterpenderivate mit einer auf Clerodan basierenden Struktur, welche aus Pflanzenmaterial isoliert werden können und in chinesischen Hamster-V-79-Zellen Antitumorwirksamkeit zeigen. Itokawa et al. (Chem. Pharm. Bull. 1990, 38 (12), 3384– 3388) beschreiben ein Verfahren zur Extraktion der Casearine A–F, wie sie auf Seite 693 von Morita et al. angeführt sind, aus Blättern von Casearia sylvestris.
• Die Esculentine A und B können als Cytokininhibitoren beschrieben werden. Sie zählen zur Diterpenklasse und werden durch die nachstehenden Formeln 1 und 2 dargestellt:

  
• Esculentin A und Esculentin B können chemisch als 18β,19β-Diacetyloxy-18α,19α-epoxy-3,13(16),14-clerodatrien-2-on bzw. 8β,19β-Diacetyloxy-18α,19α-epoxy-3,12,14-clerodatrien-2β-isovaleryloxy-6β,7α-diol beschrieben werden. Die relative Stereochemie von Verbindungen der Formeln 1 und 2 wurde auf Basis der Kopplungskonstanten und von Nuclear-Overhauser-Effect-(NOE)-Studien festgestellt. Eine Chemical-Abstract-Literatursuche unter Verwendung von Suchbegriffen der Molekülformeln zeigte, daß beide Verbindungen der Formeln 1 und 2 neu sind.
• Die Samydaceae-Familie besteht aus etwa 150 Pflanzenspezies, die über drei Gattungen verteilt sind. Von diesen wachsen einige der Casearia-Spezies und Homalium zeylanicum in Indien. Die morphologischen Details und die Verteilung der Pflanzenspezies auf diese Gattungen sind in der Literatur beschrieben (J. H. Hooker, A Flora of British India@, Bd. II, S. 590–598).
• Nach einem Aspekt der Erfindung werden Verbindungen der vorstehenden Formel 1 oder 2 und deren pharmazeutisch annehmbare Derivate bereitgestellt.
• Wir haben festgestellt, daß die Verbindungen der Formeln 1 und 2 aus zur Samydaceae-Familie gehörenden Pflanzen, insbesondere Casearia esculenta, mittels Lösungsmittel extrahiert werden können. Es ist daher ein Ziel der Erfindung, ein Verfahren zur Isolierung der neuen Verbindungen der Formeln 1 und 2 aus zur Samydaceae-Familie zählenden Pflanzen, insbesondere Casearia esculenta, bereitzustellen.
• Nach einem zweiten Aspekt der Erfindung wird daher ein Verfahren zur Herstellung von neuem pharmakologisch wirksamem 18β, 19β-Diacetyloxy-18α,19α-epoxy-3,13(16),14-clerodatrien-2-on (Esculentin A) und/oder ebensolchem 18β,19β-Diacetyloxy-18α,19α-epoxy-3,12,14-clerodatrien-2β-isovaleryloxy-6β,7α-diol (Esculentin B) der Formel 1 bzw. 2 aus zur Samydaceae-Familie zählenden Pflanzen, insbesondere Casearia esculenta, und von deren pharmazeutisch annehmbaren Derivaten bereitgestellt, welches das Extrahieren des Pflanzenmaterials mit einem organischen Lösungsmittel im Verhältnis 1 : 2 bis 10 Gewichtsteilen des Pflanzenmaterials zum organischen Lösungsmittel bei pH 5 bis 8 und das Gewinnen der Verbindungen der Formel 1 und/oder 2 aus dem Lösungsmittelextrakt und wahlweise das Überführen der Verbindungen der Formel 1 und/oder 2 in pharmazeutisch annehmbare Derivate hievon umfaßt.
• Weitere Aspekte der Erfindung umfassen pharmazeutische Zusammensetzungen, welche eine Verbindung der Formel 1 und/oder 2 gemeinsam mit einem pharmakologisch tolerierten Hilfsmittel und/oder Exzipiens enthalten, und die Verwendung von Verbindungen der Formel 1 oder 2 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von einer chronischen Entzündung oder von Krebs.
• Das Pflanzenmaterial umfaßt verschiedene Teile der Pflanze, nämlich Blätter, Zweige, Stammrinde, Stammholz, Wurzelrinde und Wurzelholz, vorzugsweise Zweige. Die Zweige von Casearia esculenta wurden um Mumbai in Indien gesammelt. Ein Belegexemplar der Spezies wird im Herbarium des Research Centre, Hoechst Marion Roussel Limited, Mulund (W), Mumbai – 400080, Indien, aufbewahrt.
• Das im Verfahren verwendete organische Lösungsmittel ist beispielsweise Petrolether (Hexan), Ethylacetat, Dichlormethan, Chloroform oder ein niederer Alkohol wie Methanol, Ethanol, Isopropanol oder Butanol. Die Extraktion wird vorzugsweise mit Petrolether, gefolgt von Dichlormethan ausgeführt. Die Extraktion wird vorzugsweise im Verhältnis der Gewichtsteile von 1 : 5 des Pflanzenmaterials zum organischen Lösungsmittel ausgeführt. Die Extraktion wird vorzugsweise bei einem pH-Wert von 7 durchgeführt.
• Die wirksamen Substanzen Esculentin A und Esculentin B der Erfindung können aus dem Extrakt beispielsweise wie folgt gewonnen werden:
• Durch Fraktionierung unter Verwendung irgendeiner der folgenden Methoden: Normalphasenchromatographie (unter Verwendung von Aluminiumoxid oder Silicagel als stationäre Phase und Eluierungsmitteln wie Petrolether, Ethylacetat, Chloroform, Methanol oder Kombinationen hievon), Umkehrphasenchromatographie (unter Verwendung von Umkehrphasensilicagel wie Dimethyloctadecylsilylsilicagel, auch als RP-18 bezeichnet, oder Dimethyloctylsilylsilicagel, auch als RP-8 bezeichnet, als stationäre Phase und Eluierungsmitteln wie Wasser, Puffern, nämlich Phosphatacetat, Citrat (pH-Wert 2 bis 8) und organischen Lösungsmitteln wie Methanol, Acetonitril oder Aceton oder Kombination dieser Lösungsmittel), Gelpermeationschromatographie unter Verwendung von Harzen wie Sephadex LH-20 (Pharmacia Chemical Industries, Schweden), TSK-Gel Toyopearl HW (TosoHaas, Tosoh Corporation, Japan) in Lösungsmitteln wie Methanol, Chloroform oder Ethylacetat oder deren Kombinationen oder Sephadex G-10 und G-25 in Wasser; oder durch gegenläufige Chromatographie unter Verwendung eines zweiphasischen Eluierungssystems, welches aus zwei oder mehr Lösungsmitteln wie Wasser und Chloroform besteht. Diese Verfahren können wiederholt angewandt werden oder es kann eine Kombination verschiedener Verfahren angewandt werden. Das bevorzugte Verfahren ist die Chromatographie über Umkehrphasen-modifiziertes Silicagel (RP-18), gefolgt von Silicagel.
• Die Esculentine A und B können oral, intramuskulär oder intravenös verabreicht werden. Pharmazeutika, welche die Esculentine A und B als wirksame Substanzen enthalten, sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung. Sie können durch Vermischen der neuen Verbindungen mit einem oder mehreren pharmakologisch tolerierten Hilfsstoffen und/oder Exzipientien wie beispielsweise Füllstoffen, Emulgatoren, Gleitmitteln, Geschmack-maskierenden Mitteln, Färbemitteln oder Puffersubstanzen, und Überführen in eine geeignete pharmazeutische Form, wie beispielsweise Tabletten, beschichtete Tabletten, Kapseln oder eine Suspension oder Lösung zur parenteralen Verabreichung hergestellt werden.
• Beispiele von Hilfsstoffen und/oder Exzipientien, welche erwähnt werden können, sind Tragacanth, Lactose, Talk, Agar-Agar, Polyglycole, Ethanol und Wasser. Geeignet und bevorzugt zur parenteralen Verabreichung sind Suspensionen oder Lösungen in Wasser. Es ist auch möglich, die wirksamen Substanzen als solche, ohne Träger oder Verdünnungsmittel in einer geeigneten Form, beispielsweise in Kapseln, zu verabreichen.
• Die Verbindungen der Formel 1 und 2 können in ihre pharmazeutisch annehmbaren Derivate wie Ester und Ether übergeführt werden. Ester können durch Umsetzen der Verbindung der Formel 2 mit Carbonsäuren in Gegenwart eines Katalysators oder durch Behandeln der Verbindung der Formel 2 mit acylierenden Mitteln wie Säurechloriden hergestellt werden. Andere Verfahren zur Herstellung von Estern sind in der Literatur angeführt [Advanced Organic Synthesis, 4. Ausg., J. March, John Wiley & Sons, 1992].
• Ether können aus der Verbindung der Formel 2 durch Umsetzen mit alkylierenden Mitteln unter basischen Bedingungen hergestellt werden. Andere Verfahren zur Herstellung von Ethern sind in [Advanced Organic Synthesis, 4. Ausg., J. March, John Wiley & Sons, 1992] angeführt.
• Die Verbindung der Formel 1 kann unter Verwendung verschiedener Reduktionsmittel, welche in der Literatur beschrieben sind, zum entsprechenden Alkohol reduziert werden [Advanced Organic Synthesis, 4. Ausg., J. March, John Wiley & Sons, 1992] und der Alkohol kann ferner, wie es zuvor für die Verbindung der Formel 2 beschrieben ist, in Ester und Ether übergeführt werden.
• Das folgende Beispiel ist für die Erfindung veranschaulichend, es schränkt den Rahmen hievon jedoch nicht ein.
• BEISPIEL 1
• Getrocknete und gemahlene Zweige von Casearia esculenta wurden aufeinanderfolgend mit Petrolether und Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten Dichlormethanextrakte wurden unter verringertem Druck von 10–100 mm Hg bei 35°C eingeengt, um Rohmaterial (200 g) zu erhalten, welches eine antiarthritische Wirksamkeit in einer Dosis von 20 mg/kg bei einer täglichen Verabreichung während 12 Tagen im Perper-Modell für Adjuvans-Arthritis zeigte [Ref: The use of a standardized adjuvant arthritis assay to differentiate between anti-inflammatory and immunosuppressive agents, R. J. Perper, B. Alvarez, C. Colombo und H. Schroder, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 137, 506 (1971)]. 18 g des Rohmaterials wurden in drei verschiedenen Chargen von jeweils 6 g auf eine Säule (Höhe 7 cm, Durchmesser 10,5 cm) mit Umkehrphasensilicagel (RP-18) (275 g) aufgebracht. Die Säule wurde nacheinander unter Vakuum mit 500 ml 50% Methanol in Wasser und jeweils einem Liter von 60%, 80% und 90% Methanol in Wasser und abschließend mit Methanol eluiert. Die Durchflußgeschwindigkeit betrug 15 ml/min. Die Fraktionen wurden in 250 ml Größe gesammelt. Die aktiven Fraktionen, welche bei 80% Methanol in Wasser eluiert wurden, wurden gesammelt, unter verringertem Druck von 10 bis 100 mg Hg bei 35°C aufkonzentriert und lyophilisiert, um 8 g angereichertes Material zu erhalten.
• 6 Gramm des vorstehenden angereicherten Materials wurden weiter auf einer Glassäule (Höhe 25 cm; Durchmesser 6 cm), gepackt mit Silicagel (200 bis 300 Mesh), fraktioniert, um die zwei wirksamen Substanzen der Formel 1 und 2 zu trennen. Die Säule wurde unter einem Druck von 0,15 kg/cm³ mit jeweils 1,5 l 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% und 75% Ethylacetat in Petrolether und abschließend mit Ethylacetat eluiert. Die Durchflußgeschwindigkeit wurde bei 7 bis 8 ml/min gehalten und die Fraktionen wurden in 250 ml Größe gesammelt. Die Verbindung der Formel 1 wurde in 30% Ethylacetat in Petrolether eluiert, wogegen die Verbindung der Formel 2 in 45% Ethylacetat in Petrolether eluiert wurde. Die Fraktionen, welche die Verbindungen der Formel 1 und 2 enthielten, wurden getrennt gesammelt, unter verringertem Druck von 10 bis 100 mm Hg bei 35°C zur Trockene eingeengt, um halbreine Verbindungen der Formel 1 (1,05 g) und 2 (0,745 g) zu erhalten.
• Die Verbindung der Formel 1 (1,05 g) wurde ferner durch eine Silicagelsäure (4 × 25 cm) unter Verwendung eines Stufengradienten von Ethylacetat in Chloroform gereinigt. Die Säule wurde so unter Druck von 0,15 kg/cm³ mit Chloroform (500 ml), 1% Ethylacetat in Chloroform (250 ml), 1,5% Ethylacetat in Chloroform (250 ml), 2% Ethylacetat in Chloroform (500 ml), 3% Ethylacetat in Chloroform (250 ml), 4% Ethylacetat in Chloroform (500 ml) und 5% Ethylacetat in Chloroform (500 ml) eluiert. Die Durchflußgeschwindigkeit wurde bei 5 bis 6 ml/min gehalten. Die Fraktionen wurden in 50 ml Größe gesammelt. Die Fraktionen, welche die Verbindung der Formel 1 enthielten, die in 2 bis 4% Ethylacetat eluiert wurde, wurden vereinigt, unter verringertem Druck von 10 bis 100 mm Hg bei 35°C zur Trockene eingeengt, um 340 mg der Verbindung der Formel 1 zu erhalten. Diese wurde anschließend in Chargen mittels CHROMATOTRON auf einer 1 mm starken, mit Silicagel beschichteten Platte unter Verwendung von 16% Ethylacetat in Petrolether zur Eluierung mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 3 ml/min gereinigt, um die reine Verbindung der Formel 1 (0,12 g) zu erhalten.
• Die Verbindung der Formel 2 (0,6 g) wurde ferner, durch Flüssigkeitschromatographie unter mittlerem Druck (MPLC) auf einer Silicagelsäule (Höhe 25,5 cm, Durchmesser 3,7 cm) unter Verwendung von 3% Methanol in Chloroform zur Eluierung gereinigt. Die Durchflußgeschwindigkeit wurde bei 25 ml/min gehalten. Die Fraktionen wurden in 50 ml Größe gesammelt. Die Fraktionen, welche die Verbindung der Formel 2 enthielten, wurden vereinigt, unter verringertem Druck von 10 bis 100 mm Hg bei 35°C zur Trockene eingeengt, um 0,39 g halbreine Verbindung der Formel 2 zu erhalten, welche abschließend mittels CHROMATOTRON auf einer 1 mm starken, mit Silicagel beschichteten Platte unter Verwendung von 3% Methanol in Chloroform zur Eluierung mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 3 ml/min gereinigt wurde, um die reine Verbindung der Formel 2 (0,12 g) zu erhalten.
• Die Reinheit der Verbindungen der Formeln 1 und 2 wurde durch HPLC (Hochdruckflüssigkeitschromatographie) auf einer Eurosphere 100-C18 Säule (4 mm × 250 mm) unter Verwendung eines Gradienten von 50% Acetonitril in Wasser auf 100% in 25 min mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 1 ml/min und W-Detektion bei 220 nm überprüft.
• Die physikochemischen Eigenschaften der Esculentine A und B der Formel 1 und 2 sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengefaßt.
• TABELLE 1

  
• Esculentin A und Esculentin B zeigten eine interessante Aktivität gegenüber LPS-stimulierter Freisetzung von IL-1α und TNF-α in mononuklearen Humanzellen. Darüber hinaus wurde von beiden Verbindungen festgestellt, daß sie eine Cyctotoxizität gegenüber HeLa- und Vero-Zelllinien zeigen und daher als Antikrebsmittel nützlich sein können.

Claims (11)

1. Verbindung der Formel 1

   

   oder ein pharmazeutisch annehmbares Derivat hievon.
2. Verbindung der Formel 2

   

   oder ein pharmazeutisch annehmbares Derivat hievon.
3. Verfahren zur Isolierung von 18β,19β-Diacetyloxy-18α,19α-epoxy-3,13(16),14-clerodatrien-2-on (Esculentin A) und/oder 18β,19β-Diacetyloxy-18α,19α-epoxy-3,12,14-clerodatrien-2β-isovaleryloxy-6β,7α-diol (Esculentin B) der Formel 1 bzw. 2 aus einer zur Samydaceae-Familie zählenden Pflanze, insbesondere Casearia esculenta, umfassend das Extrahieren des Pflanzenmaterials mit einem organischen Lösungsmittel im Verhältnis von 1 : 2 bis 10 Gewichtsteilen des Pflanzenmaterials zum organischen Lösungsmittel bei einem pH-Wert von 5 bis 8 und das Gewinnen der Verbindungen der Formel 1 und/oder 2 aus dem Lösungsmittelextrakt und wahlweise das Überführen der Verbindungen der Formel 1 und/oder 2 in pharmazeutisch annehmbare Derivate hievon.
4. Verfahren nach Anspruch 3, worin das Pflanzenmaterial Zweige umfaßt.
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei die Extraktion mit Petrolether, gefolgt von Dichlormethan ausgeführt wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, wobei die Extraktion im Verhältnis von 1 : 5 Gewichtsteilen des Pflanzenmaterials zum organischen Lösungsmittel ausgeführt wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, wobei die Extraktion bei einem pH-Wert von 7 ausgeführt wird.
8. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung der Formel 1 und/oder 2 und ein pharmakologisch toleriertes Hilfsmittel und/oder Exzipiens.
9. Verbindung der Formel 1 oder 2 zur Verwendung als entzündungshemmendes Mittel.
10. Verbindung nach Anspruch 9 zur Verwendung als Antiarthritismittel.
11. Verwendung der Verbindungen der Formel 1 oder 2 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krebs.