IT201900018938A1 - Uso di esculentina e suoi derivati per uso per il trattamento della fibrosi cistica - Google Patents

Description

Descrizione della domanda per invenzione indistriale dal titolo: Uso di esculentina e suoi derivati per uso per il trattamento della fibrosi cistica

Sfondo dell’invenzione

La presente invenzione si riferisce al settore farmacologico poiché descrive l'uso dell'esculentina e dei suoi derivati per il trattamento della fibrosi cistica.

Stato dell’arte

La fibrosi cistica (FC) è una malattia genetica autosomica recessiva che colpisce circa 1 su 2500 nuove nascite della popolazione caucasica [Cuthbert AW (2011) New horizons in the treatment of cystic fibrosis. Br J Pharmacol 163, 173-183]. E’ caratterizzata da mutazioni nel gene che codifica per il regolatore della conduttanza transmembrana della Fibrosi cistica (CFTR); un canale per lo ione cloruro che è espresso principalmente nella membrana plasmatica apicale di epiteli secretori [Sheppard DN, Welsh MJ (1999) Structure and function of the CFTR chloride channel. Physiol Rev 79, S23-45]. CFTR ha due domini transmembrana e due regioni leganti nucleotidi (NBD1 e NBD2) collegate da una porzione regolatoria [Riordan JR, Rommens JM, Kerem B, Alon N, Rozmahel R, Grzelczak Z, Zielenski J, Lok S, Plavsic N, Chou JL, et al. (1989) Identification of the cystic fibrosis gene: cloning and characterization of complementary DNA. Science 245, 1066-1073]. La fosforilazione nei siti multipli nel dominio regolatorio, mediante la protein chinasi A, cAMP-dipendente (PKA) [Cheng SH, Rich DP, Marshall J, Gregory RJ, Welsh MJ, Smith AE (1991) Phosphorylation of the R domain by cAMP-dependent protein kinase regulates the CFTR chloride channel. Cell 66, 1027-1036], tanto quanto l’interazione con ATP nei due NBDs, controlla l’apertura del canale [Anderson MP, Welsh MJ (1992) Regulation by ATP and ADP of CFTR chloride channels that contain mutant nucleotide-binding domains. Science 257, 1701-1704; Smit LS, Wilkinson DJ, Mansoura MK, Collins FS, Dawson DC (1993) Functional roles of the nucleotide-binding folds in the activation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Proc Natl Acad Sci U S A 90, 9963-9967.]. Diversamente, l’idrolisi di ATP nel dominio NBD2 induce la chiusura del canale [Carson MR, Travis SM, Welsh MJ (1995) The two nucleotide-binding domains of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) have distinct functions in controlling channel activity. J Biol Chem 270, 1711-1717].

L'epitelio delle vie aeree forma un monostrato cellulare in cui le cellule sono collegate tra loro tramite giunzioni intercellulari che si differenziano per aspetto morfologico, composizione e funzione. La giunzione stretta o zona occludens è la giunzione intercellulare che regola la diffusione dell'acqua e dei soluti e consente alle cellule adiacenti di formare barriere cellulari selettivamente permeabili le quali separano il lato apicale e basolaterale dell'albero bronchiale, controllando così i processi di trasporto tra il compartimento apicale e basolaterale, per mantenere l'omeostasi delle vie aeree. L'integrità della barriera cellulare è fondamentale per le attività fisiologiche del tessuto polmonare e può essere valutata misurando la resistenza elettrica transepiteliale/transendoteliale (TEER) attraverso un monostrato cellulare [Srinivasan B, Kolli AR, Esch MB, Abaci HE, Shuler ML, Hickman JJ (2015) TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. J Lab Autom 20, 107-126].

La mutazione prevalente associata alla FC consiste nella perdita della fenilalanina 508 nel dominio NBD1 (F508del CFTR). Ciò provoca la formazione di una proteina mal ripiegata che viene rapidamente degradata attraverso il proteasoma [Jensen TJ, Loo MA, Pind S, Williams DB, Goldberg AL, Riordan JR (1995) Multiple proteolytic systems, including the proteasome, contribute to CFTR processing. Cell 83, 129-135]. A causa di questo difetto di maturazione, una piccola frazione di F508 del CFTR raggiunge la membrana plasmatica [Pranke IM, Sermet-Gaudelus I (2014) Biosynthesis of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Int J Biochem Cell Biol 52, 26-38]. Inoltre, la proteina mutata presenta anche un difetto di apertura (gating) del canale [Denning GM, Anderson MP, Amara JF, Marshall J, Smith AE, Welsh MJ (1992) Processing of mutant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator is temperature-sensitive. Nature 358, 761-764]. Tra le altre mutazioni di CFTR, la sostituzione di acido aspartico con glicina al codone 551 (G551D) è la terza mutazione più comune con una frequenza mondiale nella FC fino all'8% [Cashman SM, Patino A, Delgado MG, Byrne L, Denham B, De Arce M (1995) The Irish cystic fibrosis database. J Med Genet 32, 972-975]. Porta alla produzione di una proteina che è ben sintetizzata, processata e correttamente inserita nella membrana plasmatica ma con una marcata riduzione dell'attività del canale [Welsh MJ, Smith AE (1993) Molecular mechanisms of CFTR chloride channel dysfunction in cystic fibrosis. Cell 73, 1251-1254].

Come conseguenza di tali mutazioni nella proteina CFTR, viene inibita la secrezione di ioni cloruro al di fuori delle cellule. Ciò provoca un crescente assorbimento d'acqua da parte delle cellule epiteliali e la formazione di uno strato di muco appiccicoso e disidratato sull'epitelio delle vie aeree che favorisce l'intrappolamento e l'accumulo di microbi inalati, tra cui lo Pseudomonas aeruginosa [Dalemans W, Barbry P, Champigny G, Jallat S, Dott K, Dreyer D, Crystal RG, Pavirani A, Lecocq JP, Lazdunski M (1991) Altered chloride ion channel kinetics associated with the delta F508 cystic fibrosis mutation. Nature 354, 526-528]. Pertanto, si sviluppa un'infezione polmonare cronica insieme a danni del tessuto polmonare e compromissione delle funzioni respiratorie.

Negli ultimi anni, la comunità di ricerca sulla FC ha focalizzato la sua attenzione sull'identificazione e sviluppo di piccole molecole in grado di aiutare la maturazione/veicolazione della proteina mutata alla membrana plasmatica (ovvero i correttori) e/o di migliorare il flusso di ioni attraverso il canale CFTR (ovvero potenziatori) [Odolczyk N, Fritsch J, Norez C, Servel N, da Cunha MF, Bitam S, Kupniewska A, Wiszniewski L, Colas J, Tarnowski K, Tondelier D, Roldan A, Saussereau EL, Melin-Heschel P, Wieczorek G, Lukacs GL, Dadlez M, Faure G, Herrmann H, Ollero M, Becq F, Zielenkiewicz P, Edelman A (2013) Discovery of novel potent DeltaF508-CFTR correctors that target the nucleotide binding domain. EMBO Mol Med 5, 1484-1501]. Tuttavia, non sono ancora disponibili composti in grado di recuperare la completa funzionalità di CFTR.

Gli studi condotti nel nostro laboratorio hanno portato alla scoperta di un peptide antimicrobico derivato dalla pelle di rana (AMP), ovvero l’Esc(1-21) [Islas-Rodriguez AE, Marcellini L, Orioni B, Barra D, Stella L, Mangoni ML (2009) Esculentin 1-21: a linear antimicrobial peptide from frog skin with inhibitory effect on bovine mastitis-causing bacteria. J Pept Sci 15, 607-614], con una potente attività anti-Pseudomonas [Luca V, Stringaro A, Colone M, Pini A, Mangoni ML (2013) Esculentin(1-21), an amphibian skin membrane-active peptide with potent activity on both planktonic and biofilm cells of the bacterial pathogen Pseudomonas aeruginosa. Cell Mol Life Sci 70, 2773-2786]. È un peptide cationico a pH neutro con una struttura ad alfa-elica in ambiente membrano-mimetico ed un meccanismo d’ azione microbicida che si basa sulla perturbazione della membrana batterica. Ciò rende più difficile lo sviluppo di resistenza da parte dei batteri rispetto agli antibiotici convenzionali che sono diretti verso un unico e singolo bersaglio.

Abbiamo anche dimostrato che modificando la configurazione di soli due L-amminoacidi nella sequenza di Esc (1-21), ovverosia la Ser14 e Leu17 con i corrispettivi enantiomeri D, il risultante diastereomero Esc(1-21)-1c era più resistente alla degradazione proteolitica; più efficiente nell’ indurre la riepitelizzazione di cellule epiteliali bronchiali esprimenti una copia funzionale o mutata del canale CFTR (rispettivamente wt-CFBE e F508del-CFBE) in un test di guarigione delle ferite (wound healing) in vitro [Cappiello F, Di Grazia A, Segev-Zarko LA, Scali S, Ferrera L, Galietta L, Pini A, Shai Y, Di YP, Mangoni ML (2016) Esculentin-1a-Derived Peptides Promote Clearance of Pseudomonas aeruginosa Internalized in Bronchial Cells of Cystic Fibrosis Patients and Lung Cell Migration: Biochemical Properties and a Plausible Mode of Action. Antimicrob Agents Chemother 60, 7252-7262]; più attivo contro biofilm di P. aeruginosa [Di Grazia A, Cappiello F, Cohen H, Casciaro B, Luca V, Pini A, Di YP, Shai Y, Mangoni ML (2015) D-Amino acids incorporation in the frog skin-derived peptide esculentin-1a(1-21)NH2 is beneficial for its multiple functions. Amino Acids 47, 2505-2519; Casciaro B, Cappiello F, Cacciafesta M, Mangoni ML (2017) Promising Approaches to Optimize the Biological Properties of the Antimicrobial Peptide Esculentin-1a(1-21)NH2: Amino Acids Substitution and Conjugation to Nanoparticles. Front Chem 5, 26]; e più potente nel ridurre il carico batterico a livello polmonare in modelli murini di infezione polmonare da Pseudomonas, in seguito ad una singola instillazione intra-tracheale ad un dosaggio molto basso (0,1 mg/kg corrispondente a 20 µM) con trascurabile tossicità o eventi collaterali infiammatori. Inoltre, abbiamo anche mostrato come nanoparticelle di acido poli(latticoglicolico)(PLGA) ingegnerizzate con alcool polivinilico rappresentino un’allettante nanoformulazione per il rilascio polmonare di Esc(1-21) ed Esc(1-21)-1c (peptidi Esc) prolungando la loro efficacia terapeutica contro l'infezione polmonare indotta da Pseudomonas [Chen C, Mangoni ML, Di YP (2017) In vivo therapeutic efficacy of frog skin-derived peptides against Pseudomonas aeruginosa-induced pulmonary infection. Sci Rep 7, 8548].

La domanda di brevetto USA n. US2017166614 descrive il peptide esculentina-2CHa e suoi analoghi, e il loro utilizzo nel trattamento del diabete, ad esempio il diabete di tipo 2; resistenza all’insulina; obesità e/o ipercolesterolemia e sua composizione farmaceutica.

Il brevetto USA N. US 6107335 descrive il 18 beta, 19 betadiacilossi-18 alfa, 19 alfa-epossi-3, 13 (16), 14-clerodatrien-2-one (Esculentina A) e 18 beta, 19 betadiacilossi-18 alpha, 19 alpha -epoxy-3, 12, 14-clerodatrien-2 beta -isovaleryloxy-6 beta, 7 alpha -diol (Esculentina B) ottenuti da piante appartenenti alla famiglia delle Samydaceae, in particolare Casearia esculenta, per uso nella preparazione di medicinali utili come agenti antinfiammatori e/o antitumorali.

In brevetto USA n. US 10059752 e la domanda di brevetto USA, pubblicazione n. US2018361010, dello stesso inventore della presente domanda, descrivono i peptidi antibatterici Esculentina Esc (1-21) e diastereomero Esc(1-21)-1c, loro composizioni farmaceutiche e l’uso per ridurre la gravità dell'infiammazione indotta da microbi, per stimolare la guarigione di ferite e per dispositivi rivestiti di peptidi antibatterici sintetici.

Problema Tecnico

Gli inventori della presente invenzione hanno studiato l'effetto dell’ Esculentina Esc (1-21) e del diastereomero Esc(1-21)-1c sulle correnti ioniche controllate da CFTR misurando la TEER in wt-CFBE, in linee cellulari che esprimono mutazioni di apertura (gating) della proteina CFTR e in cellule epiteliali primarie delle vie aeree mediante esperimenti in camera di Ussing per confermare i dati. Inaspettatamente, gli inventori della presente invenzione hanno trovato che i peptidi Esc hanno la capacità di ripristinare e migliorare la funzionalità di CFTR mutata fungendo da modulatori.

Oggetto dell’invenzione

Il suddetto problema tecnico è risolto fornendo una composizione farmaceutica comprendente Esculentina-1a (1-21)NH2 di SEQ ID NO: 2 GIFSKLAGKKIKNLLISGLKG-NH2 e/o il diastereomero di Esculentina, Esc (1-21)-1c di SEQ ID NO: 3 GIFSKLAGKKIKNLLISGLKG-NH2 come principio attivo e adiuvanti e/o veicoli e/o veicoli e/o eccipienti farmaceuticamente accettabili per uso per ripristinare la disregolazione della composizione di acqua e ioni del liquido periciliare dovuta a mutazioni del gene CFTR che codifica per il regolatore di conduttanza transmembrana della fibrosi cistica (CFTR).

Un altro scopo della presente invenzione è una composizione farmaceutica comprendente Esculentina-1a(1-21) NH2 di SEQ ID NO: 2 GIFSKLAGKKIKNLLISGLKG-NH2 e/o il diastereomero di Esculentina, Esc (1-21)-1c di SEQ ID NO: 3 GIFSKLAGKKIKNLLISGLKG- NH2 come principio attivo e adiuvanti e/o veicoli farmaceuticamente accettabili e/o eccipienti per uso per il trattamento della fibrosi cistica.

Breve descrizione delle figure

La Figura 1 mostra l'integrità epiteliale delle wt-CFBE nel pannello A e delle F508 del-CFBE nel pannello B, misurata mediante TEER dopo 24 ore di trattamento con i peptidi indicati a diverse concentrazioni. La conduttanza basale per ciascun trattamento è stata normalizzata rispetto a quella delle cellule di controllo (cellule trattate con DMSO allo 0,1%). I dati sono espressi come media di tre esperimenti indipendenti ± SEM. Non è stata trovata alcuna differenza significativa. Il correttore Vx-809 (1µM) è stato utilizzato per il confronto.

La Figura 2 mostra, nel pannello A, l'andamento temporale dell'effetto potenziatore di Esc(1-21)-1c sull'attività di F508del-CFTR. Dopo la pre-incubazione delle cellule per 24 ore con 1 µM Vx-809, la conduttanza di CFTR è stata misurata dopo 10 minuti, 1 ora e 2 ore dall’aggiunta di peptide 20 µM di forskolina (FSK) o 50 µM di genisteina (GEN). Le cellule preincubate con 0,1% di DMSO o 1µM di Vx-809 e quindi trattate con FSK GEN sono state usate rispettivamente come controlli negativi e positivi. Nel pannello B, l'attività di potenziatore di Esc(1-21) ed Esc (1-21)-1c (10 µM) dopo 10 minuti dall’ aggiunta di peptidi in presenza di 20 µM di FSK. I dati sono espressi come media di tre esperimenti indipendenti ± SEM. I livelli di significatività statistica dei campioni rispetto al controllo negativo sono i valori di P <0,01 (*) e <0,001 (**).

La Figura 3 mostra l'effetto dose-risposta dei peptidi Esc sulla conduttanza trans-epiteliale di CFTR misurata con il saggio TEER. Anche il peptide temporina A è stato incluso per confronto. I controlli negativi o positivi erano cellule trattate con 0,1% di DMSO o 1 µM Vx-809 e successivamente stimolate con FSK GEN. I dati sono espressi come media di tre esperimenti indipendenti ± SEM. Il livello di significatività statistica dei campioni rispetto al controllo negativo è un valore P <0,01 (*).

La Figura 4 mostra le misurazioni TEER eseguite su epitelio bronchiale primario umano derivato da due diversi pazienti CF omozigoti per la mutazione F508del. Dopo 24 ore di trattamento con Vx-809 (1 µM), gli epiteli sono stati stimolati con FSK GEN o con FSK+ peptide come indicato, per 10 minuti. Le barre del grafico mostrano il delta tra i valori di resistenza elettrica misurati prima e dopo l'inibizione di CFTR, e successivamente convertito nel suo reciproco valore di conduttanza (pannello A) e l'equivalente corrente di cortocircuito (pannello B). Le cellule pre-incubate con 0,1% di DMSO o 1µM di Vx-809 e quindi trattate con FSK GEN sono state usate rispettivamente come controlli negativi e positivi.

La Figura 5 mostra le tracce rappresentative delle registrazioni, misurate in camera di Ussing, delle cellule epiteliali bronchiali (HBE) derivate da un paziente omozigote F508del a seguito di un'incubazione di 24 ore con DMSO allo 0,1% (pannello A), 1 μM di Vx809 (pannello B), 10 μM di peptide Esc(1-21) (pannello C) e successivo trattamento con Vx-770, o dopo un’ incubazione con 1 μM di Vx809 e trattamento con Esc 1-21) (pannello D). I grafici a barre che riepilogano le registrazioni della media delle correnti attraverso CFTR in HBE, misurate in camera di Ussing dopo i vari trattamenti, sono mostrati nel pannello E. I dati sono la media di tre esperimenti indipendenti ± SEM. Il livello di significatività statistica rispetto ai campioni trattati con DMSO è un valore P <0,05 (*).

La Figura 6 mostra l'effetto dei frammenti Esc(1-14) ed Esc (9-21) sulla conduttanza transepiteliale di CFTR misurata con il saggio TEER rispetto all’ Esc (1-21) ed il suo diastereomero. Dopo 24 ore di trattamento con Vx-809 (1 μM), gli epiteli sono stati stimolati con FSK peptide come indicato, per 10 minuti. I dati sono espressi come media di tre esperimenti indipendenti ± SEM. Le cellule pre-incubate con 0,1% di DMSO o con 1μM di Vx-809 e quindi trattate con FSK GEN sono state usate rispettivamente come controlli negativi e positivi. Il livello di significatività statistica rispetto ai campioni trattati con DMSO è un valore P <0,05 (*).

La Figura 7 mostra la velocità di spegnimento della fluorescenza delle cellule che esprimono CFTR e YFP-H148Q dopo trattamento con FSK peptide, FSK GEN o solo con FSK e quindi esposte alla soluzione di ioduro. I risultati sono la media di almeno tre esperimenti indipendenti ± SEM. I test sono stati condotti a 37 ° C e le cellule sono state incubate a questa temperatura per 5 minuti prima di iniziare l'esperimento. Il livello di significatività statistica rispetto ai campioni trattati con FSK è un valore P <0,05 (*).

Descrizione dettagliata dell’invenzione

Nell’ambito della presente invenzione, Esculentina 1a è un peptide presente naturalmente nella pelle dell'anfibio Pelophylax lessonae/ridibundus (Rana esculenta). Ha una lunghezza di 46 amminoacidi e presenta un ponte disolfuro intramolecolare all'estremità C-terminale.

Esc-1a (1-21) NH2 è costituito dai primi 20 amminoacidi della sequenza del peptide maturo Esculentina 1a con un residuo di glicinamide al C-terminale.

SEQ ID NO: 1 Esculentina 1a:

GIFSKLAGKKIKNLLISGLKNVGKEVGMDVVRTGIDIAGCKIKGEC;

SEQ ID NO: 2 Esculentina-1a(1-21)NH2:

GIFSKLAGKKIKNLLISGLKG-NH2

Nell’ambito della presente invenzione, il diastereomero Esc (1-21) -1c risulta dal cambiamento di configurazione di soli due L-amminoacidi nella sequenza di Esc (1-21), cioè Ser14 e Leu17 con i corrispettivi enantiomeri D.

SEQ ID NO: 3 diastereomero Esc(1-21)-1c

GIFSKLAGKKIKNLLISGLKG-NH2

Nell’ambito della presente invenzione, il regolatore di conduttanza transmembrana della fibrosi cistica (CFTR) è una proteina canale appartenente alla classe di trasportatori ABC che conduce ioni cloruro attraverso la membrana delle cellule epiteliali, è codificata dal gene CFTR, le mutazioni del gene CFTR colpiscono la funzione del canale ionico per lo ione cloruro e causano alterazione del trasporto di fluidi sulla superficie epiteliale del pancreas e sull'epitelio polmonare, causando la fibrosi cistica.

Nell’ambito della presente invenzione, per liquido periciliare si intende il liquido, contenente acqua e ioni, che bagna le ciglia dell'epitelio respiratorio (o epitelio delle vie aeree), essendo quest'ultimo un epitelio colonnare ciliato che riveste il tratto respiratorio. L’ alterazione del contenuto e/o della composizione di acqua e/o di ioni del liquido periciliare è dovuta a mutazioni del gene CFTR che codifica per la proteina regolatrice di conduttanza transmembrana della fibrosi cistica (CFTR).

Nell’ambito della presente invenzione, un modulatore della proteina regolatrice di conduttanza transmembrana della fibrosi cistica (CFTR) è un composto in grado di migliorare il flusso di ioni cloruro attraverso CFTR. Un modulatore può essere scelto nel gruppo consistente di: Ivacaftor, Lumacaftor, Tezacaftor, VX-445, VX-659, VX-152, VX-440, VX-561 (CTP-656), QBW251, FDL169, GLPG1837, GLPG2222, GLPG2451, GLPG2737, GLPG3067, GLPG3067, PTI-428, PTI-801, PTI-808, QR-010, MRT5005, QBW276, SPX-101, AZD5634, BI 443651, o loro miscele (Martina Gentzsch, and Marcus A. Mall, Ion Channel Modulators in Cystic Fibrosis, CHEST, 2018; 154(2):383-393).

Oggetto della presente invenzione è una composizione farmaceutica comprendente Esculentina-1a(1-21)NH2 di SEQ ID NO: 2 GIFSKLAGKKIKNLLISGLKG-NH2 e/o il diastereomero di Esculentina, Esc (1-21)-1c di SEQ ID NO: 3 GIFSKLAGKKIKNLLISGLKG-NH2 come principio attivo e adiuvanti e/o veicoli e/o eccipienti farmaceuticamente accettabili per uso per ripristinare la disregolazione del contenuto di acqua e/o ioni e/o composizione del liquido periciliare.

Un altro oggetto della presente invenzione è una composizione farmaceutica comprendente Esculentina-1a(1-21)NH2 di SEQ ID NO: 2 GIFSKLAGKKIKNLLISGLKG-NH2 e/o il diastereomero di Esculentina, Esc (1-21)-1c di SEQ ID NO: 3 GIFSKLAGKKIKNLLISGLKG- NH2 come principio attivo e adiuvanti e/o veicoli e/o eccipienti farmaceuticamente accettabili per uso per il trattamento della fibrosi cistica.

Preferibilmente il principio attivo è Esc(1-21)-1c di SEQ ID NO: 3

Opzionalmente la composizione farmaceutica comprendente Esculentina-1a (1-21)NH2 di SEQ ID NO: 2 GIFSKLAGKKIKNLLISGLKG-NH2 e/o il diastereomero di Esculentina, Esc (1-21)-1c di SEQ ID NO: 3 GIFSKLAGKKIKNLLISGLKG-NH2 come principio attivo e come adiuvanti e/o veicoli e/o eccipienti farmaceuticamente accettabili comprende ulteriormente un modulatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica scelto nel gruppo consistente di: Ivacaftor, Lumacaftor, Tezacaftor, VX-445, VX-659, VX-152, VX-440, VX-561 (CTP-656), QBW251, FDL169, GLPG1837, GLPG2222, GLPG2451, GLPG2737, GLPG3067, GLPG3067, PTI-428, PTI-801, PTI-808, QR-010, MRT5005, QBW276, SPX-101, AZD5634, BI 443651, o una loro miscela.

Le composizioni farmaceutiche possono essere preparate con metodi e tecniche convenzionali che sono pratiche comuni nell'industria farmaceutica, come, ad esempio, quelle illustrate nel Manuale di Scienza Farmaceutica di Remington, Mack Pub. N.Y. - ultima edizione.

Le composizioni, secondo la presente invenzione contengono, insieme al principio attivo, almeno un veicolo o eccipiente farmaceuticamente accettabile. Questi possono essere coadiuvanti della formulazione particolarmente utili, ad esempio agenti solubilizzanti, agenti disperdenti, agenti di sospensione e agenti emulsionanti.

L'invenzione fornisce anche un metodo per il trattamento della fibrosi cistica in un paziente che ne ha bisogno somministrando una quantità farmaceuticamente efficace di una composizione farmaceutica comprendente Esculentina-1a(1-21)NH2 di SEQ ID NO: 2 GIFSKLAGKKIKNLLISGLKG-NH2 e/o il diastereomero di Esculentina, Esc(1-21)-1c di SEQ ID NO: 3 GIFSKLAGKKIKNLLISGLKG-NH2 come principio attivo e adiuvanti e/o veicoli e/o veicoli e/o eccipienti farmaceuticamente accettabili e, opzionalmente, un modulatore del regolatore di conduttanza transmembrana della fibrosi cistica scelto nel gruppo consistente di: Ivacaftor, Lumacaftor, Tezacaftor, VX-445, VX-659, VX-152, VX-440, VX-561 (CTP-656), QBW251, FDL169, GLPG1837, GLPG2222, GLPG2451, GLPG2737, GLPG3067, GLPG3067, PTI-428, PTI-801, PTI-808, QR-010, MRT5005, QBW276, SPX-101, AZD5634, BI 443651, o loro miscele.

Esempi

Materiali e Metodi

Le cellule epiteliali bronchiali umane primarie derivate da individui FC e non FC sono state fornite dal servizio di colture cellulari della Fondazione italiana per fibrosi cistica (FFC), mentre le cellule epiteliali bronchiali umane immortalizzate sono state ottenute da un paziente FC (CFBE41o-) e successivamente trasdotte con un vettore lentivirale per un'espressione stabile di CFTR funzionale o F508del-CFTR (rispettivamente wt-CFBE e F508del-CFBE)[Bebok Z, Collawn JF, Wakefield J, Parker W, Li Y, Varga K, Sorscher EJ, Clancy JP (2005) Failure of cAMP agonists to activate rescued deltaF508 CFTR in CFBE41o- airway epithelial monolayers. J Physiol 569, 601-615]. Le cellule epiteliali bronchiali umane sono state coltivate in fiasche, in presenza di terreno proliferativo privo di siero contenente una miscela 1:1 di RPMI 1640 e terreno basale LHC (Life Technologies, Monza, Italia) integrato con vari ormoni e integratori, 100 U/ml di penicillina e 100 μg/ml di streptomicina e quindi seminati su membrane porose (inserti Snapwell da 12 mm, Corning, codice 3801 per l'utilizzo di studi in camera di Ussing o inserti mini-transwell da 0,33 cm<2>, Corning, codice 3379 per la misurazione TEER) come descritto precedentemente [Scudieri P, Caci E, Bruno S, Ferrera L, Schiavon M, Sondo E, Tomati V, Gianotti A, Zegarra-Moran O, Pedemonte N, Rea F, Ravazzolo R, Galietta LJ (2012) Association of TMEM16A chloride channel overexpression with airway goblet cell metaplasia. J Physiol 590, 6141-6155].

Le linee di cellule epiteliali bronchiali immortalizzate (CFBE41o-) sono state coltivate in mezzo essenziale minimo (minimal essential medium MEM) e quindi seminate su membrane porose (inserti mini-transwell 0,33 cm<2>, Corning, codice 3379) per misurazioni TEER.

Le cellule tiroidee di ratto di Fischer (FRT) con espressione stabile di CFTR mutato, sono state coltivate nel terreno Ham’s F-12 modificato da Coon. Entrambi i terreni (MEM e Coon) sono stati integrati con il 10% di siero di bovino fetale (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), 2 mM di l-glutammina, 100 U/ml di penicillina e 100 μg/ml di streptomicina.

Per valutare l'integrità dell'epitelio polmonare, le linee cellulari esprimenti CFTR mutato o funzionale, seminate su supporti permeabili, sono state incubate per 24 ore nel loro terreno di coltura standard in presenza di peptidi, a diversa concentrazione. Le cellule incubate con 0,1% di dimetilsolfossido (DMSO) o con 1 µM del correttore Vx-809 sono state incluse come controlli. Dopo 24 ore, il terreno è stato sostituito con una soluzione salina contenente (in mM): 130 NaCl, 2,7 KCl, 1,5 KH2PO4, 1 CaCl2, 0,5 MgCl2, 10 glucosio, 10 Na-Hepes (pH 7,4). La soluzione salina è stata aggiunta al compartimento apicale e basolaterale dei supporti permeabili. I campioni sono stati incubati per 10 minuti a 37 ° C ed è stato misurato il valore di TEER in condizioni basali senza attivazione di CFTR, con il voltometro epiteliale (EVOM1, World Precision Instruments).

Parallelamente, per valutare l'attivazione di CFTR, è stata utilizzata la stessa soluzione salina. Dopo la misurazione di TEER basale, sono stati aggiunti 20 µM di FSK 50 µM GEN come controllo positivo o FSK peptidi alla concentrazione desiderata, sul lato apicale dell'epitelio. Infine, 30 µM di PPQ102, un inibitore specifico del CFTR, sono stati somministrati sul lato apicale dell'epitelio. Dopo ogni aggiunta, abbiamo aspettato dieci minuti a 37°C prima della misurazione. Dai valori di TEER misurati prima e dopo l'inibizione di CFTR, abbiamo calcolato la conduttanza transepiteliale CFTR-dipendente per ogni condizione [Sondo E, Falchi F, Caci E, Ferrera L, Giacomini E, Pesce E, Tomati V, Mandrup Bertozzi S, Goldoni L, Armirotti A, Ravazzolo R, Cavalli A, Pedemonte N (2018) Pharmacological Inhibition of the Ubiquitin Ligase RNF5 Rescues F508del-CFTR in Cystic Fibrosis Airway Epithelia. Cell Chem Biol 25, 891-905 e898].

Per le cellule bronchiali primarie, il terreno Ham’s F-12 modificato da Coon tamponato con 20 mM Hepes è stato utilizzato per le misurazioni TEER per valutare l'attivazione di CFTR. Più precisamente, dopo misurazioni iniziali con CFTR inattivo, 10 µM di amiloride, uno specifico inibitore del canale epiteliale del sodio (ENaC) è stato aggiunto al lato apicale dell'epitelio pre-incubato con 1 µM di Vx-809. Successivamente, sono stati aggiunti 20 µM di FSK 50 µM GEN, come controllo positivo, o FSK peptidi alla concentrazione desiderata. Infine, è stato aggiunto 30 µM di PPQ102 sul lato apicale dell'epitelio. Dopo ogni aggiunta, abbiamo aspettato dieci minuti a 37°C prima della misurazione, come indicato sopra.

I supporti Snapwell (Corning 3801), con epitelio bronchiale differenziato, sono stati montati in una camera a diffusione verticale, simile a una camera di Ussing con circolazione interna di fluido. Sia le camere apicali che basolaterali sono state riempite con 5 ml di soluzione salina. La corrente di corto-circuito è stata registrata con un convertitore analogico-digitale PowerLab 4/25 (ADInstruments) collegato a un computer. Gli epiteli sono stati incubati per 24 ore con 1 µM Vx-809 o con 0,1% DMSO. Successivamente, è stato aggiunto 10 µM di amiloride; in seguito, i canali CFTR sono stati attivati per fosforilazione dopo aggiunta di 100 µM di cptcAMP (analogo permeabile di cAMP). Quindi, 1 µM del potenziatore Vx-770 e ciascun peptide Esc sono stati aggiunti sul lato apicale dell'epitelio, come indicato. Infine, 10 µM di Inh172, un inibitore specifico di CFTR è stato aggiunto al lato apicale dell'epitelio. Le misurazioni sono state eseguite dopo 5 minuti dall'aggiunta di ciascuna sostanza. Parallelamente, per confronto, sono stati utilizzati epiteli pre-incubati per 24 ore con ciascun peptide e quindi trattati con amiloride, cpt-cAMP e Vx-770.

Le cellule FRT, che co-esprimono CFTR con mutazione G551D insieme alla proteina fluorescente gialla sensibile agli alogenuri (YFP), sono state lavate con PBS [Galietta LV, Jayaraman S, Verkman AS (2001) Cell-based assay for highthroughput quantitative screening of CFTR chloride transport agonists. Am J Physiol Cell Physiol 281, C1734-1742].

Le cellule sono state quindi incubate per 20 minuti con 60 µl di PBS più FSK (20 µM) e GEN (50 µM) o con FSK peptide Esc (10 µM) per stimolare la proteina CFTR mutata. Le cellule sono state quindi trasferite su un lettore di micropiastre per la determinazione dell'attività CFTR. Il lettore di piastre era dotato di filtri di eccitazione (HQ500) e di emissione (HQ535) di alta qualità per YFP. Ciascun test comprendeva una lettura continua della fluorescenza per 14 secondi, 2 secondi prima e 12 secondi dopo l'iniezione di 165 µl di una soluzione contenente ioduro (PBS con Cl- sostituito da I-; concentrazione finale di I- pari a 137 mM). La fluorescenza dei pozzetti bianchi (senza cellule) è stata sottratta dai valori di tutti i campioni e normalizzata rispetto al valore di fluorescenza iniziale di ogni pozzetto. Per determinare la velocità del flusso entrante di I-, i dati corrispondenti alle misurazioni finali di 11 secondi per ciascun pozzetto sono stati calcolati mediante una funzione esponenziale, per estrapolare la pendenza iniziale (tasso di spegnimento, QR). I dati quantitativi derivati da esperimenti indipendenti sono stati espressi come valore medio ± errore standard della media (SEM). La significatività statistica è stata determinata utilizzando il t test di Student, su piattaforma Igor (Wavemetrics, Lake Oswego, OR). I valori di P <0,05 sono stati considerati statisticamente significativi.

Effetto dei Peptidi sulla permeabilità dell’epitelio polmonare

Inizialmente abbiamo testato se i peptidi Esc influenzassero l'integrità epiteliale polmonare misurando la conduttanza elettrica trans-epiteliale in epiteli polarizzati wt-CFBE e F508del-CFBE, 24 ore dopo incubazione con il peptide a diverse concentrazioni (1 µM, 10 µM, 50 µM e 80 µM). Il correttore Vx-809 (1µM) è stato utilizzato per confronto. Come riportato in Figura 1, non è stato ottenuto alcun cambiamento significativo della conduttanza elettrica trans-epiteliale rispetto ai campioni di controllo trattati con DMSO, indicando che entrambi i peptidi non influenzano l'integrità dell’epitelio polmonare.

Attività dei peptidi come potenziatori su CFTR mutata

Successivamente, è stata studiata la capacità dei peptidi Esc di agire come potenziatori di CFTR mutata, promuovendo il suo stato di fosforilazione o il tempo di apertura del canale, imitando l'attività di forskolina (FSK) e genisteina (GEN), che sono entrambi necessari per la piena attivazione di CFTR [Sondo E, Falchi F, Caci E, Ferrera L, Giacomini E, Pesce E, Tomati V, Mandrup Bertozzi S, Goldoni L, Armirotti A, Ravazzolo R, Cavalli A, Pedemonte N (2018) Pharmacological Inhibition of the Ubiquitin Ligase RNF5 Rescues F508del-CFTR in Cystic Fibrosis Airway Epithelia. Cell Chem Biol 25, 891-905 e898]. Degno di nota, l'inibitore della fosfodiesterasi FSK [Ma T, Thiagarajah JR, Yang H, Sonawane ND, Folli C, Galietta LJ, Verkman AS (2002) Thiazolidinone CFTR inhibitor identified by high-throughput screening blocks cholera toxininduced intestinal fluid secretion. J Clin Invest 110, 1651-1658] FSK è descritto come necessario per innescare un aumento di cAMP intracellulare favorendo la fosforilazione di CFTR da parte delle protein chinasi cellulari tipo PKA, mentre l'isoflavone GEN accelera l'apertura del canale, promuovendo la dimerizzazione di NBD e rallenta la chiusura del canale stabilizzando la conformazione del dimero NBD1: NBD2 [Schmidt A, Hughes LK, Cai Z, Mendes F, Li H, Sheppard DN, Amaral MD (2008) Prolonged treatment of cells with genistein modulates the expression and function of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Br J Pharmacol 153, 1311-1323].

La conduttanza mediata da CFTR dell'epitelio bronchiale è stata valutata mediante TEER, dopo 10 minuti, 1 ora e 2 ore di trattamento dell’epitelio F508del-CFBE (pre-incubato con il correttore Vx-809 per favorire l'arrivo della proteina mutata nella membrana apicale) con Esc(1-21)-1c (10 µM), in assenza di FSK o GEN. È interessante notare che, in assenza di FSK, non è stato ottenuto alcun recupero di attività CFTR. Al contrario, un significativo aumento della conduttanza CFTR è stato misurato quando Esc(1-21) -1c è stato incubato con FSK senza GEN, già dopo 10 minuti di trattamento con i peptidi. Ciò indicava chiaramente che il peptide era in grado di potenziare l'attività di CFTR, probabilmente prolungando il tempo di apertura del canale. L'attività di potenziatore di Esc(1-21)-1c in assenza di GEN è stata esaminata anche dopo 1 ora o 2 ore di trattamento e si è osservato che rimaneva costante fino a 2 ore (Figura 2A). Il confronto tra Esc(1-21)-1c e all-L Esc (1-21), dopo 10 minuti di trattamento a 10 µM, è riportato nella Figura 2B.

Effetto della dose-risposta dei peptidi su F508del-CFTR espressa in linee cellulari bronchiali

La conduttanza è stata misurata su F508del-CFBE. Dopo la preincubazione con Vx-809 e l'attivazione di CFTR con FSK+GEN per 10 minuti, o con FSK+ peptidi Esc a differenti concentrazioni, un maggiore aumento nel livello di conduttanza di CFTR è stato indotto da entrambi i peptidi a 10 µM (paragonabile a quello determinato dalla completa attivazione di CFTR con FSK+GEN (controllo positivo). I risultati non possono essere attribuiti all'attività di perturbazione di membrana da parte dei peptidi Esc, perché nessun effetto sulle correnti di CFTR è stato osservato quando è stato usato il peptide membranolitico temporina A (10 µM) (Figura 3)

Effetto dei peptidi sull'attività di CFTR in cellule epiteliali primarie delle vie aeree

Sulla base di questi dati incoraggianti, l'effetto di entrambi i peptidi Esc è stato anche analizzato, alla loro concentrazione ottimale, i.e. 10 µM, su cellule bronchiali primarie derivate da due differenti pazienti CF omozigoti per la mutazione F508del, con TEER, dopo l'incubazione con Vx-809. La TEER e la differenza di potenziale (DP)sono state misurate prima e dopo la somministrazione di amiloride (10 µM) per bloccare il canale del sodio epiteliale (ENaC) che permette l'assorbimento di sodio. I risultati indicano che entrambi i peptidi migliorano l'attività di CFTR con una leggera differenza tra i due epiteli bronchiali, probabilmente dovuta all'intrinseca differenza tra i pazienti CF (Figura 4).

Esperimenti di Ussing

L'attività potenziatrice su CFTR dei peptidi Esc nelle cellule epiteliali primarie delle vie aeree è stata studiata con esperimenti di camera di Ussing su epiteli bronchiali da paziente omozigote per F508del. Gli epiteli sono stati trattati per 24h con il solo veicolo DMSO allo 0.1%, con 1μM Vx809 o con ciascuno dei peptidi Esc. Poi, i campioni sono stati montati in camere di Ussing per misurare la secrezione di cloruro attraverso l'analisi della corrente di cortocircuito. Dopo il blocco della corrente del sodio con amiloride, le cellule trattate con il solo veicolo DMSO o con i peptidi Esc hanno mostrato solo una piccola attività di CFTR in risposta all'analogo del cAMP permeabile alla membrana (cpt-cAMP) e del conosciuto potenziatore VX-770 [Ma T, Thiagarajah JR, Yang H, Sonawane ND, Folli C, Galietta LJ, Verkman AS (2002) Thiazolidinone CFTR inhibitor identified by high-throughput screening blocks cholera toxin-induced intestinal fluid secretion. J Clin Invest 110, 1651-1658], come sottolineato da un piccolo aumento di corrente (Figure 5A, C, E). Questo è stato confermato anche dalla piccola caduta di corrente causata dall'inibizione selettiva di CFTR dovuta all'aggiunta dell'inibitore 172 di CFTR (inh-172). Invece quando le cellule venivano incubate con Vx-809, è stato registrato un significativo aumento di corrente dopo la somministrazione di cpt-cAMP e Vx-770 o dei peptidi Esc (Figure 5B, D, E), dimostrando un consistente recupero dell'attività di CFTR. I risultati supportano l'ipotesi che entrambi i peptidi Esc non agiscano da correttori di CFTR, ma piuttosto come potenziatori efficienti con un'attività paragonabile a quella del Vx-770.

Effetto di frammenti dei peptidi Esc sull'attività di CFTR

Per conoscere se porzioni più piccole dei peptidi Esc fossero capaci di mantenere l'attività di potenziatore di CFTR dell'intero peptide, esperimenti di TEER sono stati condotti su linee di cellule bronchiali esprimenti F508del-CFTR, usando i frammenti 1-14 e 9-21 di Esc(1-21). Però, come mostrato nella figura 6, è stato registrato un trascurabile recupero dell'attività di CFTR, evidenziando che per ristabilire la funzionalità di F508del-CFTR è richiesta l’intera lunghezza (sequenza) del peptide Esc.

L'effetto dei peptidi su altre mutazioni di apertura (gating)

Allo scopo di verificare se l'attività di potenziatore dei peptidi Esc potesse essere estesa ad altre mutazioni di apertura (gating) di CFTR, è stato misurato il flusso entrante di ioduro, dato dalla velocità di spegnimento della fluorescenza, QR, in cellule FRT che esprimono G551D-CFTR. Maggiore è il flusso di ioduro, che indica l'apertura di CFTR, maggiore è il QR. Come riportato in figura 7, il QR ottenuto quando le cellule erano stimolate con FSK insieme a ogni peptide Esc era simile a quello trovato dalla combinazione di FSK GEN e significativamente maggiore rispetto a quello causato dalla sola FSK. I risultati chiaramente mostrano un recupero di CFTR da parte dei peptidi Esc anche in cellule che esprimono altre mutazioni di apertura (gating) come G551D.

Gli alti livelli misurati di resistenza (bassa conduttanza), mostrati in figura 1, hanno indicato che i due peptidi non causano nessuna dispersione para-cellulare di ioni e che le giunzioni cellulari sono ben serrate. Al contrario, un rapido aumento di conduttanza è stata ottenuta quando entrambi i peptidi venivano somministrati in presenza di FSK all'epitelio che esprime F508del-CFTR, 24h dopo il pre-trattamento con il correttore Vx-809, per l'espressione del canale CFTR sulla membrana apicale. Inoltre, la scoperta che dopo la somministrazione dell'inibitore specifico di CFTR (PPQ102), il livello di conduttanza tornava al valore iniziale (prima dell'attivazione di CFTR), sottolinea che il flusso di ioni stimolato dai nostri peptidi è mediato da CFTR. Considerando che un aumento significativo della conduttanza di CFTR è stato misurato quando i peptidi sono stati incubati con FSK senza GEN (Figura 2), questo significa che i peptidi Esc sono in grado di potenziare la funzione della CFTR difettiva probabilmente agendo come “apriscatole” (openers) del canale.

La capacità dei peptidi Esc di ristabilire la funzionalità della CFTR mutata è stata anche confermata dagli esperimenti in camera di Ussing su epiteli bronchiali derivati da un paziente omozigote per F508del. In questo caso, è stata calcolata la differenza tra la corrente ionica misurata al momento dell'aggiunta dei peptidi per attivare il canale e dopo quella determinata dall'inibizione specifica dovuta all'inibitore di CFTR 172. Una notevole caduta di corrente ionica è stata evidenziata dopo la somministrazione dell'inibitore specifico per CFTR 172 agli epiteli bronchiali pre-incubati con Vx-809 e poi trattati con cpt-cAMP ed i pepdtidi Esc. Questo risultato era simile a quello trovato quando il comune potenziatore Vx-770 veniva usato al posto di ciascun peptide Esc.

Gli esperimenti di TEER sono un comune saggio per lo screening iniziale di molecole capaci di recuperare l'attività di CFTR, mentre gli esperimenti di Ussing sono normalmente studiati per validare i dati ottenuti dallo screening primario, in accordo con Sondo E, Falchi F, Caci E, Ferrera L, Giacomini E, Pesce E, Tomati V, Mandrup Bertozzi S, Goldoni L, Armirotti A, Ravazzolo R, Cavalli A, Pedemonte N (2018) Pharmacological Inhibition of the Ubiquitin Ligase RNF5 Rescues F508del-CFTR in Cystic Fibrosis Airway Epithelia. Cell Chem Biol 25, 891-905 e898; Galietta LV, Jayaraman S, Verkman AS (2001) Cellbased assay for high-throughput quantitative screening of CFTR chloride transport agonists. Am J Physiol Cell Physiol 281, C1734-1742; Ma T, Thiagarajah JR, Yang H, Sonawane ND, Folli C, Galietta LJ, Verkman AS (2002) Thiazolidinone CFTR inhibitor identified by high-throughput screening blocks cholera toxin-induced intestinal fluid secretion. J Clin Invest 110, 1651-1658; Schmidt A, Hughes LK, Cai Z, Mendes F, Li H, Sheppard DN, Amaral MD (2008) Prolonged treatment of cells with genistein modulates the expression and function of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Br J Pharmacol 153, 1311-1323; Tomati V, Caci E, Ferrera L, Pesce E, Sondo E, Cholon DM, Quinney NL, Boyles SE, Armirotti A, Ravazzolo R, Galietta LJ, Gentzsch M, Pedemonte N (2018) Thymosin alpha-1 does not correct F508del-CFTR in cystic fibrosis airway epithelia. JCI Insight 3.]

In conclusione, i risultati hanno chiaramente evidenziato che oltre a mostrare una nota attività antibatterica, i peptidi Esc hanno anche la capacità di recuperare l'attività di CFTR con mutazioni di apertura (gating) (come F508de-CFTR e G551D-CFTR), presumibilmente aumentando la probabilità di apertura del canale. Questo effetto è probabilmente dovuto a una interazione diretta e a un legame dei peptidi ai domini NBDs della CFTR fosforilata, favorendo la dimerizzazione degli NBDs e l'apertura del canale, come già descritto per altri attivatori di CFTR, inclusa la GEN. E' stato anche dimostrato che l'intera sequenza dei peptidi ESC è necessaria per questo scopo. Infine, questi risultati rendono i peptidi Esc composti invitanti per il trattamento della patologia polmonare di FC poiché ristabiliscono l'attività della CFTR mutata.

Claims (4)

1. RIVENDICAZIONI 1. Composizione farmaceutica comprendente Esculentina-1a (1-21)NH2 di SEQ ID NO: 2 GIFSKLAGKKIKNLLISGLKG-NH2 e/o il diastereomero di Esculentina, Esc (1-21)-1c di SEQ ID NO: 3 GIFSKLAGKKIKNLLISGLKG-NH2 come principio attivo e adiuvanti e/o veicoli e/o veicoli e/o eccipienti farmaceuticamente accettabili per uso per ripristinare la disregolazione della composizione di acqua e ioni del liquido periciliare dovuta a mutazioni del gene CFTR che codifica per il regolatore di conduttanza transmembrana della fibrosi cistica (CFTR).
2. 2. Composizione farmaceutica comprendente Esculentina-1a (1-21)NH2 di SEQ ID NO: 2 GIFSKLAGKKIKNLLISGLKG-NH2 e/o il diastereomero di Esculentina, Esc (1-21)-1c di SEQ ID NO: 3 GIFSKLAGKKIKNLLISGLKG-NH2 come principio attivo e adiuvanti e/o veicoli e/o veicoli e/o eccipienti farmaceuticamente accettabili per uso per il trattamento della fibrosi cistica.
3. 3. Uso secondo le rivendicazioni 1 o 2 in cui la composizione farmaceutica ulteriormente comprende almeno un modulatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica scelto nel gruppo consistente di: Ivacaftor, Lumacaftor, Tezacaftor, VX-445, VX-659, VX-152, VX-440, VX-561 (CTP-656), QBW251, FDL169, GLPG1837, GLPG2222, GLPG2451, GLPG2737, GLPG3067, GLPG3067, PTI-428, PTI-801, PTI-808, QR-010, MRT5005, QBW276, SPX-101, AZD5634, BI 443651, o una loro miscela.
4. 4. Uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3 in cui il principio attivo è Esc(1-21)-1c of SEQ ID NO: 3.