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1. GEBIET
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Mikroorganismen nützlich für die Herstellung von 5-gliedrigen
oder 6-gliedrigen Ring-Lactamen aus aliphatischen α,ω-Dinitrilen
durch eine Kombination von biologischen und chemischen Methoden.
Spezieller wird zuerst ein aliphatisches α,ω-Dinitril in ein Ammoniumsalz
einer ω-Nitrilcarbonsäure in wässriger
Lösung
unter Verwendung eines Katalysators umgewandelt, der über eine
aliphatische Nitrilase (EC 3.5.5.7)-Aktivität verfügt oder einer Kombination von
Nitril-Hydratase (EC 4.2.1.84)- und Amidase (EC 3.5.1.4)-Aktivitäten. Das
Ammoniumsalz der ω-Nitrilcarbonsäure wird
sodann direkt in das entsprechende Lactam durch Hydrierung der wässrigen
Lösung
ohne Abtrennung des Intermediats ω-Nitrilcarbonsäure oder ω-Aminocarbonsäure umgewandelt.
Wenn das aliphatische α,ω-Dinitril
ebenfalls unsymmetrisch an dem α-Kohlenstoffatom
substituiert ist, erzeugt die Nitrilase das ω-Nitrilcarbonsäure-Ammoniumsalz, das
aus der Hydrolyse der ω-Nitril-Gruppe
mit mehr als 98% Regioselektivität
resultiert, wodurch lediglich eines der zwei möglichen Lactamprodukte während der
nachfolgenden Hydrierung erzeugt wird.
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2. BESCHREIBUNG DES VERWANDTEN
GEBIETES
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Nitrile
lassen sich leicht in die entsprechenden Carbonsäuren mit Hilfe einer Vielzahl
chemischer Prozesse umwandeln, wobei diese Prozesse im typischen
Fall stark saure oder basische Reaktionsbedingungen und hohe Reaktionstemperaturen
erfordern und in der Regel unerwünschte
Nebenprodukte und/oder große Mengen
anorganischer Salze als unerwünschte
Nebenprodukte erzeugen. Verfahren, bei denen eine durch Enzym katalysierte
Hydrolyse Nitril-Substrate in die entsprechenden Carbonsäuren umgewandelt
werden, sind häufig
bevorzugte chemische Methoden, da diese Verfahren oftmals bei Umgebungstemperatur
ablaufen, nicht die Anwendung stark saurer oder basischer Reaktionsbedingungen
erfordern und keine großen
Mengen an unerwünschten
Nebenprodukten erzeugen. Ein weiterer Vorteil der Enzym katalysierten
Hydrolyse von Nitrilen gegenüber
der chemischen Hydrolyse besteht darin, dass bei der Hydrolyse eine
Vielzahl von aliphatischen oder aromatischen Dinitrilen die Enzym
katalysierte Reaktion stark regioselektiv sein kann, wo lediglich eine
der zwei Nitril-Gruppen zu dem entsprechenden Ammoniumsalz der Carbonsäure hydrolysiert
wird.
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Ein
Nitrilase-Enzym wandelt ein Nitril direkt in das entsprechende Ammoniumsalz
der Carbonsäure
in wässriger
Lösung
ohne die intermediäre
Erzeugung eines Amids um. Die Verwendung aromatischer Nitrilasen für die Hydrolyse
aromatischer Nitrile zu den entsprechenden Ammoniumsalzen der Carbonsäure ist
seit vielen Jahren bekannt, jedoch ist erst vor kurzem über die
Verwendung aliphatischer Nitrilasen berichtet worden. Von Kobayashi
et al. (Tetrahedron, (1990) Bd. 46, 5587–5590; J. Bacteriology, (1990),
Bd. 172, 4807–4815)
ist eine aliphatische Nitrilase beschrieben worden, die aus Rhodococcus
rhodochrous K22 isoliert wurde, die die Hydrolyse aliphatischer
Nitrile zu den entsprechenden Ammoniumsalzen der Carbonsäure katalysiert;
ebenfalls wurden mehrere aliphatische α,ω-Dinitrile hydrolysiert und Glutaronitril
zu 4-Cyanobutansäure-Ammoniumsalz
mit 100%iger molarer Umwandlung unter Verwendung von Dauerzellen
als Katalysator umgewandelt worden. Es ist eine Nitrilase von Comamonas
testosteroni isoliert worden, die in der Lage ist, eine Reihe von aliphatischen α,ω-Dinitrilen
in das entsprechende Ammoniumsalz von ω-Nitrilcarbonsäure oder
das Ammoniumsalz der Dicarbonsäure
umzuwandeln (CA 2 103 616 (11.02.1994); S. Lévy-Schil, et al., Gene, (1995)
Bd. 161, 15- 20);
und zwar für
die Hydrolyse von Adiponitril mit einer maximalen Ausbeute an 5-Cyanovaleriansäure-Ammoniumsalz von
ca. 88%, die vor der vollständigen
Umwandlung des 5-Cyanovaleriansäure-Ammoniumsalzes zu
Adipinsäure-Diammoniumsalz
erhalten wurde.
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Von
M. L. Gradley und C. J. Knowles (Biotechnology Lett., (1994), Bd.
16, 41–46)
ist die Verwendung von Suspensionen von Rhodococcus rhodochrous
NCIMB 11216 berichtet worden, die über eine aliphatische Nitrilase-Aktivität zur Hydrolyse
mehrerer 2-Methylalkylnitrile verfügen. Die vollständige Umwandlung
von (+/–)-2-Methylbutyronitril
in 2-Methylbutansäure-Ammoniumsalz
wurde erhalten, obgleich die Hydrolyse von (+/–)-2-Methylhexannitril für das (+)-Enantiomer
enantiospezifisch zu sein scheint. C. Bengis-Garber und A. L. Gutman
(Appl. Microbiol. Biotechnol., (1989), Bd. 32, 11–16) haben
Rhodococcus rhodochrous NCIMB 11216 als Katalysator für die Hydrolyse
mehrerer Dinitrile verwendet. In dieser Arbeit wurden Fumaronitril
und Succinonitril in die entsprechenden Ammoniumsalze der ω-Nitrilcarbonsäure umgewandelt,
während
Glutaronitril, Adiponitril und Pimelonitril in die entsprechenden
Diammoniumsalze der Dicarbonsäure
umgewandelt wurden.
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Es
kann eine Kombination von 2 Enzymen, Nitril-Hydratase (NHase), und
Amidase verwendet werden, um aliphatische Nitrile in die entsprechenden
Ammoniumsalze der Carbonsäure
in wässriger
Lösung
umzuwandeln. Hierbei wird das aliphatische Nitril zunächst in
ein Amid mit Hilfe der Nitril-Hydratase
umgewandelt und anschließend
das Amid mit Hilfe der Amidase in das entsprechende Ammoniumsalz
der Carbonsäure
umgewandelt. Es ist von einer großen Vielzahl von Bakterienarten
bekannt, dass sie ein diverses Spektrum von Nitril-Hydratase- und
Amidase-Aktivitäten
besitzen, einschließlich
Rhodococcus, Pseudomonas, Alcaligenes, Arthrobacter, Bacillus, Bacteridium,
Brevibacterium, Corynebacterium und Micrococcus. Es sind sowohl
wässrige
Suspensionen dieser Mikroorganismen als auch die isolierten Enzyme
verwendet worden, um Nitrile in Amide und Carbonsäure-Ammoniumsalze umzuwandeln.
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Von
P. Hönicke-Schmidt
und M. P. Schneider (J. Chem. Soc., Chem. Commun., (1990), 648–650) ist ein
immobilisierter Rhodococcus sp.-Stamm CH 5 zur Umwandlung von Nitrilen
und Dinitrilen zu Carbonsäure-Ammoniumsalzen
bzw. ω-Nitrilcarbonsäure-Ammoniumsalzen
verwendet worden. Die Zellen enthalten sowohl eine Nitril-Hydratase-
als auch Amidase-Aktivität,
die Glutaronitril zu 4-Cyanobutansäure-Ammoniumsalz in
einer 79%igen isolierten Ausbeute bezogen auf 92% Umwandlung von
Substrat umwandelt. Von A. J. Blakely et al. (FEMS Microbiology
Lett., (1995), Bd. 129, 57–62)
sind die Nitril-Hydratase- und Amidase-Aktivität von Suspensionen von Rhodococcus
AJ270 zur regiospezifischen Hydrolyse von Malononitril und Adiponitril zur
Erzeugung lediglich der entsprechenden ω-Nitrilcarbonsäure-Ammoniumsalze
verwendet worden. H. Yamada et al. (J. Ferment. Technol., (1980),
Bd. 58, 495–500)
beschreiben die Hydrolyse von Glutaronitril zu einer Mischung von
4-Cyanobutyramid, 4-Cyanobutansäure, Glutarsäure und
Ammoniak unter Verwendung von Pseudomonas sp. K9, die sowohl eine
Nitril-Hydratase als auch Amidase enthalten. K. Yamamoto et al.
(J. Ferment. Bioengineering, 1992, Bd. 73, 125–129) beschreiben die Verwendung
von Corynebacterium sp. CH 5-Zellen, die sowohl eine Nitril-Hydratase-
als auch Amidase-Aktivität
enthalten, um trans-1,4-Dicyanocyclohexan zu trans-4-Cyanocyclohexancarbonsäure-Ammoniumsalz
mit einer Ausbeute von 99,4% umzuwandeln.
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J.
L. Moreau et al. (Biocatalysis, (1994), Bd. 10, 325–340) beschreiben
die Hydrolyse von Adiponitril zu Adipinsäure, Adipamid und Adipaminsäure durch
die intermediäre
Bildung von 5- Cyanovaleriansäure unter Verwendung
von Brevibacterium sp. R312 (Nitril-Hydratase- und Amidase-Aktivität). A. Kerridge
et al. (Biorg. Medicinal Chem., (1994), Bd. 2, 447–455) berichten über die
Verwendung von Brevibacterium sp. R312 (Nitril-Hydratase- und Amidase-Aktivität) zur Hydrolyse
von prochiralen 3-Hydroxyglutaronitril-Derivaten zu den entsprechenden
(S)-Cyanosäure-Ammoniumsalzen.
In der EP-P-178 106 B1 (31. März,
1993) wird die selektive Umwandlung einer der Cyano-Gruppen eines
aliphatischen Dinitrils zu der entsprechenden Carbonsäure, dem
Amid, dem Ester oder Thioester unter Anwendung der Mononitrilase-Aktivität (definiert
entweder als Nitrilase oder eine Kombination von Nitril-Hydratase/Amidase)
offenbart, die von Bacillus, Bacteridium, Micrococcus oder Brevibacterium
deriviert sind. Zusätzlich
zu den zahlreichen Beispielen bakterieller Katalysatoren, die über eine
Nitrilase-Aktivität
oder Nitril-Hydratase/Amidase-Aktivität verfügen demonstrieren Y. Asano
et al. (Agric. Biol. Chem., (1980), Bd. 44, 2497–2498), dass der Fungus Fusarium
merismoides TG-1 Glutaronitril zu 4-Cyanobutansäure-Ammoniumsalz und 2-Methylglutaronitril
zu 4-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz
hydrolysierte.
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Im
Stand der Technik ist keine Stelle gefunden worden, in der die Hydrierung
von Ammoniumsalzen aliphatischer ω-Nitrilcarbonsäuren in
wässriger
Lösung
zur direkten Erzeugung der entsprechenden Lactame beschrieben wurde.
Im eng verwandten Gebiet beschreibt die US-P-4 329 498 die Hydrierung
von Muconsäure-mononitril
zu 6-Aminocapronsäure
(6-ACA) in wasserfreiem Ethanol, der mit Ammoniak gesättigt ist,
indem ein Raney-Nickel-Katalysator-#2 verwendet wird. Nach Entfernung
des Hydrierungskatalysators und Erhitzen der ethanolischen Lösung von
6-ACA bis 170° bis
200°C war
der Ringschluss von 6-ACA zu Caprolactam zu erwarten. Der reduktive
Ringschluss entweder von β-Chinoxalinylpropansäuren (E.
C. Taylor et al., J. Am. Chem. Soc., (1965), Bd. 87, 1984–1990) oder
des verwandten 2-(2-Carboxyethyl)-3(4H)-chinoxalon (E. C. Taylor
et al., J. Am. Chem. Soc., (1965), Bd. 87, 1990–1995) durch Hydrierung in
1 N Natriumhydroxid-Lösung unter
Verwendung von Raney-Nickel als Katalysator soll Berichten zufolge
die entsprechenden 5-gliedrigen Ring-Lactame erzeugen, jedoch lediglich
nach Entfernung des Katalysators aus dem Produktgemisch und nach
einer Ansäuerung
des resultierenden Filtrats. Die Autoren führen aus, dass bei jeder beliebigen
dieser Reduktionen die "Lactam-Erzeugung lediglich
in sauer Lösung
ablaufen kann" (S.
1992, zweiter Abschnitt), was wahrscheinlich die Gegenwart der protonierten
Carbonsäure
und nicht des Carboxylatsalzes erfordert. Die US-P-4 730 040 offenbart
ein Verfahren für
die Herstellung von Caprolactam, indem eine wässrige Lösung von 5-Formylvaleriansäure mit Ammoniak und Wasserstoff
in Gegenwart eines Hydrierungskatalysators umgesetzt wird, wonach
Ammoniak aus dem Produktgemisch abgetrennt und die resultierende
Lösung
von 6-ACA bis 300°C
erhitzt wird.
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In
früheren
Arbeiten sind Einzeller offenbart worden, die sowohl über Nitril-Hydratase-
als auch Amidase-Aktivitäten
verfügen
und die zur Umwandlung von Nitrilen und Dinitrilen in verschiedene
Ammoniumsalze von Säuren
verwendet wurden. Im Stand der Technik ist jedoch keine Stelle gefunden
worden, in der der Ringschluss von Ammoniumsalzen von aliphatischen ω-Aminocarbonsäuren unter
den Bedingungen der Hydrierungsreaktion der vorliegenden Erfindung
(d.h. in einer wässrigen
Lösung,
die eine Überschuss
an zugesetztem Ammoniumhydroxid enthält) zur Erzeugung der entsprechenden
Lactame beschrieben wurde. Im nahe verwandten Gebiet ist der Ringschluss
von aliphatischen ω-Aminocarbonsäuren (nicht
jedoch der Ammoniumsalze) zu den entsprechenden Lactamen unter einer Vielzahl
von Reaktionsbedingungen veröffentlicht
worden. Von F. Mares und D. Sheehan (Ind. Eng. Chem. Process Des.
Dev., (1978), Bd. 17, 9-16) ist der Ringschluss von 6-Aminocapronsäure (6-ACA)
zu Caprolactam unter Verwendung von Wasser oder Ethanol als Lösemittel
beschrieben worden. In Wasser war die Reaktion der Cyclisierung
bei Konzentrationen unterhalb von 1 Mol/kg (ca. 1 M) reversibel
und die Konzentration von Caprolactam nahm mit steigender Temperatur
zu; bei einer Gesamtkonzentration von 6-ACA und Caprolactam von 0,85 Mol/kg
(ca. 0,85 M) wurde von einer Zunahme des prozentualen Caprolactams
von 38,7% bei 180°C
zu 92,2% bei 250°C
berichtet. In Ethanol wurde eine Caprolactam-Ausbeute bei 200°C von 98% erhalten, was der
Veröffentlichung
zufolge auf eine Verschiebung des Gleichgewichtes zurückzuführen ist,
die die freie Säure/freie
Amin-Form von 6-ACA in Ethanol begünstigt und weniger die intramolekulare
Alkylammoniumcarboxylat-Form von 6-ACA, die in Wasser vorherrscht.
Ein Verfahren für
die Herstellung von Caprolactam aus 6-ACA wurde auch in der US-P-4
599 199 beschrieben, wo 6-ACA in ein Aluminiumoxid-Wirbelbett in
Gegenwart von Dampf bei 290° bis
400°C eingeführt wurde.
Die Synthese von 5-, 6- und 7-gliedrigen Ring-Lactamen durch Cyclodehydratation
von aliphatischen ω-Aminosäuren und
Aluminiumoxid- oder Siliciumdioxid-Gel in Toluol bei kontinuierlicher
Entfernung des während
der Reaktion erzeugten Wassers ist von A. Bladé-Font (Tetrahedron Letters,
(1980), Bd. 21, 2443–2446)
berichtet worden. Danach ist eine freie Amino-Gruppe (unprotoniert)
erforderlich, damit die Cyclodehydratation stattfindet.
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Im
Stand der Technik ist keine Stelle gefunden worden, in der die Hydrierung
von Ammoniumsalzen aliphatischer ω-Nitrilcarbonsäuren in
wässriger
Lösung,
die Methylamin enthält,
zur direkten Erzeugung der entsprechenden N-Methyllactame beschrieben
worden. Im nahe verwandten Gebiet wurde 1,5-Dimethyl-2-pyrrolidinon
durch Hydrierung einer wässrigen
Lösung
von Levulinsäure
und Methylamin in Wasser unter Verwendung eines Raney-Nickel-Katalysators
bei 140°C
und einem Überdruck
von 1.000 bis 2.000 psig Wasserstoff hergestellt (R. L. Frank et
al., Org. Syntheses, (1954), Coll. Bd. 3, 328–329). Das resultierende Methylammoniumsalz
der 4-N-Methylaminopentansäure
wurde sodann zu dem entsprechenden Lactam durch Filtration der Produktmischung
und Destillation des Filtrats zur Entfernung von Wasser und Methylamin
cyclisiert. N-Alkyllactame sind auch mit Hilfe der direkten Hydrierung
einer wässrigen
Mischung hergestellt worden, die 2-Methylglutaronitril enthielt,
ein primäres
Alkylamin und einen Hydrierungskatalysator, wobei der Prozess eine
Mischung von 1,3- und 1,5-Dialkylpiperidon-2
lieferte (US-P-5 449 780). N-substituierte 2-Pyrrolidinone sind
durch Reaktion von γ-Valerolacton mit
einem Alkylamin bei 110° bis
130°C und
anschließendem
Erhitzen der resultierenden Mischung bis 250° bis 270°C und gleichzeitigem Abdestillieren
von Wasser hergestellt worden (F. B. Zienty und G. W. Steahly, J.
Am. Chem. Soc., (1947), Bd. 69, 715–716).
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Die
vorgenannten Verfahren für
die Herstellung von Lactamen oder N-Alkyllactamen haben ein oder mehrere
der folgenden Nachteile: die Anwendung von Temperaturen oberhalb
von 250°C,
um hohe Ausbeuten an Lactamen bei Verwendung von Wasser als Lösemittel
zu erhalten, die Entfernung von Wasser aus dem Reaktionsgemisch,
um das Gleichgewicht in Richtung auf die Lactam-Erzeugung zu verschieben,
die Einstellung des pH-Wertes des Reaktionsgemisches auf einen Säurewert
zugunsten der Lactamerzeugung oder die Verwendung eines organischen
Lösemittels,
worin das Ausgangsmaterial schwer löslich ist. Viele dieser Prozesse erzeugen
unerwünschte
Abproduktströme
oder Mischungen von Produkten, die nicht ohne weiteres abgetrennt
werden können.
Ein bedeutender Vorteil wäre
ein Verfahren für
die Umwandlung eines aliphatischen α,ω-Dinitrils in das entsprechende
Lactam oder N-Methyllactam in wässriger
Lösung
mit hoher Ausbeute und hoher Regioselektivität bei geringer Erzeugung von
Nebenprodukt oder Abproduktstrom und mit einer leichten Methode
zur Produktgewinnung.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
Mikrorganismen der Erfindung sind nützlich für die Herstellung 5-gliedriger
Ring-Lactame oder 6-gliedriger Ring-Lactame aus aliphatischen α,ω-Dinitrilen
hat die folgenden Schritte:
- (a) Kontaktieren
eines aliphatischen α,ω-Dinitrils
in einem wässrigen
Reaktionsgemisch mit einem Enzym-Katalysator, gekennzeichnet entweder
durch:
1) eine aliphatische Nitrilase-Aktivität, oder
2)
eine Kombination von Nitril-Hydratase und Amidase-Aktivitäten,
wodurch
das aliphatische α,ω-Dinitril
in ein Ammoniumsalz der ω-Nitrilcarbonsäure umgewandelt
wird;
- (b) Kontaktieren des aus Schritt (a) resultierenden wässrigen
Produktgemisches mit Wasserstoff und einem Hydrierungskatalysator,
wodurch das Ammoniumsalz der ω-Nitrilcarbonsäure direkt
umgewandelt wird zu dem entsprechenden Lactam ohne Isolierung des
Intermediats aus ω-Nitrilcarbonsäure, Ammoniumsalz der ω-Nitrilcarbonsäure, ω-Aminocarbonsäure oder
Ammoniumsalz der ω-Aminocarbonsäure; und
- (c) Gewinnen des Lactams aus dem aus Schritt (b) resultierenden
wässrigen
Produktgemisches.
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Vor
dem Schritt (b) können
Ammoniumhydroxid, Ammoniak-Gas oder Methylamin der wässrigen
Produktmischung von Schritt (a) zugesetzt werden. Diese Zugabe kann
Null bis 4 val im Bezug auf die Menge an vorhandenem Ammoniumsalz
der ω-Nitrilcarbonsäure betragen.
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In
einer weiteren Ausführungsform
wird ein aliphatisches α,ω-Dinitril
mit der Formel NCCXa(R)(CH2)nCN verwendet, worin a Null oder 1 beträgt, X ist
Wasserstoff, wenn a = 1 gilt und R = H, unsubstituiertes oder substituiertes
Alkyl oder unsubstituiertes oder substituiertes Alkenyl oder unsubstituiertes
oder substituiertes Alkyliden und worin n 1 oder 2 beträgt.
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Mikroorganismen,
die durch eine aliphatische Nitrilase-Aktivität gekennzeichnet sind und in
dem Prozess verwendbar sind, sind: Acidovorax facilis 72-PF-15 (ATCC
55747), Acidovorax facilis 72-PF-17 (ATCC 55745) und Acidovorax
facilis 72W (ACC 55746). Ein Mikroorganismus, der durch eine Kombination
von Nitril-Hydratase- und Amidase-Aktivitäten gekennzeichnet ist und
in dem Prozess verwendbar ist, ist Comamonas testosteroni 5-MGAM-4D
(ATCC 55744).
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Eine
weitere Ausführungsform
ist ein Verfahren zur Herstellung von 5-gliedrigen Ring-Lactamen
oder 6-gliedrigen Ring-Lactamen aus aliphatischen α,ω-Dinitrilen,
umfassend:
- (a) Kontaktieren eines aliphatischen α,ω-Dinitrils
entweder der Formel: worin R1 und
R2 beide H sind und R3,
R4, R5 und R6 jeweils unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend
aus H, unsubstituiertem oder substituiertem Alkyl oder unsubstituiertem
oder substituiertem Alkenyl in einem wässrigen Reaktionsgemisch mit
einem Enzymkatalysator, der ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend
aus: Acidovorax facilis 72W (ACC 55746), Acidovorax facilis 72-PF-15
(ATCC 55747), Acidovorax facilis 72-PF-17 (ATCC 55745) und Comamonas
testosteroni 5-MGAM-4D (ATCC 55744), wodurch das aliphatische α,ω-Dinitril
in ein Ammoniumsalz der ω-Nitrilcarbonsäure umgewandelt
wird;
- (b) Kontaktieren des aus Schritt (a) resultierenden wässrigen
Produktgemisches mit Wasserstoff und einem Hydrierungskatalysator,
wodurch das Ammoniumsalz der ω-Nitrilcarbonsäure direkt
umgewandelt wird zu dem entsprechenden Lactam ohne Isolierung des
Intermediats aus ω-Nitrilcarbonsäure, Ammoniumsalz der ω-Nitrilcarbonsäure, ω-Aminocarbonsäure oder
Ammoniumsalz der ω-Aminocarbonsäure;
- (c) Gewinnen des Lactams aus dem aus Schritt (b) resultierenden
wässrigen
Produktgemisch.
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Eine
weitere Ausführungsform
ist ein Verfahren für
die Herstellung 5-gliedriger Ring-Lactame oder 6-gliedriger Ring-Lactame
aus aliphatischen α,ω-Dinitrilen,
umfassend:
- (a) Kontaktieren eines aliphatischen α,ω-Dinitrils
entweder der Formel: worin R7,
R8, R9, R10, R11 und R12 jeweils unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend
aus H, unsubstituiertem oder substituiertem Alkyl oder unsubstituiertem
oder substituiertem Alkenyl, und worin entweder eines oder beide
R7 oder R8 nicht
H sind;
in einem wässrigen
Reaktionsgemisch mit Comamonas testosteroni 5-MGAM-4D (ATCC 55744),
wodurch das aliphatische α,ω-Dinitril
in ein Ammoniumsalz der ω-Nitrilcarbonsäure umgewandelt
wird;
- (b) Kontaktieren des aus Schritt (a) resultierenden wässrigen
Produktgemisches mit Wasserstoff und einem Hydrierungskatalysator,
wodurch das Ammoniumsalz der ω-Nitrilcarbonsäure direkt
umgewandelt wird zu dem entsprechenden Lactam ohne Isolierung des
Intermediats aus ω-Nitrilcarbonsäure, Ammoniumsalz der ω-Nitrilcarbonsäure, ω-Aminocarbonsäure oder
Ammoniumsalz der ω-Aminocarbonsäure;
- (c) Gewinnen des Lactams aus dem aus Schritt (b) resultierenden
wässrigen
Produktgemisch.
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Schließlich werden
neuartige Verbindungen wie folgt gewährt:
eine Verbindung der
Formel III
worin M
+ entweder
H
+ oder NH
4 + ist; und
eine Verbindung der Formel
IV
worin M
+ entweder
H
+ oder NH
4 + ist.
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KURZE BESCHREIBUNG DER
BIOLOGISCHEN HINTERLEGUNGEN
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Die
Anwender haben für
die folgenden biologischen Hinterlegungen im Rahmen des Budapester
Vertrages gesorgt:
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Wie
hierin verwendet wird, bezeichnet "ATCC" die "American Type Culture
Collection" als
Internationale Hinterlegungsstelle in 12301 Parklawn Drive, Rockville,
MD 20852, USA. Die "ATCC-Nr." ist die Zugriffsnummer
zu den Kulturen der Hinterlegung bei der ATCC.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Es
ist ein Verfahren zur Herstellung von Lactamen aus aliphatischen α,ω-Dinitrilen
mit hohen Ausbeuten entwickelt worden, bei dem eine Kombination
von enzymatischen und chemischen Reaktionen genutzt wird. In den
Fällen,
wo das α,ω-Dinitril
unsymmetrisch substituiert ist, erhält man eine hohe Regioselektivität von einem
der zwei möglichen
Lactamprodukte (Reaktionsschema 1). REAKTIONSSCHEMA
1
worin sind:
a Null oder 1;
X Wasserstoff,
wenn a = 1 gilt;
n 1 oder 2;
R = H, unsubstituiertes oder
substituiertes Alkyl oder unsubstituiertes oder substituiertes Alkenyl
oder unsubstituiertes oder substituiertes Alkyliden; und
R
1 H, -CH
3.
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Die
Produkte der vorliegenden Erfindung sind als Präkursoren für Polymere, Lösemittel
und hochwertigen Chemikalien in der landwirtschaftlichen und pharmazeutischen
Industrie verwendbar. Bei dem Verfahren werden Temperaturen unterhalb
von 250°C
eingesetzt, um eine hohe Ausbeute an Lactam zu erhalten, sofern Wasser
als Lösemittel
verwendet wird. Im Vergleich zu früher bekannten chemischen Lactam-Prozessen
erzeugt das erfindungsgemäße Verfahren
wenig Abprodukt und erlaubt eine leichte Vorgehensweise bei der
Produktgewinnung.
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Sofern
nicht anders angegeben, gelten in der Patentanmeldung die folgenden
Abkürzungen
und Definitionen:
"Enzymkatalysator" bezieht sich auf
einen Katalysator, der gekennzeichnet ist entweder durch eine Nitrilase-Aktivität oder eine
Kombination einer Nitril-Hydratase-Aktivität und einer Amidase-Aktivität. Der Katalysator kann
in Form ganzer mikrobieller Zellen vorliegen, in Form einer/mehrerer
permeabilisierter mikrobieller Zelle(n), einer oder mehrerer Zellkomponenten
eines mikrobiellen Zellextraktes, teilweise gereinigten Enzyms/Enzyme
oder gereinigten Enzyms/Enzyme.
"Hydrierungskatalysator" bezieht sich auf
ein Material, das die Hydrierung beschleunigt, ohne selbst verbraucht
zu werden oder einer chemischen Veränderung zu unterliegen.
"Wässriges Produktgemisch" wird zur Bezeichnung
einer wässrigen
Mischung verwendet, die ein aus dem entsprechenden Verfahrensschritt
resultierendes Produkt enthält.
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A. Umwandlung eines aliphatischen α,ω-Dinitrils
in das entsprechende Ammoniumsalz einer ω- Nitrilcarbonsäure mit hoher Ausbeute und
hoher Regioselektivität
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Der
erste Schritt dieses Verfahrens ist die Umwandlung eines aliphatischen α,ω-Dinitrils
in das entsprechende Ammoniumsalz einer ω-Nitrilcarbonsäure unter
Verwendung eines Enzymkatalysators. Der Enzymkatalysator verfügt entweder über eine
Nitrilase-Aktivität,
wo die Nitrilase das α,ω-Dinitril
direkt in das entsprechende Ammoniumsalz einer ω-Nitrilcarbonsäure umwandelt
(Gleichung 1), oder über
eine Kombination von zwei Enzym-Aktivitäten, nämlich der Nitril-Hydratase
(NHase) und Amidase, wo das aliphatische α,ω-Dinitril zuerst in ein ω-Nitrilalkylamid
mit Hilfe der Nitril-Hydratase umgewandelt wird und anschließend das ω-Nitrilalkylamid
mit Hilfe der Amidase in das entsprechende Ammoniumsalz einer ω-Nitrilcarbonsäure umgewandelt
wird (Gleichung 2):
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Aus
Bodenproben ist eine neuartige Mikrobe Acidovorax facilis 72W (ATCC
55746) isoliert worden, die an aliphatischen Nitrilen oder Dinitrilen
exponiert wurde und die 2-Ethylsuccinonitril als eine Stickstoffquelle nutzen
könnte.
Bei Verwendung als ein mikrobieller, ganzzelliger Katalysator für die Hydrolyse
von unsymmetrisch substituierten α-Alkyl-α,ω-dinitrilen,
wie beispielsweise 2-Methylglutaronitril
(2-MGN) oder 2-Ethylsuccinonitril (2-ESN), wird eine Mischung von
Produkten erhalten. Im Verlaufe der Reaktionen der Hydrolyse werden
zusätzlich
zu der gewünschten ω-Nitrilcarbonsäure entsprechende
Dicarbonsäuremonoamide
und Dicarbonsäuren
erzeugt. Es ist entdeckt worden, dass das Erhitzten einer Suspension
von Acidovorax facilis 72W (ATCC 55746) in einem geeigneten Puffer
bei 50°C
für eine
kurze Zeitdauer eine unerwünschte
Nitril-Hydratase-Aktivität
des ganzzelligen Katalysators deaktiviert, der die Erzeugung der
unerwünschten
Dicarbonsäuremonoamide
katalysiert (die durch eine Amidase weiter umgewandelt werden zu
der entsprechenden Dicarbonsäure).
Auf diese Weise wird ein ganzzelliger Katalysator hergestellt, der über eine
Nitrilase-Aktivität
verfügt,
die ein α-Alkyl-α,ω-dinitril
in lediglich das Ammoniumsalz der ω-Nitrilcarbonsäure umwandelt,
das aus der Hydrolyse der ω-Nitril-Gruppe
resultiert.
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Die
Wärmebehandlung
von Suspensionen von Acidovorax facilis 72W (ATCC 55746) bei 50°C für eine Stunde
erzeugt einen mikrobiellen ganzzelligen Katalysator, der 2-Methylglutaronitril
(2-MGN) zu 4-Cyanopentansäure
(4-CPA)-Ammoniumsalz, 2-Methylenglutaronitril (2-MEGN) zu 4-Cyano-4-pentensäure (4-CPEA)-Anunoniumsalz
oder 2-Ethylsuccinonitril (2-ESN) zu 3-Cyanopentansäure (3-CPA)-Ammoniumsalz mit
außerordentlich
hoher Regioselektivität
derart umwandelt, dass bei vollständiger Umwandlung des Nitrils mindestens
eine Ausbeute von 98% des Ammoniumsalzes der ω-Nitrilcarbonsäure durch
Hydrolyse der ω-Nitril-Gruppe
erzeugt wird (Tabelle 1):
-
-
Es
gibt gegenwärtig
keine nichtenzymatischen Methoden für die selektive Hydrolyse von
lediglich einer Nitril-Gruppe eines aliphatischen Dinitrils zu entweder
einer Amid-Gruppe oder einer Carbonsäure-Gruppe bei vollständiger Umwandlung des Dinitrils.
Wenn eine derartige Reaktion zu einer unvollständigen Umwandlung (<20% Umwandlung)
ausgeführt
wird, um eine hohe Selektivität
im Bezug auf ein Monoamid- oder Monosäure-Hydrolyseprodukt zu erhalten,
wird zur Abtrennung des Produktes von nicht umgesetztem Dinitril
und für
die Rückführung des
Dinitrils in die nachfolgende Reaktion ein Trennungsschritt erforderlich.
Nichtenzymatische Hydrolysereaktionen umfassen typischerweise auch
ein Erhitzen von Lösungen
des Nitrils oder Dinitrils bei erhöhten Temperaturen und oftmals
in Gegenwart einer starken Säure
oder Base, während
im Gegensatz dazu die enzymkatalysierte Reaktion, wie sie vorstehend
beschrieben wurde, bei Umgebungstemperatur in wässriger Lösung und bei neutralem pH-Wert
ohne zugesetzte Säure
oder Base ausgeführt
wird.
-
Es
sind zwei Mutanten des Acidovorax facilis 72W (ATCC 55746)-Stammes
präpariert
worden, die lediglich sehr geringe Mengen der unerwünschten
Nitril-Hydratase-Aktivität
aufweisen, die für
die Erzeugung unerwünschter
Nebenprodukte verantwortlich ist. Diese Mutantenstämme, von
Acidovorax facilis 72-PF-15 (ATCC 55747) und Acidovorax facilis
72-PF-17 (ATCC 55745) erfordern keine Wärmebehandlung der Zellen vor
der Verwendung als Katalysator für
die Hydrolyse eines aliphatischen α,ω-Dinitrils zu dem entsprechenden Ammoniumsalz
einer ω-Nitrilcarbonsäure. Im
Tabelle 2 wird ein Vergleich der Ausbeuten von 4-CPA und 2-Methylglutarsäure (2-MGA)
gezeigt, die durch Hydrolyse von 2-MGN unter Verwendung von unbehandelten
und wärmebehandelten
Acidovorax facilis 72W (ATCC 55746) und des unbehandelten Acidovorax
facilis 72-PF-15 (ATCC 55747)-Mutantenstammes erhalten worden: TABELLE
2
-
Bei
Verwendung von wärmebehandelten
Acidovorax facilis 72W (ATCC 55746) als Katalysator für die Hydrolyse
wässriger
Lösungen
der unsubstituierten aliphatischen α,ω-Dinitrile, Succinonitril (SCN,
1,25 M) oder Glutaronitril (GLN, 1,5 M), werden die entsprechenden
Ammoniumsalze der ω-Nitrilcarbonsäure, 3-Cyanopropansäure (3-CPRA)
und 4-Cyanobutansäure
(4-CBA) in Ausbeuten von 99,7% bzw. 92,3% erzeugt, und die entsprechenden
Dicarbonsäuren
sind lediglich beobachtete Nebenprodukte. Sofern dieser gleiche
Katalysator für
die Umwandlung von Adiponitril (ADN) zu 5-Cyanopentansäure (5-CPA)-Ammoniumsalz verwendet wird,
ist das Hauptprodukt Adipinsäure
(ADA)-Diammoniumsalz.
(>50% Ausbeute). Weder
Acidovorax facilis 72W (ATCC 55746) noch Acidovorax facilis 72-PF-15
(ATCC 55747) sind als Katalysator für die Herstellung von 5-CPA-Ammoniumsalz
mit hoher Ausbeute geeignet.
-
Es
wurden mehr als 30 verschiedene mikrobielle Kulturen, die aus Bodenproben
isoliert wurden, die an aliphatischen Nitrilen oder Dinitrilen exponiert
wurden und die auf verschiedenen Nitrilen oder Amiden als Stickstoffquelle
wachsen könnten,
einem Screening auf hohe Selektivität für die 5-CPA-Erzeugung unterzogen. Es wurde eine
zweite neuartige Mikrobe, Comamonas testosteroni 5-MGAM-4D (ATCC
55744) isoliert (unter Verwendung von 2-Methylglutaramid als Stickstoffquelle),
die mehrere Nitril-Hydratase- und Amidase-Aktivitäten enthielt.
Bei Verwendung als ganzzelliger Katalysator für die Hydrolyse von ADN setzt
sich das resultierende Produktgemisch hauptsächlich aus ADA-Diammoniumsalz, Adipamid
(ADAM) und Adipaminsäure
(ADMA) zusammen, wobei lediglich eine geringe Ausbeute an 5-CPA-Anunoniumsalz
beobachtet wurde. Wiederum wurde festgestellt, dass ein Erhitzen
der Mikrobe bei 50°C
für eine
kurze Zeitdauer eine unerwünschte
Nitril-Hydratase-Aktivität
in großem
Maße deaktivierte
und einen mikrobiellen Katalysator mit einer Nitril-Hydratase-Aktivität zurückließ, die ADN
zu 5-Cyanovaleramid umwandelt, sowie eine Amidase, die 5-Cyanovaleramid
zu 5-CPA-Ammoniumsalz
umwandelt. Die Wärmebehandlung
von Comamonas testosteroni 5-MGAM-4D bei 50°C für eine Stunde fuhrt zu einem
mikrobiellen Zellen-Katalysator, der 5-CPA in Ausbeuten bis zu 97%
bei vollständiger
Umwandlung von ADN erzeugt.
-
Die
Fähigkeit
zur Eliminierung unerwünschter
Nitril-Hydratase durch Wärmebehandlung,
während gleichzeitig
eine relativ wärmestabile
Nitrilase-Aktivität
oder Nitril-Hydratase-Aktivität
für die
Umwandlung von Dinitrilen zu Cyanosäuren zurückbleibt, war bisher noch nicht
bekannt und wäre
nicht vorherzusagen gewesen, da die Temperaturstabilität des Nitrilase-
oder Nitril-Hydratase-Enzyms unbekannt war. Es wird erwartet, dass
eine Wärmebehandlung
bei Temperaturen zwischen 35° und
70°C zwischen
10 und 120 Minuten die beschriebene nützliche Wirkung erzielen wird.
-
B. Herstellung von 5-
oder 6-gliedrigen Ring-Lactamen
-
Es
ist ein Verfahren für
die Herstellung von 5-gliedrigen oder 6-gliedrigen Ring-Lactamen
mit hohen Ausbeuten durch direkte Hydrierung des Produktgemisches
des Ammoniumsalzes von ω-Nitrilcarbonsäure entdeckt
worden, das durch enzymkatalysierte Hydrolyse aliphatischer α,ω-Dinitrile
in wässriger
Lösung
erzeugt wurde. Dieses Verfahren erfordert nicht die Abtrennung des
Ammoniumsalzes der ω-Nitrilcarbonsäure von
dem Produktgemisch der Hydrolysereaktion vor dem Schritt der Hydrierung,
noch erfordert es die Umwandlung des Ammoniumsalzes der ω-Nitrilcarbonsäure zur
freien Säure
(z.B. Umwandlung von 4-CPA-Anunoniumsalz zu 4-CPA) vor der Hydrierung
oder Abtrennung des resultierenden Ammoniumsalzes der ω-Aminocarbonsäure von
dem Produktgemisch der Hydrierung und die Umwandlung des Ammoniumsalzes
der freien Carbonsäure
zum Ringschluss.
-
Nach
dem Herstellen eines wässrigen
Produktgemisches, das das Ammoniumsalz einer ω-Nitrilcarbonsäure enthält, aus einem aliphatischen α,ω-Dinitrile
unter Verwendung eines Enzymkatalysators (Gleichung 3) war zu erwarten,
dass die Entfernung des Enzymkatalysators und Reaktion der resultierenden
wässrigen
Lösung
mit Wasserstoff und einem stöchiometrischen Überschuss
von zugesetztem Ammoniak (Ammoniumhydroxid) in Gegenwart eines geeigneten
Hydrierungskatalysators eine wässrige
Lösung
erzeugt, die ein Ammoniumsalz der aliphatischen ω-Aminocarbonsäure enthält (Gleichung
4):
-
Die
Verwendung eines Überschusses
an Ammoniak während
der Hydrierung eines Nitrils zum entsprechenden Amin ist erforderlich,
um die reduktive Alkylierung eines Imin-Intermediats (erzeugt während der Hydrierung
der Nitril-Gruppe zu einem Amin) durch das Produkt ω-Aminocarbonsäure zu begrenzen,
das zu einer Dim-Ererzeugung und einem Ausbeuteverlust führt. Diese
Methode ist ausreichend dokumentiert (De Bellefon et al., Catal.
Rev. Sci. Eng., (1994), Bd. 36, 459–506) und wird üblicherweise
von der Fachwelt für
die Hydrierung von Nitrilen praktiziert.
-
Anhand
des Standes der Technik war zu erwarten, dass das durch Hydrierung
eines Ammoniumsalzes der ω-Nitrilcarbonsäure erzeugte
Ammoniumsalz der ω-Aminocarbonsäure in die
freie Säure
hätte umgewandelt
werden müssen
und isoliert werden müssen
(Gleichung 5), bevor eine thermisch eingeleitete Ringschlussreaktion
zur Erzeugung des gewünschten
Lactams hätte
ausgeführt
werden können
(Gleichung 6). Nach Mares et al. (supra), existieren 6-Aminocapronsäure (6-ACA)
(Gleichung 6, n = 3, R = H) und Caprolactam als eine reversible
Gleichgewichtsmischung bei Konzentrationen unterhalb von 1,0 M/kg
(etwa 1,0 M) in Wasser und die Konzentration von Caprolactam nimmt
mit steigender Temperatur zu. Bei einer Gesamtkonzentration der
6-ACA und des Caprolactams von 0,85 Mol/kg (etwa 0,85 M) nahm der prozentuale
Anteil von Caprolactam nach Angaben von Mares et al. von 38,7% bei
180°C auf
92,2% bei 250°C
zu.
-
-
In
dem vorliegenden Fall, wo ein Überschuss
an zugesetztem Ammoniak (als Ammoniumhydroxid) vorliegt und der
pH-Wert des Reaktionsgemisches zwischen 9 und 10 liegt, war nicht
zu erwarten, dass das Ammoniumsalz von 6-ACA unter Erzeugung größerer Mengen
von Caprolactam bei Temperaturen der Hydrierung unterhalb von 200°C zum Ringschluss
kommen würde.
Die pKa-Werte der Carbonsäure-Gruppe
und der protonierten Amin-Gruppe von 6-Aminocapronsäure betragen
4,373 bzw. 10,804 (Lange's
Handbook of Chemistry, J. A. Dean, Herausg., 14. Ausgabe, (1992),
McGraw-Hill, NY, S. 8,22 (als 6-Aminohexansäure)), während der pKa-Wert von NH4 + 9,25 beträgt. Bei
einem pH-Wert des Reaktionsgemisches zwischen 9 und 10 lässt sich
berechnen, dass mindestens 99,997% des 6-ACA in der Lösung als
das Ammoniumsalz der Carbonsäure
existieren und darüber
hinaus näherungsweise
die Hälfte
der Amin-Gruppen des Ammoniumsalzes der 6-Aminocapronsäure ebenfalls
protoniert ist. Daher war nicht zu erwarten, dass größere Mengen
des 6-ACA-Ammoniumsalzes unter Erzeugung von Caprolactam unter den
Bedingungen der Hydrierung nach der vorliegenden Erfindung zum Ringschluss
kommen würden,
wo die Verdrängung
eines Hydroxyl-Anions (OH-) aus dem Intermediat
der Ringschlussreaktion, wie sie in Gleichung (7) dargestellt ist,
nicht begünstigt
wird.
-
-
Sofern
Hydrierungen von wässrigen
Lösungen
von 5-CPA-Ammoniumsalz (hergestellt durch enzymatische Hydrolyse
von ADN) in Gegenwart von Null bis 2,0 M NH
4OH
bei Temperaturen von 70° bis
160°C ausgeführt wurden,
wurde eine vollständige
Umwandlung von 5-CPA- zu 6-ACA-Ammoniumsalz
mit geringer Bildung von Nebenprodukt beobachtet und, wie vorhergesagt,
Ausbeuten an Caprolactam (das resultierende 7-gliedrige Ring-Lactam)
von weniger als 3% erhalten (Tabelle 3): TABELLE
3
-
Ausbeuten
von Caprolactam von weniger als 3% wurden auch erhalten, wenn wässrige Lösungen,
die durch Mischen von authentischer 6-ACA und Ammoniumhydroxid hergestellt
wurden, unter den gleichen Bedingungen der Hydrierungsreaktion behandelt
wurden wie bei der Hydrierung des Ammoniumsalzes von 5-CPA, das
durch enzymatische Hydrolyse von ADN hergestellt wurde. Der Ringschluss
des Ammoniumsalzes von 6-ACA in wässrigen Lösungen, die durch Hydrierung
von 5-CPA-Ammoniumsalz
bei 70°C
hergestellt wurden, wurde bei Temperaturen oberhalb von 200°C versucht,
indem zuerst der Hydrierungskatalysator entfernt und anschließend die
etwa 1,0 M 6-ACA-Ammoniumsalz-Produktmischungen
für 2 Stunden
bei 280°C
erhitzt wurden. Es wurden Ausbeuten an Caprolactam von weniger als
18% erzeugt (Tabelle 4). Diese Ergebnisse demonstrieren, dass lediglich
sehr geringe Ausbeuten an Caprolactam durch die direkte Hydrierung
wässriger Lösungen von
5-CPA-Ammoniumsalz in Gegenwart von überschüssigem Ammoniak erhalten werden.
Dieses war angesichts der vorhergesagten Unfähigkeit des 6-ACA-Ammoniumsalzes,
einen Ringschluss einzugehen, speziell in Gegenwart von überschüssigem Ammoniumhydroxid
zu erwarten. TABELLE
4
-
Es
war ebenfalls zu erwarten, dass, wenn wässrige Mischungen von 3-Cyanopentansäure (3-CPA)-Ammoniumsalz (hergestellt
durch enzymatische Hydrolyse von 2-Ethylsuccinonitril (2-ESN)) oder 4-Cyanovaleriansäure (4-CPA)-Ammoniumsalz
(hergestellt durch enzymatische Hydrolyse von 2-Methylglutaronitril (2-MGN)) von 70° bis 160°C in Gegenwart
von überschüssigem Ammoniak
hydriert wurden, die entsprechenden Ammoniumsalze der ω-Aminocarbonsäure erzeugt
würden
und dass diese Salze hätten
als freie Säuren
isoliert werden müssen,
bevor die Ringschlussreaktion zu dem entsprechenden Lactam hätte ausgeführt werden
können
(wie das der Fall bei dem 5-CPA-Ammoniumsalz ist). Obgleich die
pKa-Werte der Carbonsäure
und die protonierten Aminfunktionalitäten des Produktes 4-Amino-3-ethylbutansäure oder
5-Amino-4-methylpentansäure
nicht veröffentlicht
worden sind, kann man durchaus annehmen, dass diese pKa-Werte ähnlich denjenigen
des 6-ACA-Isomers sind.
-
Unerwartet
erzeugte die Hydrierung wässriger
Lösungen
von 3-CPA-Ammoniumsalz (erzeugt durch enzymatische Hydrolyse von
2-ESN) in Gegenwart von Raney-Nickel und überschüssigem Ammoniak bei pH 9 bis
10 und Temperaturen von 70° bis
180°C für 2 Stunden
das entsprechende Lactam 4-Ethylpyrrolidin-2-on (4-EPRD) direkt
und dieses mit Ausbeuten bis zu 91% (Tabelle 5). Die Ausbeute an
4-EPRD nahm außerdem mit
steigender Konzentration von zugesetztem Ammoniumhydroxid (zugesetzt
zusätzlich
zu der Konzentration von Ammonium-Ion, die bereits als das Ammoniumsalz
der Carbonsäure
vorhanden war) zu, womit sich zeigt, wie wünschenswert es ist, die Hydrierung
wässriger
Lösungen
der Ammoniumsalze der Mononitrilsäuren in Gegenwart von zugesetztem
Ammoniak auszuführen,
um die wohl bekannten Reaktionen der reduktiven Alkylierung, die
Dimer und Polymer erzeugen (Tabelle 6), zu begrenzen. TABELLE
5
TABELLE
6
-
Die
Hydrierung wässriger
Lösungen
von 4-CPA-Ammoniumsalz (erzeugt durch enzymatische Hydrolyse von
2-MGN) in Gegenwart von Raney-Nickel und überschüssigem Ammoniak bei pH 9 bis
10 und bei 160°C
für 2 Stunden
erzeugt das entsprechende Lactam 5-Methyl-2-piperidon (5-MPPD) direkt
und dieses mit Ausbeuten bis zu 96% (Tabelle 7): TABELLE
7
-
Hydrierung
wässriger
Lösungen
der Ammoniumsalze von 3-Cyanopropansäure (3-CPRA) oder 4-Cyanobutansäure (4-CBA)
(erzeugt durch enzymatische Hydrolyse der entsprechenden α,ω-Dinitrile)
erzeugt die entsprechenden Lactame 2-Pyrrolidinon und 2-Piperidon
mit Ausbeuten von 91,0% bzw. 93,5%. Die Hydrierung wässriger
Lösungen
von 4-Cyano-4-pentensäure
(4-CPEA)-Ammoniumsalz (erzeugt durch enzymatische Hydrolyse von
2-Methylenglutaronitril) führt
zur Hydrierung sowohl des Nitrils als auch der Kohlenstoff Kohlenstoff
Doppelbindung unter Erzeugung von 5-Methyl-2-piperidon mit einer
Ausbeute bis zu 85%.
-
Durch
Zusetzen eines Überschusses
an Ammoniak (als Ammoniumhydroxid) zu den Hydrierungsreaktionen,
um die reduktive Alkylierung während
der Hydrierung von Nitrilen zu Aminen zu begrenzen, hätten mehrere
zusätzliche
Reaktionen unter Erzeugung von Nebenprodukt auftreten können (De
Bellefon et al., Catal. Rev. Sci. Eng., (1994), Bd. 36, 459–506). In
der Fachwelt ist gut bekannt, dass eine übliche Methode für die Herstellung
eines Amids oder Carbonsäure
aus einem Nitril darin besteht, dass man eine wässrige Mischung des Nitrils
in Gegenwart eines sauren oder basischen Katalysators erhitzt. Daher
wäre eine
zu erwartende konkurrierende Reaktion des Ammoniumsalzes einer Mononitril-Carbonsäure unter
den Hydrierungsbedingungen, wie sie in der vorliegenden Erfindung
zur Anwendung gelangen, die basisch katalysierte Hydrolyse der Nitril-Gruppe
unter Erzeugung entweder des Dicarbonsäure-Monoamidammoniumsalzes
oder des Dicarbonsäure-Diammoniumsalzes.
Diese unerwünschten
Nebenprodukte von Amid/Säure
und Dicarbonsäure-Ammoniumsalzen
werden während
der Hydrierungen erzeugt, allerdings im Vergleich zu den Ausbeuten
an Lactam in sehr geringen Ausbeuten.
-
Eine
zweite Reaktion unter Erzeugung von Nebenprodukt zwischen dem vorhandenen überschüssigen Ammoniak
und dem Produkt Lactam hätte
zur Erzeugung einer Gleichgewichtsmischung des Lactams mit dem erwarteten
Ammonolyseprodukt, ein ω-Aminocarboxamid,
führen
können.
Die hohen Ausbeuten der 5-gliedrigen und 6-gliedrigen Ring-Lactame,
die unter den erfindungsgemäßen Reaktionsbedingungen
erreicht werden, legen nahe, dass die Ammonolyse (oder basisch katalysierte
Hydrolyse) der Produkt-Lactame nicht von Bedeutung ist.
-
Darüber hinaus
wurden zum Herstellen von Lactamen aus aliphatischen α,ω-Dinitrilen
N-Methyl-Lactame
durch Ersetzen von Methylamin für
Ammoniak in der Hydrierung wässriger
Lösungen
der Ammoniumsalze von 4-CPA oder 3-CPA hergestellt. Der Zusatz von
einem bis vier Äquivalenten
Methylamin (pKa 10,62 für das
protonierte Amin) zu einer wässrigen
Lösung
von 4-CPA, die ein Äquivalent
Ammonium-Ion (pKa 9,25) enthält,
hätte erwartungsgemäß eine größere Menge
an freiem Ammoniak (in Folge der relativen Unterschiede der pKa-Werte
von protoniertem Methylamin und Ammonium-Ionen in Wasser) erzeugen
müssen.
Dieses freie Ammoniak könnte
dann mit dem unprotonierten Methylamin bei der Reaktion mit dem
Intermediat Imin konkurrieren, das während der Hydrierung der Nitril-Gruppe
erzeugt wird, und zur Erzeugung einer Mischung der Ammoniumsalze
von 5-Amino-4-methylpentansäure bzw.
5-N-Methylamino-4-methylpentansäure
führen,
die wiederum unter Erzeugung von 5-MPPD bzw. 1,5-Dimethyl-2-piperidon
(1,5-DMPD) cyclisieren.
-
Die
relativen Ausbeuten an 5-MPPD und 1,5-DMPD, die durch Hydrierung
von 1,0 M wässrigen
Lösungen
des Ammoniumsalzes von 4-CPA erzeugt werden, erweisen sich als abhängig von
der Wahl des Katalysators. Raney-Nickel und Ruthenium-auf-Aluminiumoxid
erzeugen jeweils 5-MPPD als das Lactam-Hauptprodukt und dieses selbst bei Gegenwart
von 3,0 M Methylamin, während
1,5-DMPD das Hauptprodukt ist, wenn 5% Pd/C oder 4,5% Pd/0,5% Pt/C
als Katalysator bei der gleichen Methylamin-Konzentration verwendet werden. Sofern
5% Pd/C als Katalysator verwendet werden, steigt die Ausbeute an
1,5-DMPD mit zunehmender Konzentration von Methylamin (Tabelle 8).
-
Der
Ersatz von 2,0 M Methylamin für
Ammoniak bei der Hydrierung wässriger
Lösungen
von 1,0 M 3-CPA-Ammoniumsalz bei 140°C und Verwendung eines Pd/C-Katalysators
erzeugt 4-Ethyl-1-methylpyrrolidin-2-on
(4-EMPRD) bzw. 4-EPRD mit Ausbeuten von 69,8% bzw. 20,4% bei einer
Umwandlung von 96%. TABELLE
8
-
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN
AUSFÜHRUNGSFORMEN
-
METHODEN UND MATERIALIEN:
-
Mikrobielle Katalysatoren
für die
Herstellung von ω-Nitrilcarbonsäuren
-
Es
wurden 2 Mikroorganismen zur Verwendung als mikrobieller Katalysator
für die
Umwandlung von aliphatischen α,ω-Dinitrilen
zu den entsprechenden ω-Nitrilcarbonsäuren isoliert:
Acidovorax facilis 72W (ATCC 55746) und Comamonas testosteroni 5-MGAM-4D
(ATCC 55744).
-
Acidovorax
facilis 72W (ATCC 55746) wurde aus einem in Orange, Texas eingesammelten
Boden isoliert. Die Standardprozeduren der Anreicherung wurden mit
dem folgenden Medium angewendet (E2-Basalmedium, pH 7,2):
-
Die
folgenden Ergänzungen
wurden an dem E2-Basalmedium für
die vorstehend beschriebenen Anreicherungen vorgenommen:
-
Es
wurden Stämme
unabhängig
auf der Basis von Wachstum und Ammoniakerzeugung auf dem Anreicherungs-Nitril
ausgewählt.
Es wurden Isolate durch wiederholtes Durchleiten von Bacto® Brain
Heart-Infusion-Agar (Difco, Detroit, Michigan) gefolgt von einem
Screening auf Ammoniak-Produktion von dem Anreicherungsnitril gereinigt.
Die gereinigten Stämme
wurden auf der Grundlage ihres Nutzungsprofils der Kohlenstoffquelle
auf einem Biolog®-Testsystem identifiziert
(Hayward, CA, USA), indem Gram-negative Testplatten verwendet wurden.
-
Zum
Testen von Nitril-Hydrolyse-Aktivität wurde E2-Basalmedium mit
10 g/l Glucose verwendet, um A. facilis 72W aufzuziehen. Das Medium
wurde mit 25 mM (±)-2-Methylglutaronitril
ergänzt.
Es wurde ein 10 ml Volumen von ergänztem E2-Medium mit 0,1 ml
gefrorener Stammkultur beimpft. Nach dem Aufziehen über Nacht
bei Raumtemperatur (22° bis
25°C) auf
einer Schüttelvorrichtung
mit 250 U/min wurden 10 ml Inoculum zu 990 ml frischem Medium in
einem 21 Kolben zugesetzt. Die Zellen wurden über Nacht bei Raumtemperatur unter
Rühren
mit ausreichend hoher Geschwindigkeit aufgezogen, um eine Blasenbildung
in dem Medium hervorzurufen. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren
geerntet, ein Mal mit 50 mM Phosphat-Puffer (pH 7,2)/15% Glycerin
gewaschen und die konzentrierte Zellpaste sofort auf Trockeneis
eingefroren und bei –65°C aufbewahrt.
Ebenfalls wurde in den 1 l-Fermentationen 10 mM Adiponitril verwendet.
Die Fermentationen wurden nach 16 bis 20 Stunden Wachstum angehalten.
Die Zellsuspension wurde bis 4°C
abgeschreckt, durch Zentrifugieren geerntet und bei –60°C eingefroren,
gefolgt von einer Wäsche
mit 15% Glycerin in 0,05 M Phosphat-Puffer von pH 7,2. Es wurden
aufgetaute Zellpasten zum Testen auf Nitril-Hydrolyse-Aktivität verwendet. Die
gewünschte
Eigenschaft der Mikroorganismen ist eine Nitril-Hydrolyse-Aktivität, die zum
regiospezifischen Angriff einer Dinitril-Verbindung in Abwesenheit von störender Amidase-Aktivität in der
Lage ist. Die Mikroorganismen haben die Neigung, einer Mutation
zu unterliegen. Einige Mutationen können für die gewünschte Nitril-Umwandlung günstig sein.
Daher können
sogar Mutanten des eigentlichen Bakterienstammes zur Ausführung des
Verfahrens der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
-
Außerdem wurden
Standard-Anreicherungsprozeduren angewendet für Comamonas testosteroni 5-MGAM-4D mit E2-Basalmedium,
pH 7,2, die insofern modifiziert waren, dass sie ein Zehntel der
Konzentration in dem vorstehen beschriebenen Standard-Basalmedium
an Vitaminen aufwiesen. Die folgenden Ergänzungen wurden an dem modifizierten
E2-Basalmedium für
die Anreicherungen vorgenommen:
-
Es
wurden Bakterienstämme
unabhängig
auf der Grundlage des Wachstums auf Anreicherungs-Nitrilamid ausgewählt. Die
Isolate wurden durch wiederholtes Überleiten auf Agarplatten unter
Verwendung des vorgenannten Mediums gereinigt. Die gereinigten Bakterienstämme wurden
auf der Grundlage ihres Nutzungsprofils der Kohlenstoffquelle auf
einem Biolog®-Testsystems
identifiziert (Hayward, CA, USA), indem Gram-negative Testplatten
verwendet wurden.
-
Beim
Testen der Nitril-Hydrolyse-Aktivität wurde modifiziertes E2-Basalmedium
mit 6,0 g/l entweder Glucose oder Glycerin zum Aufziehen von Zellmaterial
verwendet. Das Medium wurde mit 1,0% MGAM ergänzt. Es wurde ein 250 ml Schüttelkolben
(nicht mit Prallflächen
versehen) mit einem Gehalt von 50 ml ergänztem E2-Medium mit 0,2 ml
gefrorener Stammkultur beimpft und für 72 Stunden bei 30°C auf einer
Schüttelvorrichtung
bei 200 U/min aufgezogen. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren
geerntet und mit 10 ml von 20 mM KH2PO4, pH 7,0, gewaschen. Die Zellen wurden in
10 ml-Reaktionen mit einem Gehalt von 20 mM KH2PO4, pH 7,0, und 0,1 M entweder Methylglutaronitril
oder Methylglutaramid auf regiospezifische Hydrolyse unter Anwendung
der HPLC einem Screening unterworfen. Die gewünschte Eigenschaft des Mikroorganismus ist
eine Nitril-hydrolysierende Aktivität, die zum regiospezifischen
Angriff auf eine Dinitril-Verbindung in Abwesenheit von störender Amidase-Aktivität in der
Lage ist. Die Mikroorganismen haben die Neigung, einer Mutation
zu unterliegen. Einige Mutationen können für die gewünschte Nitrilumwandlung günstig sein.
Daher können
selbst Mutanten des eigentlichen Bakterienstamms zur Ausführung des
Verfahrens der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
-
Die
vorliegende Erfindung ist nicht auf spezielle, vorstehen erwähnte Organismen
beschränkt,
sondern schließt
die Verwendung von Varianten und Mutanten davon ein, die die gewünschte Eigenschaft
erhalten. Derartige Varianten und Mutanten lassen sich aus Elternstämmen mit
Hilfe zahlreicher bekannter Maßnahmen
erzeugen, wie beispielsweise Röntgenstrahlung,
UV-Strahlung und chemischer Mutagene.
-
Zur
Erzeugung von Biokatalysatoren für
die Prozessdemonstration (Beispiele 1 bis 26) wurden die folgenden
Medien verwendet:
-
Um
das Wachstum einzuleiten, wurden 10 ml des entsprechenden Mediums
mit 0,1 ml gefrorener Stammkultur beimpft. Nach einer Aufzucht bei
28°C unter
Schütteln
bei 250 U/min über
Nacht wurde die wachsende Zellsuspension in 1 l des gleichen Mediums
in einen 2 l Kolben gegeben und die Aufzucht bei 28°C unter Schütteln fortgesetzt.
Sodann wurde die wachsende Zellsuspension von 1 l zu 9 l des gleichen
Mediums in einen 10 l Fermentationskessel gegeben und die Inkultunahme
fortgesetzt. Die Nennbedingungen in dem Fermentationsreaktor betrugen: ≥80% Sauerstoff
Sättigung,
25°C, pH
7,2, 300 bis 1.000 U/min. Nach 20 bis 91 Stunden wurde der Behälter bis
8° bis 12°C abgeschreckt
und bis zu einer Endkonzentration von 10% Glycerin zugesetzt. Das
Zellmaterial wurde durch Zentrifugieren geerntet. Die konzentrierte
Zellpaste wurde sofort auf Trockeneis eingefroren und bis zum Gebrauch
bei –70°C aufbewahrt.
Der Fachwelt sind zahlreiche andere Ergänzungen bekannt, die als Kohlenstoff
und Stickstoffquellen für
das Zellwachstum in E2-Basalmedium dienen können. Zur Erzeugung von Biokatalysator
können
sowohl diese als auch komplexe Nährmedien
verwendet werden. Das vorstehend beschriebene spezielle Medium ist
nicht als einschränkend
zu betrachten.
-
Auswahl von mutanten Bakterienstämmen von
Acidovorax facilis 72W mit mangelnder NHase-Aktivität
-
Es
wurden Mutanten von Acidovorax facilis 72W (ATCC 55746) mit verringerter
Kapazität
zur Erzeugung von unerwünschtem
2-Methylglutarsäure-Nebenprodukt
während
der Hydrolyse von 2-MGN zu 4-CPA auf der Grundlage ihrer Unfähigkeit
zur Nutzung von 2-MGN als Kohlenstoff und Energiequelle ausgewählt. Insbesondere
wurde eine Übernacht-Kultur
des Stammes A. facilis 72W, der auf LB/Succinat-Medium (1% (Gewicht/Volumen) Bacto-Trypton
(Difco, Detroit, Michigan, USA), 0,5% (Gewicht/Volumen) Bacto-Hefeextrakt (Difco),
1% (Gewicht/Volumen) NaCl, 0,5% (Gewicht/Volumen) Natriumsuccinat-Hexahydrat)
aufgezogen war, für
näherungsweise
30 Minuten an 100 μg/ml-Lösung von
N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin,
einem Mutagen-bildenden Mittel, exponiert. Dieses führte zu
einer 99,9%igen Verringerung lebensfähiger Zellen in der Kultur.
Die mutagenisierten Zellen wurden von dem Mutagen durch Zentrifugieren
in sterilen 1 M Natriumphosphat-Puffer, pH 7,2, freigewaschen. Die
gewaschenen Zellen wurden erneut in LB/Succinat-Medium suspendiert
und über
Nacht bei 30°C
aufgezogen. Die Zellen wurden sodann durch Zentrifugieren in sterilem
50 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 7,2, gewaschen und erneut in E2-Minimalmedium
(ohne Glucose) mit einem Gehalt von 0,2% (Volumen/Volumen) 2-Methylglutaronitril
und den Antibiotika Cycloserin, 0,2 mg/ml, und Piperazillin, 40 μg/ml, suspendiert.
Die Zellen wurden über
Nacht bei 30°C
inkubiert und wiederum in sterilem 50 mM Natriumphosphat-Puffer,
pH 7,2, gewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden auf Agarplatten
ausgestrichen, die ein nichtselektives Medium enthielten: E2-Minimalmedium
(ohne Glucose) plus 0,2% (Volumen/Volumen) 2-Methylglutaronitril
und 0,5% (Gewicht/Volumen) Natriumsuccinat-Hexahydrat bei einer
Konzentration von 40 bis 100 koloniebildenden Einheiten pro Platte.
Die Platten wurden für
näherungsweise
48 Stunden bei 30°C inkubiert,
um eine Entwicklung der Kolonien zu ermöglichen. Die Kolonien, die
sich entwickelten, wurden auf Agarplatten, die selektives Medium
enthielten: E2-Minimalmedium
(ohne Glucose) plus 0,2% (Volumen/Volumen) 2-MGN, Replika-plattiert.
Die Platten wurden für
48 Stunden bei 30°C
inkubiert, um eine Entwicklung der Kolonien zu ermöglichen.
Die Mutanten mit den gewünschten
Eigenschaften zeigten auf dem selektiven Medium kein gutes Wachstum.
Daher wurden nach 48 Stunden replizierte Platten verglichen und
Bakterienstämme,
die lediglich auf nichtselektivem Medium ein Wachstum zeigten, für das weitere
Testen aufbewahrt.
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Insgesamt
wurden näherungsweise
5.120 Kolonien von 89 Platten und 19 Bakterienstämmen mit den gewünschten
Eigenschaften kontrolliert und identifiziert. Diese Mutanten-Stämme wurden
weiter auf Wachstum in Flüssigkeit,
E2-Minimalmedium (ohne Glucose) plus 0,2% (Volumen/Volumen) 2-MGN
getestet. Bakterienstämme,
die wenig oder kein Wachstum in diesem Medium zeigten, wurden auf
ihre Fähigkeit
zur Erzeugung von 2-Methylglutarsäure während des Wachstums in flüssigem Medium
einem Screening unterzogen, das aus E2-Minimalmedium (ohne Glucose)
plus 0,2% (Volumen/Volumen) 2-MGN und 0,5% (Gewicht/Volumen) Natriumsuccinat-Hexahydrat
bestand. Als Ergebnis dieses Prozesses wurden 2 mutante Bakterienstämme als
Acidovorax facilis 72-PF-15 (ATCC 55747) und Acidovorax facilis
72-PF-17 (ATCC 55745)
identifiziert und zur weiteren Entwicklung aufgrund ihrer stark
herabgesetzten Leistung zur Erzeugung von 2-Methylglutarsäure ausgewählt.
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Aliphatische α,ω-Dinitril-Hydrolysereaktionen
-
Es
wurde eine wässrige
Lösung
angesetzt, die das Ammoniumsalz einer aliphatischen ω-Nitrilcarbonsäure enthielt,
indem das entsprechende aliphatische α,ω-Dinitril mit einer wässrigen
Suspension des geeigneten Enzymkatalysators (wie vorstehend im Abschnitt
A angegeben) gemischt wurden. Es lassen sich ganze mikrobielle Zellen
als Katalysator ohne jede Vorbehandlung verwenden. Alternativ können sie
in einer Polymermatrix immobilisiert werden (z.B. Alginatkügelchen
oder Polyacrylamid-Gel (PAG)-Partikel) oder auf einem unlöslichen
festen Träger
(z.B. Celite), um die Gewinnung und Wiedergewinnung des Katalysators
zu erleichtern. Methoden für
die Immobilisierung von Zellen in einer Polymermatrix oder auf einem
unlöslichen
festen Träger
sind umfangreich veröffentlicht
worden und sind in der Fachwelt gut bekannt. Das Nitrilaseenzym
oder die Nitril-Hydratase- und Amidase-Enzyme können ebenfalls von den ganzen
Zellen isoliert und direkt als Katalysator verwendet werden, oder
das/die Enzym(e) lassen sich in einer Polymermatrix oder auf einem
unlöslichen
Träger
immobilisieren. Diese Methoden sind ebenfalls umfangreich veröffentlicht
worden und der Fachwelt gut bekannt.
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Einige
der aliphatischen α,ω-Dinitrile,
die in der vorliegenden Erfindung als Ausgangsmaterial verwendet
werden, sind lediglich mäßig wasserlöslich. Ihre
Löslichkeit
ist außerdem
von der Temperatur der Lösung und
der Salzkonzentration (Puffer und/oder ω-Nitrilcarbonsäure-Ammoniumsalz)
in der wässrigen
Phase abhängig.
Beispielsweise wurde ermittelt, dass Adiponitril eine Löslichkeitsgrenze
von etwa 0,60 M (25°C,
20 mM Phosphat-Puffer, pH 7) hat und unter den gleichen Bedingungen
2-Methylglutaronitril
eine Löslichkeitsgrenze von
etwa 0,52 M hat. In diesem Fall wird die Erzeugung einer wässrigen
Lösung
eines Ammoniumsalzes der ω-Nitrilcarbonsäure bei
einer größeren Konzentration
als die Löslichkeitsgrenze
des Ausgangs-α,ω-Dinitrils unter
Verwendung eines Reaktionsgemisches erreicht, das sich zu Beginn
aus zwei Phasen zusammensetzt: eine wässrige Phase, die den Enzymkatalysator
und aufgelöstes α,ω-Dinitril
enthält,
und eine organische Phase (das ungelöste α,ω-Dinitril). Mit fortschreitender
Reaktion löst
sich das Dinitril in der wässrigen
Phase auf und es wird möglicherweise
ein einphasiges Produktgemisch erhalten.
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Die
Konzentration des Enzymkatalysators in dem Reaktionsgemisch ist
abhängig
von der spezifischen katalytischen Aktivität des Enzymkatalysators und
wird so gewählt,
dass die gewünschte
Reaktionsgeschwindigkeit erhalten wird. Das Nasszellengewicht der
mikrobiellen Zellen, die als Katalysator in den Hydrolysereaktionen
verwendet werden, liegt im typischen Fall bei 0,001 g bis 0,100
g Nasszellen pro Milliliter des gesamten Reaktionsvolumens und bevorzugt
bei 0,002 g bis 0,050 g Nasszellen pro Milliliter. Die spezifische
Aktivität der
mikrobiellen Zellen (IU/g Nasszellengewicht) wird ermittelt, indem
die Umwandlungsgeschwindigkeit einer 0,10 M Lösung eines Dinitrilsubstrats
zu demgewünschten ω-Nitrilcarbonsäure-Produkt
bei 25°C
unter Verwendung eines bekannten Gewichts des mikrobiellen Zellkatalysators
gemessen wird. Eine "IU" (Internationale
Einheit) der Enzymaktivität
ist als der Betrag der Enzymaktivität definiert, der zur Umwandlung
von einem Mikromol Substrat zu Produkt pro Minute erforderlich ist.
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Die
Temperatur der Hydrolysereaktion wird so gewählt, dass sowohl die Reaktionsgeschwindigkeit
als auch die Stabilität
der Enzymkatalysatoraktivität
optimiert sind. Die Temperatur der Reaktion kann von etwas oberhalb
des Gefrierpunktes der Suspension (etwa 0°C) bis zu 60°C reichen, wobei ein bevorzugter
Bereich der Reaktionstemperatur bei 5° bis 35°C liegt. Die mikrobielle Zellkatalysator-Suspension
kann angesetzt werden, indem die Zellen in destilliertem Wasser
oder in einer wässrigen
Lösung
eines Puffers suspendiert werden, der den Anfangs-pH-Wert der Reaktion
zwischen 5,0 und 10,0 und bevorzugt zwischen 6,0 und 8,0 bewahrt.
Mit dem Ablaufen der Reaktion kann sich der pH-Wert des Reaktionsgemisches in Folge
der Bildung eines Ammoniumsalzes der Carbonsäure aus der entsprechenden
Nitril-Funktionalität
des Dinitrils verändern. Die
Reaktion kann bis zur vollständigen
Umwandlung von Dinitril ohne eine pH-Wert-Kontrolle ablaufen oder es
kann eine geeignete Säure
oder Base im Verlaufe der Reaktion zugesetzt werden, um den gewünschten pH-Wert
aufrecht zu erhalten.
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Die
Endkonzentration des aliphatischen ω-Nitrilcarbonsäure-Aminoniumsalzes
in dem Produktgemisch bei vollständiger
Umwandlung des α,ω-Dinitrils
kann von 0,001 M bis zur Löslichkeitsgrenze
des aliphatischen ω-Nitrilcarbonsäure-Ammoniumsalzes
reichen. Im typischen Fall liegt die Konzentration des ω-Nitrilcarbonsäure-Ammoniumsalzes
im Bereich von 0,10 M bis 2,0 M. Das Produktgemisch der Hydrolysereaktion kann
in der nachfolgenden Hydrierungsreaktion nach der Gewinnung des
Enzymkatalysators durch Zentrifugieren und/oder Filtration direkt
verwendet werden. Die ω-Nitrilcarbonsäure kann
auch aus dem Produktgemisch (nach Entfernung des Katalysators) abgetrennt
werden, indem der pH-Wert des Reaktionsgemisches zwischen 2,0 und
2,5 mit konzentrierter HCl eingestellt wird und die resultierende
Lösung
mit Natriumchlorid gesättigt
wird und die ω-Nitrilcarbonsäure mit
einem geeigneten organischen Lösemittel
extrahiert wird, wie beispielsweise Ethylacetat, Ethylether oder
Dichlormethan. Die vereinten organischen Extrakte werden sodann
vereint, mit einem geeigneten Trocknungsmittel gerührt (z.B.
Magnesiumsulfat), filtriert und das Lösemittel abgetrieben (z.B.
durch Rotationsverdampfung), um das gewünschte Produkt in hoher Ausbeute
und hoher Reinheit (im typischen Fall mit einer Reinheit von 98
bis 99%) zu erzeugen. Nach Erfordernis kann das Produkt durch Umkristallisation
oder durch Destillation weiter gereinigt werden.
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Hydrierung/Ringschluss
von ω-Nitrilcarbonsäure-Ammoniumsalzen
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Die
katalytische Hydrierung ist eine bevorzugte Methode zum Herstellen
eines aliphatischen Amins aus einem aliphatischen Nitril. In der
vorliegenden Erfindung kommt die während der Hydrierung erzeugte ω-Aminocarbonsäure zum
Ringschluss zu dem entsprechenden 5-gliedrigen oder 6-gliedrigen
Ring-Lactam. Eine wässrige
Lösung
eines Ammoniumsalzes einer ω-Nitrilcarbonsäure (hergestellt
durch Zentrifugation und Filtration des wässrigen Produktgemisches, das
durch die enzymatische Hydrolyse des entsprechenden aliphatischen α,ω-Dinitrils
erzeugt wird) wird zuerst mit konzentriertem Ammoniumhydroxid und
Wasser gemischt, um eine Lösung
zu erzeugen, die 1 bis 4 stöchiometrische Äquivalente
von zugesetztem Ammoniumhydroxid enthält. Das Ammoniumhydroxid wird
zugesetzt, um die reduktive Alkylierung der ω-Nitrilcarbonsäure durch
das Produkt ω-Aminocarbonsäure im Verlaufe
der Hydrierung zu begrenzen. Um eine optimale Ausbeute des gewünschten
Lactams zu erzielen wird ein 2- bis 3-facher stöchiometrischer Überschuss
des Ammoniumhydroxids im Bezug auf die in dem Reaktionsgemisch vorhandene
Menge der ω-Nitrilcarbonsäure bevorzugt.
Wahlweise kann Ammoniak-Gas für
das zum Reaktionsgemisch zugesetzte Ammoniumhydroxid ersetzt werden.
Die Anfangskonzentration des Ammoniumsalzes der ω-Nitrilcarbonsäure in dem
Reaktionsgemisch der Hydrierung kann von 5% bis 20 Gew.% der Lösung liegen,
wobei ein bevorzugter Bereich bei 7,5% bis 12,5 Gew.% liegt.
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Für die Herstellung
eines N-Methyllactams wird Methylamin für das Ammoniumhydroxid oder
Ammoniak ersetzt, indem 1 bis 4 stöchiometrische Äquivalente
im Bezug auf die in dem Reaktionsgemisch vorhandene ω-Nitrilcarbonsäure verwendet
werden. Um eine optimale Ausbeute des gewünschten N-Methyllactams zu erzielen, wird ein
3- bis 4-facher stöchiometrischer Überschuss
von Methylamin im Bezug auf die Menge der im Reaktionsgemisch vorhandenen ω-Nitrilcarbonsäure bevorzugt.
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Zu
dem vorstehend beschriebenen Reaktionsgemisch der Hydrierung wird
anschließend
ein geeigneter Hydrierungskatalysator zugesetzt und das resultierende
Gemisch unter Druck mit Wasserstoffgas erhitzt, um das Ammoniumsalz
der ω-Nitrilcarbonsäure zu dem
entsprechenden 5-gliedrigen oder 6-gliedrigen Lactam umzuwandeln. Die für diese
Aufgabe geeigneten Hydrierungskatalysatoren schließen die
verschiedenen Platinmetalle ein, ohne auf diese beschränkt zu sein,
wie beispielsweise Iridium, Osmium, Rhodium, Ruthenium, Platin und
Palladium – aber
auch verschiedene andere Übergangsmetalle,
wie beispielsweise Kobalt, Kupfer, Nickel und Zink. Der Katalysator
kann ohne Träger
sein (beispielsweise als Raney-Nickel oder Platinoxid) oder kann
einen Träger
aufweisen (beispielsweise Palladium-auf-Kohlenstoff Platin-auf-Aluminiumoxid
oder Nickel-auf-Kieselgur).
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Der
Hydrierungskatalysator wird bei einer Mindeskonzentration verwendet,
die ausreichend ist, um die gewünschte
Reaktionsgeschwindigkeit und die Gesamtumwandlung der Ausgangsmaterialien
unter den gewählten
Reaktionsbedingungen zu erlangen. Diese Konzentration lässt sich
leicht experimentell ermitteln. Der Katalysator kann in Mengen von
0,001 bis 20 Gewichtsteilen oder mehr Katalysator pro 100 Teile
in der Reaktion eingesetzte ω-Nitrilcarbonsäure verwendet
werden. Die Katalysatorbeladung in dem Reaktionsgemisch beträgt im typischen
Fall 1% bis 10% (Gewicht Katalysator/Gewicht ω-Nitrilcarbonsäure), wobei 3% bis 5% Katalysatorbeladung
bevorzugt sind. Raney-Nickel (z.B. Raney-Nickel-Katalysator mit Cr-Promotor (Grace
Davison Raney 2400 als aktiver Metallkatalysator)) ist ein bevorzugter
Katalysator bei Reaktionen, die in Gegenwart von zugesetztem Ammoniak
ablaufen, um Lactame zu erzeugen, während 5% oder 10% Palladium-auf-Kohlenstoff
oder 4,5% Palladium/0,5% Platin- auf-Kohlenstoff
bei Reaktionen bevorzugt sind, die in Gegenwart von zugesetztem
Methylamin zur Erzeugung von N-Methyllactamen ablaufen.
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Die
Hydrierungstemperatur und Druck lassen sich weitreichend variieren.
Die Temperatur kann in der Regel im Bereich von 45° bis 200°C und vorzugsweise
von 70° bis
180°C liegen.
Der Wasserstoffdruck liegt in der Regel im Bereich von etwa Atmosphärendruck
bis etwa 100 Atm und bevorzugt bei 30 bis 60 Atm. Die Hydrierung
wird vorzugsweise ohne jede pH-Wert-Einstellung des Reaktionsgemisches
ausgeführt,
die unter Zusatz eines Überschusses
an Ammoniumhydroxid, Ammoniak oder Methylamin in der Regel zwischen
einem pH-Wert von 9 bis 12 liegt. Innerhalb dieses pH-Wert-Bereiches
kann der exakte Wert eingestellt werden, um den gewünschten
pH-Wert zu erhalten, indem eine beliebige kompatible und nicht störende Base
oder Säure zugesetzt
werden. Geeignete Basen schließen
ein, ohne auf diese beschränkt
zu sein: Alkalimetallhydroxide, -carbonate, -hydrogencarbonate und
-phosphate, während
geeignete Säuren
einschließen,
ohne auf diese beschränkt
zu sein: Salzsäure,
Schwefelsäure
oder Phosphorsäure.
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Die
Lyse der mikrobiellen Zellkatalysatoren während der Hydrolysereaktion
oder Verunreinigungsstoffe, die aus der Katalysatorherstellung vorhanden
sind, könnten
Verbindungen in das Reaktionsgemisch der Hydrierung eingebracht
haben (z.B. Thiole), die die Katalysatoraktivität vergiften könnten. Es
wurde keinerlei Vergiftung oder Deaktivierung der Hydrierungskatalysatoren
beobachtet im Vergleich zur Hydrierung von Mischungen von ω-Nitrilcarbonsäure-Ammoniumsalzen,
die über
die mikrobielle Hydrolyse mit der Hydrierung wässriger Lösungen der gleichen ω-Nitrilcarbonsäure erzeugt
wurden, die von den Hydrolyse-Produktmischungen abgetrennt und vor
der Hydrierung gereinigt wurden.
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Das
Lactam oder N-Methyllactam lassen sich mühelos von dem Produlktgemisch
der Hydrierung abtrennen, indem die Mischung zunächst zur Gewinnung des Hydrierungskatalysators
filtriert wird wonach das Produkt direkt aus dem resultierenden
wässrigen
Filtrat destilliert werden kann. Das während der Ringschlussreaktion
erzeugte oder dem Reaktionsgemisch zugesetzt Ammoniak, kann ebenfalls
zur Rückführung in
den Kreislauf mit Hilfe dieses Destillationsprozesses gewonnen werden,
womit die Erzeugung von unerwünschten anorganischen
Salzen als Abprodukte vermieden wird. Die Lactame oder N-Methyllactame lassen
sich auch durch Filtrieren des Hydrierungsgemisches, Einstellung
des pH-Wertes des Filtrates auf etwa 7 mit konzentrierter HCl und
Sättigung
mit Natriumchlorid, Extraktion des Lactams oder N-Methyllactams
(chargenweise) oder kontinuierliche Extraktion mit einem organischen
Lösemittel
gewinnen, wie beispielsweise Ethylacetat, Dichlormethan oder Ethylether,
wobei die Gewinnung des organischen Extraktes durch Destillation
oder Kristallisation erfolgt. In den beigefügten Beispielen sind die isolierten
Ausbeuten, die bei dieser Methode angegeben werden, nicht optimiert,
wobei diese Methode einfach zur Anwendung gebracht wurde, um gereinigtes
Produkt zur Analyse und Bestätigung
der chemischen Identität
zu erhalten.
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In
den folgenden Beispielen, die zur weiteren Veranschaulichung der
Erfindung dienen und diese nicht beschränken, sind die prozentualen
Angaben der Gewinnung der aliphatischen α,ω-Dinitrile und der Ausbeuten
der Hydrolyseprodukte, die während
der mikrobiellen Hydrolysereaktionen erzeugt werden, auf die Anfangsmenge
des in dem Reaktionsgemisch vorhandenen α,ω-Dinitrils bezogen (sofern
nicht anders angegeben) und mit Hilfe der HPLC unter Anwendung eines
Brechzahl-Detektors und entweder einer Supelcosil LC-18-DB-Säule (25
cm × 4,6
mm Durchmesser) oder einer Bio-Rad-HPX-87H-Säule (30 cm × 7,8 mm Durchmesser) ermittelt.
Die Ausbeuten an Lactamen und N-Methyllactamen, die mit Hilfe der Hydrierung
wässriger Lösungen von ω-Nitrilcarbonsäure-Ammoniumsalzen
erzeugt wurden, sind auf die Ausgangskonzentration des in dem Reaktionsgemisch
vorhandenen ω-Nitrilcarbonsäure-Ammoniumsalzes
bezogen (sofern nicht anders angegeben) und wurden mit Hilfe der
Gaschromatographie unter Verwendung einer DB-1701-Kapillarsäule (30
m × 0,53
mm ID, Filmdicke 1 Mikrometer) ermittelt.
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BEISPIEL 1
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4-CYANOPENTANSÄURE (AMMONIUMSALZ)
-
Zunächst wurden
0,60 g (Nasszellgewicht) gefrorene Acidovorax facilis 72W (ATCC
55764)-Zellen (zuvor
wärmebehandelt
bei 50°C
für 1 Stunde
vor dem Gefieren) in ein 15 ml-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen gegeben, gefolgt von
einer Zugabe von 12 ml Kaliumphosphat-Puffer (20 mM, pH 7,0). Nachdem
die Zellen aufgetaut und suspendiert wurden, wurde die resultierende
Suspension zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das resultierende
Zellpellet wurde erneut in einem Gesamtvolumen von 12 ml dieses
gleichen Phosphat-Puffers suspendiert. In ein zweites 15 ml-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen wurden
0,1081 g (0,114 ml, 1,00 mM, 0,100 M) 2-Methylglutaronitril eingewogen
und anschließend
9,89 ml der A. facilis 72W (ATCC 55746)-Zellsuspension (0,494 g
Nasszellgewicht) zugesetzt und die resultierende Suspension auf
einer rotierenden Plattform bei 27°C gemischt. Es wurden Proben
(0,300 ml) abgezogen und zentrifugiert und anschließend 0,180
ml des Überstandes
in eine Millipore Ultrafree-MC-Filtereinheit (10 K MWCO) gegeben
und mit 0,020 ml einer wässrigen
Lösung
von 0,750 M N-Methylpropionamid (HPLC, externe Standardlösung) gemischt.
Es wurde ausreichend 1,0 M HCl zugesetzt, um den pH-Wert der Probe
bis ca. 2,5 abzusenken, und die resultierende Lösung filtriert und mit Hilfe
der HPLC analysiert. Nach 1,0 Stunden betrugen die HPLC-Ausbeuten an 4-Cyanopentansäure und
2-Methylglutarsäure
99,3% bzw. 0,7% ohne zurückbleibendes
2-Methylglutaronitril.
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BEISPIEL 2 (VERGLEICHSBEISPIEL)
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4-CYANOPENTANSÄURE (AMMONIUMSALZ)
-
Die
in Beispiel 1 beschriebene Prozedur wurde unter Verwendung von Acidovorax
facilis 72W (ATCC 55764)-Zellen wiederholt, die nicht bei 50°C für 1 Stunde
vor dem Gefieren wärmebehandelt
worden waren. Nach 1,0 Stunden betrugen die HPLC-Ausbeuten an 4-Cyanopentansäure und
2-Methylglutarsäure 62,7% bzw.
34,6% ohne zurückbleibendes
2-Methylglutaronitril.
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BEISPIEL 3
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4-CYANOPENTANSÄURE (AMMONIUMSALZ)
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Zunächst wurden
1,136 g (Nasszellgewicht) gefrorene Acidovorax facilis 72W (ATCC
55764)-Zellen (zuvor
wärmebehandelt
bei 50°C
für 1 Stunde
vor dem Gefieren) in ein 50 ml-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen gegeben, gefolgt von
21,6 ml Kaliumphosphat-Puffer (20 mM, pH 7,0). Nachdem die Zellen
aufgetaut und suspendiert worden waren, wurde die resultierende
Suspension zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das resultierende
Zellpellet wurde erneut in einem Gesamtvolumen von 22,7 ml dieses
gleichen Phosphat-Puffers suspendiert. In ein 15 ml-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen wurden
0,4355 g (0,458 ml, 4,00 mM, 0,403 M) 2-Methylglutaronitril eingewogen
und anschließend
9,54 ml der A. facilis 72W (ATCC 55746)-Zellsuspension (0,477 g
Nasszellgewicht) zugesetzt und die resultierende Suspension auf
einer rotierenden Plattform bei 27°C gemischt. Es wurden Proben
(0,300 ml) 1:4 mit destilliertem Wasser verdünnt und anschließend zentrifugiert
und 0,180 ml des Überstandes
in eine Millipore Ultrafree-MC-Filtereinheit (10 K MWCO) gegeben
und mit 0,020 ml einer wässrigen
Lösung
von 0,750 M N-Methylpropionamid (HPLC, externe Standardlösung) gemischt.
Es wurde ausreichend 1,0 M HCl zugesetzt, um den pH-Wert der Probe
bis etwa 2,5 abzusenken, wonach die resultierende Lösung filtriert
und mit Hilfe der HPLC analysiert wurde. Nach 4,0 Stunden betrugen
die HPLC-Ausbeuten an 4-Cyanopentansäure und
2-Methylglutarsäure
99,4% bzw. 0,6% ohne zurückbleibendes 2-Methylglutaronitril.
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BEISPIEL 4
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4-CYANOPENTANSÄURE (AMMONIUMSALZ)
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Die
in Beispiel 3 beschriebene Prozedur wurde mit der Ausnahme wiederholt,
dass 1,086 g (1,143 ml, 10,04 mM, zweiphasige Reaktion, 1,00 M Produkt)
von 2-Methylglutaronitril mit 8,86 ml der wärmebehandelten A. facilis 72W
(ATCC 55746)-Zellsuspension (0,443 g Nasszellgewicht) in einem 15
ml-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen
auf einer rotierenden Plattform bei 27°C gemischt wurden. Es wurden
Proben (0,300 ml) 1:10 mit destilliertem Wasser verdünnt und
anschließend
zentrifugiert und 0,180 ml des Überstandes
in eine Millipore Ultrafree-MC-Filtereinheit (10 K MWCO) gegeben
und mit 0,020 ml einer wässrigen
Lösung
von 0,750 M N-Methylpropionamid (HPLC, externe Standardlösung) gemischt.
Es wurde ausreichend 1,0 M HCl zugesetzt, um den pH-Wert der Probe
bis etwa 2,5 abzusenken, wonach die resultierende Lösung filtriert
und mit Hilfe der HPLC analysiert wurde. Nach 15,25 Stunden betrugen
die HPLC-Ausbeuten an 4-Cyanopentansäure und 2-Methylglutarsäure 98,7%
bzw. 1,3% ohne zurückbleibendes
2-Methylglutaronitril.
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BEISPIEL 5
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4-CYANOPENTANSÄURE (AMMONIUMSALZ)
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Die
in Beispiel 1 beschriebene Prozedur wurde unter Verwendung einer
Suspension von Acidovorax facilis-Mutantenstamm 72-PF-15 (ATCC 55747)
wiederholt, die nicht bei 50°C
für 1 Stunde
wärmebehandelt wurde.
Nach 3,0 Stunden betrugen die HPLC-Ausbeuten an 4-Cyanopentansäure und
2-Methylglutarsäure 96,8%
bzw. 3,6% ohne zurückbleibendes
2-Methylglutaronitril.
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BEISPIEL 6
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4-CYANOPENTANSÄURE (AMMONIUMSALZ)
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Die
in Beispiel 3 beschriebene Prozedur wurde unter Verwendung einer
Suspension von Acidovorax facilis-Mutantenstamm 72-PF-15 (ATCC 55747)
wiederholt, die nicht bei 50°C
für 1 Stunde
wärmebehandelt wurde.
Es wurde eine Mischung von 0,4355 g (0,458 ml, 4,00 mM, 0,403 M)
2-Methylglutaronitril
und 9,54 ml der A. facilis-Mutantenstammes 72-PF-15-Zellsuspension
(0,477g Nasszellgewicht) in einem 15 ml Polypropylen-Zentrifugenröhrchen auf
einer rotierenden Plattform bei 27°C gemischt. Nach 6,0 Stunden
betrugen die HPLC-Ausbeuten an 4-Cyanopentansäure und 2-Methylglutarsäure 98,8% bzw. 1,2% ohne zurückbleibendes 2-Methylglutaronitril.
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BEISPIEL 7
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4-CYANOPENTANSÄURE (AMMONIUMSALZ)
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Die
in Beispiel 4 beschriebene Prozedur wurde unter Verwendung einer
Suspension von Acidovorax facilis-Mutantenstamm 72-PF-15 (ATCC 55747)
wiederholt, die nicht bei 50°C
für 1 Stunde
wärmebehandelt wurde.
Es wurde eine Mischung von 1,086 g (1,143 ml, 10,04 mM, 1,0 M) 2-Methylglutaronitril
und 8,86 ml der A. facilis-Mutantenstammes 72-PF-15 (ATCC 55747)-Zellsuspension
(0,443g Nasszellgewicht) in einem 15 ml Polypropylen-Zentrifugenröhrchen auf
einer rotierenden Plattform bei 27°C gemischt. Nach 15,25 Stunden
betrugen die HPLC-Ausbeuten an 4-Cyanopentansäure und 2-Methylglutarsäure 99,2% bzw. 0,8% ohne zurückbleibendes
2-Methylglutaronitril.
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BEISPIEL 8
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4-CYANOPENTANSÄURE-ABTRENNUNG
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In
einen 2 l-Erlenmeyerkolben, der mit einem Magnetrührstab ausgestattet
war, wurden 150 g (Nasszellgewicht) gefrorene Acidovorax facilis
72W (ATCC 55746) (nicht zuvor bei 50°C für 1 Stunde vor dem Gefrieren
wärmebehandelt)
eingewogen. Anschließend
wurde Kaliumphosphat-Puffer (20 mM, pH 7,0) zu einem Gesamtvolumen
von 1,50 l zugesetzt. Nachdem die Zellen aufgetaut und suspendiert
worden waren, wurde die resultierende Suspension in einem Wasserbad
für 1 Stunde
bis 50°C
erhitzt, anschließend
bis 10°C
in einem Eis/Wasserbad gekühlt,
zentrifugiert und der Überstand
verworfen. Das resultierende Zellpellet wurde ein Mal durch erneute
Suspension in 1,50 l des gleichen Phosphat-Puffers gewaschen, gefolgt
von einer Zentrifugation. Das gewaschene Zellpellet wurde in einen
mit einem Magnetrührstab
ausgestatteten 4 l-Erlenmeyerkolben gegeben und anschließend in
einem Gesamtvolumen von 2,5 l Kaliumphosphat-Puffer (20 mM, pH 7,0) suspendiert.
Unter Rühren
wurden 129,6 g (136,4 ml, 1,20 Mol, 0,400 M) 2-Methylglutaronitril
zugesetzt und das Endvolumen auf 3,00 l mit dem gleichen Phosphat-Puffer
eingestellt. Die Mischung wurde bei 25°C gerührt und Proben in regelmäßigen Abständen gezogen
und mit Hilfe der HPLC analysiert. Nach 21,5 Stunden betrugen die
HPLC-Ausbeuten an 4-Cyanopentansäure
(4-CPA) und 2-Methylglutarsäure 99,5%
bzw. 0,5% ohne zurückbleibendes
2-Methylglutaronitril.
-
Das
Reaktionsgemisch wurde zentrifugiert, das Zellpellet zur Wiederverwendung
gewonnen und der resultierende Überstand
dekantiert und unter Verwendung einer Amicon-2,5 l-Filtereinheit
filtriert, die mit einem YM-10-Filter (10K MWCO) ausgestattet war.
Das Filtrat wurde in einen 4,0 l Kolben gegeben und der pH-Wert der
Lösung
auf 2,5 mit 6 N HCl eingestellt. Zu der Lösung wurde anschließend Natriumchlorid
unter Rühren bis
zur Sättigung
zugesetzt und sodann 1,0 l-Portionen der resultierenden Lösung mit
4 × 500
ml Ethylether extrahiert. Die vereinten Etherextrakte wurden getrocknet
(MgSO4), filtriert und die Lösung durch
Rotationsverdampfung bei vermindertem Druck auf 1,0 l eingeengt.
Zu der Lösung
wurden sodann 1,2 l Hexan und 0,200 ml Ethylether zugesetzt und
die resultierende Lösung
bis –78°C gekühlt. Der
resultierende weiße
kristalline Feststoff wurde durch schnelle Vakuumfiltration abgetrennt
und mit 300 ml kaltem (5°C)
Hexan gewaschen. Das restliche Lösemittel
wurde unter hohem Vakuum (150 mTorr) entfernt, um 120,3 g (79% isolierte
Ausbeute) an 4-Cyanopentansäure
(Sp. 31,9° bis
32,6°C)
zu ergeben.
-
BEISPIEL 9
-
4-CYANOPENTANSÄURE (AMMONIUMSALZ)
-
Das
gewonnene Zellpellet aus Beispiel 8 wurde in mehreren aufeinanderfolgenden
3,0 l-Chargenreaktionen
für die
Hydrolyse von 2-Methylglutaronitril zu 4-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz
wiederverwendet. Bei Konzentrationen des 2-Methylglutaronitrils
oberhalb von 0,400 M wurde die Löslichkeit
des Dinitrils in der wässrigen
Zellsuspension überschritten
und diese Reaktionen liefen als zweiphasige wässrige/organische Mischungen
ab, bis das verbleibende 2-Methylglutaronitril in dem Reaktionsgemisch
löslich
war. In der nachfolgenden Tabelle sind die Endkonzentrationen von
4-CPA-Ammoniumsalz,
das erzeugt wurde, und die prozentualen Ausbeuten an 4-CPA und 2-Methylglutarsäure zusammengestellt.
Bezogen auf das Trockengewicht des Zellkatalysators (1 g Nassgewicht
= 0,20 g Trockengewicht) wurden 86 g 4-CPA/g Trockengewicht Acidovorax facilis
72W (ATCC 55746) erzeugt.
-
-
BEISPIEL 10
-
3-CYANOPENTANSÄURE (AMMONIUMSALZ)
-
Zuerst
wurden 0,60 g (Nasszellgewicht) gefrorene Acidovorax facilis 72W
(ATCC 55764) (zuvor wärmebehandelt
bei 50°C
für 1 Stunde
vor dem Gefrieren) in ein 15 ml-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen gegeben,
gefolgt von einer Zugabe von 10 ml Kaliumphosphat-Puffer (20 mM,
pH 7,0). Nachdem die Zellen aufgetaut und suspendiert waren, wurde
die resultierende Suspension zentrifugiert und der Überstand
verworfen. Das resultierende Zellpellet wurde erneut in einem Gesamtvolumen
von 10 ml dieses gleichen Phosphat-Puffers suspendiert. In ein zweites
15 ml-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen
wurden 0,1080 g (0,112 ml, 1,00 mM, 0,100 M) 2-Ethylsuccinonitril,
8,00 ml der A. facilis 72W-Zellsuspension (0,5 g Nasszellgewicht)
zugesetzt, das Gesamtvolumen mit Kaliumphosphat-Puffer (20 mM, pH
7,0) auf 10,0 ml eingestellt und die resultierende Suspension auf
einer rotierenden Plattform bei 27°C gemischt. Es wurden Proben
(0,300 ml) abgezogen und zentrifugiert und anschließend 0,180
ml des Überstandes
in eine Millipore Ultrafree-MC-Filtereinheit (0,22 Mikrometer) gegeben
und mit 0,020 ml einer wässrigen
Lösung
von 0,750 M N-Methylpropionamid (HPLC, externe Standardlösung) gemischt.
Die resultierende Lösung
wurde filtriert und mit Hilfe der HPLC analysiert. Nach 1,0 Stunden
betrug die HPLC-Ausbeuten an 3-Cyanopentansäure 100%
ohne zurückbleibendes
2-Ethylsuccinonitril und ohne dass andere Nebenprodukte beobachtet
wurden.
-
BEISPIEL 11
-
3-CYANOPENTANSÄURE (AMMONIUMSALZ)
-
Die
in Beispiel 10 beschriebene Prozedur wurde wiederholt, indem 0,4337
g (0,449 ml, 4,01 mM, 0,401 M) 2-Ethylsuccinonitril und 8,00 ml
der wärmebehandelten
A. facilis 72W (ATCC 55746)-Zellsuspension
(0,5 g Nasszellgewicht) in einem Gesamtvolumen von 10,0 ml (eingestellt
mit Kaliumphosphat-Puffer (20 mM, pH 7,0)) verwendet wurde. Es wurden
Proben (0,100 ml) gezogen, mit Wasser auf 1:4 verdünnt und
zentrifugiert; 0,180 ml Überstand
sodann in eine Millipore Ultrafree-MC-Filtereinheit (0,22 Mikrometer) gegeben
und mit 0,020 ml einer wässrigen
Lösung
von 0,750 M N-Methylpropionamid
(HPLC, externe Standardlösung)
gemischt. Die resultierende Lösung
wurde filtriert und mit Hilfe der HPLC analysiert. Nach 8,0 Stunden
betrug die HPLC-Ausbeute an 3-Cyanopentansäure 100% ohne zurückbleibendes
2-Ethylsuccinonitril und ohne dass andere Nebenprodukte beobachtet
wurden.
-
BEISPIEL 12
-
3-CYANOPENTANSÄURE (AMMONIUMSALZ)
-
Die
in Beispiel 10 beschriebene Prozedur wurde wiederholt, indem 1,087
g (1,13 ml, 10,1 mM, zweiphasige Reaktion, 1,01 M Produkt) von 2-Ethylsuccinonitril
und 8,00 ml der wärmebehandelten
A. facilis 72W (ATCC 55746)-Zellsuspension (0,5 g Nasszellgewicht)
in einem Gesamtvolumen von 10,0 ml (eingestellt mit Kaliumphosphat-Puffer
(20 mM, pH 7,0)) verwendet wurde. Es wurden Proben (0,100 ml) gezogen,
mit Wasser auf 1:10 verdünnt
und zentrifugiert; 0,180 ml Überstand
sodann in eine Millipore Ultrafree-MC-Filtereinheit (0,22 Mikrometer)
gegeben und mit 0,020 ml einer wässrigen
Lösung
von 0,750 M N-Methylpropionamid (HPLC, externe Standardlösung) gemischt.
Die resultierende Lösung
wurde filtriert und mit Hilfe der HPLC analysiert. Nach 71 Stunden
betrug die HPLC-Ausbeute an 3-Cyanopentansäure 100%
ohne zurückbleibendes
2-Ethylsuccinonitril und ohne dass andere Nebenprodukte beobachtet
wurden.
-
BEISPIEL 13
-
3-CYANOPENTANSÄURE-ABTRENNUNG
-
In
einen mit einem Magnetrührstab
ausgestatteten 4,0 l-Erlenmeyerkolben wurden 161 g gefrorene Acidovorax
facilis 72W (ATCC 55746)-Zellen (zuvor bei 50°C für 1 Stunde vor dem Gefrieren
wärmebehandelt) und
1,60 l Kaliumphosphat-Puffer (20 mM, pH 7,0) bei 27°C gegeben.
Die Zellen wurden unter Rühren
aufgetaut und suspendiert und sodann 325 g (336,0 ml, 3,00 Mol)
2-Ethylsuccinonitril unter Rühren
zugesetzt und das Gesamtvolumen der Mischung auf 2,40 l mit Kaliumphosphat-Puffer
(20 mM, pH 7,0) eingestellt. Die resultierende Mischung wurde bei
27°C gerührt und
Proben (0,100 ml) gezogen, mit Wasser auf 1:10 verdünnt und
zentrifugiert, 0,180 ml des Überstandes
in eine Millipore Ultrafree-MC-Filtereinheit
(0,22 Mikrometer) gegeben und mit 0,020 ml einer wässrigen
Lösung
von 0,750 M N-Methylpropionamid
(HPLC, externe Standardlösung)
gemischt. Die resultierende Lösung
wurde filtriert und mit Hilfe der HPLC analysiert. Nach 183 Stunden betrug
die HPLC-Ausbeute an 3-Cyanopentansäure 100% ohne zurückbleibendes
2-Ethylsuccinonitril und ohne dass andere Nebenprodukte beobachtet
wurden. Das Reaktionsgemisch wurde zentrifugiert, das Zellpellet
zur Wiederverwendung gewonnen und 2,3 1 des resultierenden Überstandes
dekantiert und unter Verwendung einer Amicon-2,5 l-Filtereinheit
filtriert, die mit einem YM-10-Filter (10K MWCO) ausgestattet war.
Die Konzentration des 3-Cyanopentansäure-Ammoniumsalzes in dem Filtrat betrug
1,26 M.
-
Es
wurde eine 300 ml-Portion des vorstehend beschriebenen Filtrats
mit einem Gehalt von 1,26 M 3-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz auf pH 2,5
mit ca. 60 ml 6 N HCl eingestellt und anschließend mit Natriumchlorid gesättigt und
mit 4 × 200
ml Ethylether extrahiert. Die vereinten organischen Extrakte wurden über Magnesiumsulfat
getrocknet, filtriert und das Lösemittel
durch Rotationsverdampfung bei vermindertem Druck und 28°C abgetrieben.
Das resultierende leicht gelbe viskose Öl wurde unter hohem Vakuum
(50 mTorr) gerührt,
um restliches Lösemittel
bei 28°C
zu entfernen, wonach bis –20°C für 2 bis
3 Stunden gekühlt
wurde, um 3-Cyanopentansäure
als einen kristallinen weißen
Feststoff zu erzeugen (45,9 g, 96% Ausbeute), Sp. 33,0° bis 34,0°C.
-
BEISPIEL 14
-
3-CYANOPENTANSÄURE (AMMONIUMSALZ)
-
Die
in Beispiel 10 beschriebene Prozedur wurde unter Verwendung einer
Suspension von Acidovoraz facilis-Mutanten-Bakterienstamm 72-PF-15
(ATCC 55747) wiederholt, die nicht bei 50°C wärmebehandelt worden waren.
Nach 1,0 Stunden betrug die HPLC-Ausbeute an 3-Cyanopentansäure 100%
ohne zurückbleibendes
2-Ethylsuccinonitril und ohne dass andere Nebenprodukte beobachtet
wurden.
-
BEISPIEL 15
-
3-CYANOPENTANSÄURE (AMMONIUMSALZ)
-
Die
in Beispiel 14 beschriebene Prozedur wurde unter Verwendung von
0,4325 g (0,455 ml, 4,00 mM, 0,400 M) 2-Ethylsuccinonitril und 8,00
ml (0,5 g Nasszellgewicht) einer Suspension von Acidovorax facilis-Mutanten-Bakterienstamm
72-PF-15 (ATCC 55747), die nicht bei 50°C wärmebehandelt worden war, in
einem Gesamtvolumen von 10,0 ml (eingestellt mit Kaliumphosphat-Puffer
(20 mM, pH 7,0)) verwendet wurden. Nach 25 Stunden betrug die HPLC-Ausbeute
an 3-Cyanopentansäure
100% ohne zurückbleibendes
2-Ethylsuccinonitril und ohne dass andere Nebenprodukte beobachtet
wurden.
-
BEISPIEL 16
-
3-CYANOPENTANSÄURE (AMMONIUMSALZ)
-
Die
in Beispiel 14 beschriebene Prozedur wurde wiederholt, indem 1,087
g (1,14 ml, 10,1 mM, zweiphasige Reaktion, 1,01 M Produkt) 2-Ethylsuccinonitril
und 8,00 ml (0,5 g Nasszellgewicht) einer Suspension von Acidovorax
facilis-Mutanten-Bakterienstamm 72-PF-15 (ATCC 55747), die nicht
bei 50°C
wärmebehandelt worden
war, in einem Gesamtvolumen von 10,0 ml (eingestellt mit Kaliumphosphat-Puffer (20 mM, pH
7,0)) verwendet wurden. Nach 71 Stunden betrug die HPLC-Ausbeute
an 3-Cyanopentansäure 76,6%
mit 25,1% zurückbleibendem
2-Ethylsuccinonitril und ohne dass andere Nebenprodukte beobachtet
wurden.
-
BEISPIEL 17
-
4-CYANO-4-PENTENSÄURE-ABTRENNUNG
-
In
einen 500 ml-Erlenmeyerkolben, der mit einem Magnetrührstab ausgestattet
war, wurden 50,0 g gefrorene Acidovorax facilis 72W (ATCC 55746)-Zellen
(zuvor bei 50°C
für 1 Stunde
vor dem Gefrieren wärmebehandelt)
und 450 ml Kaliumphosphat-Puffer (20 mM, pH 7,0) bei 27°C gegeben.
Die Zellen wurden unter Rühren
aufgetaut und suspendiert und anschließend zentrifugiert und der Überstand
verworfen. Das Zellpellet wurde in einem Gesamtvolumen von 863 ml
Kaliumphosphat-Puffer (20 mM, pH 7,0) in einem 1,0 l-Kolben erneut
suspendiert und anschließend
133 g (137,0 ml, 1,25 Mol) 2-Methylenglutaronitril
unter Rühren
bei 27°C zugesetzt.
Bei Konzentrationen an 2-Methylenglutaronitril oberhalb von 0,400
Mol wurde die Löslichkeit
des Nitrils in der wässrigen
Zellsuspension überschritten,
wobei diese Reaktionen als zweiphasige wässrige/organische Mischungen
abliefen, bis das verbleibende 2-Methylenglutaronitril
in dem Reaktionsgemisch löslich war.
Es wurden Proben (0,100 ml) gezogen, auf 1:10 mit Wasser verdünnt und
zentrifugiert und anschließend 0,150
ml des Überstandes
in eine Millipore Ultrafree-MC-Filtereinheit (0,22 Mikrometer) gegeben
und mit 0,150 ml einer wässrigen
Lösung
von 0,150 M N-Methylpropionamid (HPLC, externe Standardlösung) gemischt.
Die resultierende Lösung
wurde filtriert und mit Hilfe der HPLC analysiert. Nach 26 Stunden
betrug die HPLC-Ausbeute an 4-Cyano-4-pentensäure 100% ohne zurückbleibendes
2-Methylenglutaronitril und ohne dass andere Nebenprodukte beobachtet
wurden. Das Reaktionsgemisch wurde zentrifugiert, das Zellpellet
zur Wiederverwendung gewonnen und der Überstand unter Verwendung einer
Amicon-2,5 l-Filtereinheit filtriert, die mit einem YM-10-Filter
(10K MWCO) ausgestattet war. Die Endkonzentration des 4-Cyano-4-pentensäure-Ammoniumsalzes in
dem Filtrat betrug 1,298 M.
-
Es
wurde eine 100 ml-Portion des Filtrats mit einem Gehalt des vorstehend
beschriebenen Produktgemisches von 4-Cyano-4-pentensäure-Ammoniumsalz
auf pH 2,7 mit 6 N HCl eingestellt und anschließend mit Natriumchlorid gesättigt und
mit 4 × 100
ml Ethylether extrahiert. Die vereinten organischen Extrakte wurden über Magnesiumsulfat
getrocknet, filtriert und das Volumen der vereinten Extrakte mit
Hilfe der Rotationsverdampfung bei vermindertem Druck und 28°C auf 100ml
reduziert. Zu der Etherlösung
wurden 200 ml Hexan zugesetzt und die resultierende Lösung bis –78°C gekühlt. Der
resultierende weiße
Feststoff, der sich auskristallisierte, wurde durch rasche Vakuumfiltration
abgetrennt und mit 100 ml kaltem (5°C) Hexan gewaschen. Das restliche
Lösemittel
wurde unter hohem Vakuum (150 mTorr) abgetrieben, um 9,80 g (60%)
isolierte Ausbeute an 4-Cyano-4-pentensäure (Sp. 26,5° bis 27,0°C, aufbewahrt
bei –20°C) zu ergeben.
-
BEISPIEL 18
-
4-CYANO-4-PENTENSÄURE (AMMONIUMSALZ)
-
Das
aus Beispiel 17 (Acidovorax facilis 72W (ATCC 557646)-Zellen) gewonnene
Zellpellet wurde in einer zweiten aufeinanderfolgenden 1,0 l-Charge
von Reaktionen für
die Hydrolyse von 2-Methylenglutaronitril zu
4-Cyano-4-pentensäure-Ammoniumsalz
wiederverwendet. Bei Konzentrationen an 2-Methylenglutaronitril oberhalb
von 0,400 Mol wurde die Löslichkeit
des Nitrils in der wässrigen
Zellsuspension überschritten,
wobei diese Reaktionen als zweiphasige wässrige/organische Mischungen
abliefen, bis das verbleibende 2-Methylenglutaronitril in dem Reaktionsgemisch
löslich
war. Das Zellpellet wurde in einem Gesamtvolumen von 781 ml Kaliumphosphat-Puffer
(20 mM, pH 7,0) in einem 1,0 l-Kolben
erneut suspendiert und sodann 212 g (219,0 ml, 2,00 Mol) 2-Methylenglutaronitril
unter Rühren
bei 27°C
zugesetzt. Es wurden Proben (0,100 ml) gezogen, mit Wasser auf 1:20
verdünnt
und zentrifugiert und anschließend
0,150 ml des Überstandes
in eine Millipore Ultrafree-MC-Filtereinheit (0,22 Mikrometer) gegeben
und mit 0,150 ml einer wässrigen
Lösung
von 0,150 M N-Methylpropionamid (HPLC, externe Standardlösung) gemischt.
Die resultierende Lösung
wurde filtriert und mit Hilfe der HPLC analysiert. Nach 53 Stunden
betrug die HPLC-Ausbeute an 4-Cyano-4-pentensäure 100% ohne zurückbleibendes
2-Methylenglutaronitril
und ohne dass andere Nebenprodukte beobachtet wurden.
-
BEISPIEL 19
-
3-CYANOPROPANSÄURE (AMMONIUMSALZ)
-
Zuerst
wurden 0,50 g (Nasszellgewicht) gefrorene Acidovorax facilis 72W
(ATCC 55764) (zuvor wärmebehandelt
bei 50°C
für 1 Stunde
vor dem Gefrieren) in ein 15 ml-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen gegeben,
gefolgt von einer Zugabe von 10 ml Kaliumphosphat-Puffer (20 mM,
pH 7,0). Nachdem die Zellen aufgetaut und suspendiert waren, wurde
die resultierende Suspension zentrifugiert und der Überstand
verworfen. Das resultierende Zellpellet wurde erneut in einem Gesamtvolumen
von 10 ml dieses gleichen Phosphat-Puffers suspendiert. In ein zweites
15 ml-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen
wurden 0,3236 g (4,00 mM, 0,400 M) Succinonitril in einem Gesamtvolumen
von 8,00 ml Kaliumphosphat-Puffer (20 mM, pH 7,0) aufgelöst und anschließend 2,00
ml der A. facilis 72W (ATCC 55746)-Zellsuspension (0,10 g Nasszellgewicht)
zugesetzt und die resultierende Suspension auf einer rotierenden
Plattform bei 27°C
gemischt. Es wurden Proben (0,100 ml) gezogen, mit Wasser auf 1:4
verdünnt
und zentrifugiert und anschließend
0,150 ml des Überstandes
in eine Millipore Ultrafree-MC-Filtereinheit (0,22 Mikrometer) gegeben
und mit 0,015 ml 0,1 M HCl und 0,150 ml einer wässrigen Lösung von 0,100 M Propansäure (HPLC,
externe Standardlösung)
gemischt. Die resultierende Lösung
wurde filtriert und mit Hilfe der HPLC analysiert. Nach 3,0 Stunden
betrug die HPLC-Ausbeute an 3-Cyanopentansäure 100% ohne zurückbleibendes
Succinonitril und ohne dass andere Nebenprodukte beobachtet wurden.
-
BEISPIEL 20
-
3-CYANOPROPANSÄURE-ABTRENNUNG
-
In
einen 500 ml-Erlenmeyerkolben, der mit einem Magnetrührstab ausgestattet
war, wurden 20,0 g gefrorene Acidovorax facilis 72W (ATCC 55746)-Zellen
(zuvor bei 50°C
für 1 Stunde
vor dem Gefrieren wärmebehandelt)
und 200 ml Kaliumphosphat-Puffer (20 mM, pH 7,0) bei 27°C gegeben.
Die Zellen wurden unter Rühren
aufgetaut und suspendiert und anschließend zentrifugiert und der Überstand
verworfen. Diese Waschprozedur wurde wiederholt. Das resultierende
Zellpellet wurde erneut in einem Gesamtvolumen von 1,00 1 Kaliumphosphat-Puffer
(20 mM, pH 7,0) mit einem Gehalt von 101,1 g (1,25 Mol, 1,25 M)
Succinonitril suspendiert und die resultierende Mischung in einem
1 l-Kolben gemischt, der in ein Wasserbad bei 27°C gesetzt wurde. Es wurden Proben
(0,100 ml) gezogen, auf 1:10 mit Wasser verdünnt und zentrifugiert und anschließend 0,150 ml
des Überstandes
in eine Millipore Ultrafree-MC-Filtereinheit
(0,22 Mikrometer) gegeben und mit 0,015 ml 0,1 M HCl und 0,150 ml
einer wässrigen
Lösung
einer 0,100 M Propansäure
(HPLC, externe Standardlösung) gemischt.
Die resultierende Lösung
wurde filtriert und mit Hilfe der HPLC analysiert. Nach 1,0 Stunden
betrug die HPLC-Ausbeute an 3-Cyanopropansäure und
Succinsäure
99,7% bzw. 0,3% ohne zurückbleibendes
Succinonitril. Das Reaktionsgemisch wurde zentrifugiert und der Überstand
unter Verwendung einer Amicon-2,5 l-Filtereinheit filtriert, die mit einem
YM-10-Filter (10K MWCO) ausgestattet war. Die Endkonzentration von 3-Cyanopropansäure-Ammoniumsalz
in dem Filtrat betrug 1,31 M.
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Es
wurde eine 200 ml-Portion des Filtrats, das das vorstehend beschriebene
Produktgemisch von 3-Cyanopropansäure-Ammoniumsalz enthielt,
mit 6 N HCl auf pH 2,5 eingestellt und anschließend mit Natriumchlorid gesättigt und
mit 4 × 200
ml Ethylether extrahiert. Die vereinten organischen Extrakte wurden über Magnesiumsulfat
getrocknet, filtriert und das Lösemittel
durch Rotationsverdampfung bei vermindertem Druck abgetrieben. Das
resultierende farblose Öl
wurde in 150 ml Ethylether aufgelöst und anschließend 100
ml Hexan zugesetzt und die resultierende Lösung bis –78°C gekühlt. Der resultierende weiße Feststoff,
der auskristallisierte, wurde mit Hilfe der Vakuumfiltration abgetrennt
und restliches Lösemittel
unter hohem Vakuum (150 mTorr) abgetrieben, um 14,32 g (55% isolierte
Ausbeute) an 3-Cyanopropansäure (Fp.
49,5° bis
51,0°C)
zu ergeben.
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BEISPIEL 21
-
4-CYANOBUTANSÄURE (AMMONIUMSALZ)
-
Zuerst
wurden 0,50 g (Nasszellgewicht) gefrorene Acidovorax facilis 72W
(ATCC 55764) (zuvor wärmebehandelt
bei 50°C
für 1 Stunde
vor dem Gefrieren) in ein 15 ml-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen gegeben,
gefolgt von einer Zugabe von 10 ml Kaliumphosphat-Puffer (20 mM,
pH 7,0). Nachdem die Zellen aufgetaut und suspendiert waren, wurde
die resultierende Suspension zentrifugiert und der Überstand
verworfen. Das resultierende Zellpellet wurde erneut in einem Gesamtvolumen
von 10 ml dieses gleichen Phosphat-Puffers suspendiert. In ein zweites
15 ml-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen
wurden 0,3830 g (4,03 mM, 0,400 M) Glutaronitril in einem Gesamtvolumen
von 6,00 ml Kaliumphosphat-Puffer (20 mM, pH 7,0) gegeben und anschließend 4,00
ml der A. facilis 72W (ATCC 55746)-Zellsuspension (0,20 g Nasszellgewicht)
zugesetzt und die resultierende Suspension auf einer rotierenden
Plattform bei 27°C
gemischt. Es wurden Proben (0,100 ml) gezogen, mit Wasser auf 1:4
verdünnt
und zentrifugiert und anschließend
0,150 ml des Überstandes
in eine Millipore Ultrafree-MC-Filtereinheit (0,22 Mikrometer) gegeben
und mit 0,015 ml 0,1 M HCl und 0,150 ml einer wässrigen Lösung von 0,150 M Kaliumacetat
(HPLC, externe Standardlösung)
gemischt. Die resultierende Lösung
wurde filtriert und mit Hilfe der HPLC analysiert. Nach 4,0 Stunden
betrug die HPLC-Ausbeute an 4-Cyanobutansäure und Glutarsäure 85,1%
bzw. 8,2% mit 5,7% zurückbleibendem
Glutaronitril.
-
BEISPIEL 22
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4-CYANOBUTANSÄURE-ABTRENNUNG
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In
einen 250 ml-Erlenmeyerkolben, der mit einem Magnetrührstab ausgestattet
war, wurden 15,0 g gefrorene Acidovorax facilis 72W (ATCC 55746)-Zellen
(zuvor bei 50°C
für 1 Stunde
vor dem Gefrieren wärmebehandelt)
und 135 ml Kaliumphosphat-Puffer (20 mM, pH 7,0) bei 27°C gegeben.
Die Zellen wurden unter Rühren
aufgetaut und suspendiert und anschließend zentrifugiert und der Überstand
verworfen. Diese Waschprozedur wurde wiederholt. Das resultierende
Zellpellet wurde erneut in einem Gesamtvolumen von 100 ml Kaliumphosphat-Puffer
(20 mM, pH 7,0) suspendiert und diese Zellsuspension in einen 500
ml-Kolben gegeben, der einen Magnetrührstab enthielt, 42,78 g (0,450
Mol) Glutaronitril und 157,2 ml Kaliumphosphat-Puffer (20 mM, pH
7,0). Die resultierende Mischung, die 1,5 M Glutaronitril enthielt,
wurde bei 27°C
gerührt.
Es wurden Proben (0,100 ml) gezogen, auf 1:10 mit Wasser verdünnt und
zentrifugiert. Anschließend
wurden 0,200 ml des Überstandes
in eine Millipore Ultrafree-MC-Filtereinheit (0,22 Mikrometer) gegeben
und mit 0,020 ml 0,1 M HCl und 0,200 ml einer wässrigen Lösung von 0,150 M Kaliumacetat
(HPLC, externe Standardlösung) gemischt.
Die resultierende Lösung
wurde filtriert und mit Hilfe der HPLC analysiert. Nach 4,0 Stunden
betrug die HPLC-Ausbeute an 4-Cyanobutansäure-Ammoniumsalz und Glutarsäure-Diammoniumsalz
92,3% bzw. 7,7% ohne zurückbleibendes
Glutaronitril.
-
Das
Reaktionsgemisch wurde zentrifugiert und der Überstand unter Verwendung einer
Amicon-2,5 l-Filtereinheit filtriert, die mit einem YM-10-Filter
(10K MWCO) ausgestattet war. Das Filtrat, welches das vorstehend
beschrieben Produktgemisch von 4-Cyanobutansäure-Ammoniumsalz enthielt,
wurde mit 6 N HCl auf pH 3,5 eingestellt und anschließend mit
Natriumchlorid gesättigt
und mit 4 × 300
ml Ethylether extrahiert. Die vereinten organischen Extrakte wurden über Magnesiumsulfat
getrocknet, filtriert und das Lösemittel
durch Rotationsverdampfung bei vermindertem Druck abgetrieben, gefolgt
von einem Rühren
unter Vakuum (100 mTorr), um 35,3 g (62% Ausbeute) an 4-Cyanobutansäure als
ein blassgelbes Öl
zu ergeben, das beim Stehen auskristallisierte. Der Feststoff wurde
aus 1:1 Ethylacetat/Hexan bei 5°C
umkristallisiert (Fp. 39,6° bis
40,2°C).
-
BEISPIEL 23
-
5-CYANOPENTANSÄURE (AMMONIUMSALZ)
-
Zuerst
wurden 2,0 g (Nasszellgewicht) gefrorene Comamonas testosteroni
5-MGAM-4D (ATCC 55744)-Zellen (zuvor wärmebehandelt bei 50°C für 1 Stunde
vor dem Gefrieren) in ein 50 ml-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen gegeben,
gefolgt von einer Zugabe von 30 ml Kaliumphosphat-Puffer (20 mM,
pH 7,0). Nachdem die Zellen aufgetaut und suspendiert waren, wurde
die resultierende Suspension zentrifugiert und der Überstand
verworfen. Das resultierende Zellpellet wurde erneut in einem Gesamtvolumen
von 30 ml dieses gleichen Phosphat-Puffers suspendiert. In ein zweites
15 ml-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen wurden 0,1085
g (0,114 ml, 1,00 mM, 0,100 M) Adiponitril eingewogen und anschließend 9,29
ml Kaliumphosphat-Puffer (20 mM, pH 7,0) und 0,60 ml der Comamonas
testosteroni 5-MGAM-4D (ATCC 55744)-Zellsuspension (0,040 g Nasszellgewicht)
zugesetzt und die resultierende Suspension auf einer rotierenden
Plattform bei 27°C gemischt.
Es wurden Proben (0,300 ml) gezogen und zentrifugiert und anschließend 0,180
ml, des Überstandes
in eine Millipore Ultrafree-MC-Filtereinheit
(10 K MWCO) gegeben und mit 0,020 ml einer wässrigen Lösung von 0,750 M N-Ethylacetamid (HPLC,
externe Standardlösung)
und ausreichend 1,0 M HCl gemischt, um den pH-Wert der Probe auf
etwa pH 2,5 abzusenken. Die resultierende Lösung wurde filtriert und mit
Hilfe der HPLC analysiert. Nach 5,0 Stunden betrug die HPLC-Ausbeute
an 5-Cyanopentansäure,
Adipaminsäure,
Adipamid und Adipinsäure
96,6%, 1,7%, 1,4% und 0,3% ohne zurückbleibendes Adiponitril.
-
BEISPIEL 24
-
5-CYANOPENTANSÄURE (AMMONIUMSALZ)
-
Die
in Beispiel 23 beschriebene Prozedur wurde wiederholt, indem 0,4338
g (0,457 ml, 4,01 mM, 0,401 M) Adiponitril und 3,00 ml der wärmebehandelten
Comamonas testosteroni 5-MGAM-4D (ATCC 55744)-Zellsuspension (0,20
g Nasszellgewicht) in einem Gesamtvolumen von 10,0 ml (eingestellt
mit Kaliumphosphat-Puffer (20 mM, pH 7,0)) verwendet wurden. Es
wurden Proben (0,100 ml) gezogen, mit Wasser auf 1:4 verdünnt und
zentrifugiert und anschließend
0,180 ml des Überstandes
in eine Millipore Ultrafree-MC-Filtereinheit (10 K MWCO) gegeben
und mit 0,020 ml einer wässrigen
Lösung
von 0,750 M N-Ethylacetamid (HPLC, externe Standardlösung) und
ausreichend 1,0 M HCl gemischt, um den pH-Wert der Probe auf etwa
pH 2,5 abzusenken. Die resultierende Lösung wurde filtriert und mit
Hilfe der HPLC analysiert. Nach 5,0 Stunden betrug die HPLC-Ausbeute
an 5-Cyanopentansäure,
Adipaminsäure,
Adipamid und Adipinsäure
94,0%, 4,0%, 0,6% und 1,4% ohne zurückbleibendes Adiponitril.
-
BEISPIEL 25
-
5-CYANOPENTANSÄURE (AMMONIUMSALZ)
-
Die
in Beispiel 23 beschriebene Prozedur wurde wiederholt, indem 1,084
g (1,14 ml, 10,0 mM, zweiphasige Reaktion, 1,00 M Produkt) Adiponitril
und 7,5 ml der wärmebehandelten
Comamonas testosteroni 5-MGAM-4D (ATCC 55744)-Zellsuspension (0,50
g Nasszellgewicht) in einem Gesamtvolumen von 10,0 ml (eingestellt
mit Kaliumphosphat-Puffer (20 mM, pH 7,0)) verwendet wurden. Es
wurden Proben (0,100 ml) gezogen, mit Wasser auf 1:10 verdünnt und
zentrifugiert und anschließend
0,180 ml des Überstandes
in eine Millipore Ultrafree-MC-Filtereinheit (10 K MWCO) gegeben
und mit 0,020 ml einer wässrigen
Lösung
von 0,750 M N-Ethylacetamid (HPLC, externe Standardlösung) und
ausreichend 1,0 M HCl gemischt, um den pH-Wert der Probe auf etwa
pH 2,5 abzusenken. Die resultierende Lösung wurde filtriert und mit
Hilfe der HPLC analysiert. Nach 24,0 Stunden betrug die HPLC-Ausbeute
an 5-Cyanopentansäure,
Adipaminsäure,
Adipamid und Adipinsäure
90,0%, 4,2%, 0,0% und 5,7% ohne zurückbleibendes Adiponitril.
-
BEISPIEL 26
-
5-CYANOPENTANSÄURE-ABTRENNUNG
-
In
einen 2 l-Erlenmeyerkolben, der mit einem Magnetrührstab ausgestattet
war, wurde eine Suspension von 4,0 g Comamonas testosteroni 5-MGAM-4D
(ATCC 55744)-Zellen (zuvor bei 50°C
für 1 Stunde
wärmebehandelt)
in 1,72 1 Kaliumphosphat-Puffer (20 mM, pH 7,0) bei 27°C gegeben.
Anschließend
wurden unter Rühren
zu der Suspension 270,4 g (284,3 ml, 2,5 Mol, etwa 1,25 M Produkt-Endkonzentration)
Adiponitril gegeben und die resultierende Mischung bei 27°C gerührt. Es
wurden Proben (0,200 ml) gezogen, auf 1:5 mit Wasser verdünnt und
zentrifugiert und anschließend
0,200 ml des Überstandes
in eine Millipore Ultrafree-MC-Filtereinheit (10 K MWCO) gegeben
und ausreichend 1,0 M HCl zugesetzt, um den pH-Wert der Probe bis
etwa pH 2,5 abzusenken. Die resultierende Lösung wurde filtriert und mit
Hilfe der HPLC analysiert. Nach 63 Stunden verlangsamte sich die
Hydrolysereaktion deutlich, so dass zusätzlich 10,0 g des gleichen
mikrobiellen Zellkatalysators der Mischung zugesetzt wurden. Nach
86 Stunden betrug die HPLC-Ausbeute an 5-Cyanopentansäure, Adipaminsäure, Adipamid
und Adipinsäure
88,2%, 4,7%, 6,6% und 0,0% ohne zurückbleibendes Adiponitril. Das
Reaktionsgemisch wurde zentrifugiert und der Überstand unter Verwendung einer
Amicon 2,5 l-Filtereinheit filtriert, die mit einem YM-10-Filter
(10K MWCO) ausgestattet war.
-
Es
wurde eine 200 ml-Portion des Filtrats, das das vorstehend beschriebene
Produktgemisch von 5-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz (1,13 M) enthielt,
mit 6 N HCl auf pH 2,5 eingestellt, anschließend mit Natriumchlorid gesättigt und
mit 4 × 200
ml Ethylether extrahiert. Die vereinten Etherextrakte wurden über Magnesiumsulfat
getrocknet, filtriert und das Lösemittel
durch Rotationsverdampfung bei vermindertem Druck abgetrieben. Der
verbleibende Ether wurde durch Rühren
der farblosen Flüssigkeit
bei Raumtemperatur unter hohem Vakuum (60 mTorr) für 5 Stunden
abgetrieben, um 27,32 g (95% isolierte Ausbeute) an 5-Cyanopentansäure zu ergeben.
Die 5-Cyanopentansäure
wurde sodann unter Vakuum (75 mTorr) bei 110° bis 112°C ohne Zersetzung destilliert.
-
BEISPIEL 27
-
5-METHYL-2-PIPERIDON AUS
4-CYANOPENTANSÄURE-AMMONIUMSALZ
-
In
einen 100 ml-Messzylinder wurden 54,4 ml einer wässrigen Reaktionsmischung mit
einem Gehalt von 1,85 M 4-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz (0,1 M 4-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz,
erzeugt durch enzymatische Hydrolyse von 2-Methylglutaronitril;
Beispiel 9, filtrierte Produktmischung aus Reaktion #5) gegeben
und anschließend
12,9 ml konzentriertes Ammoniumhydroxid (29,3% NH3,
0,2 M NH3) zugesetzt und das Endvolumen
auf 100 ml mit destilliertem Wasser eingestellt. Die Endkonzentrationen
an 4-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz
und zugesetztem Ammoniumhydroxid betrugen 1,0 M bzw. 2,0 M. Zu der
resultierenden Lösung
wurden 0,631 g (5 Gew.% 4-Cyanopentansäure) Raney Nickel mit Chrom-Promotor
(Grace Davison Raney® 2400 Active Metal Catalyst)
zugesetzt und die resultierende Mischung in einen 300 ml 314 SS-Rührautoklav,
Engineers EZE-Seal gegeben, der mit einem Dispersimax® Turbinenimpeller
ausgestattet war. Nach dem Spülen
des Reaktors mit Stickstoff wurden die Inhaltsstoffe des Reaktors
bei 1.000 U/min gerührt
und bei 160°C
unter 500 psig Überdruck
mit Wasserstoff für
3 Stunden erhitzt. Nach dem Kühlen
bis Raumtemperatur zeigte die gaschromatographische Analyse des
abschließenden
Reaktionsgemisches eine Ausbeute von 96,4% an 5-Methyl-2-piperidon
ohne zurückbleibendes
4-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz.
-
Das
Produktgemisch wurde zur Entfernung des Katalysators filtriert und
anschließend
mit 6 N HCl auf pH 6,0 eingestellt und mit Natriumchlorid gesättigt. Die
resultierende Lösung
wurde 5 Mal mit 100 ml Dichlormethan extrahiert und die vereinten
organischen Extrakte über
Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösemittel durch Rotationsverdampfung
unter vermindertem Druck abgetrieben, um ein farbloses Öl zu ergeben.
Nach Entfernung des verbleibenden Lösemittels unter Vakuum (0,1
mmHg) kristallisierte das Öl
unter Erzeugung eines weißen
Feststoffes aus, der aus 150 ml Ethylether bei –78°C umkristallisiert wurde, um
6,69 g (59% isolierte Ausbeute) an 5-Methyl-2-piperidon (Fp. 55,5° bis 56,2°C) zu ergeben.
-
BEISPIEL 28
-
5-METHYL-2-PIPERIDON AUS
4-CYANOPENTANSÄURE
-
Die
in Beispiel 27 beschriebene Reaktion wurde unter Verwendung von
12,71 g (0,100 Mol) kristalline 4-Cyanopentansäure (von der in Beispiel 8
beschriebenen Abtrennung) und 19,34 ml konzentriertes Ammoniumhydroxid
(29,3% NH3, 0,3 Mol NH3)
und zwar in einem Gesamtvolumen von 100 ml verwendet worden. Die Endkonzentrationen
von 4-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz
und Ammoniak betrugen 1,0 M bzw. 2,0 M. Die Analyse der abschließenden Reaktionsmischung
mit Hilfe der Gaschromatographie zeigte 91,1% Ausbeute an 5-Methyl-2-piperidon
ohne zurückbleibende
4-Cyanopentansäure.
-
BEISPIEL 29
-
5-METHYL-2-PIPERIDON AUS
4-CYANOPENTANSÄURE-AMMONIUMSALZ
-
Es
wurden Hydrierungen von 5 ml wässrigen
Reaktionsgemischen mit einem Gehalt von 1,0 M 4-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz (filtriertes
Produktgemisch aus Beispiel 9, Reaktion #5), Null bis 3,0 M Ammoniumhydroxid
und 5 Gew.% oder 10 Gew.% (bezogen auf das Gewicht der 4-Cyanopentansäure) eines
Hydrierungskatalysators, ausgewählt
aus einer Gruppe, bestehend aus Raney Nickel-Katalysator mit Chrom-Promotor
(Raney 2400), 5% Palladium-auf-Kohlenstoff, 10% Palladium-auf-Kohlenstoff,
5% Ruthenium-auf-Aluminiumoxid oder 10% Ruthenium-auf-Aluminiumoxid,
die in Glasröhrchen
bei 500 psig Überdruck
Wasserstoffgas entweder bei 160° oder
180°C ausgeführt wurden,
auf die Erzeugung des entsprechenden Lactam 5-Methyl-2-piperidon
(5-MPPD) untersucht:
-
BEISPIEL 30
-
4-ETHYLPYRROLIDIN-2-ON
AUS 3-CYANOPENTANSÄURE-AMMONIUMSALZ
-
In
einen 100 ml-Messzylinder wurden 79,4 ml einer wässrigen Reaktionsmischung mit
einem Gehalt von 1,26 M 3-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz (0,1 M 3-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz,
erzeugt durch enzymatische Hydrolyse von 2-Ethylsuccinonitril; filtriertes
Produktgemisch von Beispiel 13) gegeben und anschließend 12,9
ml konzentriertes Ammoniumhydroxid (29,3% NH3,
0,2 M NH3) zugesetzt und das Endvolumen
auf 100 ml mit destilliertem Wasser eingestellt. Die Endkonzentrationen
an 3-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz
und zugesetztem Ammoniumhydroxid betrugen 1,0 M bzw. 2,0 M. Zu der
resultierenden Lösung
wurden 0,631 g (5 Gew.%/Gew.% 3-Cyanopentansäure) Raney Nickel mit Chrom-Promotor
(Grace Davison Raney® 2400 Active Metal Catalyst)
zugesetzt und die resultierende Mischung in einen 300 ml 314 SS-Rührautoklav,
Engineers EZE-Seal gegeben, der mit einem Dispersimax® Turbinenimpeller
ausgestattet war. Nach dem Spülen
des Reaktors mit Stickstoff wurden die Inhaltsstoffe des Reaktors
bei 1.000 U/min gerührt
und bei 160°C
unter 500 psig Überdruck
mit Wasserstoff für
4 Stunden erhitzt. Nach dem Kühlen
bis Raumtemperatur zeigte die Analyse des fertigen Reaktionsgemisches
mit Hilfe der Gaschromatographie eine Ausbeute von 90,7% 4-Ethylpyrrolidin-2-on
ohne zurückbleibendes
3-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz
-
BEISPIEL 31
-
4-ETHYLPYRROLIDIN-2-ON
AUS 3-CYANOPENTANSÄURE
-
Die
in Beispiel 30 beschriebene Reaktion wurde wiederholt, indem 12,71
g (0,100 Mol) kristalline 3-Cyanopentansäure (von der in Beispiel 13
beschriebenen Abtrennung) und 19,34 ml konzentriertes Ammoniumhydroxid
(29,3% NH3, 0,3 Mol NH3)
und zwar in einem Gesamtvolumen von 100 ml verwendet worden. Die Endkonzentrationen
von 3-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz
und zugesetztem Ammoniumhydroxid betrugen 1,0 M bzw. 2,0 M. Die
Analyse der fertigen Reaktionsmischung (2 Stunden Reaktionsdauer)
anhand der Gaschromatographie zeigte eine Ausbeute von 92,1% 4-Ethylpyrrolidin-2-on
ohne zurückbleibende
3-Cyanopentansäure.
-
Das
Produktgemisch wurde zur Entfernung des Katalysators filtriert und
anschließend
mit 6 N HCl auf pH 7,0 eingestellt und mit Natriumchlorid gesättigt. Die
resultierende Lösung
wurde 4 Mal mit 100 ml Dichlormethan extrahiert und die vereinten
organischen Extrakte über
Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösemittel durch Rotationsverdampfung
unter vermindertem Druck abgetrieben, um ein farbloses Öl zu ergeben.
Nach Entfernung des verbleibenden Lösemittels unter Vakuum (0,1
mmHg) wurde das Öl
in 150 ml Ethylether aufgelöst,
das danach bis –78°C gekühlt wurde.
Nach 1 Stunde wurde der weiße
Feststoff, der auskristallisiert war, durch Vakuumfiltration aufgenommen,
um insgesamt 8,96 g (79% isolierte Ausbeute) an 4-Ethylpyrrolidin-2-on
(Fp. 40,5° bis
41,5°C)
zu ergeben.
-
BEISPIEL 32
-
4-ETHYLPYRROLIDIN-2-ON
AUS 3-CYANOPENTANSÄURE-AMMONIUMSALZ
-
Die
in Beispiel 30 beschriebene Reaktion wurde exakt entsprechend der
Beschreibung mit der Ausnahme wiederholt, dass die eingesetzte Temperatur
für die
Hydrierung 140°C
betrug. Die Analyse der fertigen Reaktionsmischung (4 Stunden Reaktionsdauer)
anhand der Gaschromatographie zeigte eine Ausbeute von 87,2% an
4-Ethylpyrrolidin-2-on ohne zurückbleibende
3-Cyanopentansäure.
-
BEISPIEL 33
-
4-ETHYLPYRROLIDIN-2-ON
AUS 3-CYANOPENTANSÄURE-AMMONIUMSALZ
-
Die
in Beispiel 30 beschriebene Reaktion wurde exakt entsprechend der
Beschreibung mit der Ausnahme wiederholt, dass 1,262 g (10 Gew.%/Gew.%
3-Cyanopentansäure)
Raney Nickel mit Chrom-Promotor (Grace
Davison Raney® 2400
Active Metal Catalyst) eingesetzt wurden. Die Analyse der fertigen
Reaktionsmischung (1,5 Stunden Reaktionsdauer) anhand der Gaschromatographie
zeigte eine Ausbeute von 91,0% an 4-Ethylpyrrolidin-2-on ohne zurückbleibende
3-Cyanopentansäure.
-
BEISPIEL 34
-
4-ETHYLPYRROLIDIN-2-ON
AUS 3-CYANOPENTANSÄURE-AMMONIUMSALZ
(TEMPERATURABHÄNGIGKEIT)
-
Es
wurden Hydrierungen von 5 ml wässrigen
Reaktionsgemischen mit einem Gehalt von 1,0 M 3-Cyanopentansäure (3-CPA)-Ammoniumsalz (filtriertes
Produktgemisch aus Beispiel 13), 2,0 M Ammoniumhydroxid und 5 Gew.%
oder 10 Gew.% Raney Nickel-Katalysator mit Chrom-Promotor (Raney
2400) (bezogen auf das Gewicht der 3-Cyanopentansäure), die
in Glasschüttelröhrchen bei
500 psig Überdruck
Wasserstoffgas und bei Temperaturen von 70° bis 180°C für 2 Stunden ausgeführt wurden,
anschließend
mit Hilfe der Hochdruckflüssigchromatogaphie
auf Umwandlung von 3-CPA und mit Hilfe der Gaschromatographie auf
Erzeugung von 4-Ethylpyrrolidin-2-on analysiert:
-
BEISPIEL 35
-
4-ETHYLPYRROLIDIN-2-ON
AUS 3-CYANOPENTANSÄURE-AMMONIUMSALZ
(NH4OH-KONZENTRATIONSABHÄNGIGKEIT)
-
Es
wurden Hydrierungen von 5 ml wässrigen
Reaktionsgemischen mit einem Gehalt von 1,0 M 3-Cyanopentansäure (3-CPA)-Ammoniumsalz (filtriertes
Produktgemisch aus Beispiel 13), von mit Null bis 3,0 M Ammoniumhydroxid
und 5 Gew.% Raney Nickel-Katalysator mit Chrom-Promotor (Raney 2400)
(bezogen auf das Gewicht der 3-Cyanopentansäure), die in Glasschüttelröhrchen bei
500 psig Überdruck
Wasserstoffgas und bei Temperaturen von 160° oder 180°C für 2 Stunden ausgeführt wurden,
anschließend
mit Hilfe der Hochdruck-Flüssigchromatographie
auf Umwandlung von 3-CPA und mit Hilfe der Gaschromatographie auf
Erzeugung von 4-Ethylpyrrolidin-2-on analysiert:
-
BEISPIEL 36
-
4-ETHYLPYRROLIDIN-2-ON
AUS 3-CYANOPENTANSÄURE-AMMONIUMSALZ
(3-CPA-KONZENTRATIONSABHÄNGIGKEIT)
-
Es
wurden Hydrierungen von 5 ml wässrigen
Reaktionsgemischen mit einem Gehalt von 1,0 M, 1,5 M oder 2,0 M
3-Cyanopentansäure
(3-CPA) (isoliert aus dem filtrierten Produktgemisch aus Beispiel
13) und 2,0 M, 3,0 M oder 4,0 M Ammoniumhydroxid unter Verwendung
von 5,0 Gew.% Raney Nickel-Katalysator
mit Chrom-Promotor (Raney 2400) (bezogen auf das Gewicht der 3-Cyanopentansäure), die
in Glasschüttelröhrchen bei
500 psig Überdruck
Wasserstoffgas und bei Temperaturen von 160° oder 180°C für 2 Stunden ausgeführt wurden,
anschließend
mit Hilfe der Hochdruck-Flüssigchromatographie
auf Umwandlung von 3-CPA und mit Hilfe der Gaschromatographie auf
Erzeugung von 4-Ethylpyrrolidin-2-on analysiert:
-
BEISPIEL 37
-
CAPROLACTAM AUS 5-CYANOPENTANSÄURE-AMMONNMSALZ
-
Es
wurden Hydrierungen von 5 ml wässrigen
Reaktionsgemischen mit einem Gehalt von 1,0 M 5-Cyanopentansäure (5-CPA)-Ammoniumsalz (hergestellt
aus der enzymatischen Hydrolyse von Adiponitril; filtriertes Produktgemisch
aus Beispiel 26) Null M bis 2,5 M Ammoniumhydroxid und 5 Gew.% Raney
Nickel-Katalysator mit Chrom-Promotor (Raney 2400) (bezogen auf
das Gewicht der 5-Cyanopentansäure),
die in Glasschüttelröhrchen bei
500 psig Überdruck
Wasserstoffgas und bei Temperaturen von 70° bis 160°C für 2 Stunden ausgeführt wurden,
anschließend
mit Hilfe der Hochdruck-Flüssigchromatographie
auf Umwandlung von 5-CPA und mit Hilfe der Gaschromatographie auf
Erzeugung von Caprolactam analysiert:
-
Der
Ringschluss des Ammoniumsalzes von 6-Aminocapronsäure (6-ACA)
in den wässrigen
Produktgemischen, die durch Hydrierung von 5-CPA-Ammoniumsalz bei
70°C (entsprechend
der vorstehenden Beschreibung) hergestellt wurden, wurden bei einer
höheren
Temperatur versucht auszuführen,
indem zuerst der Hydrierungskatalysator durch Filtration entfernt
wurde und anschließend
die etwa 1,0 M 6-ACA-Ammoniumsalz-Reaktionsgemische bei 280°C für 2 Stunden
erhitzt wurden:
-
BEISPIEL 38
-
1,5-DIMETHYL-2-PIPERIDON
AUS 4-CYANOPENTANSÄURE-AMMONIUMSALZ
-
Es
wurden Hydrierungen von 5 ml wässrigen
Reaktionsgemischen mit einem Gehalt von 1,0 M 4-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz (filtriertes
Produktgemisch aus Beispiel 9, Reaktion #5) 3,0 M Methylamin und
5 Gew.% oder 10 Gew.% (bezogen auf das Gewicht von 4-Cyanopentansäure) eines
Hydrierungskatalysators, ausgewählt
aus einer Gruppe, bestehend aus Raney Nickel-Katalysator mit Chrom-Promotor
(Raney 2400), 5% Palladium-auf-Kohlenstoff, 5% Palladium-auf-Aluminiumoxid,
5% Ruthenium-auf-Aluminiumoxid oder 4,5% Palladium/0,5% Platin-auf-Kohlenstoff
in Glasschüttelröhrchen bei
500 psig Überdruck
Wasserstoffgas und bei 160°C
für 2 Stunden
ausgeführt,
anschließend
auf die Erzeugung von 1,5-Dimethyl-2-piperidon (5-DMPD) und 5-Methyl-2-piperidon
(5-MPPD) analysiert:
-
BEISPIEL 39
-
1,5-DIMETHYL-2-PIPERIDON
AUS 4-CYANOPENTANSÄURE-AMMONIUMSALZ
-
Es
wurden Hydrierungen von 5 ml wässrigen
Reaktionsgemischen mit einem Gehalt von 1,0 M 4-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz (filtriertes
Produktgemisch aus Beispiel 9, Reaktion #5), 1,0 M bis 3,0 M Methylamin
und 5 Gew.% (bezogen auf das Gewicht von 4-Cyanopentansäure) von
5% Palladium-auf-Kohlenstoff in
Glasschüttelröhrchen bei
500 psig Überdruck
Wasserstoffgas und bei 140°C
für 2 Stunden
ausgeführt
und anschließend
auf die Erzeugung von 1,5-Dimethyl-2-piperidon (5-DMPD), 5-Methyl-2-piperidon (5-MPPD)
und 2-Methylglutarsäure
(2-MGA) analysiert:
-
BEISPIEL 40
-
1,5-DIMETHYL-2-PIPERIDON
AUS 4-CYANOPENTANSÄURE-AMMONIUMSALZ
-
Es
wurden Hydrierungen von 5 ml wässrigen
Reaktionsgemischen mit einem Gehalt von 1,0 M 4-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz (filtriertes
Produktgemisch aus Beispiel 9, Reaktion #5), 1,0 M bis 4,0 M Methylamin
und 5 Gew.% (bezogen auf das Gewicht von 4-Cyanopentansäure) von
5% Palladium-auf-Kohlenstoff in
Glasschüttelröhrchen bei
500 psig Überdruck
Wasserstoffgas und bei 160°C
für 2 Stunden
ausgeführt
und anschließend
auf die Erzeugung von 1,5-Dimethyl-2-piperidon (5-DMPD), 5-Methyl-2-piperidon (5-MPPD)
und 2-Methylglutarsäure
(2-MGA) analysiert:
-
BEISPIEL 41
-
1,5-DIMETHYL-2-PIPERIDON
AUS 4-CYANOPENTANSÄURE-AMMONIUMSALZ
-
Es
wurden Hydrierungen von 5 ml wässrigen
Reaktionsgemischen mit einem Gehalt von 1,0 M 4-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz (filtriertes
Produktgemisch aus Beispiel 9, Reaktion #5), 3,0 M bis 4,0 M Methylamin
und 5 Gew.% (bezogen auf das Gewicht von 4-Cyanopentansäure) entweder
5% Palladium-auf-Kohlenstoff
oder 4,5% Palladium/0,5% Platin-auf-Kohlenstoff in Glasschüttelröhrchen bei
500 psig Überdruck Wasserstoffgas
und bei 180°C
für 2 Stunden
ausgeführt
und anschließend
auf die Erzeugung von 1,5-Dimethyl-2-piperidon (5-DMPD), 5-Methyl-2-piperidon
(5-MPPD) und 2-Methylglutarsäure
(2-MGA) analysiert:
-
BEISPIEL 42
-
1,5-DIMETHYL-2-PIPERIDON
AUS 4-CYANOPENTANSÄURE-AMMONIUMSALZ
-
In
einen 100 ml-Messzylinder wurden 54,4 ml einer wässrigen Reaktionsmischung mit
einem Gehalt von 1,84 M 4-Cyanopentansäure-Annnoniumsalz (0,1 Mol
3-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz,
erzeugt durch enzymatische Hydrolyse von 2-Ethylsuccinonitril; filtriertes
Produktgemisch von Beispiel 13) gegeben und anschließend 17,2
ml 40 gew.%iges Methylamin (6,21 g Methylamin, 0,2 Mol) zugesetzt
und das Endvolumen auf 100 ml mit destilliertem Wasser eingestellt.
Die abschließenden
Konzentrationen von 3-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz und Methylamin
betrugen 1,0 M bzw. 2,0 M. Zu der resultierenden Lösung wurden 0,636
g (5 Gew.%/Gew.% 3-Cyanopentansäure)
von 5% Pd-auf- Kohlenstoff-Pulver
zugegeben und die resultierende Mischung in einen 300 ml-Rührautoklav
314 SS Engineers EZE-Seal gegeben, der mit einem Dispersimax® Turbinenimpeller
ausgestattet war. Nach dem Spülen
des Reaktors mit Stickstoff wurden die Inhaltsstoffe des Reaktors
bei 1.000 U/min gerührt
und bei 140°C
unter 500 psig Überdruck
Wasserstoffgas für
4 Stunden erhitzt. Es wurden Proben (etwa 1,5 ml) mit Hilfe eines
Probenahmeröhrchens
im Verlaufe der Reaktion zur Analyse entnommen: Nach dem Kühlen bis
Raumtemperatur zeigte die Analyse des abschließenden Reaktionsgemisches anhand
der Gaschromatographie eine Ausbeute von 69,8% 4-Ethyl-1-methylpyrrolidin-2-on
und eine Ausbeute von 20,4% an 4-Ethylpyrrolidin-2-on ohne zurückbleibendes
3-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz
-
Das
Produktgemisch (61 ml nach der Probenahme) wurde zur Entfernung
des Katalysators filtriert und anschließend mit 6 N HCl auf pH 7,0
eingestellt und mit Natriumchlorid gesättigt. Die resultierende Lösung wurde
4 Mal mit 100 ml Ethylether extrahiert und die vereinten organischen
Extrakte über
Magnesiumsulfat filtriert und das Lösemittel durch Rotationsverdampfung
unter vermindertem Druck abgetrieben, um eine farblose Flüssigkeit
zu ergeben. Die Flüssigkeit
wurde bei 3,5 mmHg destilliert und die bei 70,0° bis 71,5°C siedende Fraktion aufgenommen,
um 4,65 g (60% isolierte Ausbeute) an 1,5-Dimethyl-2-piperidon (5-DMPD) zu ergeben.
-
BEISPIEL 43
-
1,5-ETHYL-1-METHYLPYRROLIDON-2-ON
AUS 3-CYANOPENTANSÄURE-AMMONIUMSALZ
-
In
einen 100ml-Messzylinder wurden 79,4 ml einer wässrigen Reaktionsmischung mit
einem Gehalt von 1,26 M 3-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz (0,1 Mol 3-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz,
erzeugt durch enzymatische Hydrolyse von 2-Ethylsuccinonitril; Beispiel
13 als filtriertes Produktgemisch) gegeben und anschließend 17,2
ml 40gew.%iges Methylamin (6,21 g Methylamin, 0,2 Mol) zugesetzt
und das Endvolumen auf 100 ml mit destilliertem Wasser eingestellt.
Die abschließenden
Konzentrationen von 3-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz und Methylamin
betrugen 1,0 M bzw. 2,0 M. Zu der resultierenden Lösung wurden
0,636 g (5 Gew.%/Gew.% 3-Cyano-4-pentansäure) 5%Palladium-auf-Kohlepulver
zugesetzt und das resultierende Gemisch in einen 300 ml-Rührautoklav "Engineers EZE-Seal" aus 314 SS gegeben,
der mit einem Dispersimax® Turbinenimpeller ausgestattet
war. Nach dem Spülen
des Reaktors mit Stickstoff wurden die Inhaltsstoffe des Reaktors
bei 1.000 U/min gerührt
und bei 140°C
unter 500 psig Überdruck
Wasserstoffgas für
4 Stunden erhitzt. Es wurden Proben mit dem Probenahmerohr im Verlaufe
der Reaktion zur Analyse entnommen (etwa 1,5 ml). Nach dem Kühlen bis
Raumtemperatur zeigte die Analyse des abschließenden Reaktionsgemisches anhand
der Gaschromatographie eine Ausbeute von 69,8% 4-Ethyl-1-methylpyrrolidin-2-on
und eine Ausbeute von 20,4% an 4-Ethylpyrrolidin-2-on ohne zurückbleibendes
3-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz.
-
Das
Produktgemisch (80 ml nach der Probenahme) wurde zur Entfernung
des Katalysators filtriert und anschließend mit 6 N HCl auf pH 7,0
eingestellt und mit Natriumchlorid gesättigt. Die resultierende Lösung wurde
4 Mal mit 100 ml Dichlormethan extrahiert und die vereinten organischen
Extrakte über
Magnesiumsulfat getrocknet, filtiert und das Lösemittel durch Rotationsverdampfung
unter vermindertem Druck abgetrieben, um eine farblose Flüssigkeit
zu ergeben. Die Flüssigkeit
wurde bei 16 mm Hg fraktioniert, destilliert und die bei 100,0° siedende
Fraktion aufgenommen (5,15 g, 51% Ausbeute). Das resultierende 4-Ethyl-1-methyl-pyrrolidin-2-on
enthielt <5% 4-Ethylpyrrolidin-2-on
als Verunreinigung, so dass die Flüssigkeit erneut bei 40 mm Hg destilliert
wurde und die bei 128°C
siedende Fraktion aufgenommen wurde, um 3,71 g (37% isolierte Ausbeute) an
4-Ethyl-1-methylpyrrolidin-2-on (4-EMPRD) zu ergeben.
-
BEISPIEL 44
-
5-METHYL-2-PIPERIDON AUS
4-CYANO-4-PENTENSÄURE-AMMONIUMSALZ
-
Im
einen 100 ml-Messzylinder wurden 77,0 ml einer wässrigen Reaktionsmischung mit
einem Gehalt von 1,30 M 4-Cyano-4-pentensäure-Anunoniumsalz (0,1 Mol
4-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz,
erzeugt durch enzymatische Hydrolyse von 2-Methylenglutaronitril;
Beispiel 17) gegeben und anschließend 12,9 ml konzentriertes
Ammoniumhydroxid (29,3% NH3, 0,2 Mol NH3) zugesetzt und das Endvolumen auf 100 ml
mit destilliertem Wasser eingestellt. Die abschließenden Konzentrationen
von 4-Cyano-4-pentensäure-Ammoniumsalz
und zugesetztem Ammoniumhydroxid betrugen 1,0 M bzw. 2,0 M. Zu der
resultierenden Lösung
wurden 0,626 g (5 Gew.%/Gew.% 4-Cyano-4-pentensäure) Raney Nickel mit Chrom-Promotor
(Grace Davison Raney® 2400 Active Metal Catalyst)
zugesetzt und das resultierende Gemisch in einen 300 ml-Rührautoklav 314
SS Engineers EZE-Seal gegeben, der mit einem Dispersimax® Turbinenimpeller
ausgestattet war. Nach dem Spülen
des Reaktors mit Stickstoff wurden die Inhaltsstoffe des Reaktors
bei 1.000 U/min gerührt
und bei 50°C
unter 500 psig Überdruck
Wasserstoffgas für
5 Stunden erhitzt und anschließend
für weitere
3 Stunden bei 160°C.
Nach dem Kühlen
bis Raumtemperatur zeigte die Analyse des abschließenden Reaktionsgemisches
anhand der Gaschromatographie eine Ausbeute von 85,0% 5-Methyl-2-piperidon
ohne zurückbleibendes
4-Cyano-4-pentensäure-Ammoniumsalz
-
BEISPIEL 45
-
2-PYRROLIDINON AUS 3-CYANOPROPANSÄURE-AMMONIUMSALZ
-
In
einen 100 ml-Messzylinder wurden 75,8 ml einer wässrigen Reaktionsmischung mit
einem Gehalt von 1,31 M 3-Cyanopropansäure-Ammoniumsalz (0,1 Mol 3-Cyanopropansäure-Ammoniumsalz,
erzeugt durch enzymatische Hydrolyse von Succinonitril, Beispiel
20) gegeben und anschließend
19,4 ml konzentriertes Ammoniumhydroxid (29,3% NH3,
0,3 Mol NH3) zugesetzt und das Endvolumen
auf 100 ml mit destilliertem Wasser eingestellt. Die abschließenden Konzentrationen
von 3-Cyanopropansäure-Ammoniumsalz und
zugesetztem Ammoniumhydroxid betrugen 1,0 M bzw. 3,0 M. Zu der resultierenden
Lösung
wurden 0,99 g (10 Gew.%/Gew.% 3-Cyanopropansäure) von Raney Nickel mit Chrom-Promotor
(Grace Davison Raney 2400 Active Metal Catalyst) zugesetzt und das
resultierende Gemisch in einen 300 ml-Rührautoklav 314 SS Engineers EZE-Seal
gegeben, der mit einem Dispersimax® Turbinenimpeller
ausgestattet war. Nach dem Spülen
des Reaktors mit Stickstoff wurden die Inhaltsstoffe des Reaktors
bei 1.000 U/min gerührt
und bei 70°C
unter 500 psig Überdruck
Wasserstoffgas für
4,5 Stunden erhitzt und anschließend für weitere 5 Stunden bei 81°C. Die Analyse
anhand der Gaschromatographie zeigte eine Ausbeute von 91,0% 2-Pyrrolidinon
ohne zurückbleibendes 3-Cyanopropansäure-Ammoniumsalz.
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BEISPIEL 46
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2-PIPERIDON AUS 4-CYANOBUTANSÄURE-AMMONIUMSALZ
-
Die
in Beispiel 22 beschriebene Prozedur wurde wiederholt. Nach 4,0
Stunden betrug die HPLC-Ausbeute
an 4-Cyanobutansäure-Ammoniumsalz
und Glutarsäure-Diammoniumsalz
91,7% bzw. 7,5% ohne zurückbleibendes
Glutaronitril. Die abschließende
Konzentration von 4-Cyanobutansäure-Ammoniumsalz
in dem zentrifugierten und filtrierten Reaktionsgemisch betrug 1,42
M. Es wurden in einen 100 ml-Messzylinder 70,6
ml (0,100 Mol 4-Cyanobutansäure-Ammoniumsalz)
des filtrierten wässrigen
Reaktionsgemisches gegeben und anschließend 19,4 ml konzentriertes
Ammoniumhydroxid (29,3% NH3, 0,3 Mol NH3) zugesetzt und das Endvolumen auf 100 ml
mit destilliertem Wasser eingestellt. Die abschließenden Konzentrationen
an 4-Cyanopropansäure-Ammoniumsalz
und zugesetztem Ammoniumhydroxid betrugen 1,0 M bzw. 3,0 M. Zu der
resultierenden Lösung
wurden 1,13 g (10 Gew.%/Gew.% 4-Cyanobutansäure) Raney Nickel mit Chrom-Promotor
(Grace Davison Raney® 2400 Active Metal Catalyst)
zugesetzt und das resultierende Gemisch in einen 300 ml-Rührautoklav
314 SS-Autoklav
Engineers EZE-Seal gegeben, der mit einem Dispersimax Turbinenimpeller ausgestattet
war. Nach dem Spülen
des Reaktors mit Stickstoff wurden die Inhaltsstoffe des Reaktors
bei 1.000 U/min gerührt
und bei 70°C
unter 500 psig Überdruck
Wasserstoffgas für
3,5 Stunden erhitzt. Die Analyse anhand der Gaschromatographie zeigte
eine Ausbeute von 29,7% 2-Piperidon ohne zurückbleibendes 4-Cyanobutansäure-Ammoniumsalz.
Die Temperatur wurde für
weitere 2 Stunden bis 180°C
erhöht
und die anschließende
Analyse einer Probe mit Hilfe der Gaschromatographie zeigte eine
Ausbeute von 93,5% 2-Pyrrolidinon.
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BEISPIEL 47
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5-METHYL-2-PIPERIDON AUS
4-CYANOPENTANSÄURE-AMMONIUMSALZ
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Es
wurden 50 ml einer wässrigen
Mischung mit einem Gehalt von 1,85 M 4-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz (0,1
Mol 4-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz,
hergestellt mit Hilfe der enzymatischen Hydrolyse von 2-Methylglutaronitril,
Beispiel 9, filtriertes Produktgemisch aus Reaktion #5), 5,6 g 29%iges
wässriges
Ammoniumhydroxid und 44 ml deionisiertes Wasser in einen 300 ml
Rührautoklav
geladen. Zu dieser Lösung
wurden 0,73 g (3 Gew.% bezogen auf 4-Cyanopentansäure) von
4,5% Pd/0,5% Pt-auf-Kohlenstoff-Katalysator
zugesetzt. Der Autoklav wurde verschlossen und drei Mal mit Wasserstoff
gespült,
gefolgt von einem Erhitzen unter 100 psig Überdruck Wasserstoff bis 160°C und langsamem
Rühren.
Bei 160°C
wurde der Druck bis 800 psig Überdruck
erhöht
und mit einem Maximum an Rühren
begonnen. Nach 3 Stunden wurde der Reaktor gekühlt, belüftet und mit Stickstoff gespült. Die
gaschromatographische Analyse des Produktgemisches zeigte eine Umwandlung
von 96% an 4-Cyanopentansäure
und eine Ausbeute von 95,5% (99,5% Selektivität) an 5-Methyl-2-piperidon.
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BEISPIEL 48
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1,5-DIMETHYL-2-PIPERIDON
AUS 4-CYANOPENTANSÄURE-AMMONIUMSALZ
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Es
wurden 100 ml einer wässrigen
Mischung mit einem Gehalt von 1,85 M 4-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz (0,2
Mol 4-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz,
hergestellt mit Hilfe der enzymatischen Hydrolyse von 2-Methylglutaronitril,
Beispiel 9, filtriertes Produktgemisch aus Reaktion #5) und 14 g
(0,2 Mol) 40%iges wässriges
Methylamin in einen 300 ml Autoklaven geladen. Zu dieser Lösung wurde
4,5% Pd/0,5% Pt-auf-Kohlenstoff-Katalysator zugesetzt. Der Autoklav
wurde verschlossen und drei Mal mit Wasserstoff gespült, gefolgt
von einem Erhitzen des Reaktionsgemisches unter 100 psig Überdruck
Wasserstoff und langsamem Rühren.
Bei Reaktionstemperatur wurde der Druck erhöht und mit einem Maximum an
Rühren
begonnen. Nach einer vorgegebenen Reaktionsdauer wurde der Reaktor
gekühlt, belüftet und
mit Stickstoff gespült.
Die gaschromatographische Analyse des Produktgemisches von mehreren
Durchläufen
unter verschiedenen Reaktionsbedingungen ist nachfolgend zusammengestellt:
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BEISPIEL 49
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1,5-DIMETHYL-2-PIPERIDON
AUS 4-CYANOPENTANSÄURE-AMMONIUMSALZ
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Es
wurden Hydrierungen von 4-Cyanopentansäure-Ammoniumsalz in 5 ml-Glasschüttelröhrchen bei 800
psig Überdruck
unter Verwendung verschiedener Pd-auf-Kohlenstoff-Katalysatoren
ausgeführt.
Es wurden 4 ml der 1,85 M (7 mM) wässrigen 5-Cyanopentansäure (filtriertes
Produktgemisch von Beispiel 9, Reaktion #5), 0,88 g (11,4 mM) 40%iges
Methylamin und ein Katalysator aus der Gruppe, bestehend aus 5%
Pd/C und 4,5% Pd/0,5% Pt/C in das Röhrchen geladen und 3 Stunden
umgesetzt. Die gaschromatographische Analyse der Produktgemische
nach dem Kühlen
bis 25°C
bei unterschiedlichen Reaktionsbedingungen ist nachfolgend zusammengestellt: